JPS61180720A - 脳由来細胞増殖因子 - Google Patents
脳由来細胞増殖因子Info
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- JPS61180720A JPS61180720A JP60289503A JP28950385A JPS61180720A JP S61180720 A JPS61180720 A JP S61180720A JP 60289503 A JP60289503 A JP 60289503A JP 28950385 A JP28950385 A JP 28950385A JP S61180720 A JPS61180720 A JP S61180720A
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- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
脳誘発酸性繊維芽細胞生長因子（ａＦＧＦ ）は、培養
における血管（ｖａｓｃｕｌａｒ ） 内皮細胞のた
めの活性マイトジェンであシ、以下について有用である
。
における血管（ｖａｓｃｕｌａｒ ） 内皮細胞のた
めの活性マイトジェンであシ、以下について有用である
。
１）ポリメリック（ｐｏｌｙｍｅｒｉｅ ）血管植片を
おおうための上記培養物の生長のために有用。
おおうための上記培養物の生長のために有用。
２）移植用血管の作成用チューブラ−（ｔｕ−ｂｕｌａ
ｒ ）支持器上での上記培養物の生長に有用。
ｒ ）支持器上での上記培養物の生長に有用。
３）インビボにおける血管生長の刺激及び促進、及び修
復に有用。
復に有用。
脳誘発ａＦＧＦ精製及び傷の治癒活性は、ケネス エイ
、トーマス、ジュニア（ＫｅｎｎｅｔｈんＴｈｏｍａｓ
、 Ｊｒ ） （昭和５９年４月２４日発行）の米国特
許第４，４４４，７６０号に記載されている。
、トーマス、ジュニア（ＫｅｎｎｅｔｈんＴｈｏｍａｓ
、 Ｊｒ ） （昭和５９年４月２４日発行）の米国特
許第４，４４４，７６０号に記載されている。
上記たんばく質は、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ ） 、ブ
ロク、ナトル、アカド、サイ、 （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ。
ロク、ナトル、アカド、サイ、 （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） ＵＳＡ８１．３５７−３６１
（１９８４）にもまた記載されている。同−又は同様の
たんばく質は、中枢神経系及び他の器官から抽出された
、他の部分精製抽出物中にまた存在し得る。（例えば、
マシ７グ（Ｍａｃｉａｇ ） 等、サイエンス、２２
５，９３２（１９８４）を参照） 血管内皮細胞の生長には、過去においては、高濃度（１
０〜３０％）のウシ胎児血清又は成熟ウシ血清を用いて
いたが、結果は、子牛血清の各ロフトによって一定して
おらず、細胞生長速度は一般的におそかった。しかし、
現任は、本生長因子を用いることによシ、速い生長速度
が、０〜２％の血清レベルで達成される。
（１９８４）にもまた記載されている。同−又は同様の
たんばく質は、中枢神経系及び他の器官から抽出された
、他の部分精製抽出物中にまた存在し得る。（例えば、
マシ７グ（Ｍａｃｉａｇ ） 等、サイエンス、２２
５，９３２（１９８４）を参照） 血管内皮細胞の生長には、過去においては、高濃度（１
０〜３０％）のウシ胎児血清又は成熟ウシ血清を用いて
いたが、結果は、子牛血清の各ロフトによって一定して
おらず、細胞生長速度は一般的におそかった。しかし、
現任は、本生長因子を用いることによシ、速い生長速度
が、０〜２％の血清レベルで達成される。
純粋なたんばく質マイトジェンによシ介在される血管内
皮生長の再現可能な刺激の本新規方法は、以下によシ行
なわれる。
皮生長の再現可能な刺激の本新規方法は、以下によシ行
なわれる。
１）ヒトを含めた宿主動物からの非トロンボゲン血管内
皮細胞で合成ポリメリック血管をおおう。これにより、
合成血管移植片に関連する凝固の問題の多く又はすべて
を防ぐことができる。
皮細胞で合成ポリメリック血管をおおう。これにより、
合成血管移植片に関連する凝固の問題の多く又はすべて
を防ぐことができる。
２）チューブラ支持器上での宿主血管内皮細胞の生長に
よジインビトロにおいて血管を製造し、これを上記宿主
と同じヒトを含む宿主への移植。これＫよシ移植組織の
免疫学的拒否反応が防止され、移植のための患者への良
好な血管の供給が制限されなくなるであろう。
よジインビトロにおいて血管を製造し、これを上記宿主
と同じヒトを含む宿主への移植。これＫよシ移植組織の
免疫学的拒否反応が防止され、移植のための患者への良
好な血管の供給が制限されなくなるであろう。
３）インビボにおける十分な酸素又は／及び他の血液運
搬成分の欠如した組織への血流を増加させる。
搬成分の欠如した組織への血流を増加させる。
本発明の新規方法において有用な脳誘発ａ ＦＧＦは、
米国特許第４，４４４，７６０号に記載されたように調
製され、その開示は、ここに参考として引用する。
米国特許第４，４４４，７６０号に記載されたように調
製され、その開示は、ここに参考として引用する。
ａ ＦＧＦの完全なアミノ酸配列が決定されている。還
元及びカルボキシメチル化たんば〈質の配列決定によシ
、２つの７ミノ末端が明らかとなった。長い方の配列、
すなわちａＦＧＦ−１は、６つの７ミノ末端残基を含み
、これは短い方の配列ａＦＧＦ −２形においては、見
い出されていない。マイトジェンのこれら２つの微小外
来性形状体（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕａｆ
ｏ ｒｍ）の相対量は、精製ごとに変化するが、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により以前に発見さ
れたたんばく質の２つのバンド（ｂａｎａ）（トーマス
、等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ、８１，
３５７（１９８４））の存在量と密接な相互関係を有す
る。予期できるように、長い方の７ミノ末端配列の量は
、上記ＳＤＳゲル上の高い方のマスバンドの相対量と相
互に関係を有する。
元及びカルボキシメチル化たんば〈質の配列決定によシ
、２つの７ミノ末端が明らかとなった。長い方の配列、
すなわちａＦＧＦ−１は、６つの７ミノ末端残基を含み
、これは短い方の配列ａＦＧＦ −２形においては、見
い出されていない。マイトジェンのこれら２つの微小外
来性形状体（ｍｉｃｒｏｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕａｆ
ｏ ｒｍ）の相対量は、精製ごとに変化するが、ＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動により以前に発見さ
れたたんばく質の２つのバンド（ｂａｎａ）（トーマス
、等、ブロク、ナトル、アカド、サイ、ＵＳＡ、８１，
３５７（１９８４））の存在量と密接な相互関係を有す
る。予期できるように、長い方の７ミノ末端配列の量は
、上記ＳＤＳゲル上の高い方のマスバンドの相対量と相
互に関係を有する。
上記アミノ末端でのポリペプチドの長さが、ＳＤＳゲル
上で観察された２つの微小外来性形状体の間の違いのみ
であるならば、それらの間の質量の違いは、ＳＤＳゲル
移動距離に基づいて前に概算された２００ダルトンよシ
むしろ６４２ダルトンである。アミノ末端の異種性は、
インビボにおいてか又は精製の際の限定されたたんばく
質分解の結果生ずるものと仮定される。
上で観察された２つの微小外来性形状体の間の違いのみ
であるならば、それらの間の質量の違いは、ＳＤＳゲル
移動距離に基づいて前に概算された２００ダルトンよシ
むしろ６４２ダルトンである。アミノ末端の異種性は、
インビボにおいてか又は精製の際の限定されたたんばく
質分解の結果生ずるものと仮定される。
完全なアミノ酸配列が、トリプシン（Ｔ）、スタフィロ
コッカス アウレウスｖ８ プロテアーゼ（ｖ８）、ヒ
ドロキシルアミン（ＨＡ）及び臭化シアン（ＣＮ）での
たんばく質分解的開裂により生じたオーバーラッピング
ペプチド及びアミノ末端の配列から決定された。全たん
ばく質の内のカルボキシル末端配列は、時間的に調節さ
れたカルボキシペプチダーゼＡ消化によシ立証された。
コッカス アウレウスｖ８ プロテアーゼ（ｖ８）、ヒ
ドロキシルアミン（ＨＡ）及び臭化シアン（ＣＮ）での
たんばく質分解的開裂により生じたオーバーラッピング
ペプチド及びアミノ末端の配列から決定された。全たん
ばく質の内のカルボキシル末端配列は、時間的に調節さ
れたカルボキシペプチダーゼＡ消化によシ立証された。
カレントダイホップロチインデータバンク（ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｄａｙｈｏｆｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂ
ａｎｋ ）における調査では、ａＦＧＦはそこにリスト
されている約２，０００のたんばく質配列と比較して唯
一のものであった。
ｎｔ Ｄａｙｈｏｆｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａ ｂ
ａｎｋ ）における調査では、ａＦＧＦはそこにリスト
されている約２，０００のたんばく質配列と比較して唯
一のものであった。
第１図にその配列を示す。
２つの以前に決定されたアミノ末端の内の１つで開始す
ると認′められたがゆえに、早まって末端々されたペプ
チド配列は、ラストデグラデーションサイクル（１ａｓ
ｔ ｄ’ｅｇｒａｄａ＊１ｏｎｃｙｃｌｅ ）にそって
、星印＊で印されている。
ると認′められたがゆえに、早まって末端々されたペプ
チド配列は、ラストデグラデーションサイクル（１ａｓ
ｔ ｄ’ｅｇｒａｄａ＊１ｏｎｃｙｃｌｅ ）にそって
、星印＊で印されている。
血管内皮細胞の刺激のための新規方法は、約１〜ｌ Ｏ
ｒ＋ｆ’／−濃度でａＦＧＦをともなう普通培地におい
て所望の血管内皮細胞のサンプルを処理することより成
る。
ｒ＋ｆ’／−濃度でａＦＧＦをともなう普通培地におい
て所望の血管内皮細胞のサンプルを処理することより成
る。
血管内皮細胞生長が、インビトロで行なわれる場合、ダ
ルベツコににより修正された（ ｍ１ｄｉＮｅｄ ）
イーグル培地又はその変更吻（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ） のような普通培地および低濃度（約Ｏ〜２
容童チ）の子牛又は牛血清を必要とする。ペニシリン−
ストレプトマイシン組み合わせ物のような防腐剤又は他
の広域スペクトル抗菌剤もまた使用される。約１０〜１
００μｆ／−のヘパリンもまた含有させることが望まし
い。
ルベツコににより修正された（ ｍ１ｄｉＮｅｄ ）
イーグル培地又はその変更吻（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ ） のような普通培地および低濃度（約Ｏ〜２
容童チ）の子牛又は牛血清を必要とする。ペニシリン−
ストレプトマイシン組み合わせ物のような防腐剤又は他
の広域スペクトル抗菌剤もまた使用される。約１０〜１
００μｆ／−のヘパリンもまた含有させることが望まし
い。
本発明の新規方法は、内皮細胞をともなう人工血管の適
用のために有用である。患者からの血管内皮細胞は、末
梢血管又は、毛細血管を有する組織の小片を除去するこ
とによシ得られ、所望の細胞はａ ＦＧＦ及び、ヘパリ
ン又は／及び血清を含む場合のある他の補助成分の存在
下で培養によシ生長される。合成ポリメリック血管をお
おうための相当数の内皮細胞の培養による生長の後、そ
の細胞は、上記血管の内表面上にぬられる。ヘパリンか
あるいはフィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン又
はラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ ）などのたんばく質での
共有的又は非共有的（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｏｒ ｎｏ
ｎ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ）な人工血管への前塗布が
、人工血管表面への細胞の付着性を高めるために行なわ
れる。細胞が並んだ人工血管は次いで、外科的に患者へ
移植される。この細胞が患者自身のものである上記血管
は、免疫学的に適合できるものである。上記のように並
んだ非トロンボゲン内皮細胞は、人工血管表面上でのク
ロット形成の発生を減少させ、他の場所の血管封鎖又は
塞栓症の傾向を減少させる。
用のために有用である。患者からの血管内皮細胞は、末
梢血管又は、毛細血管を有する組織の小片を除去するこ
とによシ得られ、所望の細胞はａ ＦＧＦ及び、ヘパリ
ン又は／及び血清を含む場合のある他の補助成分の存在
下で培養によシ生長される。合成ポリメリック血管をお
おうための相当数の内皮細胞の培養による生長の後、そ
の細胞は、上記血管の内表面上にぬられる。ヘパリンか
あるいはフィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン又
はラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ ）などのたんばく質での
共有的又は非共有的（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｏｒ ｎｏ
ｎ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ）な人工血管への前塗布が
、人工血管表面への細胞の付着性を高めるために行なわ
れる。細胞が並んだ人工血管は次いで、外科的に患者へ
移植される。この細胞が患者自身のものである上記血管
は、免疫学的に適合できるものである。上記のように並
んだ非トロンボゲン内皮細胞は、人工血管表面上でのク
ロット形成の発生を減少させ、他の場所の血管封鎖又は
塞栓症の傾向を減少させる。
本新規方法は、人工血管の作成のためにも有用である。
患者からの血管内皮細胞及び平滑筋細胞は培養において
、別々に得られ、生長される。内皮細胞は上記に説明さ
れたように、ａＦＧＦの存在下で生長される。平滑筋細
胞は、標準的技術により培養において生長される。生物
的適合性ポリマー（ヘパリン又は特別な付着たんばく質
が塗布されているか又はされていない合成ポリマー、又
は外科的縫糸のような、非免疫原性バイオポリメリック
（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ） 材料）のチューブ
ラ−メツシュマトリックス（ｔｕｂｕｌａ ｍｅｓｈ
ｍａｔｒＬｘ ）は、外表面上の平滑筋細胞及び内表面
上の血管内皮細胞の培養生長を維持するために使用され
る。内皮細胞が、内表面上に融合単一層を形成し、平滑
筋細胞の多重層が外側をおおったならば、その血管は患
者へ移植される。
、別々に得られ、生長される。内皮細胞は上記に説明さ
れたように、ａＦＧＦの存在下で生長される。平滑筋細
胞は、標準的技術により培養において生長される。生物
的適合性ポリマー（ヘパリン又は特別な付着たんばく質
が塗布されているか又はされていない合成ポリマー、又
は外科的縫糸のような、非免疫原性バイオポリメリック
（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ） 材料）のチューブ
ラ−メツシュマトリックス（ｔｕｂｕｌａ ｍｅｓｈ
ｍａｔｒＬｘ ）は、外表面上の平滑筋細胞及び内表面
上の血管内皮細胞の培養生長を維持するために使用され
る。内皮細胞が、内表面上に融合単一層を形成し、平滑
筋細胞の多重層が外側をおおったならば、その血管は患
者へ移植される。
本新規方法は、血管生長の誘導のためにも使用されるこ
とができる。純粋な生長因子又は、等何物ヒトたんばく
質は、患者体内の血管の生長を誘発し、促進するために
使用される。マイトジェンは、所望の血管生長の位置で
、必要とされるヘパリンを含む活性増強剤及び安定剤と
ともに投与される。表面的な傷、例えば擦過傷又は熱傷
の新血管新生を含んだ応用のためには、処方剤は損傷表
面１ｃｒｌｆｉたり約１〜１００ ｎｌｉ’／ ｄａｙ
の速度で低速放出ポリマー中において直接に塗布される
。内部血管生長のためには、処方剤は移植された低速放
出ポリメリック材料、からか又は、低速放出ポンプから
、新血管新生領域へ直接に放出される。どちらのケース
でも放出速度は、損傷組織１ ａｎ３ 当たシ約１０
Ｏｎ？ −１０μｆ／ｄａｙが好ましい。
とができる。純粋な生長因子又は、等何物ヒトたんばく
質は、患者体内の血管の生長を誘発し、促進するために
使用される。マイトジェンは、所望の血管生長の位置で
、必要とされるヘパリンを含む活性増強剤及び安定剤と
ともに投与される。表面的な傷、例えば擦過傷又は熱傷
の新血管新生を含んだ応用のためには、処方剤は損傷表
面１ｃｒｌｆｉたり約１〜１００ ｎｌｉ’／ ｄａｙ
の速度で低速放出ポリマー中において直接に塗布される
。内部血管生長のためには、処方剤は移植された低速放
出ポリメリック材料、からか又は、低速放出ポンプから
、新血管新生領域へ直接に放出される。どちらのケース
でも放出速度は、損傷組織１ ａｎ３ 当たシ約１０
Ｏｎ？ −１０μｆ／ｄａｙが好ましい。
実施例 １
牛胎児胸部大動脈内皮細胞のａＦＧＦに対する牛胎児胸
部大動脈内皮細胞（ＡＧ４７６２、Ｎ、 １． Ａ、エ
ージングセルレボジトリ−、インステイテユートフオー
メディカルリサーチ、カムデン、ニューシャーシー（Ａ
ｇｉｎｇ Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、 Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｖｃ
ｈ。
部大動脈内皮細胞（ＡＧ４７６２、Ｎ、 １． Ａ、エ
ージングセルレボジトリ−、インステイテユートフオー
メディカルリサーチ、カムデン、ニューシャーシー（Ａ
ｇｉｎｇ Ｃｅ１ｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、 Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｖｃ
ｈ。
’ Ｃａｍｄａｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ） ）は
、インビトロにおいて３８累積細胞数倍化（３８ｃｕｍ
ｕｌａｔｉｖｅｐｏｐｕｌａＨｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ
ｓ ） 後アッセイされた。
、インビトロにおいて３８累積細胞数倍化（３８ｃｕｍ
ｕｌａｔｉｖｅｐｏｐｕｌａＨｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ
ｓ ） 後アッセイされた。
細胞は、ダルベツコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ。
ギブコ）中２０％熱不活化胎児血清中に２×１０３細胞
／ｃＩｌの細胞数で、６−ウェルコスタープレート（ｗ
ｅｌｌ ｃｏｓｔａｒ ｐｌａｔｅ ）に置かれ、１８
時間後ｉｓ血清に変えられた。すべての培地には、上記
に述べたようなペニシリン−ストレプトマイシン及びグ
ルタミンが補足的に加えられた。ＤＭＫＭ１ｄ当たシ１
１Ｉｖ含まれる牛血清アルブミン（シグマ）の１００μ
ｔで希釈された純粋なａ ＦＧＦ及び血清サンプルがＤ
ＭＥＭ４０μを中４５μｍ非ラベルチミジン及び３Ｈ−
チミジン（１，６μＣｉ）にューイングランド核（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃ−ｔｅａｒ ） ） と
ともに各ウェルへ加えられた。
／ｃＩｌの細胞数で、６−ウェルコスタープレート（ｗ
ｅｌｌ ｃｏｓｔａｒ ｐｌａｔｅ ）に置かれ、１８
時間後ｉｓ血清に変えられた。すべての培地には、上記
に述べたようなペニシリン−ストレプトマイシン及びグ
ルタミンが補足的に加えられた。ＤＭＫＭ１ｄ当たシ１
１Ｉｖ含まれる牛血清アルブミン（シグマ）の１００μ
ｔで希釈された純粋なａ ＦＧＦ及び血清サンプルがＤ
ＭＥＭ４０μを中４５μｍ非ラベルチミジン及び３Ｈ−
チミジン（１，６μＣｉ）にューイングランド核（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃ−ｔｅａｒ ） ） と
ともに各ウェルへ加えられた。
４８時間の合体期間後、細胞は洗浄され、溶解され、純
粋な生長因子（÷）刺激細胞又は血清（÷）刺激細胞か
らの７５チドリクロロ酢酸（ＴＣＡ）不溶性ＤＮＡがカ
ウントされた。ａＦＧＦの種々の濃度での内皮細胞数の
増加は、トリチューム化チミジンの取シ込みを測定する
ことによシ決定された。結果は第２図に示される。
粋な生長因子（÷）刺激細胞又は血清（÷）刺激細胞か
らの７５チドリクロロ酢酸（ＴＣＡ）不溶性ＤＮＡがカ
ウントされた。ａＦＧＦの種々の濃度での内皮細胞数の
増加は、トリチューム化チミジンの取シ込みを測定する
ことによシ決定された。結果は第２図に示される。
実施例 ２
マウス肺毛細血管内皮細胞のａ ＦＧＦに対するマウス
肺毛細血管内皮細胞は、２４−ウェルコスタ−ディツシ
ュに、１ウエル当たシ０、５−中に２．６Ｘ１０４細胞
／ｄで置かれ、ＤＭＥＭ中１０中子０％チャコール処理
子牛血清クローンラボラトリーズ、ロガン、ユタ（Ｈｙ
Ｃ１ｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｌｇａｎ
、Ｕｔａｈ ） ）中で集密状態になるまで生最された
。７２時間後血清濃度は０．５−にされ、４８時間静止
状態にされた。血清又は純粋なａＦＧＦが、上述された
ように５０μを中に加えられ、１８時間後 ３Ｈ−チミ
ジン（ギブコリン酸緩衝溶液中１００μＣｉ／ｍ／
”Ｈ−チミジンの２０μｔ）の４時間パルスが行なわれ
た。細胞は処理され、放射能が実施例１と同様にカウン
トされた。結果は第３図に示される。
肺毛細血管内皮細胞は、２４−ウェルコスタ−ディツシ
ュに、１ウエル当たシ０、５−中に２．６Ｘ１０４細胞
／ｄで置かれ、ＤＭＥＭ中１０中子０％チャコール処理
子牛血清クローンラボラトリーズ、ロガン、ユタ（Ｈｙ
Ｃ１ｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｌｇａｎ
、Ｕｔａｈ ） ）中で集密状態になるまで生最された
。７２時間後血清濃度は０．５−にされ、４８時間静止
状態にされた。血清又は純粋なａＦＧＦが、上述された
ように５０μを中に加えられ、１８時間後 ３Ｈ−チミ
ジン（ギブコリン酸緩衝溶液中１００μＣｉ／ｍ／
”Ｈ−チミジンの２０μｔ）の４時間パルスが行なわれ
た。細胞は処理され、放射能が実施例１と同様にカウン
トされた。結果は第３図に示される。
実施例 ３
持続した血管生長の際、内皮細胞が活発に増殖すること
が観察される。従って、我々は、チキンエラグ漿尿膜脈
管形成アッセイにおいて、血管生長を誘発するために精
製マイトジェンの能力を試験した。粗裂癌脈管形成因子
が、同時付加のヘパリンをともなってよシ顕著な活性を
有することが示されている以前の報告に基づいて、我々
は、ヘパリン単独及び純粋なａＦＧＦが加えられたヘパ
リンの血管新生反応を試験した。
が観察される。従って、我々は、チキンエラグ漿尿膜脈
管形成アッセイにおいて、血管生長を誘発するために精
製マイトジェンの能力を試験した。粗裂癌脈管形成因子
が、同時付加のヘパリンをともなってよシ顕著な活性を
有することが示されている以前の報告に基づいて、我々
は、ヘパリン単独及び純粋なａＦＧＦが加えられたヘパ
リンの血管新生反応を試験した。
３日経過のチキン胚が、卵殻から除去され、紙カップの
内側につるされたハンディ−ラップポーチ（Ｈａｎｄｉ
ｗｒａｐ ｐｏｕｃｈｅｓ ）中で生長された。カップ
の上部は、ハンディ−ラップでおおわれた。エラグは組
織培養ふ卵器中で５〜６日間３７℃でインキュベートさ
れた。
内側につるされたハンディ−ラップポーチ（Ｈａｎｄｉ
ｗｒａｐ ｐｏｕｃｈｅｓ ）中で生長された。カップ
の上部は、ハンディ−ラップでおおわれた。エラグは組
織培養ふ卵器中で５〜６日間３７℃でインキュベートさ
れた。
ＨＰＬＣ溶液溶媒（７ｍＭ トリフルオロ酢酸／３３
−アセトニトリル）の約３０μを中ｌμｔの純粋なａ
ＦＧＦか又は、同−ＨＰＬＣ溶媒コントロール溶液が、
１０μ？ヘパリン（ブタ腸粘膜から、シグマグレード１
）を含む乳酸化リンガ−（１ａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇ
ｅｒ’ｓ ）溶液（アボット（Ａｂｂｏｔｔ ） ）
中に溶解された２チ低ゲル化温度アガロース（ミレス
（Ｍｉｌｅｓ））の等量と混合された。その小滴（６０
μｔ）が、滅菌プラスチック１．３ ｔ：ｍ直径サーマ
ノックス（Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ ）組織培養カバースリ
ップ（ｃｏｖｅｒｓ目ｐ）（ミレス）の中心上でゲル化
された。揮発性アセトニトリルの少なくとも一部が、組
織培養フードにおける滅菌空気のプレナムのもとで、１
５〜３０分間エアレーション（ａｅｒａｔｉｏｎ ）
によシ蒸発された。カバースリップがエラグ漿尿膜上
に置かれ（ペレ゛ントダウン（ｐｅｌｌｅｔ ｄｏｗｎ
） ）、３日間インキュベートされた。アッセイの終
シにカバースリップの下の大きい白色集中領域を含むエ
ラグ（炎症性細胞によシ形成されたと思われる。）が捨
てられた。漿尿膜は顕微鏡的に試験され、アガロースペ
レットの内容を知らない観察者によシ、カバースリップ
の中央の下の微小毛細血管の増殖について評価された。
−アセトニトリル）の約３０μを中ｌμｔの純粋なａ
ＦＧＦか又は、同−ＨＰＬＣ溶媒コントロール溶液が、
１０μ？ヘパリン（ブタ腸粘膜から、シグマグレード１
）を含む乳酸化リンガ−（１ａｃｔａｔｅｄ Ｒｉｎｇ
ｅｒ’ｓ ）溶液（アボット（Ａｂｂｏｔｔ ） ）
中に溶解された２チ低ゲル化温度アガロース（ミレス
（Ｍｉｌｅｓ））の等量と混合された。その小滴（６０
μｔ）が、滅菌プラスチック１．３ ｔ：ｍ直径サーマ
ノックス（Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ ）組織培養カバースリ
ップ（ｃｏｖｅｒｓ目ｐ）（ミレス）の中心上でゲル化
された。揮発性アセトニトリルの少なくとも一部が、組
織培養フードにおける滅菌空気のプレナムのもとで、１
５〜３０分間エアレーション（ａｅｒａｔｉｏｎ ）
によシ蒸発された。カバースリップがエラグ漿尿膜上
に置かれ（ペレ゛ントダウン（ｐｅｌｌｅｔ ｄｏｗｎ
） ）、３日間インキュベートされた。アッセイの終
シにカバースリップの下の大きい白色集中領域を含むエ
ラグ（炎症性細胞によシ形成されたと思われる。）が捨
てられた。漿尿膜は顕微鏡的に試験され、アガロースペ
レットの内容を知らない観察者によシ、カバースリップ
の中央の下の微小毛細血管の増殖について評価された。
エラグ当たりヘパリンの付加量が１０μ？では不活性で
あったが、エラグ当た。！７１μｆのａＦＧＦを加えた
ヘパリンの同量については、炎症の徴候なく塗布部位で
小毛細血管の生長を増大させることが明らかとなった（
第１表）。
あったが、エラグ当た。！７１μｆのａＦＧＦを加えた
ヘパリンの同量については、炎症の徴候なく塗布部位で
小毛細血管の生長を増大させることが明らかとなった（
第１表）。
アッセイは再現性があシ、結果は、ａＦＧＦの異なる試
料を用いた３つの別々のアッセイの合体である。コント
ロール及びポジティブ脈管形成反応は、ａＦＧＦによシ
誘発された毛細血管増殖の程度を示す。マイトジェンは
、従って、ヘパリンの存在下で、有力な脈管形成たんば
く質である。
料を用いた３つの別々のアッセイの合体である。コント
ロール及びポジティブ脈管形成反応は、ａＦＧＦによシ
誘発された毛細血管増殖の程度を示す。マイトジェンは
、従って、ヘパリンの存在下で、有力な脈管形成たんば
く質である。
第 １ 表
コントロール １１５ ０ａＦＧ
Ｆ ２ １０これらの
データは、３つの別々の実験の合体である。を−分布統
計を用いて、マイトジェン刺激エラグのグループが、９
９．９％の信頼レベルで、コントロール群と異なること
が計算された。
Ｆ ２ １０これらの
データは、３つの別々の実験の合体である。を−分布統
計を用いて、マイトジェン刺激エラグのグループが、９
９．９％の信頼レベルで、コントロール群と異なること
が計算された。
第１図の１〜２は本発明におけるａ ＦＧＦの完全アミ
ノ酸配列である。 第２図は、牛胎児胸部大動脈内皮細胞のａ ＦＧＦに対
するマイトジェン反応における増殖を示す図である。 第３図は、マウス肺毛細血管内皮細胞のａ ＦＧＦに対
するマイトジェン反応における増殖を示す図である。 ｐ ｇ ａＦ ＧＦ／ｍｆ ｐ ｇ ａＦ ＧＦ／ｍｌ
ノ酸配列である。 第２図は、牛胎児胸部大動脈内皮細胞のａ ＦＧＦに対
するマイトジェン反応における増殖を示す図である。 第３図は、マウス肺毛細血管内皮細胞のａ ＦＧＦに対
するマイトジェン反応における増殖を示す図である。 ｐ ｇ ａＦ ＧＦ／ｍｆ ｐ ｇ ａＦ ＧＦ／ｍｌ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、約１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度でａＦＧＦを含有する
普通培地において、所望の内皮細胞の 試料を処理することより成る、血管内皮細 胞の生長を刺激するための新規方法。 ２、２％又はそれ以下の牛血清、グルタミン及び広域ス
ペクトル抗生物質及び約１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度での
ａＦＧＦを含有する普通培地において、血管内皮細胞の
試料を処理 することより成るインビトロにおける血管 内皮細胞の生長を刺激するための方法。 ３、血管エクスプラントからの細胞が、宿主に移植する
ための合成ポリメリツク血管の 表面上において生長することを特徴とする 特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、血管エクスプラントからの内皮細胞が宿主へ移植す
るための生物的適合性チユーブ ラーメツシユ支持器の内表面に生長され、 平滑筋細胞が該チユーブラーメツシユ支持 器の外表面上に生長されることを特徴とす る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、効果的生長促進剤の治療を必要とする患者へ、新血
管新生を促進するために必要な 量のａＦＧＦを投与することより成る、インビボにおけ
る血管内皮細胞の生長を刺激す るための方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US68592384A | 1984-12-24 | 1984-12-24 | |
| US685923 | 1984-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61180720A true JPS61180720A (ja) | 1986-08-13 |
| JP2510503B2 JP2510503B2 (ja) | 1996-06-26 |
Family
ID=24754216
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60289503A Expired - Lifetime JP2510503B2 (ja) | 1984-12-24 | 1985-12-24 | 脳由来細胞増殖因子 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0437281B1 (ja) |
| JP (1) | JP2510503B2 (ja) |
| CA (1) | CA1307221C (ja) |
| DE (2) | DE3584005D1 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4889808A (en) * | 1985-10-01 | 1989-12-26 | American Home Products | Method of enchancing t-PA and SCU-PA production |
| US5827826A (en) * | 1986-03-03 | 1998-10-27 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Compositions of human endothelial cell growth factor |
| US5552528A (en) | 1986-03-03 | 1996-09-03 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Bovine b-endothelial cell growth factor |
| CA1322163C (en) * | 1986-07-03 | 1993-09-14 | Kenneth A. Thomas, Jr. | Plasminogen activator production |
| NZ229354A (en) * | 1988-07-01 | 1990-09-26 | Becton Dickinson Co | Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface |
| CA2051796A1 (en) * | 1990-09-21 | 1992-03-22 | Marvin L. Bayne | Vascular endothelial cell growth factor ii |
| US5726152A (en) | 1990-09-21 | 1998-03-10 | Merck & Co., Inc. | Vascular endothelial cell growth factor II |
| US6608182B1 (en) | 1994-03-08 | 2003-08-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Human vascular endothelial growth factor 2 |
| US5932540A (en) | 1994-03-08 | 1999-08-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
| US6040157A (en) | 1994-03-08 | 2000-03-21 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
| US7109308B1 (en) | 1994-03-08 | 2006-09-19 | Human Genome Sciences, Inc. | Antibodies to human vascular endothelial growth factor 2 |
| US7186688B1 (en) | 1994-03-08 | 2007-03-06 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of stimulating angiogenesis in a patient by administering vascular endothelial growth factor 2 |
| US7153827B1 (en) | 1994-03-08 | 2006-12-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 and methods of use |
| ATE309360T1 (de) | 1994-03-08 | 2005-11-15 | Human Genome Sciences Inc | Vaskularer endothelialer wachstumsfaktor 2 |
| US7223724B1 (en) | 1999-02-08 | 2007-05-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells |
| NZ518077A (en) | 2000-08-04 | 2003-11-28 | Human Genome Sciences Inc | Biologically active fragments, analogues and derivatives of VEGF-2 for the treatment of peripheral artery diseases such as critical limb ischemia and coronary disease |
| WO2002083704A1 (en) | 2001-04-13 | 2002-10-24 | Human Genome Sciences, Inc. | Vascular endothelial growth factor 2 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444760A (en) * | 1983-06-17 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor |
-
1985
- 1985-12-16 DE DE8585116002T patent/DE3584005D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-16 EP EP91101195A patent/EP0437281B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-16 EP EP85116002A patent/EP0186084B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-16 DE DE3587801T patent/DE3587801T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-17 CA CA000497857A patent/CA1307221C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-24 JP JP60289503A patent/JP2510503B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444760A (en) * | 1983-06-17 | 1984-04-24 | Merck & Co., Inc. | Purification and characterization of a protein fibroblast growth factor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3584005D1 (de) | 1991-10-10 |
| EP0186084B1 (en) | 1991-09-04 |
| EP0186084A2 (en) | 1986-07-02 |
| CA1307221C (en) | 1992-09-08 |
| DE3587801D1 (de) | 1994-05-19 |
| EP0437281B1 (en) | 1994-04-13 |
| EP0186084A3 (en) | 1988-03-30 |
| EP0437281A1 (en) | 1991-07-17 |
| JP2510503B2 (ja) | 1996-06-26 |
| DE3587801T2 (de) | 1994-10-20 |
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