JP2834155B2 - コラーゲンフレーク体 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、現在1987年10月27日に発行される予定の米
国特許第4,703,108号になっている、1986年３月26日に
出願された係属中の米国特許出願第848,828号の一部継
続出願である。この米国特許出願は、1984年３月27日に
出願され、現在は放棄されている特許出願第593,733号
の一部継続出願である。
国特許第4,703,108号になっている、1986年３月26日に
出願された係属中の米国特許出願第848,828号の一部継
続出願である。この米国特許出願は、1984年３月27日に
出願され、現在は放棄されている特許出願第593,733号
の一部継続出願である。
これら２件の特許出願の明細書及びその記載はそのま
ま全体が本明細書に利用されている。
ま全体が本明細書に利用されている。
また、前記の先行出願で言及されているすべての先行
文献もここで系統的に言及する。さらに、本発明に関連
する特許文献を始めとする文献のリストもここに列記す
る。
文献もここで系統的に言及する。さらに、本発明に関連
する特許文献を始めとする文献のリストもここに列記す
る。
［産業上の利用分野］ 本発明は、創傷、特に表皮及び皮膚の創傷、より特定
すれば褥瘡などの圧力性潰瘍を海綿体状コラーゲン組成
物で治療することに関する。特に、本発明はこのような
潰瘍に罹患している患者の治療において重要である。
すれば褥瘡などの圧力性潰瘍を海綿体状コラーゲン組成
物で治療することに関する。特に、本発明はこのような
潰瘍に罹患している患者の治療において重要である。
また、本発明は特に褥瘡などのヒトの圧力性皮膚潰瘍
の治療に有効なコラーゲン体、特に新規なコラーゲンフ
レーク体に関する。
の治療に有効なコラーゲン体、特に新規なコラーゲンフ
レーク体に関する。
またさらに、本発明は定期的に本発明のコラーゲンフ
レーク体で創傷を治療することからなる、特にヒトの表
皮及び皮膚潰瘍の治療方法を提供するものである。
レーク体で創傷を治療することからなる、特にヒトの表
皮及び皮膚潰瘍の治療方法を提供するものである。
またさらに、本発明は、好ましくはフィブロネクチン
（FN）及び／又はヒアルロン酸を含む、改良海綿体状架
橋コラーゲン体で圧力性潰瘍を治療する方法にも関す
る。
（FN）及び／又はヒアルロン酸を含む、改良海綿体状架
橋コラーゲン体で圧力性潰瘍を治療する方法にも関す
る。
さらに、本発明は架橋コラーゲンマトリックス即ちタ
イプＩコラーゲン海綿体、または新規なコラーゲンフレ
ーク体で動物の皮下に達する皮膚創傷や圧力性潰瘍、特
にヒトの褥瘡を治療する方法を提供するものである。
イプＩコラーゲン海綿体、または新規なコラーゲンフレ
ーク体で動物の皮下に達する皮膚創傷や圧力性潰瘍、特
にヒトの褥瘡を治療する方法を提供するものである。
さらに、本発明は圧力性潰瘍などの創傷を海綿体及び
フレーク体で治療するのに好適な生体適合性合成ポリマ
ー物質に関する。
フレーク体で治療するのに好適な生体適合性合成ポリマ
ー物質に関する。
さらに、本発明はこのように生体適合性合成物質で皮
膚創傷を治療し、治癒を促進すると共に新しい組織を形
成する治療方法を提供する。
膚創傷を治療し、治癒を促進すると共に新しい組織を形
成する治療方法を提供する。
本発明はこのような目的からみて有用な各種生成物を
提供する。
提供する。
本発明はこれら各種物質、生成物、治療方法及び温血
動物、哺乳動物、特にヒトであるが、馬、犬、牛やその
他の種の動物を治療するためにここに開示するその他の
態様を提供する。勿論、最も重要でかつ緊急な必要性の
対象はヒトの患者である。
動物、哺乳動物、特にヒトであるが、馬、犬、牛やその
他の種の動物を治療するためにここに開示するその他の
態様を提供する。勿論、最も重要でかつ緊急な必要性の
対象はヒトの患者である。
本発明はまた創傷の治療、組織の再構成、移植など以
外の分野で有用で、しかも美容整形外科においても有用
な生成物を提供するものでもある。
外の分野で有用で、しかも美容整形外科においても有用
な生成物を提供するものでもある。
本発明はまた体内又は体外の創傷に対して、及び通常
の組織状特性を刺激するのが望ましい用途に対して、ヒ
トや動物の生体組織のあらゆる特性を備えた組織や皮膚
などの材料を提供するものでもある。
の組織状特性を刺激するのが望ましい用途に対して、ヒ
トや動物の生体組織のあらゆる特性を備えた組織や皮膚
などの材料を提供するものでもある。
本発明は幾つかの新規な生成物及び組成物を提供し、
かつ医療分野に大きく貢献する治療方法の利用を可能に
するものである。
かつ医療分野に大きく貢献する治療方法の利用を可能に
するものである。
当業者には、本発明の上記以外の目的は、以下の開示
から明らかになるはずである。
から明らかになるはずである。
［発明の課題］ 本発明は主に圧力性潰瘍という重要な課題に関する。
この課題は、高齢化社会の到来や、圧力性潰瘍の問題に
とって満足すべき治療法や治療品がないため、ますます
重要になってきている。
この課題は、高齢化社会の到来や、圧力性潰瘍の問題に
とって満足すべき治療法や治療品がないため、ますます
重要になってきている。
公刊された文献から判断する限り、海綿体、シート
状、縫合体や皮膜体などのコラーゲン系物質が、その生
体適合性の理由から、そしてコラーゲン系物質が組織の
内方成長に対して“骨格（Scaffold）”と呼ばれるもの
を与えると共に、治癒時の組織の組織化において重要な
働きをすることが証明されているという理由から、皮膚
用包帯材料や移植片に関して動物研究や人体研究に利用
されている。
状、縫合体や皮膜体などのコラーゲン系物質が、その生
体適合性の理由から、そしてコラーゲン系物質が組織の
内方成長に対して“骨格（Scaffold）”と呼ばれるもの
を与えると共に、治癒時の組織の組織化において重要な
働きをすることが証明されているという理由から、皮膚
用包帯材料や移植片に関して動物研究や人体研究に利用
されている。
各種創傷に関して行われてきた研究について言えば、
圧力性潰瘍に罹患している患者の創傷治癒を増進するた
めにコラーゲン体を使用する場合、瑕瑾がある。このよ
うな潰瘍の場合、治癒速度及び／又は治癒範囲は医学的
基準を満足する程十分ではない。圧力性潰瘍は恐らく治
療・治癒が最も難しい創傷の一つである。
圧力性潰瘍に罹患している患者の創傷治癒を増進するた
めにコラーゲン体を使用する場合、瑕瑾がある。このよ
うな潰瘍の場合、治癒速度及び／又は治癒範囲は医学的
基準を満足する程十分ではない。圧力性潰瘍は恐らく治
療・治癒が最も難しい創傷の一つである。
この問題は、局部的な圧力の作用により皮膚を喪失す
る、四肢麻痺症や対麻痺症などで長期間にわたって安静
臥床している患者に発生する。この結果生じる、褥瘡と
しても知られている圧力性潰瘍は皮膚のただれや表皮や
皮膚付属器官の喪失を呈する。
る、四肢麻痺症や対麻痺症などで長期間にわたって安静
臥床している患者に発生する。この結果生じる、褥瘡と
しても知られている圧力性潰瘍は皮膚のただれや表皮や
皮膚付属器官の喪失を呈する。
ところが、本発明によれば、第２、３及び／又は４段
階にある褥瘡の治癒を促進できることが見いだされた。
潰瘍の段階の診断及び分類はある程度重なるので、任意
のある時期では、潰瘍が１段階か、あるいは複数の段階
に重なっていることがある。任意の段階の潰瘍を治療で
きるが、現在普通に行われている治療は第２段階及び／
又は第３段階にある潰瘍についてである。伝統的に、潰
瘍は表在皮膚層が（ほぼ0.1mmの深さまで）創傷化した
り、擦りむかれた場合に第１段階及び／又は第２段階潰
瘍と呼ばれ、そして病変が進行して、深さが５〜6cmか
それ以上、幅がほぼ13cmまで、そして長さが数cmまでの
創傷になった場合に第３段階及び／又は第４段階潰瘍と
呼ばれている。また、このような創傷は典型的には皮膚
弁状に皮膚から分離された皮膚縁を呈する。
階にある褥瘡の治癒を促進できることが見いだされた。
潰瘍の段階の診断及び分類はある程度重なるので、任意
のある時期では、潰瘍が１段階か、あるいは複数の段階
に重なっていることがある。任意の段階の潰瘍を治療で
きるが、現在普通に行われている治療は第２段階及び／
又は第３段階にある潰瘍についてである。伝統的に、潰
瘍は表在皮膚層が（ほぼ0.1mmの深さまで）創傷化した
り、擦りむかれた場合に第１段階及び／又は第２段階潰
瘍と呼ばれ、そして病変が進行して、深さが５〜6cmか
それ以上、幅がほぼ13cmまで、そして長さが数cmまでの
創傷になった場合に第３段階及び／又は第４段階潰瘍と
呼ばれている。また、このような創傷は典型的には皮膚
弁状に皮膚から分離された皮膚縁を呈する。
医学的基準によれば、潰瘍は伝統的に次のように診断
・分類されている。
・分類されている。
第１段階：表皮の喪失 第２段階：表皮及び真皮の上層の喪失 第３段階：表皮及び真皮の喪失 第４段階：下部の筋、腱及び骨の露出 圧力性潰瘍が治癒の最も難しい創傷の一つであること
から、本発明で使用するコラーゲン体は一般に治療がよ
り簡単な他の創傷にも有効である。
から、本発明で使用するコラーゲン体は一般に治療がよ
り簡単な他の創傷にも有効である。
［従来の技術］ 皮膚に対する熱的、化学的及び機械的外傷は過剰な皮
膚の喪失を招き、死さえも招くことがある。皮膚の喪失
の後に、細菌が侵入すると、過剰に皮膚を喪失した患者
の全身感染が生じたり、あるいは免疫系を脆弱化する。
従って、慢性的な創傷の治癒速度を促進し、かつ治癒範
囲を広げる新しい治療方法の確立が重要である。
膚の喪失を招き、死さえも招くことがある。皮膚の喪失
の後に、細菌が侵入すると、過剰に皮膚を喪失した患者
の全身感染が生じたり、あるいは免疫系を脆弱化する。
従って、慢性的な創傷の治癒速度を促進し、かつ治癒範
囲を広げる新しい治療方法の確立が重要である。
本開示で引用する文献に記載されているように、大き
な開放創の治療には、細胞移動、結合組織成分やその他
の因子の生合成や肉芽組織の沈着及び組み再モデル化を
始めとする幾つかのフィルターがある。そして、再モデ
ル化相はタイプＩコラーゲン多孔性質の存在下において
促進されることが示されている。
な開放創の治療には、細胞移動、結合組織成分やその他
の因子の生合成や肉芽組織の沈着及び組み再モデル化を
始めとする幾つかのフィルターがある。そして、再モデ
ル化相はタイプＩコラーゲン多孔性質の存在下において
促進されることが示されている。
よく知られているように、細胞外間質の成分は細胞移
動及び細胞付着を誘導できる。タイプＩコラーゲンは細
胞培養において線維芽細胞を吸引し、細胞の指向移動を
もたらすと思われる。フィブロネクチンは試験管内で線
維芽細胞の化学的吸引と拡散を増大させることが知られ
ている。また、これは胚皮膚の発育時及び創傷の治癒時
に真皮に多量に存在する。ヒアルロン酸は胚発育時に高
濃度で存在し、細胞移動及び細胞分化に関係すると共
に、創傷治癒時に細胞外間質に現れる最初の結合組織グ
リコサミノグリカンである。
動及び細胞付着を誘導できる。タイプＩコラーゲンは細
胞培養において線維芽細胞を吸引し、細胞の指向移動を
もたらすと思われる。フィブロネクチンは試験管内で線
維芽細胞の化学的吸引と拡散を増大させることが知られ
ている。また、これは胚皮膚の発育時及び創傷の治癒時
に真皮に多量に存在する。ヒアルロン酸は胚発育時に高
濃度で存在し、細胞移動及び細胞分化に関係すると共
に、創傷治癒時に細胞外間質に現れる最初の結合組織グ
リコサミノグリカンである。
高分子量成分に加えて、各種の低分子量細胞体も増殖
を刺激し、結合組織成分の細胞生合成を増進することが
示されている。これら因子には表皮成長因子、血小板誘
導成長因子、線維芽細胞成長因子、虹彩誘導成長因子及
び軟骨誘導成長因子がある。ヘパリンも毛管の形成を誘
導することが示されている。
を刺激し、結合組織成分の細胞生合成を増進することが
示されている。これら因子には表皮成長因子、血小板誘
導成長因子、線維芽細胞成長因子、虹彩誘導成長因子及
び軟骨誘導成長因子がある。ヘパリンも毛管の形成を誘
導することが示されている。
従来の研究によれば、タイプＩコラーゲン海綿体は実
験動物の切除による創傷の治癒を増進する。
験動物の切除による創傷の治癒を増進する。
上記研究のより詳細な説明については、ここに引用す
る文献をみられたい。
る文献をみられたい。
本発明に関連して行われた研究には、試験管内でタイ
プＩコラーゲン基質に培養した線維芽細胞及び表皮細胞
の形態学的特性へのタイプＩコラーゲン、フィブロネク
チン及びヒアルロン酸の作用の分析が含まれている。
プＩコラーゲン基質に培養した線維芽細胞及び表皮細胞
の形態学的特性へのタイプＩコラーゲン、フィブロネク
チン及びヒアルロン酸の作用の分析が含まれている。
研究における関心は合成真皮及び表皮置換体を再構成
するために結合組織巨大分子を使用して、慢性的な創傷
の治癒を増進することにあった。そして研究の焦点は、
線維芽細胞及び表皮細胞とタイプＩ架橋コラーゲン海綿
体試験管内細胞培養との相互作用にあった。
するために結合組織巨大分子を使用して、慢性的な創傷
の治癒を増進することにあった。そして研究の焦点は、
線維芽細胞及び表皮細胞とタイプＩ架橋コラーゲン海綿
体試験管内細胞培養との相互作用にあった。
本発明に関連する研究を十分に理解するためには、こ
こに引用する他の文献に加えて、“Molecular Cell Bio
logy"、Darnell、Lodish and Baltimore、Scientific A
merica Books、Inc.、1986、Principles of Cellular O
rganization and Function（第178〜180頁）−記載は参
考のために利用してある−；及び他の細胞及び組織を取
り囲む間質空間に局在化した細胞である線維芽細胞によ
ってコラーゲンが如何にして合成されるかを記載した
“Synthesis and Assembly of Collagen"、（第1973〜1
974頁）を見られたい。フィブロネクチン（第592頁）の
役割に関する議論、Synthesis of Collagenに関する章
及び（第983頁）で言及されている文献もここに参考の
ために利用する。
こに引用する他の文献に加えて、“Molecular Cell Bio
logy"、Darnell、Lodish and Baltimore、Scientific A
merica Books、Inc.、1986、Principles of Cellular O
rganization and Function（第178〜180頁）−記載は参
考のために利用してある−；及び他の細胞及び組織を取
り囲む間質空間に局在化した細胞である線維芽細胞によ
ってコラーゲンが如何にして合成されるかを記載した
“Synthesis and Assembly of Collagen"、（第1973〜1
974頁）を見られたい。フィブロネクチン（第592頁）の
役割に関する議論、Synthesis of Collagenに関する章
及び（第983頁）で言及されている文献もここに参考の
ために利用する。
本発明の説明では、以下の定義が役立つ。
『天然不溶性コラーゲン』は酸性又はアルカリ性水溶
液に化学的に変性しない限り溶解しない、獣皮、スプリ
ットやその他の哺乳類や爬虫類の外皮などのコラーゲン
を意味し、かつこれを指すものである。より特定すれ
ば、『天然不溶性コラーゲン』は銀面と内側との間にあ
る牛皮の中間層である真皮を意味し、かつこれを指すも
のである。
液に化学的に変性しない限り溶解しない、獣皮、スプリ
ットやその他の哺乳類や爬虫類の外皮などのコラーゲン
を意味し、かつこれを指すものである。より特定すれ
ば、『天然不溶性コラーゲン』は銀面と内側との間にあ
る牛皮の中間層である真皮を意味し、かつこれを指すも
のである。
コラーゲンは結合組織を構成し、高位の脊椎に存在す
る主要タイプの繊維状蛋白質である。コラーゲンはその
自然の状態では、トリプルチェインヘリックスに存在
し、一定の周期性が整合トリプルチェイン間にある。時
には、コラーゲンのトリプルヘリックス立体配置はロッ
ドと呼ばれ、分子群が約640Åの軸周期性をもって整合
している。
る主要タイプの繊維状蛋白質である。コラーゲンはその
自然の状態では、トリプルチェインヘリックスに存在
し、一定の周期性が整合トリプルチェイン間にある。時
には、コラーゲンのトリプルヘリックス立体配置はロッ
ドと呼ばれ、分子群が約640Åの軸周期性をもって整合
している。
幾つかのタイプのコラーゲンがあるが、主要なタイプ
は、皮膚、骨や腱の主要コラーゲンであるタイプＩと呼
ばれている。タイプＩコラーゲンは［α１（Ｉ）２α２
（Ｉ）］のチェイン組成である。α１（Ｉ）及びα２
（Ｉ）チェインは相同性である。
は、皮膚、骨や腱の主要コラーゲンであるタイプＩと呼
ばれている。タイプＩコラーゲンは［α１（Ｉ）２α２
（Ｉ）］のチェイン組成である。α１（Ｉ）及びα２
（Ｉ）チェインは相同性である。
また、コラーゲンタイプＩ以外のタイプのコラーゲ
ン、例えば、［α（II）］３に対応するタイプII、［α
Ｉ（III）］３に対応するタイプIII、［αＩ（IV）］３
及び［α２（IV）］３に対応するタイプＶや［αＩ
（Ｖ）］２α２（Ｖ）に対応するタイプＶから得た場合
には、フレーク体や海綿体も本発明に包含される。タイ
プＩコラーゲンは主に皮膚、腱、骨、歯質や筋膜などの
組織に（上述したように）分布している。また、他のタ
イプのコラーゲンは軟骨、脊索、ガラス体；皮膚子宮、
血管、レチクリン繊維；腎臓糸球体、水晶体嚢；平滑筋
及び横紋筋細胞の基底板；線維芽細胞及び間充組織細胞
の外骨格に分布している。異なるタイプのコラーゲンは
相異しているが、関連のあるコラーゲンポリペプチドか
ら構成されている。ポリペプチド鎖はそのプロリン、リ
シン及びシステイン残基を変性する範囲が異なる。前に
引用した、Darnellの“characteristics of Different
Types of collagen"、（第179頁、表５−６）を参照さ
れたい。これも参考のためにここに含めている。現在、
抽出及び精製が非常に簡単な理由から、コラーゲンタイ
プＩが最も普通に使用されている。若い動物には、コラ
ーゲンにある程度の溶解性を与える分子間架橋及び繊維
間架橋はほとんどない。しかし、年令を重ねるに従っ
て、分子間架橋及び繊維間架橋の両者が生じ、コラーゲ
ンを不溶性にする。
ン、例えば、［α（II）］３に対応するタイプII、［α
Ｉ（III）］３に対応するタイプIII、［αＩ（IV）］３
及び［α２（IV）］３に対応するタイプＶや［αＩ
（Ｖ）］２α２（Ｖ）に対応するタイプＶから得た場合
には、フレーク体や海綿体も本発明に包含される。タイ
プＩコラーゲンは主に皮膚、腱、骨、歯質や筋膜などの
組織に（上述したように）分布している。また、他のタ
イプのコラーゲンは軟骨、脊索、ガラス体；皮膚子宮、
血管、レチクリン繊維；腎臓糸球体、水晶体嚢；平滑筋
及び横紋筋細胞の基底板；線維芽細胞及び間充組織細胞
の外骨格に分布している。異なるタイプのコラーゲンは
相異しているが、関連のあるコラーゲンポリペプチドか
ら構成されている。ポリペプチド鎖はそのプロリン、リ
シン及びシステイン残基を変性する範囲が異なる。前に
引用した、Darnellの“characteristics of Different
Types of collagen"、（第179頁、表５−６）を参照さ
れたい。これも参考のためにここに含めている。現在、
抽出及び精製が非常に簡単な理由から、コラーゲンタイ
プＩが最も普通に使用されている。若い動物には、コラ
ーゲンにある程度の溶解性を与える分子間架橋及び繊維
間架橋はほとんどない。しかし、年令を重ねるに従っ
て、分子間架橋及び繊維間架橋の両者が生じ、コラーゲ
ンを不溶性にする。
本発明に関連して使用する物質及び方法のうちいくつ
かのものは既にここで言及した文献に開示されている。
走査電子顕微鏡（SEM）又は光学顕微鏡写真研究は、細
孔の大きさ及びマトリックスの立体構成を決定するため
にコラーゲン海綿体について既に行われている（文献４
および５を参照）。
かのものは既にここで言及した文献に開示されている。
走査電子顕微鏡（SEM）又は光学顕微鏡写真研究は、細
孔の大きさ及びマトリックスの立体構成を決定するため
にコラーゲン海綿体について既に行われている（文献４
および５を参照）。
［発明の概略−発明の構成・作用・効果］ 重要なあらゆる点からみて医学上及び産業上許容でき
るコラーゲン体の製造はまだ十分に達成されていない。
るコラーゲン体の製造はまだ十分に達成されていない。
本発明の目的はこのようなコラーゲン体及びこれの信
頼できる製造方法を提供することにある。過去、研究者
によって多数の方法が研究され、試みられてきたが、判
断する限りでは、いずれも信頼性よく満足のいくコラー
ゲン体を製造できる条件群は見いだされていない。
頼できる製造方法を提供することにある。過去、研究者
によって多数の方法が研究され、試みられてきたが、判
断する限りでは、いずれも信頼性よく満足のいくコラー
ゲン体を製造できる条件群は見いだされていない。
本発明によれば、現在までのところ最も満足のいくコ
ラーゲン体、例えば海綿体を製造するのに最適な条件が
確立された。この方法は、好ましくは約2.0〜4.0の範
囲、より好ましくは約2.0〜約3.75の範囲にあるpHで塩
酸などの無機酸に微細化物を分散させることからなる。
コラーゲンの好ましい濃度は約0.5〜約１％重量／容量
である。操作温度は約15〜35℃、好ましくは20〜30℃の
範囲にある。22±２℃の温度が最適と認められた。分散
又はブレンデングは撹はん器［オステライザー・フレン
ダー（Osterizer Blender）］などの好適な機械式ブレ
ンデング手段を使用して、完全な分散液を得るのに十分
な時間行う。好ましくは、適当な真空下、例えば0.4mil
litorr未満で次に分散液を脱気する。
ラーゲン体、例えば海綿体を製造するのに最適な条件が
確立された。この方法は、好ましくは約2.0〜4.0の範
囲、より好ましくは約2.0〜約3.75の範囲にあるpHで塩
酸などの無機酸に微細化物を分散させることからなる。
コラーゲンの好ましい濃度は約0.5〜約１％重量／容量
である。操作温度は約15〜35℃、好ましくは20〜30℃の
範囲にある。22±２℃の温度が最適と認められた。分散
又はブレンデングは撹はん器［オステライザー・フレン
ダー（Osterizer Blender）］などの好適な機械式ブレ
ンデング手段を使用して、完全な分散液を得るのに十分
な時間行う。好ましくは、適当な真空下、例えば0.4mil
litorr未満で次に分散液を脱気する。
次に、理想的には平均細孔径が実質的に均一で、好ま
しくは100±50μｍの細孔を有し、海綿体の外部から内
部を接続し、全体的に一方の側から他方の側を接続する
チャンネルを含み、細孔が該チャンネルに開口している
繊維状構造体を得ることができる条件でコラーゲン分散
体を凍結する。極めて満足のできるコラーゲン体を得る
ためには、エタノールなどの低級アルカノールの浴中で
−20〜−35℃の温度範囲で、好ましくは約−30℃の温度
で凍結乾燥する。好ましくは、海綿体と容器との間にあ
る空隙を最小限に抑える。
しくは100±50μｍの細孔を有し、海綿体の外部から内
部を接続し、全体的に一方の側から他方の側を接続する
チャンネルを含み、細孔が該チャンネルに開口している
繊維状構造体を得ることができる条件でコラーゲン分散
体を凍結する。極めて満足のできるコラーゲン体を得る
ためには、エタノールなどの低級アルカノールの浴中で
−20〜−35℃の温度範囲で、好ましくは約−30℃の温度
で凍結乾燥する。好ましくは、海綿体と容器との間にあ
る空隙を最小限に抑える。
ドライアイスや液体窒素を含むエタノール浴やその他
の適当な手段を使用して、約−20℃〜−90℃の温度で各
種の凍結条件を試みた。次に、有利には−60℃の温度、
約0.2millitorrの室圧で凍結体を（一般にほぼ少なくと
も２時間）乾燥する。
の適当な手段を使用して、約−20℃〜−90℃の温度で各
種の凍結条件を試みた。次に、有利には−60℃の温度、
約0.2millitorrの室圧で凍結体を（一般にほぼ少なくと
も２時間）乾燥する。
海綿体などの架橋体が望ましい場合には、任意の公知
方法で架橋を行うことができる。好ましくは、架橋を２
段法で行って、それぞれ反対に荷電された側鎖にペプチ
ド結合を形成する。K.Weadock、R.M.Olson、F.H.Silver
の“Evaluation of Collagen crosslinking technique
s"、Biomater.Med.Denies Artif.Organs、11,293−318
（1984）（文献10）を参照。この文献も参考のためにこ
こに利用している。
方法で架橋を行うことができる。好ましくは、架橋を２
段法で行って、それぞれ反対に荷電された側鎖にペプチ
ド結合を形成する。K.Weadock、R.M.Olson、F.H.Silver
の“Evaluation of Collagen crosslinking technique
s"、Biomater.Med.Denies Artif.Organs、11,293−318
（1984）（文献10）を参照。この文献も参考のためにこ
こに利用している。
また、架橋は、上記の親出願明細書に開示されている
ように行うこともできる。
ように行うこともできる。
本明細書及び親出願明細書に開示した架橋方法を用い
ると、安定な細孔及びチャンネルを備えた（即ち、細孔
又はチャンネルの収縮が認められない）安定な架橋海綿
体が得られる。このようにした得たコラーゲン体は、以
下に説明するように、二重多孔性に特徴がある海綿体で
ある。
ると、安定な細孔及びチャンネルを備えた（即ち、細孔
又はチャンネルの収縮が認められない）安定な架橋海綿
体が得られる。このようにした得たコラーゲン体は、以
下に説明するように、二重多孔性に特徴がある海綿体で
ある。
本発明の別な方法によれば、以下に説明するように、
２重多孔性をもつフレーク体が得られる。
２重多孔性をもつフレーク体が得られる。
本発明のコラーゲン体は利用的には高度な繊維状構造
を示し、その平均細孔径は約100±50μｍで、『人工』
真皮に必要な組織内方成長用コラーゲン系物質に対して
理想的な構造を与えるチャンネルを含むものである。な
お、線維芽細胞の挙動は細孔径に関係がある。即ち、細
孔径が約50〜300μｍ、理想的には約80〜120μｍ、時に
は約100μｍの時に、組織が多孔性海綿体に内方成長す
る。
を示し、その平均細孔径は約100±50μｍで、『人工』
真皮に必要な組織内方成長用コラーゲン系物質に対して
理想的な構造を与えるチャンネルを含むものである。な
お、線維芽細胞の挙動は細孔径に関係がある。即ち、細
孔径が約50〜300μｍ、理想的には約80〜120μｍ、時に
は約100μｍの時に、組織が多孔性海綿体に内方成長す
る。
本発明のコラーゲンフレーク体は以下のように説明す
ることができる。
ることができる。
コラーゲンフレーク体は一般に大きさ、長さ及び厚さ
が不均一なコラーゲンフレークからなる。繊維は全体的
に水平な面内にランダムに組織化又は位置させる。フレ
ークはその間に不均一なチャンネルを形成するが、これ
らのうち幾つかはフレーク体全体に表面から内部に深く
延長するか、フレーク体全体を横断して、迷路状構造を
形成する。また、コラーゲンフレークは相互連絡細孔を
有し、該細孔はチャンネルに開口している。本発明のフ
レーク体は細孔に連絡しているチャンネルの割合が高
く、また細孔の一部は、相互連絡しているにも拘わら
ず、すべてチャンネルに開口してるわけではない。従っ
て、この二重形式の多孔性（チャンネル及び細孔）及び
フレーク状構造は創傷に対する治癒作用が有利に増進し
ている。
が不均一なコラーゲンフレークからなる。繊維は全体的
に水平な面内にランダムに組織化又は位置させる。フレ
ークはその間に不均一なチャンネルを形成するが、これ
らのうち幾つかはフレーク体全体に表面から内部に深く
延長するか、フレーク体全体を横断して、迷路状構造を
形成する。また、コラーゲンフレークは相互連絡細孔を
有し、該細孔はチャンネルに開口している。本発明のフ
レーク体は細孔に連絡しているチャンネルの割合が高
く、また細孔の一部は、相互連絡しているにも拘わら
ず、すべてチャンネルに開口してるわけではない。従っ
て、この二重形式の多孔性（チャンネル及び細孔）及び
フレーク状構造は創傷に対する治癒作用が有利に増進し
ている。
以下、詳細に説明すると、フレーク体の形態はウエブ
状メッシュを形成する、一般に径が少なくとも約１μｍ
の個々のコラーゲン繊維の網状構造を示すだけでなく、
個々のコラーゲン繊維間及びコラーゲン繊維のシート間
にチャンネルをもつシート状構造を形成すると思われる
コラーゲン繊維の集合体を呈する。チャンネルは表面細
孔と海綿体内部の細孔とを連絡する。コラーゲン繊維は
細孔を含み、その大部分（容量で少なくとも50％、一般
には80％か90％以上）は相互連絡し、そして細孔のかな
り部分、例えば50〜80％はチャンネルに連絡している。
状メッシュを形成する、一般に径が少なくとも約１μｍ
の個々のコラーゲン繊維の網状構造を示すだけでなく、
個々のコラーゲン繊維間及びコラーゲン繊維のシート間
にチャンネルをもつシート状構造を形成すると思われる
コラーゲン繊維の集合体を呈する。チャンネルは表面細
孔と海綿体内部の細孔とを連絡する。コラーゲン繊維は
細孔を含み、その大部分（容量で少なくとも50％、一般
には80％か90％以上）は相互連絡し、そして細孔のかな
り部分、例えば50〜80％はチャンネルに連絡している。
フレークはコラーゲン繊維から構成されているため、
明らかに、その長さは繊維に等しい。フレークの厚さは
変更可能であるが、一般にその長さ又は幅より小さい。
明らかに、その長さは繊維に等しい。フレークの厚さは
変更可能であるが、一般にその長さ又は幅より小さい。
本発明のフレーク体の代表的な形態を第１図及び第２
図に示す。
図に示す。
海綿体の一例はDoillon等の“Collagen based wound
dressing"、Control of the pore structure and morph
ology、（文献５の第１〜４図）に図示されている。
dressing"、Control of the pore structure and morph
ology、（文献５の第１〜４図）に図示されている。
横断面図では、本発明のフレーク体のチャンネルは円
筒形か球形を呈している。理想をいえば、細孔は平均径
が全体的に均一、好ましくは５〜300μｍ、理想的には
約20〜110μｍ、さらに好適には30〜75μｍ、即ち約50
μｍである。拡散研究から、分子量が100,000までの巨
大分子を排除するほどチャンネルが小さくないことが認
められている。
筒形か球形を呈している。理想をいえば、細孔は平均径
が全体的に均一、好ましくは５〜300μｍ、理想的には
約20〜110μｍ、さらに好適には30〜75μｍ、即ち約50
μｍである。拡散研究から、分子量が100,000までの巨
大分子を排除するほどチャンネルが小さくないことが認
められている。
コラーゲンフレークはしばしば約0.1〜3cmの間でその
長さを変えることができるが、通常は約1cmである。適
用形式又は使用形式は適用にベストなコラーゲン体のタ
イプに影響する。大きな創傷に対しては、小さな創傷に
対してよりも、フレーク体のフレークを長くすることが
できる。
長さを変えることができるが、通常は約1cmである。適
用形式又は使用形式は適用にベストなコラーゲン体のタ
イプに影響する。大きな創傷に対しては、小さな創傷に
対してよりも、フレーク体のフレークを長くすることが
できる。
本発明のフレーク体のフレークは、明らかに、個々の
繊維自体よりも長い。というのは、繊維は、一般的にと
いうわけではないが、しばしば長さ方向に整合して、部
分的に又は完全に他の繊維に重なり、本発明のフレーク
（又はマット状構造）を形成するからである。
繊維自体よりも長い。というのは、繊維は、一般的にと
いうわけではないが、しばしば長さ方向に整合して、部
分的に又は完全に他の繊維に重なり、本発明のフレーク
（又はマット状構造）を形成するからである。
本発明のフレーク体は表面積がコラーゲン海綿体より
も著しく大きく、時には海綿体表面積の約20％から少な
くとも50％、あるいは約80％も大きい。
も著しく大きく、時には海綿体表面積の約20％から少な
くとも50％、あるいは約80％も大きい。
本発明のコラーゲンフレーク体は架橋してもいなくて
もよく、いずれも許容できる。本発明に使用する海綿体
は好ましくは架橋体であり、最適にはFN及び／又はHAを
含有する。
もよく、いずれも許容できる。本発明に使用する海綿体
は好ましくは架橋体であり、最適にはFN及び／又はHAを
含有する。
HA及び／又はFNを含有するコラーゲン体の製造は親出
願明細書に開示されている。この点においても、この開
示は参考として利用している。
願明細書に開示されている。この点においても、この開
示は参考として利用している。
本発明のフレーク体の生体内研究では、コラーゲン構
造体におけるFN及び／又はHAの存在が、コストが高くな
ることを正当化するのに十分な長所をもつ製品を与える
か否かについては明らかではないが、現状では、フレー
ク体が満足のいくものであるため、FN及び／又はHAの配
合が本発明の主用途に大きな利点をもたらすとは思われ
ない。
造体におけるFN及び／又はHAの存在が、コストが高くな
ることを正当化するのに十分な長所をもつ製品を与える
か否かについては明らかではないが、現状では、フレー
ク体が満足のいくものであるため、FN及び／又はHAの配
合が本発明の主用途に大きな利点をもたらすとは思われ
ない。
本発明のコラーゲンフレーク体はコラーゲン粉末から
区別できるものである。期待に反して、本発明のコラー
ゲン体の主用途、即ちい創傷包帯材料としての用途で
は、全く不十分である。粉末の多孔性は実質的に一種類
の細孔から得られている。即ち、チャンネルは認められ
ず、また細孔もその径が極めて小さく、約10μｍ以下、
一般には１〜５μｍ程度である。創傷の液状物の吸収度
も悪く、そして粉末の取り扱いや創傷の填塞も極めて難
しい。これらやその他の欠点が理由になり、粉体は、現
状をみる限り、全く関心をもたれていない。本発明のフ
レーク体を製造する本発明の方法は、最小限の圧力条件
下で剪断手段を用いてコラーゲン海綿体を処理すること
からなる。剪断過程では、最小限の圧力を適用して、海
綿体のスライスやラメラを切断する。切断手段を乾燥海
綿体に作用させて、コラーゲン海綿体の薄片、スライス
又はフレークを切り離し、コラーゲンの多孔性構造の破
壊を最小限に抑える。剪断過程では、海綿体の切り離し
た薄片を切断手段、あるいは薄片を圧縮する経口のある
その他の手段との接触状態から引き離すのが好ましい。
生成したフレークは約0.1mm〜約1mmの範囲で平均厚さを
変えることができる。ところが、フレークの厚さは切断
又は剪断手段を調節することによって調節できる。多重
剪断羽根を使用することができるが、この場合には、２
つのこのような隣接手段間の距離が少なくとも部分的に
フレークの厚さを決定する。
区別できるものである。期待に反して、本発明のコラー
ゲン体の主用途、即ちい創傷包帯材料としての用途で
は、全く不十分である。粉末の多孔性は実質的に一種類
の細孔から得られている。即ち、チャンネルは認められ
ず、また細孔もその径が極めて小さく、約10μｍ以下、
一般には１〜５μｍ程度である。創傷の液状物の吸収度
も悪く、そして粉末の取り扱いや創傷の填塞も極めて難
しい。これらやその他の欠点が理由になり、粉体は、現
状をみる限り、全く関心をもたれていない。本発明のフ
レーク体を製造する本発明の方法は、最小限の圧力条件
下で剪断手段を用いてコラーゲン海綿体を処理すること
からなる。剪断過程では、最小限の圧力を適用して、海
綿体のスライスやラメラを切断する。切断手段を乾燥海
綿体に作用させて、コラーゲン海綿体の薄片、スライス
又はフレークを切り離し、コラーゲンの多孔性構造の破
壊を最小限に抑える。剪断過程では、海綿体の切り離し
た薄片を切断手段、あるいは薄片を圧縮する経口のある
その他の手段との接触状態から引き離すのが好ましい。
生成したフレークは約0.1mm〜約1mmの範囲で平均厚さを
変えることができる。ところが、フレークの厚さは切断
又は剪断手段を調節することによって調節できる。多重
剪断羽根を使用することができるが、この場合には、２
つのこのような隣接手段間の距離が少なくとも部分的に
フレークの厚さを決定する。
従って、本発明の方法は、剪断歪みを海綿体に作用さ
せることからなる。この歪みは隣接手段を相互に実質的
に平行な方向に滑動又は移動させるか、あるいは滑動又
は移動させる傾向のある力から生じる。剪断応力によ
り、海綿体のラメラ又はスライスを多孔性体から切り離
し、この多孔体を多数のフレークに剪断する。剪断中
（前及び後）の圧縮応力は好ましくは最小限に抑える
か、又は本質的にはゼロにする。
せることからなる。この歪みは隣接手段を相互に実質的
に平行な方向に滑動又は移動させるか、あるいは滑動又
は移動させる傾向のある力から生じる。剪断応力によ
り、海綿体のラメラ又はスライスを多孔性体から切り離
し、この多孔体を多数のフレークに剪断する。剪断中
（前及び後）の圧縮応力は好ましくは最小限に抑える
か、又は本質的にはゼロにする。
勿論、多段剪断手段は使用する必要がない。海綿体を
剪断手段に送り、これによりフレークを切り離し、フレ
ークを剪断手段との接触状態から引き離せばよい。
剪断手段に送り、これによりフレークを切り離し、フレ
ークを剪断手段との接触状態から引き離せばよい。
多孔性海綿体を剪断する手段は本質的ではない。この
目的を達成するのに好適な手段ならば任意のものを使用
できる。現在のところ、全く申し分のない装置は海綿体
用の容器からなり、この容器は細長い管状シリンダ内に
鋭いプロペラ状ナイフを備え、このシリンダにより剪断
手段付近から上方にスライスしたフレークを取り出す。
全く申し分のない装置はウィリーミル（Willey Mill）
である。勿論、この装置は、羽根付近からスライスした
フレークを重力により取り出せるように操作できる。
目的を達成するのに好適な手段ならば任意のものを使用
できる。現在のところ、全く申し分のない装置は海綿体
用の容器からなり、この容器は細長い管状シリンダ内に
鋭いプロペラ状ナイフを備え、このシリンダにより剪断
手段付近から上方にスライスしたフレークを取り出す。
全く申し分のない装置はウィリーミル（Willey Mill）
である。勿論、この装置は、羽根付近からスライスした
フレークを重力により取り出せるように操作できる。
本発明では、この剪断を達成するために機械式手段を
使用する。同様に、同じことを達成できる他の手段、例
えば超音波装置なども使用できる。
使用する。同様に、同じことを達成できる他の手段、例
えば超音波装置なども使用できる。
本発明のフレーク体は多孔性コラーゲン海綿体から得
る必要はない。また、このフレーク体は海綿体を媒介せ
ずにコラーゲン繊維から直接得ることも可能である。
る必要はない。また、このフレーク体は海綿体を媒介せ
ずにコラーゲン繊維から直接得ることも可能である。
合成の生体適合性ポリマー海綿体から得たフレークを
海綿体を媒介せずにコラーゲン繊維から直接得ることも
可能である。
海綿体を媒介せずにコラーゲン繊維から直接得ることも
可能である。
例えば、フレークはマット状やフレーク状構造体に形
成できる。
成できる。
前に説明したように、合成の生体適合性ポリマーから
得たフレーク体は同じ方法で得られる。
得たフレーク体は同じ方法で得られる。
本発明の目的からみて満足のいくフレーク体には、広
い範囲にわたって各種のものがある。実質的に粉末粒子
（40メッシュスクリーンを通過する粒子）を含まず、し
かもフレークの大部分、即ち50％以上の部分、好ましく
は80％以上から約100％の部分が10〜30メッシュスクリ
ーンを通過するフレーク体が好ましい。前述したよう
に、繊維の平均長さは一般に0.1mm〜3mm（又はそれ以
上）、時には約1mm（又はそれ以上）である。なお、コ
ラーゲン（又は生体適合性合成ポリマー）のフレーク体
である限り、かなりの許容度が認められている。スクリ
ーンなどの適当な分離手段により、海綿体の粉末などの
より小さな粒子からフレークを分離する。
い範囲にわたって各種のものがある。実質的に粉末粒子
（40メッシュスクリーンを通過する粒子）を含まず、し
かもフレークの大部分、即ち50％以上の部分、好ましく
は80％以上から約100％の部分が10〜30メッシュスクリ
ーンを通過するフレーク体が好ましい。前述したよう
に、繊維の平均長さは一般に0.1mm〜3mm（又はそれ以
上）、時には約1mm（又はそれ以上）である。なお、コ
ラーゲン（又は生体適合性合成ポリマー）のフレーク体
である限り、かなりの許容度が認められている。スクリ
ーンなどの適当な分離手段により、海綿体の粉末などの
より小さな粒子からフレークを分離する。
剪断過程の実施条件はかなり変えることができる。剪
断過程は、本発明のコラーゲンのその他の工程又は処理
と同時に、あるいはその前後に実施できる。
断過程は、本発明のコラーゲンのその他の工程又は処理
と同時に、あるいはその前後に実施できる。
一般に、剪断過程の実施温度は出発物質及び最終品の
崩壊又は損傷をもたらさない温度ならばよく、例えば、
ほぼ凍結温度〜約60℃の範囲、好ましくはほぼ室温であ
ればよい。剪断過程の実施時間は、前記した形態を備え
た、所望のフレーク体が得られるまでである。当業者な
らば、合理的でない実験を行わなくても、剪断手段の時
間及び速度を調節できるはずである。
崩壊又は損傷をもたらさない温度ならばよく、例えば、
ほぼ凍結温度〜約60℃の範囲、好ましくはほぼ室温であ
ればよい。剪断過程の実施時間は、前記した形態を備え
た、所望のフレーク体が得られるまでである。当業者な
らば、合理的でない実験を行わなくても、剪断手段の時
間及び速度を調節できるはずである。
剪断過程の実施雰囲気は空気か、その他の望ましい雰
囲気であればよい。この剪断過程は真空下でも実施する
ことができる。好ましくは、雰囲気は乾燥空気である。
また、この雰囲気は滅菌空気か、少なくとも濾過空気で
あってもよい。フレーク体は剪断過程後に滅菌するのが
好ましい。本発明方法の興味深い態様では、剪断時にコ
ラーゲンを架橋することができる。即ち、コラーゲンを
まづ凍結乾燥してから、剪断と同時に、あるいはその後
に架橋することができる。この関連からいえば、例え
ば、剪断装置内の雰囲気は所望架橋剤の蒸気などの適当
な雰囲気であればよい。アルデヒドやカルボジイミド類
などの従来から用いられている化学品のうち任意のもの
を蒸発し、剪断過程と同時に、（又はその前から後に）
重合を行ってもよい。フレーク体を滅菌する場合には、
エチレンオキシドなどの適当な滅菌ガスを使用すること
ができる。
囲気であればよい。この剪断過程は真空下でも実施する
ことができる。好ましくは、雰囲気は乾燥空気である。
また、この雰囲気は滅菌空気か、少なくとも濾過空気で
あってもよい。フレーク体は剪断過程後に滅菌するのが
好ましい。本発明方法の興味深い態様では、剪断時にコ
ラーゲンを架橋することができる。即ち、コラーゲンを
まづ凍結乾燥してから、剪断と同時に、あるいはその後
に架橋することができる。この関連からいえば、例え
ば、剪断装置内の雰囲気は所望架橋剤の蒸気などの適当
な雰囲気であればよい。アルデヒドやカルボジイミド類
などの従来から用いられている化学品のうち任意のもの
を蒸発し、剪断過程と同時に、（又はその前から後に）
重合を行ってもよい。フレーク体を滅菌する場合には、
エチレンオキシドなどの適当な滅菌ガスを使用すること
ができる。
本発明の方法は回分式・連続式のいずれでも実施でき
る。いずれの場合も、フレーク体から大きな塊を分離
し、リサイクルして、て適当な大きさに剪断すればよ
い。
る。いずれの場合も、フレーク体から大きな塊を分離
し、リサイクルして、て適当な大きさに剪断すればよ
い。
なお、本発明の方法を工業的規模で実施する場合、本
発明の所望フレーク体を得るために、本発明方法に各種
変更を加えることができる。
発明の所望フレーク体を得るために、本発明方法に各種
変更を加えることができる。
本発明によれば、フレーク体にはコラーゲンだけでは
なく、その他の生体適合性合成ポリマーも使用できる。
本発明に関連して開示した用途に使用できる生体適合性
合成ポリマーには、“Transdermal Controlled Systemi
c Medications"、Marcel Dekker、Inc.、（1987）の、K
elvin S.Weadock等によるPolymeric Materials of Skin
Biocompatibilityに関する章に記載されているものが
ある。この記載は参考としてここに利用している。
なく、その他の生体適合性合成ポリマーも使用できる。
本発明に関連して開示した用途に使用できる生体適合性
合成ポリマーには、“Transdermal Controlled Systemi
c Medications"、Marcel Dekker、Inc.、（1987）の、K
elvin S.Weadock等によるPolymeric Materials of Skin
Biocompatibilityに関する章に記載されているものが
ある。この記載は参考としてここに利用している。
代表的なポリマーはポリウレタン類、ポリエチレン
類、シリコーンポリマー類、ヒドロゲル類などである。
製造中に添加剤が使用されていないポリマーはアレルギ
ー性反応や腫瘍形成性反応をほとんど引き起こさないと
考えられる。合成ポリマーは生物分解性であってもなく
てもよい。
類、シリコーンポリマー類、ヒドロゲル類などである。
製造中に添加剤が使用されていないポリマーはアレルギ
ー性反応や腫瘍形成性反応をほとんど引き起こさないと
考えられる。合成ポリマーは生物分解性であってもなく
てもよい。
なお、注意すべきは、このような合成繊維は任意の長
さで得ることができるので、フレーク体も特定用途に望
ましい長さにすることができる。従って、本発明によれ
ば、生物適合性ポリマーの合成繊維のフレーク体は幾つ
かの望ましい特徴を与える。
さで得ることができるので、フレーク体も特定用途に望
ましい長さにすることができる。従って、本発明によれ
ば、生物適合性ポリマーの合成繊維のフレーク体は幾つ
かの望ましい特徴を与える。
上記と同様な方法で、例えば、多孔性ポリウレタン類
などから合成生物適合性ポリマーを製造する。
などから合成生物適合性ポリマーを製造する。
なお、本発明において注意すべきは、相互連絡し（又
は相互連絡せず）、海綿体構造の内部に位置しているコ
ラーゲン海綿体の細孔がフレーク及び／又はフレーク間
のチャンネルの表面に連絡していることである。従っ
て、本発明のフレーク体の形態の特徴はこの二重多孔性
と著しく大きな表面積にある。この形態は極めて理想的
なもので、線維芽細胞及び上皮細胞を吸引し、これによ
り創傷中に新しいコラーゲンの合成を促進するものであ
る。
は相互連絡せず）、海綿体構造の内部に位置しているコ
ラーゲン海綿体の細孔がフレーク及び／又はフレーク間
のチャンネルの表面に連絡していることである。従っ
て、本発明のフレーク体の形態の特徴はこの二重多孔性
と著しく大きな表面積にある。この形態は極めて理想的
なもので、線維芽細胞及び上皮細胞を吸引し、これによ
り創傷中に新しいコラーゲンの合成を促進するものであ
る。
現在まで発見された限りでは、本発明のコラーゲンフ
レークのこの特定な形態は、創傷の皮下まで達する治癒
を促進する程実質的に理想的なものである。
レークのこの特定な形態は、創傷の皮下まで達する治癒
を促進する程実質的に理想的なものである。
カラーゲンやその創傷及び皮膚の回復における役割、
あるいは一部の文献が言っているような『合成』皮膚に
おける役割に関してかなり多くのの科学文献や特許公報
が公刊・発行されているが、本発明体の形態をもつコラ
ーゲン体が記載されていないのは驚くべきことであり、
また今のところ、本発明体の形態が創傷の治癒にこのよ
うな有利な作用を発揮できることは理解されていない。
あるいは一部の文献が言っているような『合成』皮膚に
おける役割に関してかなり多くのの科学文献や特許公報
が公刊・発行されているが、本発明体の形態をもつコラ
ーゲン体が記載されていないのは驚くべきことであり、
また今のところ、本発明体の形態が創傷の治癒にこのよ
うな有利な作用を発揮できることは理解されていない。
コラーゲン海綿体で創傷を治療することに関連して、
親出願明細書には、HA及び／又はFNがある程度の有利な
作用を発揮することが示されている。
親出願明細書には、HA及び／又はFNがある程度の有利な
作用を発揮することが示されている。
本発明による潰瘍の治療においても、HA又はFNの役割
を考慮すべきである。HAが存在すると、FN又はコラーゲ
ン海綿体だけの存在に比較して、接種三日後においてコ
ラーゲンの合成の増進が認められた。また、FNが存在す
ると、コラーゲン海綿体上のみで成長させた細胞に比較
して、コラーゲンのマトリックス中への沈着は、特に接
種７日後及び９日後において増進したことが認められ
た。FN及びHAは共に生体内において創傷の治癒を増進し
たが、同時に同じ方法で治癒過程に影響したとは思われ
ない。
を考慮すべきである。HAが存在すると、FN又はコラーゲ
ン海綿体だけの存在に比較して、接種三日後においてコ
ラーゲンの合成の増進が認められた。また、FNが存在す
ると、コラーゲン海綿体上のみで成長させた細胞に比較
して、コラーゲンのマトリックス中への沈着は、特に接
種７日後及び９日後において増進したことが認められ
た。FN及びHAは共に生体内において創傷の治癒を増進し
たが、同時に同じ方法で治癒過程に影響したとは思われ
ない。
さらに、プラスチック製の培養皿で成長させた線維芽
細胞について行われた研究から、細胞外間質（ECM）が
生体内で形成するか否かは必ずしも予知できなかった。
コラーゲン海綿体で培養した細胞は全面成長しなかった
が、新たに合成されたECMが存在していた。コラーゲン
海綿体では、細胞が伸張していることが認められ、幾つ
かの糸状仮足があらゆる方向に延びて、外生の、新しく
形成したコラーゲンだけでなく、培地対向面の微小絨毛
に付着していた。プラスチック上で成長させた細胞に
は、微小絨毛は認められなかった。
細胞について行われた研究から、細胞外間質（ECM）が
生体内で形成するか否かは必ずしも予知できなかった。
コラーゲン海綿体で培養した細胞は全面成長しなかった
が、新たに合成されたECMが存在していた。コラーゲン
海綿体では、細胞が伸張していることが認められ、幾つ
かの糸状仮足があらゆる方向に延びて、外生の、新しく
形成したコラーゲンだけでなく、培地対向面の微小絨毛
に付着していた。プラスチック上で成長させた細胞に
は、微小絨毛は認められなかった。
コラーゲン海綿体上で成長させた細胞は接種６日後に
全面成長し、SEMで調べたところ、この全面成長の結
果、細胞の表面層が形成し、従って下部のECMを観察す
ることができなかった。コラーゲン海綿体上で成長させ
た細胞については、微小絨毛だけでなく、糸状仮足も認
められた。光学顕微鏡で調べたところ、細胞をプラスチ
ック上で成長させた時だけではなく、コラーゲン海綿体
上で成長させた時にも、細胞の全面成長及び重なりが認
められた。全面成長細胞層の下部には、プラスチック成
長細胞だけではなく、コラーゲン成長細胞についても、
円形又は三角形の細胞に伴うECMが認められた。プラス
チックに比較した場合、マトリックスに沈着された合成
コラーゲンが高く、そして培地に放出されたそれは低か
った。細胞が全面成長に近づいても、コラーゲン合成は
低下しない。
全面成長し、SEMで調べたところ、この全面成長の結
果、細胞の表面層が形成し、従って下部のECMを観察す
ることができなかった。コラーゲン海綿体上で成長させ
た細胞については、微小絨毛だけでなく、糸状仮足も認
められた。光学顕微鏡で調べたところ、細胞をプラスチ
ック上で成長させた時だけではなく、コラーゲン海綿体
上で成長させた時にも、細胞の全面成長及び重なりが認
められた。全面成長細胞層の下部には、プラスチック成
長細胞だけではなく、コラーゲン成長細胞についても、
円形又は三角形の細胞に伴うECMが認められた。プラス
チックに比較した場合、マトリックスに沈着された合成
コラーゲンが高く、そして培地に放出されたそれは低か
った。細胞が全面成長に近づいても、コラーゲン合成は
低下しない。
HA又はFNが存在すると、成長速度及びコラーゲン合成
が増進する。これは、コラーゲン海綿体のみで成長させ
た細胞に比較して、細胞***が増進することにより、あ
るいはHA又はFNを含有する海綿体内部に移動した細胞の
数が増えたことにより説明することができる。
が増進する。これは、コラーゲン海綿体のみで成長させ
た細胞に比較して、細胞***が増進することにより、あ
るいはHA又はFNを含有する海綿体内部に移動した細胞の
数が増えたことにより説明することができる。
FN及びHAについては、別な有利な作用も認められた。
従来の研究が示唆するところによれば、線維芽細胞の複
製はコラーゲンの存在により抑制されることがある。し
かし、興味深いことには、FN又はHAが存在すると、細胞
がこの抑制から解放されるか、それ自体が成長・***を
刺激する。
従来の研究が示唆するところによれば、線維芽細胞の複
製はコラーゲンの存在により抑制されることがある。し
かし、興味深いことには、FN又はHAが存在すると、細胞
がこの抑制から解放されるか、それ自体が成長・***を
刺激する。
本発明のこの実施態様によれば、（光学顕微鏡観察で
は）生化学的組成もまた細胞浸潤に影響することが認め
られた。FN又はHAの存在はコラーゲン海綿体中への細浸
湿潤に影響した。HAが存在すると、細孔空間にある細胞
はHAには直接結合するが、コラーゲンには直接接触しな
い。というのは、HAは海綿体の細孔空間に位置すること
ができるからである。コラーゲン海綿体において、細胞
がコラーゲン繊維と結合したHAに直接接触すると、細胞
がコラーゲン繊維にのみ直接接触している時とは対照的
に、細胞が増殖し、ECMを合成する。従来の研究が示唆
するところによれば、線維芽細胞がHAのゲルの作用を直
接受けると、細胞移動及び増殖が抑制される。一方、本
発明に関連して行った研究の結果が示唆するところによ
れば、細胞移動及び細胞増殖を増進するには、HAとコラ
ーゲン繊維の結合が重要である。
は）生化学的組成もまた細胞浸潤に影響することが認め
られた。FN又はHAの存在はコラーゲン海綿体中への細浸
湿潤に影響した。HAが存在すると、細孔空間にある細胞
はHAには直接結合するが、コラーゲンには直接接触しな
い。というのは、HAは海綿体の細孔空間に位置すること
ができるからである。コラーゲン海綿体において、細胞
がコラーゲン繊維と結合したHAに直接接触すると、細胞
がコラーゲン繊維にのみ直接接触している時とは対照的
に、細胞が増殖し、ECMを合成する。従来の研究が示唆
するところによれば、線維芽細胞がHAのゲルの作用を直
接受けると、細胞移動及び増殖が抑制される。一方、本
発明に関連して行った研究の結果が示唆するところによ
れば、細胞移動及び細胞増殖を増進するには、HAとコラ
ーゲン繊維の結合が重要である。
FNが存在すると、細胞は異なる挙動を示す。従来のSE
M観察に基づくと、ECMの沈着は主に海綿体の表面層のコ
ラーゲン繊維上に生じると思われる。この観察は、放射
線標識法によって接種９日後に認められた、マトリック
ス中へのコラーゲンの沈着が増進したことに対応させる
ことができる。海綿体の内部のコラーゲン繊維に付着し
た細胞の周囲には、ごく少量の新たに形成したECMが沈
着するに過ぎないと思われる。コラーゲン海綿体の場合
には、FNはコラーゲン繊維に直接結合しないため、HAと
同様に、海綿体の細孔空間に位置しない。光学顕微鏡観
察によれば、コラーゲンに結合したFNは細胞浸潤及び細
胞付着を促進するが、海綿体内部へのECMの沈着は増進
しない。従って、コラーゲンの線維芽細胞による複製及
び生合成は使用する支持体の構造というよりは、ECM環
境との直接接触の影響を受けるものと考えられる。
M観察に基づくと、ECMの沈着は主に海綿体の表面層のコ
ラーゲン繊維上に生じると思われる。この観察は、放射
線標識法によって接種９日後に認められた、マトリック
ス中へのコラーゲンの沈着が増進したことに対応させる
ことができる。海綿体の内部のコラーゲン繊維に付着し
た細胞の周囲には、ごく少量の新たに形成したECMが沈
着するに過ぎないと思われる。コラーゲン海綿体の場合
には、FNはコラーゲン繊維に直接結合しないため、HAと
同様に、海綿体の細孔空間に位置しない。光学顕微鏡観
察によれば、コラーゲンに結合したFNは細胞浸潤及び細
胞付着を促進するが、海綿体内部へのECMの沈着は増進
しない。従って、コラーゲンの線維芽細胞による複製及
び生合成は使用する支持体の構造というよりは、ECM環
境との直接接触の影響を受けるものと考えられる。
つまり、FMまたはHA含有コラーゲン海綿体上で成長さ
れた線維芽細胞は、未変性マトリックスやプラスチック
上で成長させた線維芽細胞に比較して、新たに合成され
るコラーゲンを増殖し、そのマトリックスへの沈着を増
進するものである。特に、マトリックス中のHAは海綿体
の細孔及びチャンネル中への細胞浸潤を促し、一方FNは
海綿体のコラーゲン繊維への細胞付着を促す。このよう
に、HA及びFNをコラーゲン海綿体に配合すると、コラー
ゲン海綿体における細胞移動及び細胞複製が増進すると
共に、その人工結合組織としての特性が向上する。従っ
て、圧力性潰瘍の治療においても、FN及び／又はHA海綿
体の存在は同様に治癒・回復を速めるのに役立つ。
れた線維芽細胞は、未変性マトリックスやプラスチック
上で成長させた線維芽細胞に比較して、新たに合成され
るコラーゲンを増殖し、そのマトリックスへの沈着を増
進するものである。特に、マトリックス中のHAは海綿体
の細孔及びチャンネル中への細胞浸潤を促し、一方FNは
海綿体のコラーゲン繊維への細胞付着を促す。このよう
に、HA及びFNをコラーゲン海綿体に配合すると、コラー
ゲン海綿体における細胞移動及び細胞複製が増進すると
共に、その人工結合組織としての特性が向上する。従っ
て、圧力性潰瘍の治療においても、FN及び／又はHA海綿
体の存在は同様に治癒・回復を速めるのに役立つ。
親出願明細書及び文献に開示されているように、本発
明に使用する海綿体及び本発明の・本発明に使用するフ
レーク体には、ホルモン、殺菌剤、成長促進剤、免疫源
や抗生物質などの、創傷の治癒を増進する任意数の添加
剤を配合することができる。
明に使用する海綿体及び本発明の・本発明に使用するフ
レーク体には、ホルモン、殺菌剤、成長促進剤、免疫源
や抗生物質などの、創傷の治癒を増進する任意数の添加
剤を配合することができる。
以下、実施例及び例示により本発明を説明していく
が、これらは単に説明を目的とするもので、発明を制限
するものではない。当業者ならば、本発明の精神から逸
脱せずに、例示方法に各種の変更を加えることができる
はずである。
が、これらは単に説明を目的とするもので、発明を制限
するものではない。当業者ならば、本発明の精神から逸
脱せずに、例示方法に各種の変更を加えることができる
はずである。
［実施例の説明］ コラーゲン海綿体の調製 前述したように（Doillon等、1984）、細胞培養研究
及び人体研究を目的として、コラーゲン海綿体を調製し
た。Weadock等（1984）に従って、牛皮からのタイプＩ
コラーゲンを0.5％HCl溶液（pH3.0）に分散し、凍結乾
燥・架橋した。2.5Mradのガンマ線を照射することによ
りコラーゲン海綿体を滅菌した。
及び人体研究を目的として、コラーゲン海綿体を調製し
た。Weadock等（1984）に従って、牛皮からのタイプＩ
コラーゲンを0.5％HCl溶液（pH3.0）に分散し、凍結乾
燥・架橋した。2.5Mradのガンマ線を照射することによ
りコラーゲン海綿体を滅菌した。
Ruoslahti等（1982）の記載に従って、新鮮な牛の血
からフィブロネクチンを抽出した。ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動法によって測定したところ、このもの
は、（Brokaw等）還元後の分子量が約220,000の２つの
ポリペプチド鎖からなっていた。FNを0.1M酢酸アンモニ
ウムに溶解した。
からフィブロネクチンを抽出した。ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動法によって測定したところ、このもの
は、（Brokaw等）還元後の分子量が約220,000の２つの
ポリペプチド鎖からなっていた。FNを0.1M酢酸アンモニ
ウムに溶解した。
Sigma Chemical社製のヒアルロン酸（III級、カリウ
ム塩）を使用し、これをHCl（pH3.0）に溶解した。ウォ
リング・ブレンダー（Waring blender）でFN及びHA溶液
をコラーゲン分散体と混合した。FN:コラーゲン重量比
が1:99で、HA:コラーゲン重量比が1:19の混合物を調製
した。これら濃度のHA及びFN（Doillon ＆ Silver、198
6a）で、組織の内方成長を最大化した。
ム塩）を使用し、これをHCl（pH3.0）に溶解した。ウォ
リング・ブレンダー（Waring blender）でFN及びHA溶液
をコラーゲン分散体と混合した。FN:コラーゲン重量比
が1:99で、HA:コラーゲン重量比が1:19の混合物を調製
した。これら濃度のHA及びFN（Doillon ＆ Silver、198
6a）で、組織の内方成長を最大化した。
前記の係属中の特許出願明細書に開示されている方法
に従っても海綿体は調製できる。適当な方法はDoillon
等によっても開示されている（文献３、４、５、６）。
に従っても海綿体は調製できる。適当な方法はDoillon
等によっても開示されている（文献３、４、５、６）。
細胞培養 血清を含まないダルベッコの変性イーグル培地（Dulb
ecco's Modified Eagle Medium（DMEA）（Gibco Labora
tories）に３日間浸漬して海綿体pHを安定化した後、コ
ラーゲン海綿体上で線維芽細胞を成長させた。この線維
芽細胞は、Kao等（1975）の記載に従って、未熟なひよ
この腱から誘導したもので、100単位/mlのペニシリン、
100μg/mlのストレプトマイシン、アスコルビン酸（毎
日10μg/ml添加）及び牛胎児の５％血清（FBS）（Gibco
Laboratories）を補ったDMEM中で培養した。一次培養
として1.5×105〜3.2×105細胞/cm2濃度で線維芽細胞を
プレート化した。海綿体に接種する前に、細胞を50〜25
0μのDMEMに懸濁し、混合物を各海綿体に広げ、２時
間付着させた（Doillon等、1987）。10％CO2雰囲気中で
組織培養インキュベータにより37℃で細胞を成長させ
た。培地を２日おきに取り換え、毎日アスコルビン酸を
新しく加えた。
ecco's Modified Eagle Medium（DMEA）（Gibco Labora
tories）に３日間浸漬して海綿体pHを安定化した後、コ
ラーゲン海綿体上で線維芽細胞を成長させた。この線維
芽細胞は、Kao等（1975）の記載に従って、未熟なひよ
この腱から誘導したもので、100単位/mlのペニシリン、
100μg/mlのストレプトマイシン、アスコルビン酸（毎
日10μg/ml添加）及び牛胎児の５％血清（FBS）（Gibco
Laboratories）を補ったDMEM中で培養した。一次培養
として1.5×105〜3.2×105細胞/cm2濃度で線維芽細胞を
プレート化した。海綿体に接種する前に、細胞を50〜25
0μのDMEMに懸濁し、混合物を各海綿体に広げ、２時
間付着させた（Doillon等、1987）。10％CO2雰囲気中で
組織培養インキュベータにより37℃で細胞を成長させ
た。培地を２日おきに取り換え、毎日アスコルビン酸を
新しく加えた。
切除・脱脂し、そして1mm2の薄片に切断した（Doillo
n等、1986c）モルモットの薄片から表皮細胞を得た。Si
gma Chemical社製の、DMEMとハムのF12培地（F12）（Ha
m's F 12 Medium）との1:1混合物で、100μg/mlのペニ
シリン、10μg/mlのストレプトマイシン及び３μg/mlの
アンフォテレシンＢを含有する混合物からな培地中で表
皮薄片を洗浄した。次に、表皮薄片を5mg/mlのコラゲナ
ーゼ（Copper Biomedical）を含むDMEM/F12溶液に90分
間入れた。分解された表皮薄片を次に重力の作用で10分
間沈降させた。表皮細胞に富む沈降物を懸濁・計数し、
接種に使用した。
n等、1986c）モルモットの薄片から表皮細胞を得た。Si
gma Chemical社製の、DMEMとハムのF12培地（F12）（Ha
m's F 12 Medium）との1:1混合物で、100μg/mlのペニ
シリン、10μg/mlのストレプトマイシン及び３μg/mlの
アンフォテレシンＢを含有する混合物からな培地中で表
皮薄片を洗浄した。次に、表皮薄片を5mg/mlのコラゲナ
ーゼ（Copper Biomedical）を含むDMEM/F12溶液に90分
間入れた。分解された表皮薄片を次に重力の作用で10分
間沈降させた。表皮細胞に富む沈降物を懸濁・計数し、
接種に使用した。
抗生物質、インシュリン（１μg/ml）、ヒドロコルチ
ゾン（20μg/ml）及び15％FBS（Doillon等、1986c）を
補ったDMEM/F12で表皮細胞を培養した。主培養物として
２×106細胞/cm2の濃度でプレート化した。線維芽細胞
について説明したように、各コラーゲン海綿体に細胞を
接種した。２時間後、残っている培地を加えた。５％CO
2雰囲気中において組織培養インキュベータにより37℃
で細胞を成長させた。培養地は２日おきに取り換えた。
１週間でFBSは15％から10％に低下した。
ゾン（20μg/ml）及び15％FBS（Doillon等、1986c）を
補ったDMEM/F12で表皮細胞を培養した。主培養物として
２×106細胞/cm2の濃度でプレート化した。線維芽細胞
について説明したように、各コラーゲン海綿体に細胞を
接種した。２時間後、残っている培地を加えた。５％CO
2雰囲気中において組織培養インキュベータにより37℃
で細胞を成長させた。培養地は２日おきに取り換えた。
１週間でFBSは15％から10％に低下した。
引用した刊行物に記載されている他の方法を使用する
ことができ、記載の一部は参考としてここに利用してい
る。
ことができ、記載の一部は参考としてここに利用してい
る。
放射線標識実験 ２μCi/ml［3H］チミジンか２μg/ml［14C］プロリン
（New England Nuclear）のいずれかを含有するDMEMを
使用して、接種１、３、５、７及び９日後に線維芽細胞
を標識化した。［3H］チミジンで線維芽細胞を４時間培
養した。前に説明したように（Doillon等、1987）、培
地を除去し、0.5N過塩素酸溶液を加え、細胞を回収し
た。音波処理後、0.5N過塩素酸で沈降DNAを２回洗浄
し、90℃で90分間加熱した。遠心分離後、上澄み液を液
体シンチレーションカウンター（アクアゾル−2,New En
gland Nuclear）でカウントした。
（New England Nuclear）のいずれかを含有するDMEMを
使用して、接種１、３、５、７及び９日後に線維芽細胞
を標識化した。［3H］チミジンで線維芽細胞を４時間培
養した。前に説明したように（Doillon等、1987）、培
地を除去し、0.5N過塩素酸溶液を加え、細胞を回収し
た。音波処理後、0.5N過塩素酸で沈降DNAを２回洗浄
し、90℃で90分間加熱した。遠心分離後、上澄み液を液
体シンチレーションカウンター（アクアゾル−2,New En
gland Nuclear）でカウントした。
他の線維芽細胞培養体を２μCl/ml［14C］プロリンで
４時間培養した。次に、細胞から培地を除去し、新しい
DMEMを細胞に加えた。放射線標識化［14C］プロリンを
含有する細胞及び培地分画をプロテアーゼ阻害剤（Kao
等、1977）で処理し、そして音波処理した。サンプルを
２％ドデシル硫酸ナトリウム（SDV）の最終濃度にし、
0.124トリス−HCl中に２％（W/V）SDS、10％（V/V）グ
リセリン、0.005％ブロモフェノールブルーを含むSDSサ
ンプル緩衝液に対して透析し、そしてアリコートを液体
シンチレーションカウンターでカウントした。
４時間培養した。次に、細胞から培地を除去し、新しい
DMEMを細胞に加えた。放射線標識化［14C］プロリンを
含有する細胞及び培地分画をプロテアーゼ阻害剤（Kao
等、1977）で処理し、そして音波処理した。サンプルを
２％ドデシル硫酸ナトリウム（SDV）の最終濃度にし、
0.124トリス−HCl中に２％（W/V）SDS、10％（V/V）グ
リセリン、0.005％ブロモフェノールブルーを含むSDSサ
ンプル緩衝液に対して透析し、そしてアリコートを液体
シンチレーションカウンターでカウントした。
線維芽細胞培養体について記載した方法（上記参照）
を使用して、15日と22日との間で表皮細胞培養物を標識
化した。
を使用して、15日と22日との間で表皮細胞培養物を標識
化した。
光学顕微鏡検査 一次細胞培養物を接種９日後に観察した。細胞を接種
したコラーゲン系海綿体及びプラスチック皿をリン酸緩
衝塩化ナトリウム水溶液で簡単に洗浄してから、変性し
たカルノフスキーの固定液（Karnovsky's fixative）で
固定した。前に説明したように（Doillon等、1984）、
グリコールメタクリレートに標本を埋め込んだ。光学顕
微鏡検査するために、同様な方法で細胞を含む対照プラ
スチック皿を処理した。倍率が128倍の35mmカメラを備
えたLaborlux 12 Pol光学顕微鏡で光学顕微鏡写真を取
った。
したコラーゲン系海綿体及びプラスチック皿をリン酸緩
衝塩化ナトリウム水溶液で簡単に洗浄してから、変性し
たカルノフスキーの固定液（Karnovsky's fixative）で
固定した。前に説明したように（Doillon等、1984）、
グリコールメタクリレートに標本を埋め込んだ。光学顕
微鏡検査するために、同様な方法で細胞を含む対照プラ
スチック皿を処理した。倍率が128倍の35mmカメラを備
えたLaborlux 12 Pol光学顕微鏡で光学顕微鏡写真を取
った。
人体研究 生体内研究の治療処方は次の通りであった。すべての
患者の褥瘡は重症であった。すべての被験者が同意書に
署名した。
患者の褥瘡は重症であった。すべての被験者が同意書に
署名した。
表面積が約１〜10cm2の範囲にある非感染皮膚潰瘍に
滅菌したコラーゲンフレークを投与した。この研究で
は、第２段階又は第３段階に分類されている潰瘍のみを
対象とした。皮下のただれの程度については患者間に違
いが認められたが、いずれの場合にも、露出した腱、筋
や骨（第４段階）には何も投与しなかった。患者の年令
範囲は約35歳から70歳であった。少なくとも６人の患者
を対照群とコラーゲン治療群に分けて研究を行った。
滅菌したコラーゲンフレークを投与した。この研究で
は、第２段階又は第３段階に分類されている潰瘍のみを
対象とした。皮下のただれの程度については患者間に違
いが認められたが、いずれの場合にも、露出した腱、筋
や骨（第４段階）には何も投与しなかった。患者の年令
範囲は約35歳から70歳であった。少なくとも６人の患者
を対照群とコラーゲン治療群に分けて研究を行った。
対照群及びコラーゲン治療群の創傷の両者を次の治療
処方を使用して治療した。すべての創傷を過酸化水素の
１％（W/V）溶液で洗浄してから、通常の塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄した。（対照群を除いて）コラーゲンフ
レークを各創傷に填塞した。次に、すべての創傷を塩化
ナトリウム水溶液を浸したコットンガーゼで覆った。次
に、乾いたコットンガーゼの層を適用し、周囲の健全な
皮膚にテープで止めた。すべての創傷は毎日過酸化水素
及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、包帯を取り換え
た。コラーゲンフレークで治療した創傷については、塩
化ナトリウム水溶液で洗浄した後、毎日填塞し直した。
処方を使用して治療した。すべての創傷を過酸化水素の
１％（W/V）溶液で洗浄してから、通常の塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄した。（対照群を除いて）コラーゲンフ
レークを各創傷に填塞した。次に、すべての創傷を塩化
ナトリウム水溶液を浸したコットンガーゼで覆った。次
に、乾いたコットンガーゼの層を適用し、周囲の健全な
皮膚にテープで止めた。すべての創傷は毎日過酸化水素
及び塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、包帯を取り換え
た。コラーゲンフレークで治療した創傷については、塩
化ナトリウム水溶液で洗浄した後、毎日填塞し直した。
皮膚創傷治癒速度は、１週間に一度各創傷の写真を取
り、各創傷上に直接セットしたプラスチック透明陽画を
使用する創傷視野計をトレーシングすることによって評
価した。定規を各創傷の隣にセットした状態で一定の距
離から写真を撮影した。各創傷の面積はIBM PCにインタ
ーフェースで接続したデジタル化パッドを使用して計算
した。元の創傷面積（時間＝０）で割ることにより創傷
面積を正規化して、面積変化率（％）の値を求めた。
り、各創傷上に直接セットしたプラスチック透明陽画を
使用する創傷視野計をトレーシングすることによって評
価した。定規を各創傷の隣にセットした状態で一定の距
離から写真を撮影した。各創傷の面積はIBM PCにインタ
ーフェースで接続したデジタル化パッドを使用して計算
した。元の創傷面積（時間＝０）で割ることにより創傷
面積を正規化して、面積変化率（％）の値を求めた。
結果及び考察 従来の研究によれば、タイプＩコラーゲン海綿体は新
しく合成されたコラーゲンの空間的沈着を組織化し、か
つ再モデル化を促進することによって動物の皮膚創傷の
治療を増進することが指摘されているが、さらに、タイ
プＩコラーゲン海綿体にヒアルロン酸及びフィブロネク
インを配合すると、この結果コラーゲン系海綿体に移動
する線維芽細胞の数が増え、従って新しく合成されるコ
ラーゲンの沈着の増進が認められる。
しく合成されたコラーゲンの空間的沈着を組織化し、か
つ再モデル化を促進することによって動物の皮膚創傷の
治療を増進することが指摘されているが、さらに、タイ
プＩコラーゲン海綿体にヒアルロン酸及びフィブロネク
インを配合すると、この結果コラーゲン系海綿体に移動
する線維芽細胞の数が増え、従って新しく合成されるコ
ラーゲンの沈着の増進が認められる。
凍結乾燥コラーゲンサンプルのSEM観察によれば、SEM
によって測定したところ、細孔径が一般に60μｍと250
μｍとの間にある多孔性構造が認められ、そしてこれら
細孔は深い層とは連絡しない表面細孔（表面細孔）か、
あるいは海綿体の深い構造に連絡する細孔−チャンネル
と呼ばれる（深い細孔）−のいずれかであると思われ
る。表面細孔は５％FN及び１％HAが存在するとしばしば
見られたものであるが、希な場合には、１％HA＋１％FN
が存在しても見られることがあった。深い細孔はしばし
ば１％HA＋１％FNが存在すると認められるが、１％HAの
存在で、対照コラーゲン海綿体にも認められる。ほとん
どの場合、チャンネル又は深い細孔は内面が平滑で、特
に１％FNが存在するとそうである。また、１％HA＋１％
FN及び５％HA＋１％FNが存在すると、深い又は表面の細
孔の表面に繊維状構造の形成が認められる。ただし、こ
れは５％HAの存在で最小になる。
によって測定したところ、細孔径が一般に60μｍと250
μｍとの間にある多孔性構造が認められ、そしてこれら
細孔は深い層とは連絡しない表面細孔（表面細孔）か、
あるいは海綿体の深い構造に連絡する細孔−チャンネル
と呼ばれる（深い細孔）−のいずれかであると思われ
る。表面細孔は５％FN及び１％HAが存在するとしばしば
見られたものであるが、希な場合には、１％HA＋１％FN
が存在しても見られることがあった。深い細孔はしばし
ば１％HA＋１％FNが存在すると認められるが、１％HAの
存在で、対照コラーゲン海綿体にも認められる。ほとん
どの場合、チャンネル又は深い細孔は内面が平滑で、特
に１％FNが存在するとそうである。また、１％HA＋１％
FN及び５％HA＋１％FNが存在すると、深い又は表面の細
孔の表面に繊維状構造の形成が認められる。ただし、こ
れは５％HAの存在で最小になる。
深い細孔又はチャンネルは相互連絡して、迷路状構造
を形成する。即ち、すべてのチャンネルが相互連絡して
いるわけではなく、またすべてのチャンネルが外部への
開口を有しているわけでもない。
を形成する。即ち、すべてのチャンネルが相互連絡して
いるわけではなく、またすべてのチャンネルが外部への
開口を有しているわけでもない。
いずれの場合も、プラスチックに埋め込んだ海綿体部
分は約20〜200μｍの範囲にある細孔をもつ多孔性構造
を呈していた。HA及びFNの両者がコラーゲンに対して１
％の時に、常にチャンネル構造が認められた。後者のに
おいては、相互チャンネルの連絡が大きい場合に、『開
放』チャンネルがしばしば認められた。
分は約20〜200μｍの範囲にある細孔をもつ多孔性構造
を呈していた。HA及びFNの両者がコラーゲンに対して１
％の時に、常にチャンネル構造が認められた。後者のに
おいては、相互チャンネルの連絡が大きい場合に、『開
放』チャンネルがしばしば認められた。
単純な細胞培養モデルだけではなく、より複雑なヒト
の皮膚潰瘍における線維芽細胞及び表皮細胞とコラーゲ
ン海綿体との相互作用について、以下に説明する。
の皮膚潰瘍における線維芽細胞及び表皮細胞とコラーゲ
ン海綿体との相互作用について、以下に説明する。
プラスチック上で成長させた線維芽細胞は平坦な形状
を呈し、若干の細胞外間質（ECM）を合成する（表１を
参照）。対照的に、コラーゲン海綿体上で成長させた細
胞は伸長細胞の幾つかの全面成長層を形成し、多量のEC
Mを沈着する。ところが、９日では、線維芽細胞が約25
％のコラーゲン海綿体に浸潤するに過ぎない。５％（W/
W）ヒアルロン酸を含有するコラーゲン海綿体上に成長
させた線維芽細胞はコラーゲン海綿体全体に、海綿体の
コラーゲン繊維が形成した細孔に主に存在する。１％
（W/W）フィブロネクチンを含有するコラーゲン海綿体
上に成長させた線維芽細胞はコラーゲン繊維に沿って付
着かつ伸長し、海綿体全体に浸潤することが認められて
いる。ヒアルロン酸又はフィブロネクチンが存在する
と、コラーゲン海綿体の表面に全面成長細胞の幾つかの
表面層が見られる。
を呈し、若干の細胞外間質（ECM）を合成する（表１を
参照）。対照的に、コラーゲン海綿体上で成長させた細
胞は伸長細胞の幾つかの全面成長層を形成し、多量のEC
Mを沈着する。ところが、９日では、線維芽細胞が約25
％のコラーゲン海綿体に浸潤するに過ぎない。５％（W/
W）ヒアルロン酸を含有するコラーゲン海綿体上に成長
させた線維芽細胞はコラーゲン海綿体全体に、海綿体の
コラーゲン繊維が形成した細孔に主に存在する。１％
（W/W）フィブロネクチンを含有するコラーゲン海綿体
上に成長させた線維芽細胞はコラーゲン繊維に沿って付
着かつ伸長し、海綿体全体に浸潤することが認められて
いる。ヒアルロン酸又はフィブロネクチンが存在する
と、コラーゲン海綿体の表面に全面成長細胞の幾つかの
表面層が見られる。
３日間の細胞培養でプラスチック上に成長させた線維
芽細胞には、タイプＩコラーゲン海綿体上で成長させた
細胞に配合したよりも約５倍以上の［14C］プロリンを
配合した（コラーゲン合成）。コラーゲンマトリックス
の存在が線維芽細胞によりコラーゲン合成を阻害するこ
とを示唆している。細胞培養３日後に線維芽細胞に
［3H］チミジンを配合した場合（細胞の複製）、プラス
チック及びコラーゲン海綿体上で成長させた細胞につい
ては結果は同様であった。ところが、５％HA又は１％FN
を加えると、［3H］チミジン配合が増加した。９日まで
は、幾分低下したけれども、これらの傾向は依然として
存在していた（表２参照）。すべての基質上に成長させ
た線維芽細胞はタイプＩプロコラーゲン、タイプＩコラ
ーゲン及び［14C］プロリン配合及びフルオログラフィ
ーに基づく幾つかの中間体を合成した。この結果は、多
孔性タイプＩコラーゲン基質と線維芽細胞との相互作用
がコラーゲン生産を抑制することを示唆している。0.1
％〜0.5％という少量のHA又はFNを加えると、細胞複製
及びコラーゲン合成を増進できる。加える量を10％とい
う多量にしても、所望の効果は得られないと思われる。
芽細胞には、タイプＩコラーゲン海綿体上で成長させた
細胞に配合したよりも約５倍以上の［14C］プロリンを
配合した（コラーゲン合成）。コラーゲンマトリックス
の存在が線維芽細胞によりコラーゲン合成を阻害するこ
とを示唆している。細胞培養３日後に線維芽細胞に
［3H］チミジンを配合した場合（細胞の複製）、プラス
チック及びコラーゲン海綿体上で成長させた細胞につい
ては結果は同様であった。ところが、５％HA又は１％FN
を加えると、［3H］チミジン配合が増加した。９日まで
は、幾分低下したけれども、これらの傾向は依然として
存在していた（表２参照）。すべての基質上に成長させ
た線維芽細胞はタイプＩプロコラーゲン、タイプＩコラ
ーゲン及び［14C］プロリン配合及びフルオログラフィ
ーに基づく幾つかの中間体を合成した。この結果は、多
孔性タイプＩコラーゲン基質と線維芽細胞との相互作用
がコラーゲン生産を抑制することを示唆している。0.1
％〜0.5％という少量のHA又はFNを加えると、細胞複製
及びコラーゲン合成を増進できる。加える量を10％とい
う多量にしても、所望の効果は得られないと思われる。
タイプＩコラーゲン海綿体上に成長させた表皮細胞に
関するコラーゲン合成及び細胞複製について評価をした
（表４参照）。表皮細胞は、プラスチックよりも海綿体
上に成長させた時の方が、重層細胞層数を多くした。コ
ラーゲン海綿体が存在すると、一部の培養物はコラーゲ
ン海綿体と基底細胞層との間に基底膜状の構造が存在す
る徴候を示した。さらに、コラーゲン海綿体の内部で
は、表皮細胞は原子的な腺に似た複合体を形成してい
た。しかし、表４の結果が示すように、コラーゲン海綿
体は［14C］標識化プロリンのコラーゲンへの配合を阻
害しなかった。これら結果は、タイプＩコラーゲン海綿
体が表皮細胞によって基底膜沈着（タイプIVコラーゲン
及びラミニン）を増進することを示唆している。
関するコラーゲン合成及び細胞複製について評価をした
（表４参照）。表皮細胞は、プラスチックよりも海綿体
上に成長させた時の方が、重層細胞層数を多くした。コ
ラーゲン海綿体が存在すると、一部の培養物はコラーゲ
ン海綿体と基底細胞層との間に基底膜状の構造が存在す
る徴候を示した。さらに、コラーゲン海綿体の内部で
は、表皮細胞は原子的な腺に似た複合体を形成してい
た。しかし、表４の結果が示すように、コラーゲン海綿
体は［14C］標識化プロリンのコラーゲンへの配合を阻
害しなかった。これら結果は、タイプＩコラーゲン海綿
体が表皮細胞によって基底膜沈着（タイプIVコラーゲン
及びラミニン）を増進することを示唆している。
細胞培養実験の結果は、タイプＩコラーゲンマトリッ
クス上に成長させた場合、線維芽細胞及び表皮細胞の両
者がコラーゲンを複製かつ合成することを示唆してい
る。コラーゲンマトリックスは線維芽細胞によりコラー
ゲン合成を阻害するが、線維芽細胞及び表皮細胞の両者
に対する生体適合性が高いと思われる。このコラーゲン
マトリックスの生体適合性及びコラーゲン誘導ペプチド
類の走化性は、コラーゲンマトリックスが褥瘡などの慢
性創傷の治癒の増進に有効である可能性を示唆してい
る。表３及び表４を参照。
クス上に成長させた場合、線維芽細胞及び表皮細胞の両
者がコラーゲンを複製かつ合成することを示唆してい
る。コラーゲンマトリックスは線維芽細胞によりコラー
ゲン合成を阻害するが、線維芽細胞及び表皮細胞の両者
に対する生体適合性が高いと思われる。このコラーゲン
マトリックスの生体適合性及びコラーゲン誘導ペプチド
類の走化性は、コラーゲンマトリックスが褥瘡などの慢
性創傷の治癒の増進に有効である可能性を示唆してい
る。表３及び表４を参照。
なお、これら試験管試験の結果は、褥瘡などの皮下ま
で達する創傷の治療にコラーゲン海綿体を使用した結果
を十分に予見できる程決定的なものではなかった。
で達する創傷の治療にコラーゲン海綿体を使用した結果
を十分に予見できる程決定的なものではなかった。
生体内治療 毎日創傷を洗浄すること、及びガーゼによる包帯を含
む標準的な治療処方に従って治療した患者の場合、６週
間にわたって創傷面積は小さくならなかった。多くの症
例において、３月かそれ以上創傷面積は変らなかった。
これら患者の治療処方を変更して、タイプＩコラーゲン
フレークで毎日創傷を填塞するようにした場合、創傷面
積は３週間で平均20％、６週間で平均40％小さくなっ
た。コラーゲン治療の３週間後、血液の色から判断して
創傷への血液供給量が増加し、そして６週間までにかな
りの表皮移動が認められる。
む標準的な治療処方に従って治療した患者の場合、６週
間にわたって創傷面積は小さくならなかった。多くの症
例において、３月かそれ以上創傷面積は変らなかった。
これら患者の治療処方を変更して、タイプＩコラーゲン
フレークで毎日創傷を填塞するようにした場合、創傷面
積は３週間で平均20％、６週間で平均40％小さくなっ
た。コラーゲン治療の３週間後、血液の色から判断して
創傷への血液供給量が増加し、そして６週間までにかな
りの表皮移動が認められる。
これら結果は、蓐瘡（第２段階及び第３段階）の治癒
速度はタイプＩコラーゲンフレークを用いた毎日の治療
によって増進することを示す。この増進機構には、皮膚
細胞及び炎症細胞の創傷域への吸収が含まれているよう
に思われる。
速度はタイプＩコラーゲンフレークを用いた毎日の治療
によって増進することを示す。この増進機構には、皮膚
細胞及び炎症細胞の創傷域への吸収が含まれているよう
に思われる。
第４段階の潰瘍の治療も同様な方法で行う。この潰瘍
の場合、第３段階及び第２段階、次に第１段階へと順次
に治癒していくことが認められた。治療期間は創傷の重
症度に応じて長くなる。
の場合、第３段階及び第２段階、次に第１段階へと順次
に治癒していくことが認められた。治療期間は創傷の重
症度に応じて長くなる。
一般に、第１段階における創傷の場合を除いて、閉塞
的包帯は行わない。
的包帯は行わない。
コラーゲン海綿体を用いた治療では、約半分の患者が
若干の良化を示したが、残りの患者は良化を示さなかっ
た。コラーゲンフレークを用いた治療では、すべての患
者が良化を示した。
若干の良化を示したが、残りの患者は良化を示さなかっ
た。コラーゲンフレークを用いた治療では、すべての患
者が良化を示した。
ここで、添付図面についてすこし詳しく説明する。
第１図：走査電子顕微鏡写真で、相互に連絡した網状構
造のコラーゲンフレーク、即ち明瞭なパターンをもたず
にランダムに組織化されているフレークを示している。
長さ、径及び構造が異なるチャンネルがフレーク中を走
っている。チャンネルは相互連絡し、そしてこれより少
ない割合のバンドは相互連絡していない。フレークは長
さ及び幅が一定せず、一般に約0.5〜1.5mmで、その厚さ
は時には約1mmである。フレーク中の細孔径範囲は約５
μｍ〜約10μｍで、チャンネルのそれは約100μｍ〜約1
000μｍである。バー:100μｍ。
造のコラーゲンフレーク、即ち明瞭なパターンをもたず
にランダムに組織化されているフレークを示している。
長さ、径及び構造が異なるチャンネルがフレーク中を走
っている。チャンネルは相互連絡し、そしてこれより少
ない割合のバンドは相互連絡していない。フレークは長
さ及び幅が一定せず、一般に約0.5〜1.5mmで、その厚さ
は時には約1mmである。フレーク中の細孔径範囲は約５
μｍ〜約10μｍで、チャンネルのそれは約100μｍ〜約1
000μｍである。バー:100μｍ。
第２図：走査電子顕微鏡写真で、相互に連絡した網状部
材のコラーゲンフレーク、即ち明瞭なパターンをもたず
にランダムに組織化されているフレークを示している。
長さ、径及び構造が異なるチャンネルがフレーク中を走
っている。チャンネルは相互連絡し、そしてこれより少
ない割合のバンドは相互連絡していない。フレークは長
さ及び幅が一定せず、一般に約0.5〜1.5mmで、その厚さ
は時には約1mmである。フレーク中の細孔径範囲は約５
μｍ〜約10μｍで、チャンネルのそれは約100μｍ〜約1
000μｍである。バー:1000μｍ。
材のコラーゲンフレーク、即ち明瞭なパターンをもたず
にランダムに組織化されているフレークを示している。
長さ、径及び構造が異なるチャンネルがフレーク中を走
っている。チャンネルは相互連絡し、そしてこれより少
ない割合のバンドは相互連絡していない。フレークは長
さ及び幅が一定せず、一般に約0.5〜1.5mmで、その厚さ
は時には約1mmである。フレーク中の細孔径範囲は約５
μｍ〜約10μｍで、チャンネルのそれは約100μｍ〜約1
000μｍである。バー:1000μｍ。
第３図：走査電子顕微鏡写真で、本発明で使用した海綿
体を示している。繊維中の細孔及び繊維間のチャンネル
が明らかに見て取れる。バー:100μｍ。
体を示している。繊維中の細孔及び繊維間のチャンネル
が明らかに見て取れる。バー:100μｍ。
第４図および第５図：走査電子顕微鏡写真で、多孔性コ
ラーゲンの粉末を示している。コラーゲン体は多孔性
で、細孔は僅か数ミクロンで、チャンネルは実質的に見
られない。構造の物理的統合性は大きく損なわれてい
る。バーはそれぞれ100μｍ及び1000μｍである。
ラーゲンの粉末を示している。コラーゲン体は多孔性
で、細孔は僅か数ミクロンで、チャンネルは実質的に見
られない。構造の物理的統合性は大きく損なわれてい
る。バーはそれぞれ100μｍ及び1000μｍである。
実験例１ 牛皮コラーゲンを精製するための全体的な処方 不溶性コラーゲンを次のようにして牛皮から抽出し
た。
た。
１の凍結生牛皮を室温で解凍し、18容積の処理槽
にいれた。処理槽には水用及び空気用配管を取り付けて
あった。
にいれた。処理槽には水用及び空気用配管を取り付けて
あった。
処理混合物の全容積が14になるまで、蒸留水を加え
た。6psiの圧力を空気を５分間処理槽に導入して、混合
物を均質化した。次に、この混合物を20分間沈降させ
た。沈降の終了後、液相を取り出し、全容積が14にな
るまで新たな蒸留水を加えた。この操作を３回繰り返し
た。
た。6psiの圧力を空気を５分間処理槽に導入して、混合
物を均質化した。次に、この混合物を20分間沈降させ
た。沈降の終了後、液相を取り出し、全容積が14にな
るまで新たな蒸留水を加えた。この操作を３回繰り返し
た。
固体相に８の99.8％イソプロパノールを加え、混合
物を空気混合し、処理槽を12時間ジャイロトリーシェー
カーにセットした。
物を空気混合し、処理槽を12時間ジャイロトリーシェー
カーにセットした。
液相を取り出し、８の99.8％イソプロパノールを固
体相と混合した。次に、混合物をさらに12時間シェーカ
ーにセットした。
体相と混合した。次に、混合物をさらに12時間シェーカ
ーにセットした。
液相を取り出した後、これを２の蒸留水で洗浄し、
プラスチックトレーに注いでから、フリーザーに入れ、
凍結固化させた。次に、棚を０℃に維持した凍結乾燥器
の低温トラップにこの凍結固化体を置いた。次に、10ミ
クロンの真空を48〜96時間作用させた。真空を解除し、
内容物を取り出した。
プラスチックトレーに注いでから、フリーザーに入れ、
凍結固化させた。次に、棚を０℃に維持した凍結乾燥器
の低温トラップにこの凍結固化体を置いた。次に、10ミ
クロンの真空を48〜96時間作用させた。真空を解除し、
内容物を取り出した。
ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法やアミノ酸分析などの標準的な方法によって、
このオラーゲンは非コラーゲン質蛋白質を含まない、代
表的なタイプＩコラーゲンとして同定された。
気泳動法やアミノ酸分析などの標準的な方法によって、
このオラーゲンは非コラーゲン質蛋白質を含まない、代
表的なタイプＩコラーゲンとして同定された。
実験例２ 本発明のコラーゲンフレーク体を次のようにして調製
する。
する。
コラーゲン分散液を次の方法で調製する。室温でpH3.
0になるまで、120mlの蒸留水にHClの1N溶液を徐々に添
加する。次に、ビーカーの中身を200mlの目盛り付きシ
リンダに空ける。
0になるまで、120mlの蒸留水にHClの1N溶液を徐々に添
加する。次に、ビーカーの中身を200mlの目盛り付きシ
リンダに空ける。
ニージャージー州、サマーヴィルのDevro社から入手
した（実験例１による）、精製した不溶性コラーゲンを
120mlのHClと共にpH3.0でウォリングブレンダーに加え
る。１％のW/V分散液を高速（5,000rpm）で３分間ブレ
ンドする。
した（実験例１による）、精製した不溶性コラーゲンを
120mlのHClと共にpH3.0でウォリングブレンダーに加え
る。１％のW/V分散液を高速（5,000rpm）で３分間ブレ
ンドする。
分散液をサイドアームフラスコ（600ml）に空ける。
気泡がなくなるまで、室温で100ミクロンの真空を分散
液に作用させる。この方法には、15分間までの時間が必
要なことがある。10″×20″×２″トレーに１％V/Wコ
ラーゲン分散液を注ぎ、凍結乾燥する。
気泡がなくなるまで、室温で100ミクロンの真空を分散
液に作用させる。この方法には、15分間までの時間が必
要なことがある。10″×20″×２″トレーに１％V/Wコ
ラーゲン分散液を注ぎ、凍結乾燥する。
72時間真空中で−110℃に加熱してから、シアナミド
の10％溶液の水蒸気を作用させることによって、凍結乾
燥コラーゲン海綿体の３″×３″×1/4″薄片を架橋す
る。
の10％溶液の水蒸気を作用させることによって、凍結乾
燥コラーゲン海綿体の３″×３″×1/4″薄片を架橋す
る。
架橋凍結乾燥コラーゲン海綿体をウォリングブレンダ
ーに入れ、低速（3,000rpm）で５分間ブレンドする。コ
ラーゲンのフレークが生成する。
ーに入れ、低速（3,000rpm）で５分間ブレンドする。コ
ラーゲンのフレークが生成する。
これらコラーゲンフレークは厚さが約1mmで、長さ及
び幅が1mm〜1cmである。細孔径は100〜10,000μｍの範
囲にある。
び幅が1mm〜1cmである。細孔径は100〜10,000μｍの範
囲にある。
1gのコラーゲンフレークをプラスチックバックに入
れ、2.5Mradのガンマ線を作用させて滅菌する。
れ、2.5Mradのガンマ線を作用させて滅菌する。
これで、皮膚のただれや表皮の喪失を呈する褥瘡にか
かっている患者を治療する準備ができる。
かっている患者を治療する準備ができる。
実験例３ 毎日創傷を洗浄すること、及びガーゼによる包帯を含
む通常の治療処方によって、褥瘡として知られている圧
力性潰瘍にかかっている患者を治療した。６週間のあい
だ創傷面積の減少は認められない。
む通常の治療処方によって、褥瘡として知られている圧
力性潰瘍にかかっている患者を治療した。６週間のあい
だ創傷面積の減少は認められない。
多くの症例において、３月かそれ以上創傷面積には変
化はなかった。
化はなかった。
そこで、患者の治療処方を次のように変更した。看護
婦が創傷を填塞し、そして（プラスチックバックから取
り出した）コラーゲンフレークが創傷とほぼ同じレヴェ
ルになるまで、このコラーゲンフレークで周囲の皮膚の
縁を覆う。次に、コラーゲンフレークで填塞した創傷を
ガーゼで包帯する。１日後、コラーゲンフレークの填塞
体を取り外し、創傷を塩化ナトリウム水溶液で洗浄す
る。すべてのコラーゲンフレーク体を取り外したわけで
はないが、細胞の内方成長が創傷、特に底部に残る徴候
が認められる。創傷は新たなコラーゲンフレークに再び
填塞する。
婦が創傷を填塞し、そして（プラスチックバックから取
り出した）コラーゲンフレークが創傷とほぼ同じレヴェ
ルになるまで、このコラーゲンフレークで周囲の皮膚の
縁を覆う。次に、コラーゲンフレークで填塞した創傷を
ガーゼで包帯する。１日後、コラーゲンフレークの填塞
体を取り外し、創傷を塩化ナトリウム水溶液で洗浄す
る。すべてのコラーゲンフレーク体を取り外したわけで
はないが、細胞の内方成長が創傷、特に底部に残る徴候
が認められる。創傷は新たなコラーゲンフレークに再び
填塞する。
この処方を６〜12週間毎日繰り返す。創傷の底部の毛
管が非常に淡いクリーム色から徐々に淡いピンク及び赤
みを帯びた色に変色し、脈管構造の発現及び若干の血液
循環を示すことが徐々に認められる。
管が非常に淡いクリーム色から徐々に淡いピンク及び赤
みを帯びた色に変色し、脈管構造の発現及び若干の血液
循環を示すことが徐々に認められる。
なお、褥瘡の典型である、創傷縁部付近の皮膚弁が徐
々に付着し始め、新しい組織が形成し、これが創傷の周
囲縁部に結合して、徐々に創傷を閉鎖することも認めら
れる。
々に付着し始め、新しい組織が形成し、これが創傷の周
囲縁部に結合して、徐々に創傷を閉鎖することも認めら
れる。
淡いピンク色の組織がその徴候である新しい組織の成
長は創傷の周囲にも認められる。
長は創傷の周囲にも認められる。
患者の創傷の重症度に応じて、底部及び側部から徐々
に始まり、創傷の傷腔に侵入する組織の新たな内方成長
によって創傷が徐々に閉じていく。治療の最後では、こ
の新しい組織が創傷をほぼ充填する。
に始まり、創傷の傷腔に侵入する組織の新たな内方成長
によって創傷が徐々に閉じていく。治療の最後では、こ
の新しい組織が創傷をほぼ充填する。
これで、自己移植などによって移植組織が用意でき
る。必要な時には、皮膚成長因子を加える。
る。必要な時には、皮膚成長因子を加える。
創傷の填塞には、フレーク体の幾つかの填塞体を使用
できる。各填塞体には、異なる量のフレーク体を配合で
きる。
できる。各填塞体には、異なる量のフレーク体を配合で
きる。
第1A図、第1B図及び第1C図は、本発明のコラーゲンフ
レーク体で治療した結果、重度の褥瘡が徐々に閉塞する
状態を示す写真である。1.5月後に撮影した写真Ｃで
は、新しく成長した組織の色が淡いピンク色になり、血
液循環が増進し、毛管が形成した徴候が認められる。
レーク体で治療した結果、重度の褥瘡が徐々に閉塞する
状態を示す写真である。1.5月後に撮影した写真Ｃで
は、新しく成長した組織の色が淡いピンク色になり、血
液循環が増進し、毛管が形成した徴候が認められる。
フレーク体は浮腫による液状物を吸収するだけでな
く、創傷中の細菌も吸収する。
く、創傷中の細菌も吸収する。
フレーク体はコラーゲン海綿体と共に使用できる。創
傷をまづ（特に手の届き難い部分において）フレークで
填塞してから、その上に海綿体を設け、この後閉塞性包
帯治療を行う。
傷をまづ（特に手の届き難い部分において）フレークで
填塞してから、その上に海綿体を設け、この後閉塞性包
帯治療を行う。
本発明のフレーク体は肝臓外科などにおける内臓創傷
の治療にも有効である。一般に、コラーゲン体は凝塊や
（ADP放出を介する）血小板凝集を刺激する共に、白血
球をコラーゲン繊維構造に吸収すると考えられている。
細胞は細孔を通って移動し、充填されると、細胞それ自
体がコラーゲン繊維に付着する。それから、細胞外間質
（結合組織）が形成する。この細胞外間質が徐々に崩壊
して、内皮細胞が伸長して、新しい毛管を形成する。こ
のようにして、新しい組織が再構成する。各種の因子に
応じて、開放傷も７〜14日間で徐々に閉塞でき、従っ
て、新たな移植が生じる。
の治療にも有効である。一般に、コラーゲン体は凝塊や
（ADP放出を介する）血小板凝集を刺激する共に、白血
球をコラーゲン繊維構造に吸収すると考えられている。
細胞は細孔を通って移動し、充填されると、細胞それ自
体がコラーゲン繊維に付着する。それから、細胞外間質
（結合組織）が形成する。この細胞外間質が徐々に崩壊
して、内皮細胞が伸長して、新しい毛管を形成する。こ
のようにして、新しい組織が再構成する。各種の因子に
応じて、開放傷も７〜14日間で徐々に閉塞でき、従っ
て、新たな移植が生じる。
実験例４ 水蒸気バリヤーをもつコラーゲン海綿体は次のように
して調製する。
して調製する。
120mlの希HCl溶液、pH3.0に不溶性コラーゲン（1.2
g）を加え、混合物を2,000rpmの速度で１分間ウォリン
グブレンダーで分散する。次に、分散液を真空フラスコ
に注入し、10mtorr未満の真空で10分間脱気する。次
に、脱気コラーゲン分散液を０℃に冷却し、−30℃で凍
結し、10mtorr未満の真空で凍結乾燥する。スパチュラ
を使用して、シラスチック医薬級（Silastic Medical G
rade）接着剤をコラーゲン海綿体の表面に塗布する。22
℃で２時間100mtorrの真空を作用することによってシラ
スチック拡散制御層を硬化する。得られた拡散制御層及
び海綿体層の複合体を海綿体側を下にして創傷に整え
る。
g）を加え、混合物を2,000rpmの速度で１分間ウォリン
グブレンダーで分散する。次に、分散液を真空フラスコ
に注入し、10mtorr未満の真空で10分間脱気する。次
に、脱気コラーゲン分散液を０℃に冷却し、−30℃で凍
結し、10mtorr未満の真空で凍結乾燥する。スパチュラ
を使用して、シラスチック医薬級（Silastic Medical G
rade）接着剤をコラーゲン海綿体の表面に塗布する。22
℃で２時間100mtorrの真空を作用することによってシラ
スチック拡散制御層を硬化する。得られた拡散制御層及
び海綿体層の複合体を海綿体側を下にして創傷に整え
る。
創傷の治療は上記のようにして行う。本発明を当業者
を対象にして説明したきたが、本発明の精神から逸脱せ
ずに容易に変更・改変を実施できる。
を対象にして説明したきたが、本発明の精神から逸脱せ
ずに容易に変更・改変を実施できる。
以下に、本発明に関連する技術情報を列記する。
本発明に関連する技術文献 米国特許 米国特許第3,098,693号−シーナン （SHEENAN） 米国特許第3,800,792号−マクナイト （MCKNIGHT） 米国特許第3,903,882号−オーグルト （AUGURT） 米国特許第3,955,012号−オカヌラ （OKANURA） 米国特許第4,060,081号−ヤナス （YANNAS） 米国特許第4,280,954号−ヤナス （YANNAS） 米国特許第4,350,629号−ヤナス （YANNAS） 米国特許第4,352,883号−リム （LIM） 米国特許第3,363,758号−マスホ （MASUHO） 米国特許第4,374,121号−シオカ （CIOCA） 米国特許第4,399,123号−オリバー （OLIVER） 米国特許第4,409,322号−ジェフェリーズ（JEFFERIES） 米国特許第4,412,947号−シオカ （CIOCA・） 米国特許第4,418,691号−ヤナス （YANNAS） 米国特許第4,458,678号−ヤナス （YANNAS） 西ドイツ特許 西ドイツ特許第2734503号−フロイデン バーグ （FREUDEN BERG） 文献 （１）アルバート エル．ラスキン 医学博士（ALBERT
L.RUSIN,M.D.,），クルト エイチ．ステンツェル 医
学博士（KURT H.STENZEL,M.D,），テルオ ミヤタ 博
士（TERUO MIYATA,ph.D.,），マリー ジョー ホワイ
ト 科学博士（MARY JO WHITE,B.S.,），マイケル ド
ゥン 医学博士（MICHAEL DUNN,M.D.），ニューヨー
ク，エヌ．ワイ（New York N.Y.） 「薬剤デリバリー媒体としてのコラーゲン」（Collagen
as a Vehicle for Drug Delivery） ザ ジャーナル オブ クリニカル ファーマコロジー
（The Journal of Clinical Phamacology）（1937年8/9
月号） （２）ドロイン，シー．ジェイ．（Doillon,C.J.,），
ドゥン，エム．ジー．（Dunn,M.G.,），バーグ，アー
ル．エー．（Berg,R.A.），シルバー，エフ．エイチ．
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n During Wound Repair） スキャニング エレクトロン マイクロスコピー（Scan
ning Electron Microscopy）1985年/11:897−903 1985
年６月24日 （３）ドイロン，シー．ジェイ（Doillon,C.J.），シル
バー，エフ．エイチ．（SILVER,F.H.）（1986年） 「コラーゲンを主成分とした軟膏：ヒアルロン酸及びフ
ィブロネクチンの効果」（Collagen−based Dressing:E
ffects of Hyaluronic Acid and Fibronectin） バイオマテリアルズ ７（Biomaterials 7）:3:7 （４）ドロイン，シー．ジェイ．（Doillon,C.J.），シ
ルバー，エフ．エイチ．（Silver,F.H.），バーグ，ア
ール．エー．（Berg,R.A.）（1987年５月） 「ヒアルロン酸及びフィブロネクチンを含有する多孔性
コラーゲン 海綿体における線維芽細胞成長」（Fibrob
last Growth on a Porous Collagen Sponge Containing
Hyaluronic Acid and Fibronectin） バイオマテリアルズ ８（Biomaterials 8）195−200 （５）ドイロン，シー．ジェイ．（Doillon,C.J.,），
フェイン，シー．エフ．（Whyne,C.F.,），ブランドウ
ィーン，エス．（Brandwein,S.），シルバー エフ．エ
イチ．（Silver,F.H.）（1986年） 「コラーゲンを主成分とした創傷軟膏：孔構造及び形態
のコントロール」（Collagen−based Wound Dressings:
Control of the Pore Structure and Morphology） ジャーナル オブ バイオナディカル マテリアルズ
リサーチ 20（J.Biomed.Mat.Res.20）:1219−1228 （６）ドイロン，シー．ジェイ（Doillon,C.J.,），ヴ
ァッサーマン，エイ．ジェイ．（Wasserman,A.J.,），
バーグ，アール．エー．（Berg,R.A.），シルバー，エ
フ．エイチ．（Silver.F.H.）（1986年） 「コラーゲンを主成分とした物質上に培養された表皮組
繊」（Epidermal Cells Cultured on a Collagen−base
d material） エレクトロン マイクロスコピック ソサエィー オブ
アメリカ（Electron Microscopic Society of Americ
a,），サンフランシスコ プレス インコーポレーテッ
ド，（San Francisco Press,Inc.）サンフランシスコ，
カリフォルニフォルニア州,212−213 （７）エフ．エイチ．シルバー，（F.H.Silver,），ア
イ．ヴィー．ヤナス（I.V.Yannas,），イー．ダヴリュ
ー．ザルツマン（E.W.Salzman,） 「グリコサミノグリカン−沈降性コラーゲンの血液適合
性」（In Vitro Blood Compatibility of Glycosaminog
lycan−Precipitated Collagens） ジヤーナル オブ バイオメディカル マテリアルズ
リサーチ（Journal of Biomedical Materials Reserarc
h） （８）フレデリック エイチ．シルバー（Frederick H.
Silver,）イオアニス ヴィー．ヤナス（Ioannis V.Yan
nas,），エドウィン ダヴリュー．ザルツマン（Edwin
W.Salzan,） 「コラーゲン誘導血小板集合体のグリコサミノグリカン
の抑制」（Glycosaminoglycan Inhibition of Collagen
Induced Platelet Aggregation） トロンボシス リサーチ（Thrombosis Research）13巻
２号267−277ページ （９）ジェームズ エム．ペイチヤンス（JAMES M.PACH
ENCE），リチャード エー．バーグ（RICHARD A.BER
G），フレデリック エイチ．シルバー（FREDERICK H.S
ILVRE）， 「コラーゲン：医薬器械産業におけるその役割」（“Co
llagen:Its Place in the Medical Device Industry"） ザ バイオマテリアル センター（The Biomaterials C
enter）エムディーアンドディーエル（MD ＆ DL）1987
年11月 （10）ケビン ウィードック（KEVIN WEADOCK），ロバ
ート エム．オルソン（ROBERT M.OLSON），フレデリッ
ク エイチ．シルバー（FREDERICK H.SILVER）， 「コラーゲン架橋技術の評価」（Evaluation of Collag
en Cross−linking Techniques） バイオマット．メド．デブ．アート．オーグ．（Bioma
t.Med.Dev.Art.Org.,）11（４）,293−318（1983−84
年） （11）ロバート エー．フラー（ROBERT A.FULLER），
ジョナサン ジェイ．ローゼン（JONATHAN J.ROSEN）， 「薬剤用材料」（Materials for Medicine）1986年10
月， サイエンティフック アメリカン（Scientific America
n） （12）「人体に試用される合成皮膚」（Synthetic Skin
Ready To Try On Humans） ケミカル アンド エンジニアリング ニューズ（Chem
ical ＆ Engineering News）1965年10月４日 （13）アレキザンダー，エス．エー．（Alexander,S.
A.），ドノフ，アール．ビー．（Donoff,R.B.）， 「開いた傷におけるグルコサミノグリカン」（The glyc
osaminoglycans of open wounds） ジェー．スルジ．リス.29（J.Surg.Res.29）:422−429 （14）アズィツカーン，アール．ジー．（AZIZKHAN,R.
G.），アズィツカーン，ジェー．シー．（AZIZKHAN,J.
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シー．ジェー．（DOILLON,C.J.），ハーン，アール．エ
ー．（HAHN,R.N.），バーグ，ディー．イー．（BIRK,D.
E.），バーク，アール．エー．（BERG.R.A.），シルバ
ー，エフ．エイチ．（SILVER,F.H.）（1985年） イントル．ジェイ．バイオロジカル マクロモルキュル
ズ（Intl.J.Biological Macromolecules）7,135−140 （16）デビットソン，ジェー．エム（DAVIDSON,J.
M.），クラグスブルン，エム．（KLAGSBRUN,M.），ヒ
ル，ケー．イー．（HILL,K.E.），バークレイ，エー．
（BUCKLEY,A.），サリバン，アール．（SULLIVAN,
R.），ブリューワー，ピー．エス（BREWER,P.S.），ウ
ッドワァード，エス．シー．（WOODWARD,S.C.）（1985
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0）:1219−1227 （17）ドイロン，シー．ジェー．（DOILLON,C.J.），フ
ェイン，シー．エフ．（WHYNE,C.F.），バーグ，アー
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化なしに、孵化前のニワトリの腱から培養された線維芽
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を増進する」（Ascorbate increases the synthsis of
procollagen hydroxyproline by cultured fibroblasts
from chick embryo tendons without activation of p
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W.Y.），バーグ，アール．エー．（BERG,R.A.）、プロ
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K.），クレーベ アール．ジェイ．（KLEBE R.J.）マー
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raction of Bovine Epithelial Lans（BEL）Cells with
Extracellular Matrix（ECM） and Eye−derived Grow
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T.），ヘイ，イー．ディー．（HAY,E.D.）フジワード，
ケー．（FUJIWARD,K.） 「コラーゲンは，胚子の角膜と線維腫線維芽細胞の細胞
の形状と細胞骨格を調整する：アクチニ，−アクチニン
とミオシンの分布」（Collagen modulates,cell shape
and cytoskeleton of embryonic corneal and fibroma
fibroblasts:Distribution of actin,−Actinin and my
osin.） デブ．バイオル.92（Dev.Biol.92）107−122
L.RUSIN,M.D.,），クルト エイチ．ステンツェル 医
学博士（KURT H.STENZEL,M.D,），テルオ ミヤタ 博
士（TERUO MIYATA,ph.D.,），マリー ジョー ホワイ
ト 科学博士（MARY JO WHITE,B.S.,），マイケル ド
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ク，エヌ．ワイ（New York N.Y.） 「薬剤デリバリー媒体としてのコラーゲン」（Collagen
as a Vehicle for Drug Delivery） ザ ジャーナル オブ クリニカル ファーマコロジー
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年６月24日 （３）ドイロン，シー．ジェイ（Doillon,C.J.），シル
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コラーゲン 海綿体における線維芽細胞成長」（Fibrob
last Growth on a Porous Collagen Sponge Containing
Hyaluronic Acid and Fibronectin） バイオマテリアルズ ８（Biomaterials 8）195−200 （５）ドイロン，シー．ジェイ．（Doillon,C.J.,），
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のコントロール」（Collagen−based Wound Dressings:
Control of the Pore Structure and Morphology） ジャーナル オブ バイオナディカル マテリアルズ
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の抑制」（Glycosaminoglycan Inhibition of Collagen
Induced Platelet Aggregation） トロンボシス リサーチ（Thrombosis Research）13巻
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procollagen hydroxyproline by cultured fibroblasts
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and cytoskeleton of embryonic corneal and fibroma
fibroblasts:Distribution of actin,−Actinin and my
osin.） デブ．バイオル.92（Dev.Biol.92）107−122
以下に添付する写真は、本願発明に係る繊維状タンパク
質であるコラーゲン繊維の繊維の形状（形態）を示すも
のである。 第１図は、本発明のフレーク体を示す写真（バー:100μ
ｍ）である。 第２図は、本発明のフレーク体を示す写真（バー:1000
μｍ）である。 第３図は、本発明の海綿体を示す写真（バー:100μｍ）
である。 第４図は、本発明の粉体を示す写真（バー:100μｍ）で
ある。 第５図は、本発明の粉体を示す写真（バー:100μｍ）で
ある。
質であるコラーゲン繊維の繊維の形状（形態）を示すも
のである。 第１図は、本発明のフレーク体を示す写真（バー:100μ
ｍ）である。 第２図は、本発明のフレーク体を示す写真（バー:1000
μｍ）である。 第３図は、本発明の海綿体を示す写真（バー:100μｍ）
である。 第４図は、本発明の粉体を示す写真（バー:100μｍ）で
ある。 第５図は、本発明の粉体を示す写真（バー:100μｍ）で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールズ ジェイ．ドイロン アメリカ合衆国 08817 ニュージャー ジー州 エディソン，ホライゾン ドラ イブ 420 (72)発明者 アーカディー チェルノモルスキー アメリカ合衆国 07208 ニュージャー ジー州 エリザベス ネワーク アベニ ュー 571 (72)発明者 ロバート エム．オルソン アメリカ合衆国 ニュージャージー州 プリンストン ウインザー ドライブ ９ (56)参考文献 特開 昭58−212447（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−246371（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502129（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61L 15/01 - 15/04 A61L 27/00
Claims (16)
- 【請求項１】コラーゲン繊維の集合体で、大きさ、長さ
及び厚さが均一ではないコラーゲンフレークから構成さ
れた多孔性のコラーゲンフレーク体であって、 該コラーゲンフレークにより画定され、コラーゲンフレ
ーク体の表面と内部とを連絡し、コラーゲンフレーク体
の全体にわたって迷路状の構造を形成するチャンネル
と、 該コラーゲンフレーク内に存在し、該チャンネルと連絡
する細孔と とからなる二重多孔性を有することを特徴とするコラー
ゲンフレーク体。 - 【請求項２】該コラーゲン繊維が、水平面内において全
体的に配向しているシート状構造を形成する請求項１に
記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項３】該フレークが相互に重なっている請求項２
に記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項４】寸法安定性であるが、該フレークが相互に
滑り移動できる請求項３に記載のコラーゲンフレーク
体。 - 【請求項５】該コラーゲン繊維の平均の長さが0.1〜3cm
の範囲である請求項２に記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項６】該繊維の平均の長さが約1cmである請求項
５に記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項７】細孔度が50〜90容量％の範囲にある請求項
２に記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項８】架橋されたコラーゲンである請求項１、
２、又は３のいずれかに記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項９】架橋していないコラーゲンである請求項
１、２、又は３のいずれかに記載のコラーゲンフレーク
体。 - 【請求項１０】自重の５〜40倍の液状物を吸収する請求
項３に記載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項１１】脱水した請求項３に記載のコラーゲンフ
レーク体。 - 【請求項１２】水分が15重量％を超えない請求項11に記
載のコラーゲンフレーク体。 - 【請求項１３】滅菌した請求項11に記載のコラーゲンフ
レーク体。 - 【請求項１４】プラスチック容器内に密封されている請
求項13に記載の滅菌されたコラーゲンフレーク体。 - 【請求項１５】請求項１に記載のコラーゲンフレーク体
に、さらに水蒸気拡散層を設けてなる、特に潰瘍用の創
傷包帯材料。 - 【請求項１６】コラーゲン多孔性海綿体状物質を剪断す
る間、コラーゲンの多孔性構造が破壊されないように該
コラーゲン多孔性海綿体状物質に加わる圧力を最小の圧
力にするようにして該コラーゲン多孔性海綿体状物質を
剪断することによってコラーゲンフレーク体にする工程
と、該コラーゲンフレーク体を分離する工程とを備える
請求項１に記載のコラーゲンフレーク体を製造する方
法。
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