DE3587730T2

DE3587730T2 - Kontrollsysteme für rekombinant-manipulationen.

Info

Publication number: DE3587730T2
Application number: DE85900939T
Authority: DE
Inventors: David Gelfand; Francis Lawyer; Susanne Stoffel
Original assignee: Cetus Oncology Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1984-02-08
Filing date: 1985-02-07
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2005-02-08
Also published as: DE3587730D1; JPS62500212A; JP2595205B2; EP0172194A1; EP0172194B1; WO1985003522A1; ATE100494T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Gesichtspunkte der DNA-Rekombinationstechnik, die sich mit der Bereitstellung von Expressions-Kontrollsystemen beschäftigen insbesondere betrifft die Erfindung eine geeignete Temperatur-empfindliche Kontrollkassette

Stand der Technik

Die Veränderung der genetischen Ausstattung einer Wirtszelle ist der modus operandus der gegenwärtigen Biotechnologie. Eine geeignete Modifikation kann bewirken, daß die Wirtszellen üblicherweise in größeren Mengen nicht erhältliche Proteinsequenzen, beispielsweise Fibroblasten- oder Leukocyten-Interferone, produzieren oder ihr Stoffwechsel kann verändert werden, wodurch sie dazu induziert werden, einige ungewöhnliche Funktionen, beispielsweise die Umwandlung von Stärke in einfachen Zucker, durchzuführen.
Zur Durchführung dieser neuen Proteinsynthesen muß erreicht werden, daß die Zellen 1) die gewünschte codierende Sequenz aufnehmen und 2) mit Wirts-verträglichen, funktionell mit den codierenden Sequenzen verbundenen Kontrollsequenzen ausgestattet sind. Es müssen Verfahren bereitgestellt werden, um einschätzen zu können, ob diese beiden Voraussetzungen erfüllt sind. Die vorliegende Erfindung liefert eine verbesserte Kontrollsequenzkassette, mit der dies überprüft werden kann.

Kontrollsequenzen

Der hier beschriebene, dominante Selektionsmarker war ein nützliches Hilfsmittel, um die sehr effiziente, Temperatur-empfindliche, erfindungsgemäße Kontrollkassette zu erhalten.
Die Kontrollsequenzen werden zweckmäßigerweise als übertragbare Kassetten bereitgestellt, die zwischen Plasmiden übertragbar sein sollten, damit sie bei Bedarf Proteincodierenden Sequenzen voranstehen. Solche übertragbaren Sequenzen sind im Stand der Technik bereits bekannt. Beispielsweise ist das trp-Promotor-/Operatorsystem, einschließlich seiner Ribosomenbindungsstelle und einigen Codons der Leadersequenz, genau beschrieben worden (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 4057).
Das Kontrollsystem muß jedoch neben seiner Eignung als übertragbares System auch noch durch externe Parameter regulierbar sein. Da bakterielle Wirte häufig zur Produktion nicht-endogener Proteine gewählt werden, kann sich eine vorzeitige Produktion dieser Proteine während der Wachstumsphase der Kultur nachteilig auf das gesunde Wachstum der Wirtszellen auswirken. Um ein gesundes Wachstum sowie eine gute quantitative Proteinproduktion zu erreichen, kann es erforderlich sein, die Expression des gewünschten Gens während der Wachstumsphase der Kultur zu unterdrücken und erst dann zuzulassen, wenn die Wachstumsphase im wesentlichen abgeschlossen ist.
Obwohl die gegenwärtig verfügbaren, übertragbaren Promotorsysteme derart reguliert werden können, ist eine so wirkende Kontrolle nicht perfekt. Der vorstehend beschriebene trp-Promotor wird beispielsweise durch die Gegenwart oder das Fehlen von Tryptophan im Medium reguliert. Der Promotor wird in Abwesenheit von Tryptophan angeschaltet, in Beiner Gegenwart jedoch reprimiert. Es ist mit einem solchen Promotor jedoch weder eine vollständige "an"- noch "aus"- Stellung erreichbar. In den meisten Bakterien liefert das eigene Repressorgen keine ausreichenden Repressormengen, um mit den wünschenswerten erhöhten Mengen von auf den Multicopy-Plasmiden innerhalb der Zelle vorhandenen Promotor/codierende Sequenz-Konstrukten vollständig zu interagieren. Da andererseits viele Proteine, deren Synthese erwünscht ist, selber Tryptophan enthalten, ist es bei ihrer Produktion nicht möglich, Tryptophan aus dem Medium vollständig zu entfernen. Selbst eine annähernde Kontrolle ist mühsam, da das Medium zur ausreichenden Änderung der Tryptophanmenge oft ausgetauscht werden muß.
Der PL-Promotor des Phagen λ unterliegt jedoch einer genauer einstellbaren und leichteren Kontrolle, da der an seine Operatorsequenz bindende Repressor Temperatur-empfindlich sein kann. Der PL-Operator wird bei niedriger Temperatur durch Repressorproteine, beispielsweise cI857, die durch geeignete Wirtszellmutanten synthetisiert werden, reprimiert. Bei erhöhten Temperaturen wird dieses Repressorprotein jedoch inaktiviert und der Promotor angeschaltet. Daher kann lediglich durch eine Erhöhung der Kulturtemperatur die Synthese der gewünschten Proteinsequenz angeschaltet werden. Der PL-Promotor bewirkt in seiner natürlichen Umgebung unter anderem die Synthese eines "N-Gen"- Proteins, dessen Translation durch eine NRBS-Ribosomenbindungsstelle kontrolliert wird. Im Phagen ist das N-Gen die erste codierende Sequenz der polycistronischen Information unter der Kontrolle des PL-Promotors. Der PL-Promotor allein und der PL-Promotor auf einer Sequenz mit der NRBS (die nicht funktionell verwendet wird) sind zuvor auch schon verwendet worden, um die Expression von Genen zu kontrollieren, die E. coli-Proteine oder fremde Proteine in bakteriellen Systemen codieren. Vgl. Shimatake et al., Nature 292 (1981), 128, Remaut, E. et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 4677, und Remaut, E. et al., Gene 22 (1983), 103. Dieses Kontrollsystem war jedoch nicht in ein leicht transprofilierbares Segment eingefügt, das problemlos von einem Expressionsvektor in einen anderen übertragen werden kann. Die beschriebene Lage der NRBS-Sequenz im Lambda-Phagen von E. coli und damit die Zusammensetzung der beschriebenen Sequenz ist im Gegenteil stark fehlerhaft (Scherer, G. F. E. et al., Nucleic Acids Res. 8 (1980), 3895-3898).
Unter Verwendung des selektierbaren G418-Resistenzmarkers ist die fein regulierbare PLNRBS-Kontrollsequenz in ein leicht abspaltbares Segment in geeigneten Ursprungsvektoren eingefügt worden, so daß es entweder unter Anordnung der PLNRBS-Sequenzen vor einem ATG-Startcodon verwendet werden kann oder dadurch, daß der PLNRBS mit einem ATG mit glattem 3'-Ende zur Ligierung an den glatten N-Terminus der codierenden Sequenz versehen wird.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert eine DNA-Sequenz-"Kassette", die geeignete, sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende liegende, eine leichte Übertragbarkeit ermöglichende Restriktionsstellen und durch einfache Manipulationen leicht regulierbare Kontrollelemente für die Proteinsynthese aufweist. Die Sequenz enthält den PL-Promotor vom Lambda-Phagen sowie die unmittelbar vor einer Restriktionsstelle liegende NRBS (Ribosomenbindungsstelle für das N-Gen).
Dementsprechend betrifft ein Gesichtspunkt der Erfindung eine DNA-Sequenz, die den PL-Promotor umfaßt, der funktionell mit der NRBS verbunden ist, wobei innerhalb von 6 bp stromabwärts der NRBS, eine HindIII-Restriktionsstelle liegt, und Vektoren, die die Sequenz enthalten. Die erhaltenen Vektoren können selbstverständlich die Restriktionsstelle auch nicht mehr enthalten. Zellen oder Zellkulturen, die mit solchen Vektoren transformiert wurden, und deren Nachkommenschaft sind ebenfalls ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die den PL-Promotor umfaßt, der funktionell mit der NBRS und einem ATG-Startcodon verbunden ist, wobei die Sequenz innerhalb von 6 bp stromabwärts vom ATG eine Restriktionsstelle aufweist, sowie Vektoren, die diese Sequenz enthalten, wobei auch hier die Spaltstelle wiederum fehlen kann.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in rekombinanten Wirtszellen, das die Züchtung der vorstehend beschriebenen Transformanten und die Gewinnung des produzierten Proteins umfaßt. Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Expressionsvektoren, das die Ligierung der erfindungsgemäßen PLNRBS-Kassetten in eine im Hinblick auf die gewünschten codierenden Sequenzen funktionelle Position umfaßt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die angefügte Figur stellt die Konstruktion von pFC54 dar.

Ausführungsarten zur Durchführung der Erfindung

A. Definitionen

"PLNRBS-Kassette" betrifft eine DNA-Sequenz, die die funktionell mit NRBS verbundene PL-Promotorsequenz enthält, wobei die Kassette durch Restriktionsstellen stromaufwärts der PL-Promotorsequenz und stromabwärts der NRBS-Sequenz begrenzt ist. Während die genaue Lage der stromaufwärts liegenden Restriktionsstelle nicht von Bedeutung ist, muß die Lage der stromabwärts liegenden Stelle nahe genug sein, um eine funktionelle Verbindung mit einem ATG-Startcodon zu ermöglichen. Daher muß die stromabwärts liegende Restriktionsstelle die Spaltung innerhalb von 6 bp nach dem letzten Basenpaar der RBS ermöglichen, so daß die gesamte Kassette innerhalb eines funktionsfähigen Abstandes zu einem ATG- Startcodon des gewünschten Proteins leicht inseriert werden kann.
"PLNRBS-ATG-Kassette" betrifft eine DNA-Sequenz, die einen PL-Promotor enthält, der funktionell mit der NRBS-codierenden Sequenz und einem ATG-Startcodon verbunden ist. Die Kassette enthält eine stromabwärts liegende Restriktionsstelle, die eine Spaltung innerhalb von 6 bp 3'-seitig vom G des ATG-Startcodons ermöglicht. Dies ermöglicht eine einfache Ligierung der glattendigen Kassette in den Leserahmen einer gewünschten codierenden Sequenz.
Eine Spaltung "innerhalb von 'n' bp" von einer bestimmten Stelle setzt voraus, daß mindestens einer der beiden Stränge so gespalten sein muß. Wie bekannt ist, katalysieren die meisten Restriktionsenzyme die Spaltung mit überstehenden Enden, in der die Spaltstelle in einem Strang durch mehrere bp von der Spaltstelle im komplementären Strang getrennt ist. Um der hier beschriebenen Definition zu genügen, braucht nur eine dieser Stellen innerhalb der erforderlichen "n" bp zu liegen.
Die die erfindungsgemäße Kassette enthaltenden Vektoren können, müssen aber nicht, eine wie vorstehend beschriebene Spaltstelle enthalten. Je nach Protokoll zur Ligierung der Kassette in einen Vektor-Rezipienten kann die Stelle fehlen oder vorhanden sein. "NRBS" und "NRBS-entsprechende Sequenz" oder "Ribosomenbindungsstelle und "Ribosomenbindungsstelle-entsprechende Sequenz" werden auch austauschbar verwendet, wobei die beabsichtigte Ausführungsform aus dem Zusammenhang klar hervorgeht. Daher ist bei der Verwendung von "NRBS" zur Beschreibung eines Teils der DNA klar, daß eine "NRBS-entsprechende Sequenz" gemeint ist.
Der Begriff "IL-2" bezeichnet Proteine, die eine Sequenzhomologie zu und die Wirkung von Interleukin-2 aufweisen. Es gehören Proteine dazu, die die genaue Sequenz von nativem IL-2 aufweisen, sowie Sequenzen, die Sequenzmodifikationen enthalten, die die Aktivität nicht zerstören. In den nachstehend beschriebenen Erläuterungen wird eine Modifikation oder ein "Mutein" verwendet, das an Position 125 einen Serinrest anstelle eines Cysteins aufweist.
Der Ausdruck "funktionell verbunden" bezeichnet Konstruktionen, in denen die darin beschriebenen Bestandteile so nebeneinander angeordnet sind, daß sie in einer einander gegenüberliegenden Anordnung in der beabsichtigten Weise wirken können. Daher ist ein Promotor, der mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden ist, ein Promotor, der die Transkription der gewünschten codierenden Sequenz bewirken kann.
"Polyadenylierungssignal" oder "Terminator" soll all das, was in diesen Sequenzen erforderlich ist, einschließen, und nicht auf diese bestimmte Funktion beschränkt sein. Diese Definition ist aufgrund der Kenntnisse im gegenwärtigen Stand der Technik erforderlich, in dem die Bedeutung der Sequenzen neben ihrer Funktion als Polyadenylierungssignal unklar ist.
Der Ausdruck "rekombinante Wirtszelle" bezeichnet eine Zelle, die mit DNA-Sequenzen, die durch Rekombinationstechniken manipuliert worden sind, transformiert wurde.
Die Begriffe "Zellen" und "Zellkulturen" werden, wenn der Zusammenhang es erlaubt, austauschbar verwendet und schließen die Nachkommenschaft jeder einzelnen, angegebenen Zelle ein. Daher bezeichnen diese Begriffe Zellen, ungeachtet dessen, ob sie vom Medium getrennt oder in ihm suspendiert sind und ob sie leben oder abgestorben sind. Diese Begriffe schließen daher die Nachkommenschaft einer transformierten Stammkultur ein, deren Nachkommenschaft sich durch Mutation von den parentalen Zellen unterscheiden kann.

B. Allgemeine Beschreibung

Es werden drei Vektorplasmide beschrieben, die in die Erfindung eingeschlossen sind und eine geeignete Quelle für die PLNRBS-Kassette darstellen, die eine zur Insertion der Kassette unmittelbar stromaufwärts eines ATG geeignete Restriktionsstelle enthalten. Weitere Plasmide können leicht konstruiert werden, indem die Kassette auf jedes beliebige andere, die geeigneten Stellen enthaltende Wirtsplasmid übertragen wird. Derartige Stellen können an der Stelle von identischen oder kompatiblen, im Wirtsplasmid üblicherweise verfügbaren Restriktionsstellen oder an neu konstruierten kompatiblen Stellen, die durch Spaltung des Wirtsplasmids an verfügbaren Stellen und Insertion von geeigneten, im Handel erhältlichen Linkern konstruiert werden können, direkt in ein Wirtsplasmid inseriert werden. Es sind weitere Plasmide beschrieben, die die PLNRBS-ATG-Kassette liefern, d. h., die das mit der Ribosomenbindungsstelle funktionell verbundene ATG-Startcodon enthaltende Kassette. Weitere zur Clonierung dieser Kassette geeignete Plasmide können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren konstruiert werden.

C. Verwendete Verfahren

Sowohl die Clonierungs- als auch die Expressionsvektoren für die gewünschten Sequenzen wurden unter Verwendung der nachstehend beschriebenen, üblicherweise verwendeten Restriktions- und Ligierungsverfahren konstruiert. Weitere Plasmide, die den beschriebenen analog sind, können unter Verwendung dieser im Stand der Technik gut bekannten Verfahren ebenfalls konstruiert werden, indem andere Replikons, Vektorfragmente, Kontrollsequenzen, codierende Sequenzen, Polylinker und Expressionskassetten verwendet werden.
Üblicherweise kann die verfügbare DNA-Menge durch Clonierung der gewünschten Fragmente erhöht werden, d. h., durch Insertion in ein geeignetes Cloniervehikel, beispielsweise in pBR322, und durch Transformation von und Replikation in E. coli, und gegebenenfalls kann die Menge durch Chloramphenicol-Amplifikation oder Phagen-Replikation weiter erhöht werden. Zur Expression können die gewünschten Fragmente anschließend aus den Cloniervektoren oder Phagen entfernt und an geeignete Kontrollsequenzen ligiert werden, die mit dem Wirt, der zur Expression des Gens verwendet werden soll, kompatibel sind. Derartige Wirte werden anschließend mit diesen Expressionsvektoren transformiert und unter Bedingungen gezüchtet, die die Stabilisierung des Plasmids und die sichere Produktion der gewünschten Proteinfragmente unterstützen. Solche Bedingungen könnten die Repression des kontrollierenden Promotors bis annähernd zum Ende der log- Phase und anschließend eine Veränderung der Bedingungen zur Unterstützung der Peptidsynthese einschließen.

C. 1 Transformationen

Die in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Transformationen wurden unter Verwendung des Calciumchlorid- Verfahrens, wie es von S. N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 2110, beschrieben ist, durchgeführt. Die Calciumbehandlung wird bei Prokaryoten oder anderen, wesentliche Zellwandbarrieren enthaltenden Zellen verwendet.

C. 2 Vektorkonstruktion

Die Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten codierenden Sequenzen und Kontrollsequenzen enthalten, setzt Standardligierungs- und Restriktionsverfahren ein, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, nach Maßgabe weiterbearbeitet und in der gewünschten Form erneut ligiert.
Die Stellenspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter im Stand der Technik gut bekannten Bedingungen durchgeführt, wobei die Einzelheiten durch den Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben werden. Vgl. beispielsweise den Produktkatalog von New England Biolabs. Üblicherweise wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Sequenz durch eine Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten. In den hier beschriebenen Beispielen wird üblicherweise ein Restriktionsenzymüberschuß verwendet, um die vollständige Spaltung des DNA-Substrats sicherzustellen. Inkubationszeiten von etwa ein bis zwei Stunden bei etwa 37ºC sind möglich, obwohl Abweichungen unbedenklich sein können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, woran sich eine Etherextraktion anschließen kann, und die Nucleinsäure kann durch Ausfällung mit Ethanol aus den wäßrigen Fraktionen gewonnen werden, worauf sie durch eine Sephadex G-50-Spin- Säule geleitet wird. Falls erwünscht, kann die Trennung nach Größe der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden. Eine ausführliche Beschreibung der Trennung nach Größe ist in Methods in Enzymmology 65 (1980), 499-560, zu finden.
Mit Restriktionsenzymen gespaltene Fragmente können durch Behandlung mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli (Klenow) in Gegenwart der vier Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Min. bei 20 bis 25ºC in 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM Mgcl&sub2;, 6 mM DTT und 5 bis 10 dNTPs mit glatten Enden versehen werden. Das Klenow- Fragment füllt überstehende 5'-Enden auf, baut jedoch am 3'- Ende überstehende Einzelstränge ab, selbst wenn die vier dNTPs vorhanden sind. Falls erwünscht, kann eine selektive Reparatur durch Zusatz von nur einem oder von ausgewählten dNTPs innerhalb der Grenzen, die durch die Natur der überstehenden Enden vorgegeben sind, durchgeführt werden. Nach einer Behandlung mit Klenow wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, worauf es durch eine Sephadex G-50-Spin-Säule geleitet wird. Die Behandlung mit SI-Nuclease unter geeigneten Bedingungen bewirkt eine Hydrolyse jedes einzelsträngigen Abschnitts.
Synthetische Oligonucleotide werden durch das Triesterverfahren von Matteucci et al., (J. Am. Chem. Soc. 103 (1981), 3185-3191) hergestellt. Eine Kinase-Behandlung von Einzelsträngen vor dem Aneinanderlagern oder zur Markierung wird unter Verwendung eines Überschusses, beispielsweise etwa 10 Einheiten Polynucleotid-Kinase auf 1 nMol Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 10 mM Mgcl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 1 bis 2 mM ATP, 1,7 pMol º³²P-ATP (2,9 mCi/mMol), 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA, durchgeführt.
Die Ligierungen werden in 15 bis 30 1 Volumina unter den nachstehend beschriebenen Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM bis 50 mM NaCl und entweder 40 uM ATP, 0,01 bis 0,02 (Weiss-) Einheiten T4-DNA- Ligase bei 0ºc (zur Ligierung von überstehenden Enden) oder 1 mM ATP, 0,3 bis 0,6 (Weiss-) Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14ºC (zur Ligierung von glatten Enden). Intermolekulare Ligierungen von überstehenden Enden werden üblicherweise bei DNA-Gesamtkonzentrationen von 33 bis 100 ug/ml (Gesamtkonzentration der Enden: 5 bis 100 nM) durchgeführt. Intermolekulare Ligierungen von glatten Enden (üblicherweise wird ein 10 bis 30facher molarer Überschuß von Linkern verwendet) werden bei einer Gesamtkonzentration der Enden von 1 uM durchgeführt.
Bei Verwendung von " Vektorfragmenten" für Vektorkonstruktionen wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt, um das Phosphat am 5'-Ende zu entfernen und die erneute Ligierung des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden etwa eine Stunde bei 60ºC bei einem pH-Wert von 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na&spplus; und Mg&spplus;² unter Verwendung von etwa 1 Einheit BAP pro ug Vektor durchgeführt. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und durch Auftragen auf eine Sephadex G-50-Spin-Säule entsalzt. In einer anderen Ausführungsform kann die erneute Ligierung in zweimal gespaltenen Vektoren verhindert werden, indem die unerwünschten Fragmente mit einem Restriktionsenzym ein weiteres Mal gespalten werden.

C.3 Bestätigung der Konstruktion

In den nachstehend beschriebenen Konstruktionen werden die korrekten Ligierungen der Plasmid-Konstruktion überprüft, indem der E. coli-Stamm MM294, der vom E. coli- Genetic Stock Center, CGSC #6135, erhalten wurde, oder ein anderer geeigneter Wirt mit dem Ligierungsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin, Tetracyclin oder durch eine andere Antibiotikaresistenz oder unter Verwendung von anderen Markern, je nach Art der Plasmidkonstruktion, wie im Stand der Technik bekannt, selektiert. Anschließend werden die Plasmide im Anschluß an eine Chloramphenicol-Amplifikation (D. B. Clewell, J Bacteriol. 110 (1972), 667) gemäß dem Verfahren von Clewell, D. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969), 1159, aus den Transformanten gewonnen. Die isolierte DNA wird durch Restriktion analysiert und/oder durch das Didesoxy-Verfahren von Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, wie dies auch von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9 (1981), 309, beschrieben wird, oder durch das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65 (1980), 499, sequenziert.

C.4 Wirte

Zwei Wirtsstämme wurden zur Clonierung und Expression der nachstehend beschriebenen Plasmide verwendet:
Zur Clonierung und Sequenzierung und zur Expression einer Konstruktion unter der Kontrolle der überwiegenden Zahl der bakteriellen Promotoren wurde der E. coli-Stamm MM294 (vorstehend beschrieben), Talmadge, K. et al., Gene 12 (1980), 235, und Meselson, M. et al., Nature 217 (1968), 1110, als Wirt verwendet.
Bei der Kontrolle der Expression durch den prokaryotischen PL-Promotor und NRBS wurde jedoch der E. coli-Stamm MC1000 Lambda-N&sub7;N&sub5;&sub3;cI857SusP&sub8;&sub0; als exprimierender Wirt verwendet (ATCC 39531, am 21. Dezember 1983 hinterlegt). Dieser Stamm wird hier nachstehend als MC1000-39531 bezeichnet. Dieser Stamm enthält einen Lambda-Prophagen, der einen Temperatur-empfindlichen, bei der permissiven Temperatur (30 bis 32ºC) aktiven cI-Repressor codiert. Bei der nicht-permissiven Temperatur (36 bis 44ºC) ist der Repressor inaktiv, und die Transkription vom PL-Promotor kann beginnen. Es ist ferner für diesen Stamm charakteristisch, daß der Prophage bei erhöhten Temperaturen nicht induzieren kann.

D. Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Konstruktion eines Donorolasmids für eine übertragbare PLNRBS-EcoRI/HindIII-Prä-ATG-Kassette

Das mtAPH-I-Gen wurde als ein geeigneter Marker zur Konstruktion einer PLNRBS-Kassette verwendet. Zunächst wurde eine DNA-Sequenz, die den PL-Promotor des λ-Phagen und die Ribosomenbindungsstelle des N-Gens (NRBS) enthielt, von einem von Shimatake und Rosenberg, Nature 292 (1981), 128, beschriebenen pKC30-Derivat erhalten. pKc3o enthält ein in das HindIII/BamHI-Vektorfragment von pBR322 cloniertes 2,34 kb- Fragment vom λ-Phagen. Der PL-Promotor und die NRBS liegen auf einem Abschnitt zwischen einer BgIII- und HpaI-Stelle in pKc30. Das Derivat weist die in eine EcoRI-Stelle umgewandelte BgIII-Stelle auf.
Die dem PL-Promotor unmittelbar vorangehende BgIII- Stelle wurde, wie nachstehend beschrieben, in eine EcoRI- Stelle umgewandelt: pKc30 wurde mit BgIII gespalten, mit Klenow und dNTPs aufgefüllt, mit T4-Ligase an einen EcoRI- Linker (New England Biolabs) ligiert und der E. coli-Stamm MM294-Lambda&spplus; damit transformiert. Die Plasmide wurden aus Amp®TetS-Transformanten isoliert und die gewünschte Sequenz durch Restriktionsenzymanalyse bestätigt. Das erhaltene Plasmid pFC3 wurde mit PvuI und Hpal doppelt gespalten, um ein die gewünschte Sequenz einrahmendes etwa 540 bp-Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde mit Hinf I partiell gespalten und das erhaltene 424 bp-Fragment isoliert und mit Klenow und dATP und anschließend mit S1-Nuclease behandelt, um ein Fragment mit glatten Enden und mit der Sequenz
-AGGAGAA am 3'-Ende zu erzeugen, in der der -AGGAGA-Teil die NRBS ist. Dieses Fragment wurde mit EcoRI behandelt, um ein DNA-Fragment von 347 Basenpaaren mit 5'-EcoRI/Hinf 1-3'-Enden (partielles Auffüllen, durch S1 erzeugte glatte Enden) zu erhalten.
Um ein Plasmid zu erhalten, das die gewünschte, PLNRBS enthaltende EcoRI/HindIII-Kassette enthielt, wurde das erhaltene Fragment in ein von pDG144 erhaltenes, mit EcoRI/HindIII gespaltenes Plasmidvektorfragment (aufgefüllt) ligiert. pDG144, das am 13. Januar 1984 unter der ATCC-Nr. 39579 hinterlegt wurde, ist ein verändertes, ein intaktes Amp®-Gen enthaltendes pBR322 und eine codierende Sequenz für ein Protein, das eine Kanamycin-Resistenz (Kan®) trägt. Vor der Kan® codierenden Sequenz liegt ein synthetischer Polylinker. Da pDG144 weder einen Promotor noch eine Ribosomenbindungsstelle vor der codierenden Sequenz enthält, wird Kan® nicht exprimiert, und die pDG144 enthaltenden Zellen sind gegen Kanamycin und strukturell ähnliche Antibiotika empfindlich. Die Polylinkersequenz, die unmittelbar vor dem ATG-Startcodon des Kanamycingens liegt, kann durch Spaltung mit EcoRI und HindIII entfernt und PLNRBS inseriert werden.
Dementsprechend wurde pDG144 mit HindIII gespalten, mit Klenow und dNTPs mit glatten Enden versehen und anschließend mit EcoRI gespalten. Das Vektorfragment wurde mit dem vorstehend hergestellten EcoRI/Hinf I-Fragment (aufgefüllt) ligiert und MC1000-39531 damit transformiert. Amp®Kan®-Kolonien wurden selektiert, die Plasmide isoliert und die korrekte Sequenzkonstruktion wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung bestätigt. Ein Plasmid, das die richtige Sequenz enthielt, erhielt die Bezeichnung PLKan.
Ein alternativer Vektor zur Bereitstellung der Promotor-RBS-Kassette, pFC5, verwendet die lac-Z-Fusions-Fahne "flag" als Marker für die erfolgreiche Konstruktion. pβI- Z15, das am 13. Januar 1984 unter der ATCC-Nr. 39578 hinterlegt worden ist, wurde durch Fusion einer Sequenz, die ATG sowie 140 bp β-IFN an lac-Z fusioniert enthielt, in pBR322 hergestellt. In pβI-Z15 bleibt die EcoRI-Stelle von pBR322 erhalten, und die Insertion enthält eine HindIII-Stelle, die unmittelbar vor dem ATG-Startcodon liegt. pβI-Z15 wurde mit HindIII gespalten, mit Klenow und dNTPs mit glatten Enden versehen und anschließend mit EcoRI gespalten. Das erhaltene EcoRI/HindIII-Vektorfragment (aufgefüllt) wurde mit dem vorstehend beschriebenen EcoRI/Hinf I-Fragment (aufgefüllt) ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von MC1000-39531 verwendet, und die die gelungene Konstruktion enthaltenden Amp® -Transformanten wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf Lactose-Minimalplatten bei 34ºC, jedoch nicht bei 30ºC zu wachsen. (Transformationen wurden auf X- Gal-Amp-Platten bei 30ºC und 34ºC und auf Lactose-Minimalplatten bei 30ºC und 34ºC plattiert. Transformanten mit der geeigneten Konstruktion sind auf X-Gal-Amp-Platten bei beiden Temperaturen blau, sie wachsen jedoch auf Lactose-Minimalplatten nur bei 34ºC.) Die erfolgreiche Konstruktion erhielt die Bezeichnung pFC5.
pFC5 oder pPLKan und analoge Vektoren, die so konstruiert werden, daß sie diese Kassette zusammen mit einem geeigneten Marker und Replikon enthalten, können zur Clonierung und als Quelle des EcoRI/HindIII-PLNRBS-Fragments verwendet werden. Die Kassette kann anschließend bei einer gewünschten Sequenz leicht hinter ein ATG-Startcodon der Sequenz, wo unmittelbar angrenzend an dieses Codon eine HindIII-Stelle enthalten ist, in einen Expressionsvektor eingebaut werden.

Konstruktion von Vektoren, die die PLNRBS-ATG-Kassette liefern - PLNRBS-ATG und pDG141(PL)

Die PLNRBS-Kassette kann durch Ligierung der Kassette ohne ATG in einen geeigneten Wirtsvektor auch mit einem funktionell verbundenen ATG-Startcodon geliefert werden. pBW20, ein Derivat von pBR322, das eine synthetische Sequenz enthält, die ein ATG-Startcodon in einem geeigneten Abstand stromabwärts der HindIII-Stelle liefert, kann zu diesem Zweck verwendet werden.
Zur Herstellung von pBW20 wurde pBR322 mit HindIII gespalten, mit Klenow und den vier dNTPs repariert und anschließend mit PvuII gespalten. Das Vektorfragment wurde anschließend in einer Standardligierung für glatte Enden mit dem selbstkomplementären Dodecamer TATGAGCTCATA ligiert, das eine partiell überlappende und stromabwärts der ATG-Sequenz liegende Sacl-Erkennungsstelle enthielt. Mit dem Ligierungsgemisch wurde E. coli MM294 transformiert und eine korrekte Konstruktion durch Isolierung der Plasmide und eine Maxam- Gilbert-Sequenzierung bestätigt. Die erhaltene relevante Sequenz in pBW20 ist nachstehend dargestellt:
Zur Herstellung von pPLNRBS-ATG wurde pPLKan mit HindIII und EcoRI gespalten und an das mit EcoRI/HindIII gespaltene, mit BAP behandelte Vektorfragment von pBW20 ligiert und E. coli MC1000-39531 damit transformiert. Amp®- Kolonien wurden selektiert und die gewünschte Vektorkonstruktion durch Sequenzierung oder Restriktionsenzymanalyse bestätigt.
Eine clonierte Kolonie, die die richtige Konstruktion pPLNRBS-ATG enthielt, liefert so eine Quelle für eine PLNRBS-ATG-Kassette in einem Wirtsplasmid, das zur Insertion einer Gensequenz, deren Expression gewünscht wird, geeignet ist. Der passend gespaltene, die Kassette enthaltende Wirtsvektor kann durch Spaltung mit SacI, Erzeugen glatter Enden durch Klenow oder SI-Nuclease und Insertion des mit glatten Enden versehenen Gens bereitgestellt werden.
pDG141, das am 24. Januar 1984 bei der ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer 39588 erhielt, kann ebenfalls das ATG für die PLNRBS-ATG-Kassette liefern. pDG141 enthält vor einer trp-Promotor-Kassette die gleiche Dodecamer-Insertion wie pBW20. Entsprechend dem Verfahren des vorstehenden Absatzes, jedoch durch den Austausch von pBW20 gegen pDG141, wird das analoge Plasmid pDG141 (PL) erhalten.

Die Verwendung der PLNRBS-Kassette zur Exoression

Die nachstehend beschriebenen Beispiele erläutern einen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt, indem sie die Konstruktion von zur Produktion von IL-2 geeigneten Expressionsvektoren und die erfolgreiche Expression der gewünschten codierenden Sequenzen beschreiben. IL-2 und seine modifizierten Formen gehören zu einer als Lymphokine bezeichneten Klasse von Proteinen, die in der Therapie eines abweichenden Zellmetabolismus nützlich sind. Selbstverständlich könnte jedes gewünschte Peptid analog hergestellt werden, indem die geeignete codierende Sequenz in einer zur erläuterten Herstellung von IL-2 analogen Weise bereitgestellt wird. Ferner könnte anstelle der PLNRBS-Kassette die PLNRBS-ATG-Kassette, wie vorstehend beschrieben, vor den Codons für das gewünschte Peptid inseriert werden.
Natives IL-2 ist eine Sequenz von 133 Aminosäuren mit einem N-terminalen Alanin. Zur Expression in prokaryotischen Systemen werden die Codons der Leadersequenz im nativen Gen durch ein ATG ersetzt, um ein Protein mit einem N-terminalen Methioninrest herzustellen. In den nachstehenden Absätzen wird unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen Kassette eine 133 Aminosäuren aufweisende, modifizierte, ein N-terminales Methionin enthaltende IL-2-Sequenz hergestellt, der das native N-terminale Alanin fehlt, die Serin an Position 125 enthält und die hier als IL-2-des-Ala,Ser124 bezeichnet wird. Andere Ausführungsformen von diese Kassette verwendenden IL-2-Konstruktionen, wie in Abschnitt H.3 beschrieben, oder andere IL-2-Formen betreffende Konstruktionen können selbstverständlich ebenfalls hergestellt werden.

Konstruktion von pFC54

pFC54 ist ein Expressionsvektor für eine modifizierte Form von IL-2, in der das Cystein an Position 125 durch einen Serinrest ersetzt worden ist (IL-2-des-Ala,ser125). Er wird unter Verwendung von pFC5 als Quelle der PLNRBS-Kasette, pLW46 als Quelle der codierenden Sequenz und pCS4 als Quelle des Replikons mit hoher Kopienzahl, wie nachstehend beschrieben, konstruiert:
pCS4 (nachstehend beschrieben) und pFC5 wurden jeweils mit EcoRI und HindIII gespalten und die Spaltprodukte in einem molaren Verhältnis von 1 : 2, 60 ug/ml, unter Bedingungen für überstehende Enden ligiert. Die ligierte DNA (150 ng) wurde unter Übertragung der Amp® zur Transformation von MC1000-39531 verwendet und die Lac -Transformanten auf das gewünschte 5,45 kb-Plasmid abgesucht. Das richtige Plasmid, pFC8, enthielt das gewünschte 346 bp-EcoRI/HindIII- PLNRBS-Fragment anstelle der 110 bp-trp-Kontrollregion von pCS4.
pLW46 enthält die codierende Sequenz für ein IL-2- Mutein (des-Ala,Ser125) auf einem einzigen HindIII/BanII- Fragment. Dieses Plasmid, mit dem E. coli MM294 transformiert worden war, wurde am 26. September 1983 hinterlegt und erhielt die ATCC-Nr. 39452.
pLW46 wurde vollständig mit PvuII (zur Spaltung des unerwünschten Fragments), HindIII und BanII gespalten. pFC8 wurde mit HindIII und BanII ebenfalls vollständig gespalten. Die Spaltprodukte wurden vermischt (in einem molaren Verhältnis von 4 : 1, 50 ug/ml DNA), die überstehenden Enden unter entsprechenden Bedingungen ligiert und das Gemisch (100 ng DNA) unter Übertragung der Amp® zur Transformation von MC1000-39531 verwendet. Erfolgreiche Transformanten wurden auf das gewünschte 5,4 kb-Plasmid abgesucht, dem die PstI-Stelle von pLW46 fehlt, das eine einzige XbaI-Stelle und eine einzige HindIII-Stelle enthält und ein 526 bp- EcoRI/XbaI-Fragment liefert. Das gewünschte Plasmid erhielt die Bezeichnung pFC54. Seine Konstruktion wird in der Figur zusammengefaßt.
pFC54, mit dem der Lambda-lysogene E. coli-Stamm DG95 transformiert worden war, wurde bei der CMCC unter der Nr. 2015 und am 4. September 1984 bei der ATCC hinterlegt und weist die Hinterlegungsnr. 39831 auf.

Konstruktion von pCS4

pCS4 wurde ausgehend von pCS3 konstruiert, einem Plasmid, das ein Temperatur-empfindliches Replikon für hohe Kopienzahl enthält, indem das kleinere EcoRI/BamHI-Spaltfragment von pCS3 durch ein EcoRI/XhoII-Spaltfragment ersetzt wurde, das den trp-Promotor/die βIFN-codierende Sequenz enthält, erhalten vom Plasmid p ltrp3-4-1, das am 30. März 1984 bei der ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnr. ATCC 39646 aufweist. pCS3 wurde am 3. Juni 1982 bei der ATCC hinterlegt und weisen die Hinterlegungsnr. ATCC 39142 auf.

Herstellung von IL-2-des-Ala, Ser125

Mit pFC54 wurde der Lambda-lysogene E. coli-Stamm DG95 transformiert, und die Transformanten wurden, wie nachstehend beschrieben, gezüchtet und induziert: Frische, über Nacht gezüchtete Proben von pFC54/DG9s wurden in N8-2-Medien inokkuliert (pro 500 ml: 20 mM NH&sub4;Cl, 44 mM KH&sub2;PO&sub4;, 56,2 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 18 mM K&sub2;SO&sub4;, 0,4 mM MgSO&sub4;, 6 M ZnSO&sub4;, 6 uM MnSO&sub4;, 0,2 uM CuSO&sub4;, 0,4% Glucose und 0,002% Thiamin), die mit 5 g/1 Casaminosäure, 5 ug/l Glucose, 100 ug/m1 Ampicillin und 10 uM FeSO&sub4; versetzt waren. Die Zellen wurden bei 30ºC bis zu einer OD&sub6;&sub8;&sub0; von 0,150 gezüchtet und anschließend durch Temperaturerhöhung induziert. Diese Transformanten produzierten nach einer Induktion von 1 bis 2 Std. bei 40ºC IL-2- des-Ala,Ser12s zu 20% des insgesamt produzierten Zellproteins. Zur Beurteilung der Produktionsmenge wurden 0,5 ml Zellen zentrifugiert und das Pellet in 20 ul 3% SDS, 62,5 mM Tris-HCI, pH-Wert 6,8, resuspendiert. Nach einer 5-minütigen Erwärmung auf 95ºC wurden die Proben durch ein 12,5% SDS-Polyacrylamid-3%-Sammelgel geleitet. Die Produktionsmenge wurde anschließend durch die Intensität der Coomassie- Blau-Färbung der SDS-Polyacrylamidgele getestet. Die Aktivität des produzierten IL-2 wurde unter Verwendung von Standardtestverfahren bestätigt.

Konstruktion von DFC53

Eine 134 Aminosäurereste aufweisende IL-2-Sequenz, die sich von der vorstehend beschriebenen Sequenz durch einen vorhandenen Alaninrestes unmittelbar nach dem Methionin, das durch ein ATG-Startcodon codiert ist (der normale N-Terminus in der nativen Sequenz), unterscheidet, kann in einer den vorstehend beschriebenen Erläuterungen genau entsprechenden Weise erhalten werden. Die codierende Sequenz dieses hier nachstehend als IL-2-Ser125 bezeichneten Proteins wird als ein HindIII/BanII-Fragment erhalten, das die codierende Sequenz von pLW55 enthält. (pLW55 in MC1000-39531 wurde am 18. November 1983 bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer 39516.) Das erhaltene Plasmid, das das Temperatur-empfindliche Replikon für eine hohe Kopienzahl von pCS4 und die erfindungsgemäße PLNRBS-Kassette von pFC5 ,enthält, erhielt die Bezeichnung pFC53.
Die Transformation des Lambda-lysogenen E. coli- Stamms DG95 mit pFC53 führte zu Kulturen, die IL-2-Ser125 produzierten.
Die nachstehend aufgeführten Plasmide wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, (ATCC) nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentverfahren und den dafür geltenden Bestimmungen (Budapester Vertrag) hinterlegt und werden so nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages erhalten und verfügbar gemacht. Die Verfügbarkeit solcher Stämme darf nicht als Lizenz zur Durchführung der Erfindung unter Verletzung der Rechte ausgelegt werden, die im Hoheitsbereich einer jeden Regierung gemäß ihren Patentgesetzen garantiert sind.
Den hinterlegten Plasmiden sind die angegebenen ATCC- Hinterlegungsnummern zugewiesen worden. Die Plasmide sind auch bei der Master Culture Collection (CMCC) der Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornien, USA, dem Rechtsbevollmächtigten der vorliegenden Anmeldung, hinterlegt worden, und ihnen wurden die angegebenen CMCC-Hinterlegungsnummern zugewiesen: Plasmid CMCC-Hinterlegungsnr ATCC-Nr.

Claims

1. Übertragbare regulierbare Kontrollkassette für die Expression eines heterologen Proteins in Prokaryonten, wobei die Kassette von einem Vektor erhältlich ist, der unter der Nummer ATCC39831 hinterlegt wurde, oder ein funktionelles Äquivalent davon ist, mit einer ersten DNA-Sequenz, die der PL-Promotor ist, der funktionell mit einer zweiten DNA-Sequenz verknüpft ist, die der RBS des N-Gens des X-Phagen entspricht, stromaufwärts von einer dritten DNA-Sequenz mit einer Hind III-Restriktionsstelle, die die Spaltung innerhalb von 6 Basenpaaren 3' von der RBS-Sequenz ermöglicht.

2. Kassette nach Anspruch 1, wobei die ersten und zweiten DNA-Sequenzen funktionell mit einem ATG-Startcodon verknüpft sind, die alle stromaufwärts von einer dritten DNA-Sequenz liegen, die eine Restriktionsstelle aufweist, die sonst nirgendwo in der Kassette vorliegt und die die Spaltung innerhalb von 6 Basenpaaren 3' vom G des ATG-Startcodons ermöglicht.

3. Vektor für die Expression eines heterologen Proteins, wobei der Vektor eine Kassette nach Anspruch 1 oder 2 umfaßt, die funktionell verknüpft ist mit ,einer DNA-Sequenz, die das an der Restriktionsstelle inserierte heterologe Protein codiert, wobei der codierenden Sequenz ein eingeschlossenes Startcodon vorausgeht.

4. Vektor pFC54, erhältlich von ATCC39831.

5. Zellen oder Zellkulturen, die mit einem Vektor nach Anspruch 3 oder 4 transformiert sind.

6. Zellen oder Zellkulturen, die mit einem Vektor nach Anspruch 3 transformiert sind, wobei der Vektor weiterhin einen Replikationsursprung umfaßt, der temperaturreguliert ist.

7. Zellen oder Zellkulturen nach Anspruch 5 oder 6, wobei die gewünschte codierende Sequenz IL-2 oder ein Nutein davon codiert.

8. Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins, umfassend die Züchtung der transformierten Zellen nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7, und Gewinnung des gewünschten Proteins daraus.

9. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach Anspruch 3, umfassend die Ligierung einer Kassette nach Anspruch 1 oder 2 in eine funktionelle Position in Bezug auf die DNA-Sequenz, die das heterologe Protein codiert, durch Insertion der codierenden Sequenz an der Restriktionsstelle.

10. Verwendung einer Kassette nach Anspruch 1 oder 2, in der Expressionskontrolle eines heterologen Proteins in einen Prokaryonten.