JP2970811B2 - 原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム - Google Patents

原核生物細胞中にポリペプチドを調製するための発現システム

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Description

【発明の詳細な説明】 序 論 技術分野 本発明は、新規ペプチドの組成物及びその調製方法、
特に組換え技法を用いての融合ポリペプチドに関する。
背 景 遺伝子工学の出現は、多量の種々のペプチドの容易な
製造を可能にした。しかしながら、この可能性は、多く
の理由のために十分に実現化されていない。たとえば、
ペプチドが生成され、そして宿主生物の細胞質中に保持
されている場合、封入体は、しばしば単に一部又はほと
んどの好結果をもたらさないで、タンパク質の変性及び
再生の必要性をもたらして来た。他の場合、ペプチドが
実質的に分解され、その結果、低収率のみならず、また
複雑化された混合物が得られ、そしてこれらは分離する
のに難かしくなる。
これらの困難性に対する可能性ある解決法として、栄
養培地中への所望するペプチドの分泌を得ることの可能
性が調査されて来た。所望するタンパク質の分泌を得る
ことは、すべてのタンパク質は、使用されて来た宿主細
胞により分泌され得ないので、これまで制限されて来
た。さらに、分泌される場合でさえ、宿主細胞によるペ
プチドのプロセッシングは、所望するポリペプチドの組
成物及び／又はコンホメーションとは異なる生成物をも
たらし、そしてそのタンパク質の収量は予想よりも少な
かった。従って、所望するポリペプチドが分解しないで
宿主細胞中で蓄積することができ、そして活性コンホメ
ーション形で分泌されるか又は便利には機能的状態にプ
ロセッシングされ、そして再生され得る活性ペプチドの
効果的且つ経済的産生のためのシステムを開発すること
に実質的な興味が存在する。
発明の要約 活性遺伝子生成物の増強された発現及び産生を提供す
る発現カセット及びそれらの調製及び使用方法が記載さ
れる。その発現カセットは、宿主細胞が所望するポリペ
プチドの発現を付与するために適切な効果的転写及び翻
訳開始及び終結調節領域を含む。その発現カセットは、
さらに好ましくは、宿主細胞のために適切なように、調
節領域の転写及び翻訳調節下での発現のためのリーダー
配列、成熟ポリペプチドからリーダーペプチドの分解の
ために酵素又は化学的分解部位を付与する配列及びモジ
ュレートされるべき対象の遺伝子の発現の時期を可能に
する調節配列を含む。その発現カセットは、条件下で宿
主細胞中に導入され、それによってその得られた形質転
換体は安定して発現カセットを維持する。天然に存在す
るDNA及び合成遺伝子は、対象のポリペプチドの産生の
ために使用され得る。
特定の態様の記載 本発明によれば、宿主細胞中に挿入される場合、増強
された安定性を有し、そして活性コンホメーションで分
泌され又は便利には活性状態にプロセッシングされ、そ
して再生され得る対象のポリペプチドの調製を可能にす
る発現カセットが供給される。
宿主細胞中に対象のポリペプチドの増強された発現を
得るために、対象のポリペプチドのＮ−末端アミノ酸を
コードするヌクレオチドを、コドン宿重の強制下で変性
し、発現カセットに使用されるシャイン−ダルガルノ配
列と共に見出される天然の遺伝子配列のヌクレオチドを
まねる。従って、発現カセットは次の一般構造を有す
る:P−S.D.−met−G1。ここで、ＰはRNA鎖の開始から上
流の約−35及び−10ヌクレオチドで存在する調節領域を
含むプロモーター配列を含み、そしてまた、調節の誘発
を可能にする調節配列も含むことができ； S.D.はシャイン−ダルガルノ配列を含み； metは対象のポリペプチドの開始メチオニンのための
コドンを含み；そして G1は対象のポリペプチドのための遺伝を含み、ここで
その遺伝子の初めの７〜30個のコドンは、可能な場合ど
こででも、発現カセットに使用されるシャイン−ダルガ
ルノ配列に続く天然の遺伝子のヌクレオチド配列に近づ
けるためにコドン宿重を用いて変性されている。
宿主細胞から対象のポリペプチトの増強された発現を
得るための他の手段として、ポリペプチドは、対象の遺
伝子からの上流で読み枠を合わして連結されるリーダー
配列ペプチドをコードするDNA配列を発現カセットに含
むことによって、融合タンパク質として発現され得る。
融合タンパク質としての対象のポリペプチドの発現は、
対象のポリペプチドである宿主細胞により産生されるタ
ンパク質30％まで又はそれ以上をもたらすことができ
る。融合タンパク質を発現するための発現カセットは次
の基本構造を有する： Ｐ−S.D.−met−Ｌ−Ｇ。
ここで、P,S.D.及びmetは上記意味を有し； Ｇは対象のポリペプチドのための遺伝子を含み；そし
て Ｌは細菌又はパクテリオファージ遺伝子からである
が、しかし一般的には高く発現された遺伝子からである
Ｎ−末端配列のリーダーペプチドをコードするDNA配
列；多くの数の疎水性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列；又は多くの数の親水性アミノ酸残基を含むアミノ酸
配列を含む。Ｌが疎水性アミノ酸配列を含む場合、この
配列は好ましくは、シグナル配列として機能し、宿主細
胞からの対象のポリペプチドの分泌及びそのポリペプチ
ドからのシグナル配列の分離を可能にする。Ｌをコード
するDNA配列はまた、可能な場所のどこでも、コドン宿
重を用いて変性され、発現カセットに使用されるシャイ
ン−ダルガルノ配列に続く天然の遺伝子のヌクオチド配
列に近づけられる。
上記発現カセットは、対象のポリペプチド及びリーダ
ーペプチドを含んで成る融合発現生成物を付与する。対
象のポリペプチドのみを得ることが所望され、そしてた
とえば天然のシグナル配列により付与されるような便利
な切断部位が存在しない場合、切断部位は、対象の遺伝
子からの上流で読み枠を合わして切断部位をコードする
少なくとも１つのコドンを連結することによって付与さ
れ得る。従って、そのカセットは次の構造を有する： Ｐ−S.D.−met−Ｌ−Ｃ−Ｇ。
ここでP,S.D.,met,L及びＧは前記意味を有し、そして、
Ｃは化学的又は酵素的切断部位を付与する少なくとも１
つのコドンを含んで成る。
mRNAを安定化し、そして所望するポリペプチドの高レ
ベルの発現を付与するためには、転写終止領域（Ｔ）
が、対象の遺伝子から下流の発現カセットに含まれ得
る。Ｔを含んで成る発現カセットの例は次の通りであ
る： Ｐ−S.D.−met−Ｇ−Ｔ。
但し、Ｔは上記のいづれかの発現カセットに含有され
る。
発現カセットの構成 高レベルの遺伝子生成物を得るための発現システムの
ためには、発現に影響を及ぼすことが決定されている遺
伝子の特定の領域だけでなく、またいかにこれらの領域
（及び従ってそれらの配列）がお互い影響を及ぼすかを
考慮すべきである。可能な場合、適切な調節配列の選択
により、発現に影響を及ぼす種々の因子を考慮すべきで
ある。種々の遺伝子が、特定の発現速度を得るためにこ
れらの因子のすべての組合せを生ぜしめ、従って高く発
現された遺伝子が有用なモデルとしてみなされ得る。
転写調節に関しては、mRNAの量及び安定性が、遺伝子
生成物の発現に影響を及ぼす重要な因子である。mRNAの
量は、特定の遺伝子のコピー数、そのプロモーターの相
対的効力及びプロモーターを調節する因子、たとえばエ
ンハンサー又はリプレッサーにより決定される。開始
は、コード配列の起原のちょうど上流に存在すると思わ
れる。
原核生成細胞中のプロモーターは、転写の効力に影響
を及ぼすことができるヌクレオチド配列を含有する。こ
れらの配列は、RNA鎖の開始から約−35及び−10のヌク
レオチドで調節領域を含む。効果的なプロモーターは、
これらを含み、ここで−35及び−10の調節領域のヌクレ
オチド配列は、高い効果的な遺伝子からの細菌性プロモ
ーターにおけるこれらの領域のためのコンセンサス配列
と実質的に同じである。一般的にこれらの領域はそれぞ
れ約５個のヌクレオチド及び６個のヌクレオチドの長さ
を有し、そしてそれぞれの配列は長さ及び／又は配列で
約１個のヌクレオチドにより異なることができる。−35
コンセンサス調節配列のための好ましい配列はtrpプロ
モーター、すなわちTGACAからのものであり、そして−1
0コンセンサス調節配列のための好ましい配列はlacプロ
モーター、すなわちTATAATからのものである。
ヌクレオチド配列だけでなく、また−35及び−10の調
節領域のコンセンサス配列の空間が、対象の遺伝子の最
適な転写を得るためにお互い重要である。一般的に、−
35及び−10の調節領域のコンセンサス配列は、約16〜18
個のヌクレオチド、好ましくは約17個のヌクレオチドに
より分離される。
効果的な転写を付与する例示的な転写調節領域又はプ
ロモーターは、β−galプロモーター、左及び右のλプ
ロモーター、trp及びlacプロモーター並びにtrp−lac
（tac）融合プロモーター、及び同様のものを含む。こ
れらの配列に実質的に類似する配列を有する合成プロモ
ーターもまた使用され得る。好ましいプロモーターは、
trpプロモーターからの−35調節領域及びlacプロモータ
ーからの−10調節領域を含む融合プロモーターである。
最っとも好ましくは、プロモーターは、−35trpコンセ
ンサス配列が−10lacコンセンサス配列から約17個のヌ
クレオチド目の上流に位置するプロモーターである。
転写調節領域はさらに、増殖培地中における栄養物又
は発現生成物の存在又は不在により、温度及び同様のも
のにより調節されるべき対象の遺伝子の発現の時期を可
能にする調節配列を含むことができる。たとえば対象の
遺伝子の発現は、発現ベクター中にバクテリオファージ
λPLプロモーター、バクテリオファージOLオペレーター
及び温度感受性CIリプレッサーをコードする遺伝子CI 8
57をを含有する調節配列を含むことによって宿主細胞増
殖培地の温度により調節され得る。これは、低温度、た
とえば約30℃でリプレッサーとオペレーターとの相互作
用によりプロモーターの調節を可能にするであろう。約
42℃への温度の上昇は、リプレッサーを不活性化し、そ
して対象の遺伝子の発現を可能にする。
増殖培地栄養物を用いる調節の例として、lac又はtrp
−lacハイブリッドプロモーターの調節が、−10調節領
域から下流のlacプロモーター領域に結合する、Lac Iリ
プレッサーのための遺伝子の使用により達成され得る。
そのLac Iリプレッサー遺伝子は、エピゾーム、好まし
くはlac I q増強変異体上に存在することができ、又は
発現カセット自体中に含まれ得る。増殖培地中における
有意な濃度のリプレッサーの存在は、インデューサーの
不在下でプロモーター機能を阻害する。従って、宿主増
殖培地へのIPTG又はラクトースの添加は、プロモーター
機能を増強する。細菌株がLac+である場合、ラクトース
が、IPTGの代わりにインデューサーとして使用され得
る。
転写調節領域は、転写を終結し、そしてmRNAの分解を
阻害し、そして従ってmRNA種の安定性を高め、そして高
い発現を可能にする配列又は構造体を付与する調節配列
をさらに含むことができる。原核生物の配列のいくつか
の例として、trpターミネーター、遺伝子（T4）ターミ
ネーター又は遺伝子32に配列的に類似する合成ターミネ
ーターが知られている。
翻訳調節に関しては、mRNAが存在する場合、発現は、
開始の速度（mRNAに係合するリボソーム）、延長の速度
（mRNAの向こう側へのリボソームのトランスロケーショ
ン）、翻訳後変性の速度及び遺伝子生成物の安定性に影
響を及ぼすことにによって調節され得る。延長の速度は
たぶん、コドン処理により影響され；微量tRNAのための
コドンの使用は翻訳速度を減じることができる。従っ
て、翻訳速度を早めるために宿主細胞により通常発現さ
れる遺伝子に頻繁に出現するコドンを使用することが好
ましい。
−35及び−10の調節領域から下流に、一般的にシャイ
ン−ダルガルノ配列と呼ばれるAGGAのコンセンサスヌク
レオチド配列が存在し、これはリボソーム結合に関与す
ると思われている。最適なリボソーム結合及び翻訳の開
始は、高く発現された遺伝子からの、宿主細胞中で機能
的なリボソーム結合部位を用いることによって達成され
得る。シャイン−ダルガルノ配列、及びたぶんリボソー
ムが開始部位を認識する構造上のモチーフの形成により
リボソーム結合に影響を及ぼすことができるコード領域
内の配列を囲むヌクレオチド配列の存在が証拠として指
摘され、従って、前記コード領域のヌクレオチド配列の
変更が、最適なリボソーム結合及び翻訳の開始を達成す
るために使用され得る。開始コドンATGの後の初めの約
７〜30個のコドンの配列がまた、結合及び発現にも影響
を及ぼすことができる。好ましくは、リーダー配列及び
シャイン−ダルガルノ配列は同じ遺伝子から得られ、又
はそれぞれが異なった遺伝子から得られる場合、リーダ
ー配列のコドンは、リーダー配列に続く天然の遺伝子の
ヌクレオチド配列に接近するようにコドン縮重を用いて
変性され得る。
開始ATGコドンに関するAGGA配列の位置が発現に影響
を及ぼすことができる。一般的に、シャイン−ダルガル
ノ配列は、突然、高レベルの発現が発現カセットを用い
て達成され得るけれども、開始コドンから約５〜９個目
のヌクレオチドに位置し、この際、前記発現カセットに
おいては、シャイン−ダルガルノ配列は開始コドンから
約10〜13個目のヌクレオチド、好ましくは11〜12個目の
ヌクレオチドに位置する。
mRNAの安定性は、リボヌクレアーゼ酵素へのmRNAの感
受性により支配される。一般的に、エキソヌクレアーゼ
消化は、mRNAの末端での構造的モチーフ、パリンドロー
ム構造、変更されたヌクレオチド又は特定のヌクレオチ
ド配列の存在により阻害される。エンドヌクレアーゼ消
化は、mRNA内の特定の認識部位で生じると思われ、そし
て安定したmRNAはこれらの部位で欠失するであろう。ま
た、高レベルの翻訳を受けるmRNAはまた、mRNA上のリボ
ソームの存在により分解から保護されるある証拠が存在
する。
発現生成物の安定性は、所望するポリペプチドが第２
ポリペプチド又はそのフラグメント、特に細菌性ポリペ
プチドと一緒に発現される融合ポリペプチドとして所望
する遺伝子生成物の発現により助けられる。好ましく
は、発現生成物の安定性は、対象のポリペプチドが発現
され、リーダー配列に連結されている融合タンパク質の
合成を付与することによって達成される。たとえば高く
発現された細菌性又はバクテリオファージ遺伝子、たと
えばバクテリオファージλＮタンパク質遺伝子もしくは
cro遺伝子又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子からのＮ−
末端アミノ酸配列をコードするDNA配列が、対象の遺伝
子から上流に及びその遺伝子と読み枠を合わして連結さ
れる。リーダー配列は、通常、約８〜約35、好ましくは
約15〜約25個のＮ−末端アミノ酸を含む。
他の遺伝子からのリーダー配列を有する融合タンパク
質としての対象のポリペプチドの発現は、安定性を付与
する他に、いくつかの利点を有する。たとえば、Ｎ−末
端アミノ酸の存在は、種々のポリペプチドのいづれかの
精製のための一般的な精製技法を用いるための手段を付
与する。たとえば、Ｎ−タンパク質のＮ−末端アミノ酸
は、たぶん抗原性であり、そして従ってＮ−タンパク質
のＮ−末端アミノ酸に対して生ぜしめられた特異的抗体
は、Ｎ−タンパク質のＮ−末端を含む融合タンパク質の
アミノ精製のために使用され得る。さらに、Ｎ−タンパ
ク質のＮ−末端は、高い陽性の電荷を有し、これはイオ
ン交換クロマトグラフィー及び同様のものにより所望す
るタンパク質の精製を促進する。
リーダ配列はまた、疎水性アミノ酸配列であり、これ
はさらに、分泌のためのシグナル配列として機能するこ
とができる。シグナル配列をコードするDNA配列は、対
象の遺伝子から上流に及びその遺伝子と読み枠を合わし
て連結される。典型的には、そのシグナル配列は、シグ
ナル配列ペプチダーゼにより認識される切断部位を含
む。従って、シグナル配列切断部位のすぐ後に対象のポ
リペプチドを配置することは、シグナル配列からの特異
的な切断及び成熟ポリペプチドとしての分泌を可能にす
るであろう。疎水性アミノ酸配列の例として、細菌性ア
ルカリ性ホスファターゼシグナル配列;LPPシグナル配
列；β−ラクタマーゼシグナル配列；及びトキシンシグ
ナル配列を包含される。
使用され得る他のリーダー配列は、親水性配列、たと
えば対象のポリペプチドの機能の変性を提供することが
できるアンフィレグリン（amphiregulin）からのＮ−末
端の41個のアミン酸残基を含む。さらに、細胞毒性物
質、たとえばトキシンＡ−鎖フラグメント、リシンＡ−
鎖、ヘビ毒増殖停止ペプチド又は標的分子、たとえばホ
ルモン又は抗体は、ほとんどの場合、対象の遺伝子生成
物の生物学的活性に対して最小を効果でリーダー配列と
共有結合され得る。他のリーダー配列に関しては、リー
ダー配列をコードするDNA配列は、対象の遺伝子から上
流に及びその遺伝子と読み枠を合わして連結される。
リーダー配列がシグナル配列でなく又は便利な天然の
切断部位を含まない場合、追加のアミノ酸が、対象の遺
伝子とリーダー配列との間に挿入され、リーダーペプチ
ドの切断のための酵素的又は化学的切断部位が付与さ
れ、融合タンパク質の精製の後、成熟ポリペプチドの続
く精製を可能にされる。たとえば融合タンパク質の２つ
のセグメト間への酸不安定性アスパルチル−プロリン結
合の導入は、低いpHでのそれらの分離を促進する。この
方法は、所望するポリペプチドが酸不安定性である場
合、適切でない。融合タンパク質は、メチオニン残基の
カルボキシ側に対して特異的である臭化シアンにより切
断され得る。リーダー配列と所望するポリペプチドとの
間へのメチオニンの位置決定は、所望するポリペプチド
の開放を可能にするであろう。この方法は、所望するポ
リペプチドがメチオニン残基を含む場合、適切でない。
リーダー配列がシグナル配列を含む場合、分泌リーダ
ー配列を有する対象の遺伝子は、前記配列が保持され又
は切断され得る条件下でリーダー配列を伴って又はその
配列を伴わないで発現され得る。さらに、培地中に分泌
される成熟した切断された及び再生されたペプチドとし
て高い割合の所望するポリペプチドを得るためには、低
温、たとえば約30℃で作用することができるプロモータ
ー、たとえばtacプロモーターを使用することが好まし
い。思いがけなく、高いレベルの分泌が低温で得られ
る。ひじょうに高い発現レベルは、タンパク質の十分な
翻訳的変性の存在を妨げることができ、未切断前駆体
（すなわち構造タンパク質及び分泌リーダー）の集合及
び蓄積をもたらす。同様に、高温、たとえば42℃での増
殖はまた、未切断前駆体の集合及び蓄積をもたらす傾向
がある。
対象のポリペプチドは、発現が所望されるいづれかの
ポリペプチドであり、そして同種（宿主細胞に由来す
る）又は異種（外来源又は合成DNA配列に由来する）の
ものであり得る。そのポリペプチドは、原核生物源又は
真核生物源に由来し、この真核生物源としては菌類、原
生生物、脊椎動物、無脊椎動物及び同様のものを挙げる
ことができる。対象のポリペプチドは、酵素、たとえば
イソペニシリンシンセターゼ；哺乳類ペプチド、たとえ
ばインターロイキン、カイトキン、増殖因子、たとえば
上皮増殖因子、血小板由来の増殖因子、オンコスタチン
Ｍ、TGF−α及び−β、ウィルス性増殖因子、たとえば
ワクシニアウィルス、ショープ繊維腫；ヘビ毒増殖停止
性ペプチド、脳由来性ペプチド、免疫グロブリン及びそ
のフラグメント、及び同様のものを含むことができる。
対象の遺伝子が所望する対象の遺伝子の天然の転写及
び翻訳調節領域を認識する宿主に発現される予定である
場合、その天然５′及び３′−調節領域を有する完全な
遺伝子が、適切な発現ベクター中に導入され得る。しか
しながら、その遺伝子が天然の転写及び翻訳調節領域を
認識する宿主中に発現される予定である場合、追加の操
作が必要とされるであろう。対象の遺伝子から上流の非
コード５′−領域は、エンドヌクレアーゼによる制限、
Bal31による制限又は同様のものにより除去され得る。
他方の便利な制限部位が対象の遺伝子の５′−末端近く
に存在する場合、対象の遺伝子が制限され、そしてアダ
プターがプロモーター領域に対象の遺伝子を結合するた
めに使用される（この際、そのアダプターは対象の遺伝
子の欠失ヌクレオチドを提供する）。種々の３′−転写
調節領域が知られていて、そして停止コドンから下流に
挿入され得る。
対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、所望す
るコード配列を定義するために一緒に連結され得るオー
バーラッピング性一本鎖を付与する従来の技法を用いて
合成され得る。その末端は、制限部位を付与するように
計画され、又は一端又は両端が発現ベクターの相補的末
端への連結のためにブラント末端化され得る。その配列
の発現のためには、開始メチオニンが付与される。発現
ベクターは一般的に入手でき、そして文献中に十分に記
載されている。
対象の遺伝子を合成する代わりに、遺伝子が種々の技
法により単離される。これらは、対象のポリペプチドを
コードする宿主生物体からのmRNAの単離を含み、そのmR
NAが逆転写され、その得られた一本鎖（ss）DNAは二本
鎖（ds）DNAを調製するための鋳型として使用され、そ
してそのds DNAが単離される。もう１つの技法は、宿主
細胞のゲノムDNAの断片を単離し、そして適切に分離
し、対象のポリペプチドをコードする遺伝子において最
っとも保存された配列の領域を含んで成るプローブを用
いて、宿主細胞ゲノムにおける対象のポリペプチドをコ
ードする配列を同定することを含む。そのプローブは、
完全な配列よりも相当に短かいがしかし少なくとも10
個、好ましくは少なくとも14個、より好ましくは少なく
とも20個のヌクレオチドの長さであるべきである。より
長いオリゴヌクレオチド、すなわち対象のポリペプチド
をコードする遺伝子の完全な長さまでのオリゴヌクレオ
チドがまた有用である。DNA及びRNAプローブの両者が使
用され得る。
使用する場合、プローブは典型的には、検出可能な態
様で（たとえば32P−ラベルされた又はビオチニル化さ
れたヌクレオチドにより）ラベルされ、そして遺伝子が
見出される生物体からの一本鎖DNA又はRNAと共にインキ
ュベートされる。ハイブリダイゼーションは、一本鎖及
び二本鎖（ハイブリダイズされた）DNA又はDNA/RNAが典
型的にはニトロセルロース紙を用いて分離された後、ラ
ベルにより検出される。オリゴヌクレオチドと共に使用
するための適切なハイブリダイゼーション技法は、当業
者に良く知られている。
プローブは、通常、容易な同定と可能にする検出可能
なラベルと共に使用されるけれども、ラベルされたプロ
ーブの前駆体として及びDNA又はDNA/RNAの直接的な検出
を提供する方法に使用するためには、ラベルされていな
いオリゴヌクレオチドがまた、有用である。従って、用
語、“オリゴヌクレオチド”とは、ラベルされた形及び
ラベルされていない形の両者を言及する。
所望するDNA配列が得られた後、それは、発現を付与
するために種々の方法で操作され得る。たとえば、キメ
ラ性ポリペプチド配列は、天然に存在するポリペプチド
鎖に実質的に類似する配列を有する少なくとも２種のポ
リペプチドの遺伝子フラグメントを組合すことによって
調製され得る。ポリペプチドの立体構造体、特に対象の
ポリペプチドの生物学的活性を担持することができる構
造体の一部を保持することが高く所望される。フラグメ
ントの源及び所望するポリペプチドの長さに依存して、
便利な制限部位が、キメラ性ポリペプチドを構成するた
めに使用される合成遺伝子中に予定される。可能な場
合、制限部位は、未変性ポリペプチドのアミノ酸配列を
残す。しかしながら、多くの場合、新しい制限部位の導
入により、タンパク質の活性を変えないで、変性された
アミノ酸配列を付与することができる。
発現カセットの構成の間、DNAの種々のフラグメント
が通常、DNAの増幅、DNAの変性又は配列、リンカー又は
同様のものの連結又は除去による操作を可能にする適切
なクローニングベクター中にクローンされるであろう。
通常、ベクターは、細菌中において比較的高いコピー数
で複製することができるであろう。多くのベクターは、
グラム陰性細菌、特にE.コリにおけるクローニングのた
めに容易に利用でき、そのようなベクターとして、pBR3
22,pACY184,M13,Charon4A及び同様のものが存在する。
そのクローニングベクターは、宿主細菌中て機能する効
果的複製システムを有することにより特徴づけられる。
クローニングベクターは、少なくとも１つのユニーク
な制限部位、通常多くのユニークな制限部位を有し、そ
してまた多重制限部位も含むことができる。さらに、ク
ローニングベクターは、形質転換体の選択を提供する１
又は複数のマーカーをを有するであろう。そのマーカー
は通常、細菌毒性物質、たとえば抗生物質、重金属、ト
キシン又は同様のものに対する耐性、栄養要求性宿主の
相補性又はファージに対する免疫性を付与するであろ
う。ベクター及びカセットの適切な制限及び適切なよう
にその末端の変性により、ブラント末端を付与するため
にオーバーハングをチューイングバックし又はフィルイ
ンすることによって、リンカーの付加により、連結する
ことによって、相補性末端が発現カセット又はその成分
へのベクターの連結を付与され得る。
カセットの進行におけるDNAのそれぞれの操作の後、
プラスミドはクローン化され、そして単離され、そして
必要な場合、特定のカセット成分が、正しい配列が得ら
れたことを確めるためにその配列について分析されるで
あろう。操作の性質に依存して所望する配列がプラスミ
ドから切断され、そして異なったベクター中に導入さ
れ、又はプラスミドが制限され、そして発現カセット成
分が適切なように操作される。
多くの場合、シャトルベクター（ここで該ベクターは
異なった複製システムを必要とする異なった宿主におい
て複製することができる）が使用されるであろう。これ
は、２種の宿主において機能する追加のマーカーを必要
とするかも知れないが又は必要としないかも知れない。
そのようなマーカーが必要とされる場合、これらはベク
ター中に含まれ、プラスミドがカセットを含む場合、２
種の複製システム又はマーカーが必要に応じ、１つの宿
主から他の宿主にトランスファーされ得る。選択のため
には、いづれかの有用なマーカーが使用され得る。所望
により、ネオマイシン又はテトラサイクリに対する耐久
が興味の対象である。しかしながら、選択のためのマー
カーは便利さのためにひじょうに所望されるけれども、
形質転換された細胞をスクリーニングするための他の方
法が記載されている。たとえば、G.Reipinなど.,Curren
t Genetics（1982）189〜193を参照のこと。形質転換さ
れた細胞はまた、それらが製造する特定の生成物により
スクリーンされ、たとえば所望する生成物の合成が免疫
学的又は酵素学的方法により測定され得る。
発現カセットは、適切は細胞宿主においてエプゾーム
維持のために複製システム内に含まれ、又は複製システ
ム外に供給され得、ここでそれは宿主ゲノム中に組み込
まれるようになる。DNAは、既知の技法、たとえばリン
酸カルシウム−沈殿DNAを用いて形質転換、細胞とウィ
ルスとを接触することによるトランスフェクション、細
胞中へのDNAのマイクロインジェクション及び同様の技
法に従って宿主中に導入され得る。
対象の遺伝子が適切な宿主中に導入された後、宿主は
対象の遺伝子を発現するために増殖される。種々の原核
生物宿主が使用され得る。種細胞は、グラム陰性生物、
たとえばE.コリ、たとえばJM 109,JM 101及び107;HB 10
1,DH 1又はDH 5を包含する。グラム陰性生物、たとえば
細胞周辺腔を有さず、そいて増殖培地中にポリペプチド
を直接的に分泌するB.サブチリス（B.Subtilis）が特に
好ましい。
宿主細胞は、適切な栄養培地中において高密度に増殖
され得る。プロモーターが誘発性である場合、許容状
態、たとえば温度変化、代謝生成物又は栄養物の消耗又
は過多又は同様のものが使用されるであろう。たとえ
ば、調節配列がバクテリオファージλPLプロモーター、
バクテリオファージOLオペレーター及びCI 857温度感受
性リプレッサーを含む場合、宿主細胞が許容温度、一般
的に約30℃で増殖され、この温度でPLプロモーターから
の転写が抑制され、そして宿主細胞が、さらに、宿主生
物に対して毒性であるかも知れない外来性遺伝子生成物
の合成の要求により妨げられないまま増殖するかも知れ
ない。宿主細胞が最適密度に達した場合、その温度は非
許容温度、たとえば約42℃に上げられ、この時、CIリプ
レッサーが不活性化され、PLプロモーターからの転写を
可能にする。
最大の分泌は、lacプロモーター又はtrp−lacプロモ
ーターを用いることにより及びlac+宿主株のための代謝
インデューサー、たとえばタクトースによる誘発により
並びにベクター上にlac I qを供給することによって得
られる。このシステムと共に使用され得る宿主細胞の例
として、DH 1,DH 5又はHB 101を挙げることができる。
生成物が宿主細胞中に保持される場合、細胞が収穫さ
れ、溶解され、そして生成物が単離され、そして抽出
法、沈殿法、クロマトグラフィー処理法、電気泳動法及
び同様の方法により精製される。生成物が細胞周辺腔中
に分泌される場合、細胞は収穫され、そして生成物が細
胞壁の破壊により、たとえば低張ショック及び同様の方
法により生ぜしめられる。生成物が培地中に分泌される
場合、栄養培地が集められ、そして生成物は従来の手
段、たとえばアフィニティークロマトグラフィーにより
単離される。活性タンパク質を生成するためには、タン
パク質の再生を可能にする必要がある。タンパク質がリ
ーダー配列との融合タンパク質として発現される場合、
リーダー配列は、たとえば蟻酸又は臭化シアンによる処
理により除去され得る。リーダー配列は好ましくは、タ
ンパク質の再生の後、除去される。
次の例は、例示的であって、限定するものではない。
実験内容の表 生物学的寄託物 方 法 例 I. 活性アッセイ A.マイトジェンアッセイ B.軟寒天コロニー増殖刺激アッセイ C.EGF受容体結合阻害アッセイ D.創傷の治療 1.中間−皮膚熱損傷 2.中間−皮膚供与体移植片損傷 E.DNA合成の阻害 F.ヌードマウスにおける腫瘍増殖の阻害 例 II. クローニング及び発現プラスミの構成 A.プラスミドpBM 11 1. pBM4の構成 2. pBM8の構成 3. pBM9の構成 4. pBM 10の構成 5. pBM 11の構成 B.pBM11M4の構成 1. pBM 11/Mの構成 2. pBM 11/M1の構成 3. pBM 11/M2の構成 4. pBM 11/M3の構成 5. pBM 11/M4の最終構成 C.pBM11M5の構成 D.pBM 11/Cシリーズの構成 E.pBM 11/NDPの構成 F.pBM16tの構成 G.pBM 16/NDPの構成 H.pBM 11/PAD（またpBM11M3/PADとも呼ばれる）の構成 I.pBM 14の構成 1. pBM 12の構成 2. pBM 13の構成 3. pBM 14の最終構成 J.プラスミドpLEBam K.プラスミドplac/cro−β gal L.プラスミドptac/cro−β gal M.プラスミドJacPak N.プロスミドpTCPt O.プラスミドpTNPt 1. pBM16tの調製 2. Hind III部位を欠くpBM16t/GFaの2.8KbのEcoR I
−BamH Iフラグメントの調製 3. pBM 11/PAKAの150bpのBamH I−Bsm Iフラグメン
トの調製 4. オリゴヌクレオチドTacA+及びTacA-の調製 5. pTNPtの連結及び単離 例 III. 対象の遺伝子の調製 A.合成増殖因子遺伝子 1. TGF合成オリゴヌクレオチド 2. VGF合成オリゴヌクレオチド 3. EGF合成オリゴヌクレオチド 4. アッセンブリー増殖因子遺伝子 B.合成血小板因子４遺伝子 C.オンコスタチンＭのDNAクローニング 1. cDNAライブラリーの調製 2. 制限部位地図 3. オンコスタチンＭのDNA配列 4. RAN分析 例 IV. Ｎ−タンパク質を有する融合タンパク質としての対象の
ポリペプチドの発現 A.変性された合成TGF 1. pBM 11/N/TGFの調製 B.変性された合成TGF−VGFハイブリッド 1. pBM 11N/TTVの調製 C.合成血小板因子４ 1. pBM 11/N/PF4の調製 例 V. Ｎ−タンパク質及び切断部位を有する融合タンパク質と
しての対象のポリペプチドの発現 A.変性された合成VGF 1. pBM 11/NDP/VGFAの調製 2. pBM 11/NDP/VGFaの調製 B.変性された合成TGF−VGFハイブリッド 1. pBM 11/NDP/TTVの調製 2. pBM 11/NDP/VTVの調製 3. pBM 16/NDP/TVVの調製 C.合成EGF 1. pBM 11/NDP/EGFの調製 D.合成血小板因子４（PF4） 1. pBM 11/NDP/PF4の調製 E.オンコスタチンＭ 1. pBM 16/NDP/OncoMの構成 2. pBMX/OncoMの調製 例 VI. 変性されたアルカリホスファターゼシグナル配列を有す
る融合タンパク質としての対象のポリペプチドの発現 A.pBM 11/PAD/EGFの調製 1. EGFの0.17KbのEcoR I−BamH Iフラグメントの調
製 2. pBM 11/PADの0.5KbのPvu I−Hind IIIフラグメン
トの調製 3. pBM 11/PADの5.2KbのPvu I−Bamrl Iフラグメン
トの調製 4. pBM 11/PAD/EGFの連結及び単離 B.pBM 11/PAD/OncoMの調製 1. 変性されたオンコスタチンＭ遺伝子フラグメント
の調製 2. pBM11M3/PADフラグメントの調製 3. pBM 11/PAD/OncMの連結及び単離 C.pBM 11/PAD/nVGFaの調製 1. Hind III−Pvu Iにより消化されたpBM 11/PADの
0.5Kbフラグメントの調製 2. pBM 11プラスミドの5.2KbのPvu I−BamH Iフラグ
メントの調製 3. 合成VGFa遺伝子の170bpのNco I（ブラント）−Ba
mH Iフラグメントの調製 4. pBM 11/PAD/nVGFaの連結及び単離 D.pBM 11/PAD/PF4の調製 例 VII. アルカリホスファターゼシグナル配列を有する融合タン
パク質としての対象のポリペプチドの発現 A.pBM 11/PAK/nVGFaの調製 B.pBM 11/PAK/EGFの調製 C.TacPak/EGFの調製 例 VIII. 転写終結領域を含む発現カセットを用いて、アルカリホ
スファターゼシグナル配列を有する融合タンパク質とし
ての対象のポリペプチドの発現 A.pTCPt/EGFの調製 1. TacPak/EGFの420bpのHind III（ブラント）−Bam
H Iフラグメントの調製 2. pBM16t/NDP/VGFaの2.8KbのEcoR I（ブラント）−
BamH Iフラグメントの調製 3. pTCPt/EGFの連結及び単離 B.pTCPt/nVGFaの調製 1. pBM 11/PAK/nVGFaの350bpのPvu I−BamH Iフラグ
メントの調製 2. pTCPt/EGFの2.8KbのPvu I−BamH Iフラグメント
の調製 3. pTCPt/nVGFaの連結及び単離 C.pTNPt/EGFの調製 1. pTNPtの2.8KbのPvu I−BamH Iフラグメントの調
製 2. pBM 11/PAK/EGFの300bpのPvu I−BamH Iフラグメ
ント調製 3. pTNPt/EGFの連結及び単離 例 IX. 組換えポリペプチドの単離 A.PLプロモーター及びCIリプレッサーを用いてpBM−基
礎ベクター中に産生される増殖因子 1. TGF及び変性されたTGF a. N/TGF 2. 変性され、そして切断されたVGF a. PAD/nVGFa b. NDP/VGFa c. VGFa d. NDP/VGFA 3. キメラ性TGF/VGFハイブリッド a. N/TTV b. NDP/TTV c. NDP/VTV d. NDP/TVV B.tac又はlacプロモーターを含むベクター中に産生され
る増殖因子 1. PAK/EGF 2. PAK/nVGFa C.血小板因子４ 1. N/PF4 2. NDP/PF4 D.オンコスタチンＭ 1. NDP/オンコスタチンＭ 2. PAD/オンコスタチンＭ 例 X. 原核生物細胞中で調製された組換え増殖因子の生物学的
活性 A.EGF受容体結合 1. キメラ性ペプチドの受容体結合 B.マイトジェン活性 C.創傷の治療 1. 中間−皮膚損傷 2. 中間−皮膚供与体−移植片損傷 例 XI. 原核生物細胞中で調製された組換え血小板因子４の生物
学的活性 A.DNA合成の阻害 B.ヌードマウスにおける腫瘍の増殖の阻害 例 XII. 原核生物細胞中で調製された組換えオンコスタチンＭの
生物学的活性 A.生理化学的特徴 1. SDS−PAGE B.組換えオンコスタチンＭの増殖阻害活性 C.組換えオンコスタチンＭの受容体結合活性 生物学的寄託物 すべてE.コリHB101中に形質転換された次の発現プラ
スミドが、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（American Type Culture Collection）（12301 Parkla
wn Drive,Rockville,MD 20852）に、指示された日に寄
託され、そして下記に示される寄託番号及びATCC名称を
有する： 方 法 Mariatisなど.,1982“Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual",Cold Spring Harbor Laboratory,CSH,New Y
orkに記載される一般的なクローニング技法を用いた。
すべてのDNA−変性酵素は、市販されている。それらは
製造業者の指示に従って使用された。DNA精製及び分離
のための材料及び装置は、供給業者からの指示に従って
使用された。
例 I. 活性アッセイ A.マイトジェン活性 マイトジェン誘発アッセイを次の通りに行なった：新
生児の***の外植片から得られた二倍体のヒト繊維芽細
胞を３×104個の細胞／ウェルの密度で接種し（96−ウ
ェルプレート、Nanclon,Roskilde,Denmark）、そしてダ
ルベッコの変性イーグル培地（GIBCO）/10％ウシ血清中
に集密的になるまで増殖した。次に、培養物を、0.2％
のウシ血清を含む培地中に入れ、そして２日後、試験さ
れるべき種々の濃度の増殖因子を添加した。８時間後、
培養物を５〔125I〕ヨード−２′−デオキシウリジン
（Amersham,10μCi/ml,5Ci/mg;1Ci＝37GBq）によりラベ
ルし、そしてTCA不溶性物質中に組込まれる同位体の量
を、Twardzikなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）18
2:5300〜5304に記載のようにして測定した。
B.軟寒天コロニー増殖刺激アッセイ 増殖培地中における0.5％寒天（Agar Noble;Difco La
boratories,Detroit,Michigan）の基層0.5mlを、24−ウ
ェルCostar組織培養プレートに添加した。１〜1.5×104
個の細胞/mlのNRK細胞又は他の対象の細胞系及び試験さ
れるべき種々の濃度の因子を含む増殖培地中における0.
3％寒天0.5mlを、寒天の基層上にオーバーレイした。そ
のプレートを空気中において５％CO2の加湿雰囲気下で3
7℃でインキュベートし、そして試験されるべき同じ濃
度の因子を含む増殖培地中における0.3％寒天0.5mlの添
加により、７日後再び栄養を与えた。コロニーを固定し
ないで及び染色しないで計数した。６個以上の細胞を有
するコロニーの数を計数した。
C.EGF受容体結合阻害アッセイ ラジオレセプターアッセイを次の通りに行なった： 標的細胞の単層上で125I−ラベル化増殖因子のその受
容体への結合を、Cohen及びCarwenter,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1975）72:1317〜1321に記載の方法に従って変
性した。細胞（１×103/ウェル）を、アッセイの前、リ
ン酸緩衝溶液中、10％ホルマリンを有する24−ウェルプ
レート（Linbro,Flow Laboratories）上に固定した。ホ
ルマリン−固定された細胞は、固定されていない細胞と
同じように容易にプレートから脱離せず、そして従って
複数値はより一定であった。増殖因子の濃度は、ml当た
りの生来の増殖因子のng当量として、すなわち既知量の
生来の増殖因子により生成される増殖因子結合の阻害性
に等しい125I増殖因子結合の阻害性を生成するのに必要
とされる量として表わされる。
D.創傷の治療 1. 中間−皮膚熱損傷 中間−皮膚熱損傷を、麻酔された雌のヨークシャブタ
（30ポンド）（この背中は短く刈られ、そして市販の毛
除去クリームにより脱毛されている）の背側の胸郭部上
に作った。黄銅型板（３×3cm,147g）を70℃の水浴中で
平衡化し、そして正確に10秒間、皮膚と堅く接触せしめ
た。次にその得られた水疱を除いた。５個の中間−皮膚
やけどを背骨のそれぞれの側上に生ぜしめ、そしてお互
いから約１インチ分けた。やけどを、１日２度、約3ml
のビークルクリーム（Silvadene ）のみにより又は増
殖因子を含むビークルクリームにより治療し、又は未治
療のままにした。治療の９日後は10日後、ブタに麻酔を
かけ、そして焼痂をそのやけどから除いた。バイオプシ
ーを、再上波形成したそれぞれのやけど部分から採取し
た。
2. 中間−皮膚供与移植片損傷 ５か月の20.5kgのミクロブタを、20mg/kgのケタミン
及び2mg/kgのRompumにより麻酔をかけた。背側の胸郭部
の毛を刈り、ベータジンにより準備し、そして食塩水に
より十分にすすいだ。一連の６個の５×5cm供与体部分
を、30/1000インチで２回強打することによって、650/1
000インチでPadgettデルマトームにより背側の胸郭部の
それぞれの側上に作った。局部治療が、左側の６個の傷
の間に食塩水1ml中、Silvadene 20gを均等に分布する
ことによってほどこされた。右側を、６個の傷の間に均
等に分布される20gのSilvadene 中、試験されるべき増
殖因子1mlにより治療した。すべての傷を、大きなやけ
ど用包帯、チャックス、エースラップ及びガーキンによ
りおおった。その動物を、実施後、1,2,3,4,7,8,9,10及
び11日目に上記のようにして麻酔をかけた。傷を、ベー
タジンにより軽くふき、そして食塩水により十分にすす
いだ。適切な薬剤を適用し、そして傷を上記のようにし
て再び包帯でおおった。
E.DNA合成の阻害 ２日目の朝、Nunc 96−ウェルプレート（Kamstrupvej
90.DK−4,000,Roskilde,Denmark）中に、A549細胞（ヒ
ト肺癌）を生ぜしめた。これらの細胞を、30個よりも少
ない場合、継代した。周辺ウェルを除くすべてのウェル
中に導入し、４×103個の細胞/50μl/ウェル〔10％FCS,
P/S、グルタミンを含むアッセイ培地（DMEM）ml当たり
９×104個の細胞〕にした。PBS 50μｌを受けた周辺ウ
ェル及び全プレートを37℃でインキュベートした。午
後、試験化合物を、アッセイ培地中に再懸濁した。すべ
ての化合物を三回試験した。それぞれの試験ウェル中
に、アッセイ培地中、試験化合物50μｌを導入し、そし
て対照ウェルは50μｌのアッセイ培地のみを受けた。次
に、それぞれのプレートを、37℃で３日間インキュベー
トした。４日目、それぞれのウェル中に、125I−ヨード
−２′−デオキシウリジン（4Ci/mg〜0.5mCi/ml）（１
μｌの同位体/mlアッセイ培地）の溶液50μｌを添加
し、そしてそのプレート37℃で一晩インキュベートし
た。５日目、培地をウェルから吸い出し、そしてウェル
をPBSにより洗浄した。100μｌのメタノールを室温で10
分間にわたって添加した。メタノールを吸い出し、そし
て1Mの水酸化ナトリウム200μｌをそれぞれのウェルに
添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、
そして水酸化ナトリウムをTiteFlekプラグ（Flow Lab
s）により除いた。次に、そのプラグをγカウンターに
より計数した。
F.ヌードマウスにおける腫瘍増殖の阻害 雄のヌードマウス（Balb/c−nu+/nu+）は、Fred Hntc
hinson Cancer Research Cenfar、シアトル、ワシント
ンにより供給された。12週で、マウスは、リン酸緩衝溶
液0.2mlの体積中、約1.3×106個のヒト肺癌細胞（A54
9）により首の部分に皮下注射された。明らかにわかる
腫瘍（約10mm3）が通常、20日で進展した。それぞれの
グループは５匹の動物を含んだ。動物は、PBS 0.1ml
（対照グループ）又はPBS 0.1ml中に再懸濁された試験
サンプル（1.2μg/注射）により腫瘍部位で２又は３日
ごとに注射された。処理後１日目が初日に相当し、そし
て動物は試験化合物により腫瘍部位で注射された。腫瘍
の大きさは、指示された日、続く注射の前、測定され、
そしてグループ中のそれぞれの動物の腫瘍の平均サイズ
を表わす。
例 II. クローニング及び発現プラスミドの構成 A.プラスミドpBM 11 プラスミドpBM 11は、バクテリオファージλＮタンパ
ク質の初めの33個のＮ−末端アミノ酸をコードするヌク
レオチド配列を含む。それはまた、選択マーカーとして
ネオマイシン耐性遺伝子及びλPLプロモーターから下流
に外来性遺伝子のクローニングのためのユニークBamH I
部位も含む。pBM 11は次の通りにして構成された。
1. pBM4の構成 バクテリオファージλc Iをコードする遺伝子配列を
含む2.4KbのDNAフラグメントが、37℃で２時間、混合物
をインキュベートすることにより、170単位のBgl II（B
RL）制限酵素により120μｇのλc I 857S7 DNA（New En
gland BioLabs）を消化（切断）することによって単離
された。その消化混合物を、従来の組換えDNA技術を用
いて１％分離用アガロースゲル上で電気泳動にゆだね
た。2.4Kbのフラグメント（塩基対35771〜38103;番号は
Dariel,など.,ラムダIIにおけるPq.519,Hendrix,Robert
s,Stahl,及びWeisberによる編集に基づく）を、gelから
切り出し、そして室温で４時間、100Vでの電気溶離にゆ
だねた。その得られた溶出物を回収し、濃縮し、そして
フェノール：クロロホルム（1:1）の等体積により３度
抽出した。DNAを、1/10体積の3Mの酢酸ナトリウム（pH
5.2）の存在下でエタノール沈殿法により水性相から回
収した。フラグメントの回収率は、アガロースゲル電気
泳動により分析された。
プラスミドpPL−λ（５μg,Pharmacia）〔左方向への
λプロモーターPL,λＮ遺伝子及びＮ（TL）及び2BamH I
部位の転写のための終結部位を含むpBR322誘導体〕を、
37℃で20分間、その混合物をインキュベートすることに
よって５単位のBamH Iにより消化した。その消化された
DNAをアガロース−電気泳動により分離し、そして十分
な長さのDANを当業者に良く知られている技法を用いて
電気溶離により回収した。
線状化されたpPL−λを、アルカリホスファターゼに
より処理し、５′リン酸を除き、そしてリガーゼ緩衝液
（500mMのTris−HCl,pH7.8,100mMのMgCl2,200mMのDTT,1
0mMのATP）及T4 DNAリガーゼ（BRL）の存在下でc I 857
1S7からの2.4KbのBgl IIフラグメント（３μl,約250n
g）に連結した。その得られた反応混合物を12℃で約15
時間インキュベートし、次にコンピテントE.コリHB101
細胞中への形質転換のために直接使用した。
E.コリ細胞を、Hanahan,J.Mol,Biol.，（1983）166:5
57〜580により記載される方法の変法によりコンピテン
トにした。HB 101細胞の飽和培養物を、20mMのMgCl2に
より補足されたルリアブイヨンにより1:200に希釈し、
そして培養物が0.3の光学密度（OD）（nmA550）に達す
るまで、旋回水浴中において37℃でインキュベートし
た。20mlの培養物を、４℃で遠心分離することによって
収穫した。その得られたペットを、氷で冷却された50mM
のMgCl2/20mMの酢酸カリウム（pH6.0）溶液4ml中に再懸
濁し、そして氷上に15分間維持した。その細胞を遠心分
離し、そしてそのペレットを10mMのカリウムメタンスル
ホネート、pH6.2,100mMの塩化カリウム、45mMのMnCl2・
4H2O,10mMのCoCl2,3mMのヘキサミンCoCl3,100μｌのDMS
O及び100μｌの1MのDTTの溶液1.4ml中に再懸濁した。
その処理された細胞300μｌを、４μｌ及び６μｌの
連結混合物に添加した。その処理された細胞を30分間氷
上に置き、42℃で90秒間インキュベートし、そして次に
氷上に90秒間再び置いた。次にその細胞を、100μg/ml
のアンピシリンにより補充されたＬ−ブイヨン寒天プレ
ート上に置いた。挿入体を含む細菌形質転換体について
スクリーンするための早く且つ便利な方法は存在しない
ので、形質転換体をHolmes及びQuigley,Anal.Bioche
m.，（1981）114,193〜198の急速なプラスミドDNA単離
方法により種々のDNAを単離することによりスクリーン
した。“正しい”大きさで移動する組換え細菌からのプ
ラスミドDNA調製物を制限地図分析により分析し、挿入
体の配向を決定した。
2. pBM8の構成 プラスミドpBR322（５μｇ）を、Pst I（３μl,New E
ngland BioLabs）により消化し、続いて1:1（V:V）のフ
ェノール：クロロホルム溶液を用いて３回の連続した抽
出を行ない、続いてエーテルにより２回抽出した、消化
の完成に伴って沈殿せしめられたDNAを、0.8％アガロー
スゲル上で電気泳動により分析した。Pst Iにより消化
されたpBR322（10μｌ）をT4ポリマラーゼ（１μl,BR
1）により処理し、３′突出末端をブラント末端に転換
した。Hind III部位を、リン酸化された合成Hind III＊
リンカー（５′−ｄ〔CAAGCTTG〕）（Pharmacia）の連
結によりpBR322のPst I部位で導入した。その得られたD
NAを、過剰のHind IIIにより消化した。２種のDNAフラ
グメント、3.58Kb及び782bpのフラグメントを得た。3.5
8Kbのフラグメントを単離し、連結し、そしてコンピテ
ントE.コリHB101中に形質転換した。形質転換体を、ア
ガロースゲル上でHind III消化性DNAを分離することに
よって上記のようにして分析した。
3. pBM19の構成 プラスミドpBM8を、Hitd III及びBamH Iにより消化
し、２種のDNAフラグメントを得た。3.23Kbの長い方の
フラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離し、
そして電気溶離により回収した。プラスミドpNeo（Phar
macia）をHind III及びBamH Iにより消化し、ネオマイ
シン耐性をコードする遺伝子配列を含む1.5Kbのフラグ
メントを得た。1.5Kbのフラグメントを単離し、そして
精製し、次にpBM8からの3.23Kbのフラグメントに連結し
た。その得られたプラスミド、pBM9をコンピテントE.コ
リHB101中に形質転換し、そしてその形質転換体を前記
のようにしてスクリーンした。
4. pBM10の構成 プラスミドpBm9を、Nde I（New Englad BioLabs）に
より消化した。５′突出末端を、E.コリのDNAポリマラ
ーゼ“クレハウ”フラグメントを用いてブラント末端に
転換し、そしてフィルインされたNde I部位でリン酸化
された合成EcoR Iリンカー（５′−ｄ〔GGAATTCC〕−
３′）に連結した。その得られたプラスミド、pBM 10を
コンピテントE.コリHB 101中に形質転換し、そしてその
形質転換体を前記のようにしてスクリーンした。
5. pBM 11の最終構成 プラスミドpBM 10を、EcoR I及びBamH Iにより完全に
消化した。ネオマイシン遺伝子及び複製の起点を含むそ
の得られた2.8Kbのフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動により単離し、そして電気溶離により回収した。
プラスミドpBM4（上記）を、EcoR I及びBamH Iにより完
全に消化した。c I遺伝子及びλPLプロモーター並びに
Ｎ遺伝子リボソーム結合部位のためのDNA配列を含む2.8
4Kbのフラグメントを単離し、そして回収した。次にそ
れを、2.84KbのpBM4フラグメントに連結し、pBM 11を形
成した。プラスミドpBM 11をコンピテントE.コリHB101
中に形質転換し、そしてその得られた形質転換体を上記
のようにしてスクリーンした。pBM 11を含む細胞を、Ba
mH Iによる制限酵素分析によりさらにスクリーンした。
B.pBM11M4の構成 このプラスミドはpBM 11に由来し、そしてＮ遺伝子の
開始メチオニンのすぐ後のBamH I制限部位で外来性遺伝
子のクローン化を可能にする。プラスミドpBM 11/M4は
また、ネオマイシン遺伝子のNco I部位も含む。それを
次の通りにして構成した： 1. pBM 11/Mの構成 プラスミドpBM11（20μｇ）を、BamH I及びPvu Iによ
り切断した。消化が完結した後、DNAを0.8％のアガロー
スゲルを通して電気泳動し、そして大きなフラグメント
（5124bp）を単離し、そして電気溶離により回収した。
pBM11（10μｇ）の第２サンプルをSph Iにより完全に消
化し、そして３′突出末端をT4 DNAポリマラーゼにより
ブラント末端に転換した。前記２種のフラグメントのそ
れぞれ0.3μｇを、制限部位EcoR I,Nde I及びBamH Iを
含む。37.5pモルのリン酸化された合成オリゴデオキシ
ヌクレオチド（Pharmacia P−L Biochemical）,5′AGGA
GAATTCATATGGATCCACAA 3′と共に混合した。その得られ
れたプラスミドを、pBM 11/Mと命名した。そのプラスミ
ドpBM 11/Mを100℃で３分間加熱し、次に連続的に次の
通りに冷却した:30℃で30分間、４℃で30分間及び０℃
で10分間。再アニールされたDNAを続いて、T4 DNAリガ
ーゼにより処理し、そしてE.コリHB 101中に形質転換し
た。ネオマイシン耐性形質転換体を、合成オリゴヌクレ
オチドによりコードされる新しい３種の制限部位を含む
プラスミドについてスクリーンした。
2. pBM 11/M1の構成 プラスミドpBM 11/MをBamH Iにより完全に消化し、次
に0.7％のアガロースゲルを通して電気泳動した。大き
なフラグメント（5554bp）を単離し、そして電気溶離に
より回収した。リボソーム結合性翻訳開始部位から下流
にλＮ遺伝子の100bp領域を欠くその得られたプラスミ
ドを、pBM 11/M1と命名した。プラスミドpBM 11/M1を再
連結し、そしてコンピテントE.コリHB101中に形質転換
した。
3. pBM 11/M2の構成 プラスミドpBM11（0.3μｇ）の第１サンプルを、BamH
I及びPvu Iにより切断した。プラスミドpBM11（0.3μ
ｇ）の第２サンプルをSph Iにより切断し、そして次にT
4ポリマラーゼにより処理した。これらの２種のサンプ
ルを、BamH I部位のみを含み、3.75pモルのリン酸化さ
れた合成オリゴデオキシヌクレオチド（Pharmacia P−L
Biochemical）,5′AGGAGAATCCAGATGGATCCACAA 3′と共
に混合した。その混合物を加熱し、そして上記のように
して冷却し、そしてT4DNAリガーゼ及びE.コリDNAポリマ
ラーゼ“クレノウ”フラグメントにより処理した。pBM
11/M2と命名されたその得られたプラスミドを、コンピ
テントE.コリ＝HB 101中に形質転換した。マイオシン耐
性コロニーを、合成オリゴデオキシヌクレオチドにより
コードされる新規のBamH I部位を含むプラスミドについ
てスクリーンした。
4. pBM 11/M3の構成 プラスミドpBM 11/M2をBamH Iにより完全に消化し
た。切断されたDNAを0.7％アガロースゲルを通して電気
泳動し、そして大フラグメント（5554bp）を単離し、そ
して電気溶離により回収した。再連結され、そしてpMB
11/M2として命名されたDNAをコンピテントE.コリHB101T
中に形質転換した。
5. pBM 11/M4の最終構成 プラスミドpBM 11/M1（20μｇ）を、EcoR I及びBamH
Iにより完全に消化し、次に0.7％アガロースゲルを通し
て電気泳動した。大フラグメント（5544bp）を単離し、
そして電気溶離により回収した。このDNAを、Nco I部位
を含む次のリン酸化された合成オリゴデオキシヌクレオ
チド（それぞれ200pモル）の対に連結した： その混合物を65℃に加熱し、そしてアニールするために
25℃への冷却を可能にした。pBM 11/M4と命名されたそ
の得られたプラスミドを、コンピテントE.コリHB101中
に形質転換した。ネオマイシン耐性コロニーを、新規の
Nco I部位を含むプラスミドについてスクリーンした。
C.pBM 11/M5の構成 プラスミドpBM 11/M5は、pBM 11に由来した。ネオマ
イシン耐性遺伝子に存在するNco I部位は、意図された
突然変異誘発により除去されている。プラスミドpBM 11
/M5はpBM 11/M4と同一である。但し、ネオマイシン遺伝
子中のNco I部位が、部位特異的突然変異誘発により除
去されている。従って、pBM 11/M5中への外来性遺伝子
のクローニングは、Nco Iによるそのベクターの部分消
化を必要としない。
D.pBM 11/Cシリーズの構成 E.コリコンセンサスリボソーム結合部位を含むpBM 11
プラスミドを生成し、そして“pBM 11/C"として命名し
た。プラスミドpBM11（30μｇ）を、80μｇのPvu I及び
192単位のBamH Iにより消化した。その得られた２種の
フラグメト（5.1Kb及び0.53Kb）を、ゲル電気泳動によ
り分離し、そして電気溶離により単離した。次に0.53Kb
のフラグメントを、Hae IIIにより消化した。その得ら
れたフラグメントをゲル電気泳動により分離し、そして
324bpのフラグメントを電気溶離により単離した。構成
体pBM11C,5.1Kb及び324bpのフラグメントを、プラスミ
ドpBM 11から単離し、そして化学的に合成されたリン酸
化リンカー、 を一緒に連結した。このようにして構成されたプラスミ
ドを、pBM 11/Cと命名する。プラスミドpBM 11/Cは、ク
ローニング部位として制限部位BamH I及びリボソーム結
合部位のスペーサー領域内にユニークなSsp I制限部位
を有する。スペーサーの長さは、タンパク質翻訳の効力
に影響を及ぼすことが報告されている。Ssp I部位の存
在は、スペーサー領域の長さの変化を可能にし、そして
また発現されるべき他の遺伝子のための他のクローニン
グ部位の挿入を可能にする。
プラスミドpBM 11/Cの変性をまた行なった。pBM 11/C
（10μｇ）を制限酵素Ssp I（45単位）により消化し、
そして５′ホスフェートをホスファターゼにより除去し
た。このDNAを、リン酸化された合成Nco Iリンカー、CC
ATGGに連結した。pBM11C/1と命名されたその得られたプ
ラスミドは、２個のNco I部位を含み、その１つはネオ
マイシン遺伝子中に存在し、そして他の１つは外来性遺
伝子のクローニングのためのものである。外来性遺伝子
のクローニングにおいてpBM 11/CIのNco Iによる部分消
化を避けるために、ネオマイシン遺伝子中のNco I制限
部位を、前記技法を用いて部位特異的突然変異誘発によ
り除去した。このプラスミドを、pBM 11/C2と命名す
る。
E.pBM 11/NDPの構成 プラスミドpBM 11に由来するプラスミドpBM 11/NDP
は、λＮタンパク質の初めの32個のアミノ酸をコードす
るヌクレオチド配列、続いて酸分解性アスパラギン酸−
プロリンジペプチドをコードするヌクレオチド配列を含
む。そのプラスミドは、PLプロモーターの下流に外来性
遺伝子をクローニングするためのNco I部位及びCla I部
位を含む。
F.プラスミドpBM16t このプラスミドは、pBM 11/NDPと同一である。但し、
それは上記のように（例II.F.）、ネオマイシン遺伝子
にNco I部位を欠いていて、そしてそれはプラスミドpTN
Ptについて記載されるように転写ターミネーターを含む
〔例（II.N.ターミネーター配列に関する）を参照のこ
と〕。
G.プラスミドpBM 16/NDPの構成 プラスミドpBM 11/NDP/VGFa（下記例V.A.I.を参照の
こと）を、Nco I及びBamH Iにより消化し、pBM 16/PPプ
ラスミドフラグメントから合成遺伝子TVVを除去した。
次にpBM 16/NDPのNco I−BamH Iの5.5Kbプラスミドフラ
グメントを、ゲル精製した。このフラグメント中のNco
I部位を、Ｎ−遺伝子の初めの32個のアミノ酸をコード
するヌクレオチド配列の下流に及び酸不安定性ジペプチ
ドAsp−Proをコードする配列のすぐ後に配置する。
H.pBM 11/PAD（またpBM11M3PADとも呼ばれる）の構成 このプラスミドは、pBM 11/M3に由来し、そして変性
されたアルカリホスファターゼシグナル配列から下流の
Hind III,Sma I又はBamH I部位での外来性遺伝子のクロ
ーン化を可能にする。合成オリゴヌクレオチドが、変性
されたアルカリホスファターゼシグナルペプチド及び３
種のクローニング部位（Hind III,Sma I及びBamH I）を
有するリンカー領域をコードするDNAを、PLプロモータ
ー及びＮ遺伝子リボソーム結合部位から下流のpBM 11発
現ベクター中に挿入することを可能にするように計画さ
れた。そのヌクレオチド配列は、λＮ遺伝子配列が有効
的なリボソーム開始及び翻訳のためにそのリボソーム結
合部位の配列により生ぜしめられるように、λＮ遺伝子
のアミノ末端のヌクレオチド配列にできるだけ類似する
ように最適化された。
シグナル配列をコードするオリゴヌクレオチドの配列は
下記に示される： オリゴヌクレオチドA1及びA2を、Applied Biosystems O
ligonucleontide Syntheszerにより合成し、そしてアク
リルアミドゲル上で精製した。そのオリゴヌクレオチド
を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端でリ
ン酸化し、そして次にお互いにアニールし、それぞれの
末端でBamH Iオーバーハングを有する二本鎖の0.067Kb
のDNAフラグメトを得た。
pBM 11/PADを次の通りに構成した： プラスミドpBM 11/M3（20μｇ）を、Ｎ遺伝子リボソ
ーム結合部位及び開始メチオニンのためのATGコドンの
すぐ後で、30単位のBamH Iにより消化し、プラスミドを
線状化した。５′ホスフェートを、ウシ腸のアルカリホ
スファターゼによる消化によ除去した。
0.067KbのPAオリゴヌクレオチドフラグメントを、前
記線状化されたpBM 11/M3プラスミドに連結し、そして
その得られたDNAを用いて、コンピテントE.コリHB101を
形質転換した。その形質転換体を、ヌクレオチド配列決
定によりスクリーンし、そして正しい構造体を単離し
た。
I.pBM 14の構成 1.pBM 12の構成 プラスミドpBR322を、制限酵素Pst Iにより消化し
た。その得られた３′突出末端を、従来の技法に従って
T4 DNAポリマラーゼにより前記消化生成物を処理するこ
とによってブラント末端に転換した。合成Bgl IIリンカ
ー（５′−ｄ〔CAGATCTG〕）をリン酸化し、そしてブラ
ント末端DNAに連結し、そしてそれを用いてコンピテン
トE.コリHB101を形質転換した。プラスミドDNA調製物
を、従来の技法を用いてテトラサイクリン耐性形質転換
耐から調製し、Pst I制限部位の欠失及びBgl II制限部
位の付加についてスクリーンするためにPst I及びBgl I
Iにより消化した。
2.pBM 13の構成 上記のようにして得られたプラスミドpBM4を、Hpa I
により消化した。３′突出末端を、ブラント末端に転換
し、そしてリン酸化されたBgl IIリンカーをそのブラン
ト末端に付加した。連結反応混合物を用いて、コンピテ
ントE.コリHB101を形質転換した。
3.pBM 14の最終構成 プラスミドpBM 12を、Bgl II及びEcoR Iにより消化し
た。テトラサイクリン遺伝子及び複製の起点を含むその
得られた3.6Kbのフラグメントを単離し、そして回収し
た。プラスミドpBM 13をBgl II及びEcoR Iにより消化
し、そしてバクテリオファージλc I 857DNA配列及びPL
及びＮリボソーム結合部位を含むその得られた2.8Kbの
フラグメントを単離し、そして回収した。pBM 12からの
3.6Kbのフラグメント及びpBM13からの2.8Kbのフラグメ
ントを連結し、プラスミドpBM 14を形成した。その得ら
れた連結混合物をE.コリHB101中に形質転換し、そして
その得られた形質転換をpBM 14についてスクリーンし
た。推定上のpBM 14を、従来の技法を用いて制限消化に
よりさらに分析した。
J.プラスミドpLEBam プラスミドpLEBamが、その便利なBasH II及びBamH I
制限部位により合成オリゴヌクレオチドフラグメントを
クローン化するために使用された。Nco I及びBamH I制
限部位を有するプラスミド、たとえばpBM 11又はpBM 11
/NDP（下に説明される）を、合成ヌクレオチドフラグメ
ントをクローニングするために使用することができる。
K.プラスミドplac/cro−βgal. ベクターplac/cro−βgalの調節要素は、E.コリのラ
クトース（lac）オペロンのオペレーター−プロモータ
ー領域及びlac及びcroのリボソーム結合部位から成る。
このベクターは、プラスミドpTR213〔Robertsなど.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA（1978）76:760〕及びpLG300〔Gua
ranteなど.,Cell（1980）20:543〕に由来する。
プラスミドplac/cro−βgalを、BamH I及びBgl IIに
より消化された下記のオリゴヌクレオチドリンカー： の存在下で、pTR213からの0.96KbのPst I−Bgl IIフラ
グメント及びpLG300からの5.54KbのPst I−BamH Iフラ
グメントを連結することによって構成した。
このリンカーは次の目的を満たした： （１）親プラスミドからBgl II及びBamH I部位を再生す
ること、（２）外来性DNAの挿入のために追加の部位を
供給すること及び（３）挿入されたDNAがcro5′−galコ
ード配列に関いて正しい翻訳の読み枠を合わしての存在
を可能にすること。
L.プラスミドptac/cro−βgal プラスミドptac/cro−βgalは、外来性遺伝子が細菌
性Croタンパク質のＮ−末端の21個のアミノ酸の下流に
クローン化されることを可能にする。それは、plac/cro
−βgalプラスミドの0.87KbのRsa Iフラグメント（前も
ってクレノウ酵素の作用によりブラント末端に転換され
ている）を、BamH I部位でpDR540（Pharmacia）中に挿
入することによって構成された。挿入されたDNAの配向
は、リボソーム結合部位及びCroのコード配列がlacのリ
ボソーム結合部位から下流に位置するような方向であっ
た。その得られたプラスミド、ptac/croは、lac及びcro
のリボソーム結合部位及びCroのＮ−末端コード配列を
含んだ。
ptac/cro−βgalの構成における第２段階は、それぞ
れptac/cro及びpLG400プラスミドからの1.16Kb及び5.54
KbのPst I−BamH Iフラグメントを連結することであっ
た。従って発現ベクターptac/cro−βgalはplac/cro−
βgalに類似した。但し、ptac/cro−βgalのプロモータ
ーは、トリプトファンオペロンのプロモーターからの−
35領域及びlacオペロンのプリブナウ配列（−10領域）
から成る。このハイブリッドプロモーターは、plac/cro
−βgalよりも高いレベルの発現を可能にるする。
M.Tac Pak この調製のためには、例VII cを参照のこと。
N.プラスミドpTCPt このプラスミドは、tacプロモーター要素を有し、そ
してアルカリホスファターゼシグナル配列の後に対象の
遺伝子を発現するためにcro SDを利用するように企画さ
れている。このプラスミドの構成の例は、下記のpTCPt/
EGFの構成において示される。
Q.pTNPtの構成（〔trp−35〕17bp〔lac−10〕〔nSD〕8b
p〔ATG〕／アルカリホスファターゼシグナル／リンカー
／翻訳終結−NEO） このプラスミドは、tacプロモーター要素を有し、そ
してアルカリホスファターゼシグナル配列の後に一定の
遺伝子を発現するためにＮ−遺伝子SDを利用するように
企画されている。それは、ネオマイシ耐性遺伝子を有す
るpBR322バックグラウンドを有する。プラスミドpTNPt
を、次の通りにして構成した： 1.Hind III部位を欠くpBM16t/VGFaの28KbのEcoR I−Bam
H Iフラグメントの調製 プラスミドpBM16t/VGFaをEcoR I及びBamH Iにより消
化し、そして2.8Kbのフラグメントを単位した。その2.8
Kbのフラグメントを、EcoR I及びBamH Iリンカーに連結
し、そして正しい構造体を制限分析により単離し、そし
て中間体Ｉとして言及 する。
ネオマイシン耐性遺伝子の近くのユニークHind III部
位をHind IIIによる消化により中間体Ｉプラスミドから
除き、クレノウフラグメントを用いてブラント末端を作
り、そして再連結した。これは、Hind III部位を欠く中
間体IIプラスミドをもたらした。
Hind III部位を欠くpBM16t/VGFaの2.8KbのEcoR I−Ba
mH Iフラグメントを、EcoR I及びBamH Iによる中間体II
の消化により単離した。その得られた2.8Kbのフラグメ
ントを、アガロースゲル電気泳動により単離した。
2.pBM 11/PAKの150bpのBamH I−Bsm Iフラグメントの調
製 プラスミドpBM 11/PAKは、pBM 11/PAK/EGFと同一であ
る。但し、それはEGF遺伝子の代わりに、アルカリホス
ファターゼシグナル配列の下流にHind III,Sma I及びBa
mH Iを有するリンカー領域を含む。pBM 11/PAMをBsm I
及びBamH Iにより消化し、そしてＮ−遺伝子SDを含む15
0bpのフラグメント、アルカリホスファターゼシグナル
配列及びリンカー領域を単離した。
3.オリゴヌクレオチドTacA+及びTacA-の調製 オリゴヌクレオチドTacA+及びTacA-をApplied Biosys
tems Oligonucloutido合成機上で合成し、そしてSst I
部位の位置を定められた17個のヌクレオチドによりlac
−10コンセンサス配列から分離されたtrp−35コンセン
サス配列を有する５′末端でEcoR Iオーバーハングを有
するように企画された。この配列はまた、lac mRNAの
５′末端、lacリプレッサー結合部位及びBsm Iオーバー
ハングも含んだ。
4.pTNPtの連結及び単離 2.8KbのEcoR I−BamH Iフラグメント、150bpのBsm I
−BamH Iフラグメント及びオリゴヌクレオチドTacA+及
びTacA-を、DNAリガーゼを用いて一緒に連結し、そして
そのDNAを用いてコンピテントJM109（lacIq）を形質転
換した。正しい構造体を、制限分析及びDNA配列決定に
より単離した。
例 III. 対照の遺伝子の調製 A.合成増殖因子遺伝子 高レベルの発現のために最適化された宿主細胞コドン
を使用する合成増殖因子遺伝子を企画した。さらに、い
くつかの便利な制限部位を、合成遺伝子中に精製した。
可能な場合、その新規な制限部位は、増殖因子の遺伝子
のアミノ酸配列を不変化のままにし、しかしながらある
場合、新規の制限部位の導入は変更されたアミノ酸配列
を生成した。これらの部位は、合成遺伝子をおおまかに
３部分、すなわちＮ末端ドメイン、中間ドメイン及びＣ
−末端ドメインに分割した。
天然のVGF遺伝子生成物は、成熟TGFの対照体を有さな
い極端なＮ−末端ドメインを含む。このドメインを欠く
VGFフラグメントは、切断されたものとして言及され
る。その制限部位を、１つの制限部位から他の部位に延
びる一部合成のオリゴヌクレオチドフラグメントから最
終遺伝子の初期構成のために使用した。オリゴヌクレオ
チドを、Applied Biosystems Oligonucleotide合成機に
より合成し、そしてアクリルアミドゲル上で精製した。
オリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて５′末端でリン酸化し、そして次にそれぞれのオ
リゴヌクレオチドをその補体にアニールした。
1.TGF合成オリゴヌクレオチド a.ヒトTGF N−末端ドメイン b.ラットTGF中に見出される、QEEKに変えられるヒト配
列QEDKを有する変性されたヒトTGF中間ドメイン C.ヒトTGF C−末端ドメイン 2.VGF合成オリゴヌクレオチド a.VGF極端Ｎ−末端ドイメン b.天然の配列HGDに取って代る配列HGTと共にAsp−Pro切
断部位を含む変性されたVGF N−末端ドメイン c.天然の配列GMYCに取って代る配列GYACを有する変性さ
れたVGF中間ドイメン d.VGF C−末端ドメイン、５′末端 e.天然の配列RCSに取って代る配列VCSを有する変性され
たVGF C−末端ドメイン、５′末端 f.DNTの代わりにYQRで、天然の分泌されたVGFの推定上
のＣ−末端をコードするVGF C−末端ドメイン、３′フ
ラグメント 3.EGF合成オリゴヌクレオチド ヒトEGFをコードする３種のオーバーラップする合成
オリゴヌクレオチド１（A,B）,2（A,B）及び３（A,B）
を、Applied Biosystemsのオリゴヌクレオチド合成機に
より合成し、そしてアクリルアミドゲル上で精製した。
オリゴヌクレオチドを、５′末端でT4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いてリン酸化した。それぞれのオリゴヌク
レオチドを、その補体にアニールした。
4.増殖因子遺伝子のアセンブリー a.プラスミドpLEBam/TTVの調製 TTV又は（TGF/TGF/VGF）で示される合成キメラ増殖因
子を、クローニングベクターpLEBam中にアセンブリーし
た。このハイブリッド増殖因子は、遺伝子の2/3のアミ
ノ末端中にヒトTGFのアミノ酸配列を含んだ（但し、天
然のヒト配列QEDKから変更された配列QEEKを除く）。カ
ルボキシ末端は、VGFのアミノ酸配列に由来し、そして
天然の配列PNTの上流で配列YQR TMRを末端とした。プラ
スミドpLEBamを、BssH II及びBamH Iにより消化した。
次にBssH II−BamH IのpLEBamを、DNAリガーゼを用い
て、オリゴヌクレオチドTGF101,102,103及び104、並び
にVGF1,2,3及び４に連結し、そしてその得られたプラス
ミドを用いてコンピテントHB101を形質転換した。その
形質転換体をアンピシリンに対して選択し、そしてEcoR
I,Nco I及びBamH Iを用いての制限分析により及びMoxa
m−Gilbert方法を用いてのヌクレオチド配列決定により
スクリーンした。正しい構造体を単離し、そしてpLEBam
/TTVと命名した。
b.プラスミドpLEBam/TVVの調製 TVV又は（TGF/VGF/VGF）として示される合成キメラ増
殖因子を、クローニングベクターpLEBam中にアセンブリ
ーした。このハイブリッド増殖因子は、遺伝子のＮ−末
端ドメイン中にヒトTGFのアミノ酸配列を含んだ。中間
及びＣ−末端ドメインは、切断されたVGF配列に由来
し、そして天然の配列PNTの上流で配列YQRを末端とす
る。さらに、その合成遺伝子は、変性部、すなわちGYCR
Cに代るGYACVCを有する。
（１）pLEBam/TTVの4.3KbのKpn I−Sph Iフラグメント
の調製 プラスミドpLEBam/TTVをKpn I及びSph Iにより消化
し、そして4.3KbのKpn I−Sph Iフラグメントをゲル精
製した。この消化は、クローニングプラスミドpLEBam中
の合成遺伝子TTVから中間のTGFドメインを除去する。
（２）pLEBam/TVVの連結及び単離 オリゴヌクレオチドVGF101a及び102aを、DNAリガーゼ
を用いて、pLEBam/TTVの4.3KbのKpn I−Sph Iフラグメ
ントに連結し、そしてその得られた混合物を用いて、コ
ンピテントHB101を形質転換した。その形質転換体をア
ンピシリンに対して選択し、そしてサンガー−ジデオキ
シ法を用いてヌクレオチド配列決定することによりスク
リーンした。
B.合成血小板因子４遺伝子 高レベルの発現のために最適化された細菌性コドを使
用する合成血小板因子４遺伝子を企画した。一本鎖オー
バーラッピング配列を調製し、マニーリング媒体中で混
合し、そして連結し、血小板因子４が単離される融合タ
ンパク質を調製するために読み枠を合わして発現ベクタ
ー中への挿入のために適切な末端を有する完全な遺伝子
を付与した。その得られた発現ベクターは、PHCPF4と呼
ばれた。一本鎖セグメントを、T4ポリヌクレオチドリガ
ーゼにより５′−リン酸化し、そして反応体積物（30mM
のATP,10mMのDTT,10mMのMgcl2,1μg/mlのスペルミジ
ン、100mMのTris−HCl,pH7.8及びT4 DNAリガーゼ）30μ
ｌ中でそれぞれのゼグメント200pモルを混合することに
よってアニールした。そのdsDNAをBamH II及びBamH Iに
より消化し、そして７％ポリアクリルアミドゲル上で精
製した。
次の配列が調製された： C.オンコスタチンＭのDNAクローニング 1.cDNAライブラリィの調製 ホルボール12−シリステート13−アセテートPMA（10n
g/ml）を含む媒体により16,36及び52時間処理されたU93
7細胞から得られたポリ（Ａ）+RNAをプールし、そして
実質的に、Huynhなど.,DNA Cloning Techniques:A Prac
tical Approach,D.Glover（ed）（1984）により記載さ
れているようにしてcDNA合成及びλgt10ベクター中への
クローニングのために使用した。手短に言えば、10μｇ
のポリ（A+）RNAを、50pモルのオリゴdTの存在下で逆転
写した。第２鎖を、DNAポリマラーゼＩを用いて合成
い、そしてcDNAをS1ヌクレアーゼにより処理し、ヘアピ
ンループを排除した。次にcDNAを、末端デオキシヌクレ
オチドトランスフェラーゼによる処理によりdG末端化し
た。dG末端化されたcDNAを続いて、BiogelA−50カラム
上でクロマトグラフィー処理し、300bp以下のcDNAを排
除した。分類されたdG末端化されたcDNAを、EcoR Iによ
り切断されたλgt10中に、５′末端からのAATT、次いで
12個のデオキシシトシン残基を含む一本鎖の16個のヌク
レオチドの長さのリンカー分子の存在下で連結した（We
bbなど.,1987）。この連結されたDNAをインビトロでパ
ッセージし〔Grosveldなど.,Gene（1981）13:227〜23
7〕、そしてそのファージを用いてE.コリC60Hfl+を感染
せしめた。この技法は、３×106個の組換え体／μg cDN
Aを付与した。ニトロセルロースフィルタープラークリ
フトを２通り行ない、そしてそのフィルターを、長く最
良と思われる35〜50個のヌクレオチドの長さのプロープ
を用いてプローブした。そのオリゴヌクレオチドプロー
ブは、自動化された反復エドマン分解により得られたペ
プチド配列に由来した。その精製されたオンコスタチン
Ｍ配列は、そのタンパク質のＮ−末端から又はプロテア
ーゼにより生成された。リシンペプチドを配列決定する
ことによって得られた。
λgt10ライブラリィーの初期スクリーニングを、50ヌ
−のオリゴヌクレオチドプローブを用いて行なった。そ
のプローブは、リシンペプチドに由来した。
ペプチド1: 〔32P〕によりラベルされた上記オリゴヌクレオチドに
対して陽性の反応性を示すλgt10クローンを、プラーク
精製した。８個のクローンを得た。サザンブロット分析
は、クローン中における陽性反応性cDNA挿入体は、600b
p〜2Kbの範囲であることを示した。続いて、サザンブロ
ット法は、351マ−のオリゴヌクレオチド（アミノ酸53
〜64をコードする）及び41マ−のオリゴヌクレオチド
（アミノ酸22〜35をコードする）を用いて行なった。た
った１個のクローンが、すべての３種の放射性ラベルさ
れたオリゴヌクレオチドプローブと陽性の反応性を示し
た。
λgt10クローン（λ0M）のcDNA挿入体は、およそ2.1K
bであることが見出された。５′及び３′末端でEcoR I
部を有するcDNA挿入体を、プラスミドベクターpEMBL18
〔Denteなど.,Nucleic Acid Res.（1983）11:1645〜165
5〕のポリリンカー領域のEcoR I部位にサブクローンし
た。その組換え体をp0ncM46と命名した。次に、追加のc
DNAクローンを、オンコスタチンＭ遺伝子の５′コード
領域に由来するオリゴヌクレオチドを用いて特異的感作
により得、そしてその全遺伝子を含むゲノムクローンを
単離した。
2.制限部位地図 オンコスタチンＭタンパク質をコードするクローンp0
ncM46の制限地図を、プラスミドDNAの標準の単一又は二
重消化により得た。そのコード領域は、Pst I部位、Bgl
II部位及びSma I部位を有する。
3.オンコスタチンＭのDNA配列 cDNAクローンの完全なヌクレオチド配列を得、そして
コンセンサス配列を次のように決定した： コンセンサス配列を、ゲノムクローンの配列と比べる
ことによってさらに確めた。その読み取り枠は、ヌクレ
オチド１からヌクレオチド783での終止コドンまで続
く。その読み取り枠は、推定上の開始メチオニンから上
流に８個のアミノ酸をコードする。その推定上の開始メ
チオニンをコードするヌクレオチド配列は、その開始メ
チオニンのためのコンセンサス配列と一致する〔Kozak,
Cell（1986）44:283〜292〕。
コンセンサスcDNA配列から推定されるオンコスタチン
Ｍポリペプチドのアミノ酸配列は、オンコスタチンＭが
253個のアミノ酸前駆体のポリペプチドに由来すること
を示す。精製されたオンコスタチンＭのアミノ末端配列
〔上記及びZarlingなど.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（198
6）83:9739〜9743）は、アミノ酸26で存在する。それ
は、シグナル配列として機能するように思われる疎水性
領域により先行される。成熟タンパク質は26,000の分子
量を有する228個のアミノ酸を有し、そしてそれは精製
されたオンコスタチンＭのポリアクリルアミドゲル電気
泳動により測定される場合、約Ｍｒ＝28,000にほぼ一致
する（Zarling,など.,1986前記）。
初期のタンパク質化学研究（Zarlingなど.,1986前
記）は、オンコスタチンＭが糖タンパク質であることを
示した。cDNAクローン配列は、成熟タンパク質のアミノ
酸76及び193で位置する２種の可能性あるＮ−グリコシ
ル化部位〔Hubbard及びIvatt,Ann.Rev.Biochem.（198
1）50:555〜583〕を示唆する。ヌクレオチド誘導タンパ
ク質配列は、オンコスタチンＭが高い親水性分子である
ことを示す。５′未翻訳領域の24個の塩基対及び３′未
翻訳領域の1054個の塩基対を、異なったcDNAクローンに
得た。しかしながら、ポリＡ末端及びポリアデニル化の
認識部位は得られなかった。
4.p0ncMVV2の調製 2.1KbのオンコスタチンＭのcDNAを、EcoR Iによる消
化により、λファージ組換え体、p0ncM46から切り出し
た。その挿入体をpEMBL18〔Denteなど.,Nucl.Acid Res.
（1983）11:1645〜1655〕中にEcoR I部位でクローン化
し、β−gal配列に対立するオンコスタチンＭコード配
列を有するクローンp0ncM46−15ベクターを生成した。
オンコスタチンＭの５′非コード配列を、p0ncM46−15
のSal I及びBgl IIでの二重消化により除去し、そして
合成の80bpのSal I−Bgl IIフラグメントにより交換
し、新規のBamH I及びNco I部位を付与した。その得ら
れたクローンをp0ncMEV5と命名した。その80bpのフラグ
メントの配列は次の通りである： オンコスタチンＭのコード配列を、Xho I及びSal Iで
の二重消化によりp0ncMEV5から0.7Kbのフラグメントと
して切り出し、そしてSal I部位でpUC8ベクター中にク
ローン化した。lac Z′配列に対立するコード配列を有
するcDNA挿入体を含むクローンp0ncMVV2を単離した。ク
ローンp0NcMVV2から切り出された0.7KbのNco I−BamH I
及び0.7KbのBamH I−BamH Iフラグメントを用いて、λp
L−基礎の（pBM16/NDP/OncM）発現ベクターを構成し
た。
例 IV. Ｎ−タンパク質を有する融合タンパク質としての対象の
ポリペプチドの発現 A.変性された合成TGF 1.pBM11/N/TGFの調製 変性されたヒトTGFが、Ｎ−遺伝子の33個のＮ−末端
アミノ酸との融合の一部としてこのシステムに発現さ
れ、そしてヒト配列QEDKに取って代る配列QEEKを有す
る。
a.pBM11/N/TTVからの780bpのSph I−Pvu Iフラグメント
の調製 プラスミドpBM11/N/TTVをSph I及びPvu Iにより消化
し、そいて780bpのSph I−Pvu Iフラグメントをゲル精
製した。このフラグメントは、Pvu I末端及びSph I末端
でpBM11プラスミドの一部、Ｎ−遺伝子及びヒトTGF遺伝
子のＮ−末端の2/3を含む。
b.pBM11/N/TTVからの5KbのBamH I−Pvu Iフラグメント
の調製 プラスミドpBM11/N/TTVをBamH I及びPvu Iにより消化
し、そして5KbのBamH I−Pvu Iフラグメントをゲル精製
した。
c.pBM11/N/TGFの連結及び単離 オリゴヌクレオチドTGF205及び206,pBM11/N/TTVから
の780bpのSph I−Pvu Iフラグメント及び5KbのBamH I−
Pvu Iフラグメントを一緒に連結し、そしてそれを用い
て、コンピテントHB101を形質転換せしめた。その形質
転換体をネオマイシンに対して選択し、そしてEcoR Iを
用いての制限分析及びサンガー−ジデオキシ方法従って
のヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。正しい
構造体を単離し、そしてpBM11/N/TGFと命名した。
B.変性された合成TGF−VGFハイブリッド 1.pBM11/N/TTVの調製 この構造体においては、変性された合成TTVキメラ遺
伝子が、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの33個のアミノ酸
を有する融合タンパク質のＣ−末端部分として発現され
た。このハイブリッド増殖因子は、前記遺伝子のアミノ
末端の2/3にヒトTGFのアミノ酸を有した（但し、天然の
ヒト配列QEDKから変えられた配列QEEKを除く）。カルボ
キシ末端はVGFのアミノ酸配列に由来し、そして天然の
配列PNTの上流で配列YQRを末端とした。
a.Nco I（ブラント）−BamH I TTV合成遺伝子の調製 プラスミドpLEBam/TTVをNco Iにより消化し、そして
その末端を、DNAポリマラーゼのクレノウフラグメント
を用いてオーバーハングをフィルインすることによって
ブラント化した。次にそのDNAをBamH Iにより消化し、
そして170bpのNco I（ブラント）−BamH I TTVフラグ
メントをゲル精製した。
b.BamH Iにより消化されたpBM11の調製 プラスミドpBM11をBamH Iにより消化した。
c.pBM11/N/TTVの連結及び単離 BamH Iにより消化されたpBM11,Nco I（フラント）−B
amH I TTVフラグメント及びBamH Iリンカー（５′GATC
CG3′）を、DNAリガーゼを用いて一緒に連結し、そして
その得られた混合物を用いて、コンピテントHB101を形
質転換した。その形質転換体をネオマイシンに対して選
択し、そして制限分析及びサンガー−ジデオキシ方法を
用いてのヌクレオチド配列決定によりスクリーンした。
正しい構造体を単離し、そしてpBM11/N/TTVと命名し
た。
C.合成血小板因子４ 1.pBM11/N/PF4（Ｎ−遺伝子／血小板因子４）の調製 このプラスミドを、pBM11/N/TTVについて上に記載し
ているようにして調製した。但し、合成PF4遺伝子がキ
メラTTV遺伝子の代わりに使用された。発現ベクターpBM
11中においてバクテリオファージλＮ−遺伝子の初めの
33個のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の下流で
融合する合成血小板因子４遺伝子のヌクレオチド配列及
びその対応するアミノ酸配列は次の通りである。
例 V. Ｎ−タンパク質及び切断部位を有する融合タンパク質と
しての対象のポリペプチドの調製 A.変性された合成VGF 1.pBM11/NDP/VGFAの調製： 合成VGFA遺伝子のＮ−末端配列は、天然のVGF配列の
切断部分であり、そして配列DIPAIRで始まる。このプラ
スミドにおいて、DGFAフラグメントは、λＮ−タンパク
質の32個のアミノ酸及びジペプチドのアスパラギン酸−
プロリンの下流に位置する。Kpn I部位を保存するため
に、合成配列が、天然のVGF配列CLHGDCの代わりにCLHCG
TCをコードするように変えられ、そしてそれは天然の配
列PNTの上流で配列YQRで終結する。さらに、VGFA遺伝子
は、天然の配列GMYCRCに取って代る配列GYACVCをコード
する。
a.合成VGF遺伝子の80bpのKpn I−BamH I Ｃ−末端フラ
グメントの調製 プラスミドpLEBam/TVViをKpn I及びBamH Iにより消化
し、そして80bpのKpn I−BamH Iフラグメントをゲル精
製した。このフラグメントは、５′末端でKpn I部位を
有する合成VGF遺伝子のＣ−末端の2/3を含む。
b.BamH Iにより消化された脱リン酸化されたpBM11の調
製 プラスミドpBM11/N/TTVをBamH Iにより消化し、そし
て５′ホスフェートをウシの腸のアルカリホスファター
ゼによる処理により除去した。5.6KpのBamH Iプラスミ
ドフラグメントをゲル精製した。
c.pBM11/NDP/VGFAの連結及び単離 オリゴヌクレオチドVGF103a,104a,pBM11の5.6KbのBam
H Iフラグメント及びpLEBam/TTVの80bpのKpn I−BamH I
フラグメントを、DNAリガーゼを用いて一緒に連結し、
そして次にそれを用いてコンピテントHB101を形質転換
せしめた。形質転換体をネオマイシンに対して選択し、
そしてCla Iを用いる制限分析及びサンガー−ジデオキ
シ技法に従ってのヌクレオチド配列決定によりスクリー
ンした。正しい構成体を単離し、そしてpBM11/NDP/VGFA
と命名した。この構成体は、VGF配列GDC及びGMYCRCの代
わりに配列GTC及びGYACVCを有する。
2.pBM11/NDP/VGFaの調製 VGFaのＮ−末端配列は、天然のVGF配列の切断された
部分であり、そしてそれは配列DIPAIRにより始まる。さ
らに、そのVGFa配列は、天然のVGF配列、GDC及びGMYCRC
の代わりに変えられた配列、GTC及びGYACRCを含む。こ
のプラスミドにおいて、VGFa遺伝子は、λＮ−タンパク
質の32個のアミノ酸及びジペプチドのアスパラギン酸−
プロリンの下流に位置する。蟻酸による精製された融合
タンパク質の処理は、λＮ−タンパク質のアミノ末端か
らVGFaタンパク質の分離を可能にする、酸不安定性アス
パラギン酸−プロリンのペプチド結合での切断をもたら
す。VGFaタンパク質がアミノ末端でプロリン残基と共に
放されるように切断は、存在する。
a.Sph Iにより消化され、脱リン酸化されたpBM11/DP/VG
FAの調製 プラスミドpBM11/DP/VGFA（10μｇ）を、30単位のSph
Iにより消化し、そして５′ホスフェートをウシの腸の
アルカリホスファターゼによる処理により除去した。5K
bのプラスミドフラグメントを、アガロースゲル上で電
気泳動した後、回収した。
b.pBM11/DP/VGFAの70bpのEcoR I−Sph Iフラグメントの
調製 プラスミドpBM11/DP/VGFA（10μｇ）を、30単位のEco
R Iにより及び次に30単位をSph Iにより消化した。70bp
のフラグメントを、アガロースゲル上で電気泳動した
後、回収した。
3.pBM11/NDP/VGFaの連結及び単離 オリゴヌクレオチドVGF 1A及び2Aを含む24bpのフラグ
メント、5KbのSph Iフラグメント及びpBM11/DP/VGFAの7
0bpのEcoR I−Sph Iフラグメントを一緒に連結し、そし
てその混合物を用いてコンピテントE.コリHB101細胞を
形質転換せしめた。その形質転換体を、サンガー−ジデ
オキシヌクレオチド方法を用いてヌクレオチド配列決定
することによってスクリーンした。正しいクローンを単
離し、そしてpBM11/NDP/VGFaと命名した。
B.変性された合成TGF−VGFハイブリッド 1.pBM11/NDP/TTVの調製 この構成体においては、変性された合成TTVキメラ遺
伝子が、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの32個のアミノ酸
を有する融合タンパク質のＣ−末端部分として発現され
る。酸不安定性アスパラギン酸−プロリンジペプチド
は、融合の２種の部分を分離する。ハイブリッド増殖因
子は、その遺伝子のアミノ末端の2/3においてヒトTGFの
アミノ酸配列を含む。但し、天然のヒトTMR配列QEDKか
ら変更された配列QEEKを除く。カルボキシ末端は、VGF
のアミノ酸配列に由来し、そして天然の配列PNTの上流
で配列YQRで終結された。
a.5KbのNco IによるpBM11プラスミドフラグメントの調
製 プラスミドpBM11/NDP/VGFAをNco Iにより消化し、そ
して5KbのNco Iプラスミドフラグメントをゲル精製し
た。このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの32個のア
ミノ酸をコードする配列の下流でのアスパラギン酸−プ
ロリン切断部位で１個のNco Iオーバーハングを有す
る。他のNco I部位は、ネオマイシン耐性遺伝子に存在
する。
b.pBM11の0.6KbのNco I−BamH Iフラグメントの調製 プラスミドpBM11/N/TTVをNco I及びBamH Iにより消化
し、そして0.6KbのNco I−BamH Iプラスミドフラグメン
トをゲル精製した。このフラグメントは、ネオマイシン
耐性遺伝子中にNco I−オーバーハングを有する。
c.170bpの合成TGF/TGF/VGFフラグメントの調製 プラスミドpLEBam/TTVをNco I及びBamH Iにより消化
し、そしてTGF/TGF/VGF合成遺伝子を含む170bpのNco I
−BamH Iフラグメントをゲル精製した。このフラグメン
トは、遺伝子の５′末端でNco Iオーバーハング及び遺
伝子の３′末端でBamH Iオーバーハングを有する。
d.pBM11/NDP/TTVの連結及び単離 5KbのNco Iフラグメント及び0.6KbのNco I−BamH Iフ
ラグメントを、DNAリガーゼを用いて170bpのNco I−Bam
H I TTV遺伝子と共に連結し、そしてその得られた混合
物を用いて、コンピテントHB101を形質転換せしめた。
その形質転換体を、正しく再構成されたネオマイシン耐
性遺伝子を有するコロニーのみが生存するようにネオマ
イシンに対して選択した。形質転換体を、Nco Iによる
制限分析及びサンガー−ジデオキシ技法を用いるヌクレ
オチド配列決定を用いてスクリーンした。正しい構成体
を単離し、そしてpBM11/NDP/TTVと命名した。
2.pBM11/NDP/VTVの調製 この構成においては、変性された合成VTVキメラ遺伝
子が、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの32個のアミノ酸を
有する融合タンパク質のＣ−末端部分として発現され
た。酸不安定性アスパラギン酸−プロリンジペプチド
は、融合の２種の部分を分離する。ハイブリッド増殖因
子は、天然の配列QEDKに取って代るアミノ酸配列QEEKを
有する中間のドメインにおいてヒトTGFのアミノ酸配列
を含んだ。Ｎ−末端及びＣ−末端ドメインは、切断され
たVGF配列に由来し、そしてそれは配列DIPAIRで始ま
り、そして天然の配列PNTの上流で存在する配列YQRで終
結する。
a.pBM11の5KbのBamH I−Nco Iフラグメントの調製 プラスミドpBM11/N/TTVをBamH I及びNco Iにより消化
し、そして5KbのBamH I−Nco Iフラグメントをゲル精製
した。このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの32個の
アミノ酸をコードする配列の３′末端でBamH Iオーバー
ハング及びネオマイシン耐性遺伝子中にNco I部位を含
む。
b.pBM11/N/TTVの700bpのKpn I−Nco Iフラグメントの調
製 プラスミドpBM11/N/TTVをKpn I及びNco Iより消化
し、そして700bpのKpn I−Nco Iフラグメントをゲル精
製した。このフラグメントは、Nco Iオーバーハングで
ネオマイシン耐性遺伝子の一部及びKpn Iオーバーハン
グでTTV合成遺伝子のＣ−末端VGFドメインを含むプラス
ミドpBM11の一部から製造される。
c.pBM11/NDP/VTVの連結及び単離 オリゴヌクレオチドVGF103a及び104a,pBM11の5KbのBa
mH I−Nco Iフラグメント及びpBM11/N/TTVの700bpのKpn
I−Nco IフラグメントをDNAリガーゼを用いて一緒に連
結し、そして次にそれを用いてコンピテントHB101を形
質転換した。その形質転換体をネオマイシンに対して選
択し、そしてCla Iを用いての制限分析及びサンガー−
ジデオキシ技法に従ってのヌクレオチド配列決定により
スクリーンした。
3.pBM16/NDP/TVVの調製 この構成体においては、変性された合成TVVキメラ遺
伝子は、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の初めの32個のアミノ酸
を有する融合タンパク質のＣ−末端部分として発現され
た。酸不安定性アスパラギン酸−プロリンジペプチド
は、融合の２種の部分を分離する。ハイブリッド増殖因
子は、Ｎ−末端ドメインにおいてヒトTGFのアミノ酸配
列を含んだ。中間及びＣ−末端ドメインは切断されたVG
F配列に由来し、そして配列YQRで終結した。さらに、合
成遺伝子は、GMYCRCに代る変性体GYACVCを有する。
a.pBM11/NDP/VGFaの4.3KbのNco I−Bgl IIフラグメント
の調製 プラスミドpBM11/NDP/VGFaをNco I及びBgl IIにより
消化し、そして4.3Kbのフラグメントをゲル精製した。N
co Iオーバーハングは、Ｎ−遺伝子の初めの32個のアミ
ノ酸のすぐ下流のアスパラギン酸−プロリン切断部位に
位置する。
b.pBM11M5の1.2KbのBamH I−Bgl IIフラグメントの調製 プラスミドpBM11M5をBamH I及びBgl IIにより消化
し、そして1.2Kbのフラグメントをゲル精製した。この
フラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子中のNco I部
位が除去されていることにおいて正常なpBM11フラグメ
ントと異なり、そしてこのNco I部位を欠くすべての続
くベクターをpBM16として言及する。
c.170bpのNco I−BamH I TVV合成遺伝子フラグメント
の調製 プラスミドpLEBam/TVVをNco I及びBamH Iにより消化
し、おして170bpのNco I−BamH Iフラグメントをゲル精
製した。この合成遺伝子フラグメントは、５′−末端で
Nco I部位及び３′−末端でBamH I部位を有する。
d.pBM16/NDP/TVVの連結及び単離 pBM11/NDP/VGFaの4.3KbのNco I−Bgl IIフラグメン
ト、pBM11M5の1.2KbのBamH I−Bgl IIフラグメント及び
170bpのNco I−BamH I TVV合成遺伝子フラグメントをD
NAリガーゼを用いて一緒に連結し、そしてその得られた
混合物を用いて、コンピテントHB101を形質転換せしめ
た。その形質転換体をネオマイシンに対して選択し、制
限分析及びサンガー−ジデオキシ技法を用いてのヌクレ
オチド配列決定によりスクリーンした。そのプラスミド
をpBM16と命名し、そしてそれはネオマイシン耐性遺伝
子におけるNco I制限部位の欠失を示唆する。
C.合成EGF 1.pBM11/NDP/EGFの調製 この構成体において、ヒトEGF遺伝子は、Asp−Pro切
断部位の下流に存在するＮ−遺伝子の32個のＮ−末端ア
ミノ酸を有する融合タンパク質の一部として発現され
る。
a.pBM11の5KbのNco Iフラグメントの調製 プラスミドpBM11/DP/VGFAをNco Iにより消化し、そし
て５′ホスフェートをウシの腸のアルカリホスファター
ゼによる処理により除去した。その5Kbのプラスミドフ
ラグメントをゲル精製した。このフラグメントは、Ｎ−
遺伝子の初めの32個のアミノ酸をコードする配列の下流
のAsp−Pro切断部位で１つのNco Iオーバーハングを有
する。他のNco I部位は、ネオマイシン耐性遺伝子中に
存在する。
b.pBM11の0.6KbのNco I−BamH Iフラグメントの調製 プラスミドpBM11/N/TTVをNco I及びBamH Iにより消化
し、そしてこの0.6KbのNco I−BamH Iプラスミドフラグ
メントをゲル精製した。このフラグメントは、ネオマイ
シン耐性遺伝子中にNco Iオーバーハングを有する。
c.pBM11/DP/EGFの連結及び単離 ５′末端でNco Iオーバーハング及び３′末端でBamH
Iオーバーハングを有する３組のアニールされたEGFオリ
ゴヌクレオチド、pBM11の5KbのNco Iフラグメント及びp
BM11の0.6KbのNco I−BamH Iフラグメントを、T4 DNAリ
ガーゼを用いて一緒に連結し、そしてその得られた混合
物を用いて、コンピテントE.コリHB101を形質転換せし
めた。その形質転換体を、正しく再構成されたネオマイ
シン耐性遺伝子を有するコロニーのみが生存するように
ネオマイシンに対して選択した。その形質転換体を、上
記のようにEcoR I及びBamH Iを用いての制限分析及びDN
A配列決定によりスクリーンした。
D.合成血小板因子４ 1.pBM11/NDP/PF4（Ｎ−遺伝子/DP/血小板因子４）の調
製 この構成体においては、合成PF4遺伝子が、Ｎ−末端
でＮ−遺伝子の初めの32個のアミノ酸を有する融合タン
パク質のＣ−末端タンパク質として発現される。酸不安
定性アスパラギン酸−プロリンジペプチドは、融合体の
２種の部分を分離する。
a.プラスミドpBM11の5KbのNco Iフラグメントの調製 プラスミドpBM11/NDP/VGFAをNco Iにより消化し、そ
して5KbのNco Iプラスミドのフラグメントをゲル精製し
た。このフラグメントは、Ｎ−遺伝子の初めの32個のア
ミノ酸をコードする配列の下流のアスパラギン酸−プロ
リン切断部位で１つのNco Iオーバーハングを有する。
他のNco I部位は、ネオマイシン耐性遺伝子中に存在す
る。
b.プラスミドpBM11の0.6KbのNco I−BamH Iフラグメン
トの調製 プラスミドpBM11/N/PF4をNco I及びBamH Iにより消化
し、そして0.6KbのNco I−BamH Iフラグメントをゲル精
製した。このフラグメントは、ネオマイシン耐性遺伝子
中にNco Iオーバーハングを有する。
c.pBM11/NDP/PF4の連結及び単離 5KbのNco I及び0.6KbのNco I−BamH Iフラグメント
を、DNAリガーゼを用いてPF4遺伝子と共に連結し、そし
てその得られた混合物を用いてコンピテントHB101を形
質転換せしめた。その形質転換体を、正しく再構成され
たネオマイシン耐性遺伝子を有するコロニーのみが生存
するようにネオマイシンに対して選択した。形質転換体
を、Nco Iによる制限分析及びサンガー−ジデオキシ技
法を用いてのヌクレオチド配列決定によりスクリーンし
た。正しい構成体を単離し、そしてpBM11/NDP/PF4と命
名した。
発現ベクターpBM11におけるバクテリオファージλＮ
−遺伝子の初めの32個のアミノ酸をコードするヌクレオ
チド配列及び酸不安定性ジペプチドAsp−Pro（＊＊＊）
の下流での融合体中の合成血小板因子４のヌクレオチド
配列及びその対応するアミノ酸配列は、次の通りであ
る。
E.オンコスタチンＭ 1.pBM16/NDP/CncMの構成 a.変性されたオンコスタチンＭ遺伝子フラグメントの調
製 変性されたオンコスタチンＭ遺伝子を含むプラスミド
p0ncMVV2を、Nco I及びBamH Iにより消化し、そして700
bpのNco I−BamH IオンコスタチンＭ遺伝子をゲル精製
した。このフラグメントは、遺伝子の５′末端でNco I
オーバーハング及び遺伝子の３′末端でBamH Iオーバー
ハングを含んだ。
b.pBM16/NDP/OncMの連結及び単離 変性されたオンコスタチンＭ遺伝子の700bpのNco I−
BamH Iフラグメント及びプラスミドpBM16/NDP/のNco I
−BamH IフラグメントをT4リガーゼにより一緒に連結
し、そしてそれを用いてコンピテントE.コリHB101を形
質転換せしめた。その形質転換体を、サンガー−ジデオ
キシ技法を用いての配列決定により正しい構成体につい
てスクリーンした。正しいコロニーを選択し、そしてpB
M16/NDP/OncMと命名した。
c.pBM16/NDP/OncMを用いてのオンコスタチンＭの調製 酸分解性ジペプチド（DP）に融合されるバクテリオフ
ァージλＮ−遺伝子の初めの32個のアミノ酸をコードす
るプラスミドpBM16/NDP/OncM及び合成OncM遺伝子を含む
E.コリHB101株を、30℃で増殖せしめた。約0.9のOD600
で、温度を42℃に上げ、NDP/OncM融合遺伝子の転写及び
翻訳を可能にするためにPLプロモーターを誘発する温度
感受性リプレッサーを不活性化する。その融合タンパク
質は、バクテリオファージλＮ−遺伝子の32個のアミノ
末端残基、続いて酸不安定性ジペプチドAsp−Pro、続い
てそのＮ−末端メチオニンを含むオンコスタチンＭの22
8個のアミノ酸を有することによって特徴づけられる。
2.pBMXを用いてのオンコスタチンＭの調製 82bpのフラグメントを、下記に示すように化学的に合
成した。
p0ncMVV2から単離された82bpのフラグメント及び切断
された0ncMcDNA（Bgl II−Hind III）を、Nco I及びHin
d IIIによる２重消化により調製されたpBM16/NDP/TVVベ
クター中にクローン化した。そのDNAを用いて、E.コリD
H5αを形質転換せしめた。クローンpBMXを単離し、そし
て予測される配列を担持することを確証した。そのコー
ド配列は−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−、すなわち成熟OncMのＮ−
末端に正確に融合される因子Ｘ認識部位を含むので、pB
MXにより産生される組換えタンパク質は、活性化された
因子Ｘの処理に従って−Ｉ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−のＲ残基で切
断され、確実なＮ−末端配列を有する成熟OncMが生成さ
れる。pBM16/NDP/OncMからオンコスタチンＭを調製する
ために、pBMXを用いてのオンコスタチンＭの類似する方
法が使用された。
例 VI. アルカリホスファターゼシグナル配列を有する融合タン
パク質としての対象のポリペプチドの調製 A.pBM11/PAD/EGFの調製 合成オリゴヌクレオチドを、PLプロモーター及びＮ遺
伝子リボソーム結合部位の下流のpBM11発現ベクター中
への、変性されたアルカリホスファターゼシグナルペプ
チド及び３種のクローニング部位（Hind III,Sma I及び
BamH I）を有するリンカー領域をコードするDNAの挿入
を可能にするように企画した。そのヌクレオチド配列
は、λＮ遺伝子配列が効果的なリボソーム開始及び翻訳
のためにそのリボソーム結合部位の配列と共に進展する
につれて、λＮ遺伝子のアミノ末端のヌクレオチド配列
にできるだけ類似するように最適化された。さらに、ア
ルカリホスファターゼシグナル配列の第２アミノ酸、す
なわち塩基性アミノ酸のリシンが、酸性アミノ酸、すな
わちアスパラギン酸に変えられた。
1.EGFの0.17KbのEcoR I−BamH Iフラグメントの調製 プラスミドpBM11/NDP/EGF（30μｇ）を、30単位のEco
R Iにより消化し、そして次に４単位のDNAポリマラーゼ
のクレノウフラグメントにより処理し、ブラント末端を
製造した。最終的に、そのDNAを30単位のBamH Iにより
消化し、そしてEGFの0.17Kbのフラグメントを、アガロ
ースゲル上での電気泳動後、回収した。そのように精製
されたDNAは、５′末端でブラント化されたEcoR I部位
及び３′末端でBamH Iオーバーハングを有する。
2.pBM11/PADの0.5KbのPvu I−Hind IIIフラグメントの
調製 プラスミドpBM11/PAD（18μｇ）を、30単位のHind II
Iにより消化し、そして次にクレノウフラグメントによ
り処理し、末端をブラント化した。次にそのDNAをPvu I
により消化し、そして0.5KbのPvu I−Hind III（ブラン
ト）フラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動
後、回収した。
3.pBM11/PADの5.2KbのPvu I−BamH Iフラグメントの調
製 プラスミドpBM11/PAD（18μｇ）を、30単位のPvu I、
次に30単位のBamH Iにより消化した。5.2Kbのフラグメ
ントを、アガロースゲル上での電気泳動後、回収した。
4.pBM11/PAD/EGFの連結及び単離 0.17KbのBcoR I（ブラント）−BamH Iフラグメント、
0.5KbのPvu I−Hind III（ブラント）フラグメント及び
5.2TKbのPvu I−BamH Iフラグメントを一緒に連結し、
そしてその得られた混合物を用いて、コンピテントE.コ
リHB101を形質転換せしめた。その形質転換体を、上記
のようにDNA配列決定によりスクリーンした。所望する
シグナル配列/EGF領域は、次の配列を有した： pBM11/PAD発現システム中での外来性タンパク質の産
生の効力及び融合生成物から機能的に活性的な外来性タ
ンパク質を精製するための能力が、例としてpBM11/PAD/
EGFを用いて示された。サイズ排除クロマトグラフィー
（TSK−250）により処理した後、10.3mg等量の活性EGF
融合ポリペプチドを、EGF遺伝子を発現するために抑制
解除された23g（8l）のE.コリから回収した。40％のEGF
活性が、シグナル配列から切断されたEDFに由来した。
B.pBM11/PAD/OncMの構成 1.変性されたオンコスタチンＭ遺伝子フラグメントの調
製 変性されたオンコスタチンＭ遺伝子を含むプラスミド
pOncMVV2を、Nco Iにより消化し、そして５′オーバー
ハング塩基をS1ヌクレアーゼによる処理により除去し、
ブラント末端化されたフラグメントを残した。そのヌク
レアーゼ処理は、開始メチオニンのためのコドンを除去
した。そのプラスミドをさらに、BamH Iにより消化し、
そして700bpのNco I（ブラント）−BamH Iオンコスタチ
ンＭ遺伝子フラグメントをゲル精製した。このフラグメ
ントは、５′末端でNco Iブラント末端及び３′末端でB
amH Iオーバーハングを含んだ。
2.pBM11M3/PADフラグメントの調製 変性されたアルカリホスファターゼシグナル配列をコ
ードするヌクレオチド配列を含むプラスミドpBM11M3/PA
DをHind IIIにより消化し、シグナル配列の下流を直接
切断した。そのオーバーハング末端をフィルインし、そ
してDNAポリマラーゼのクレノウフラグメントを用いて
ブラント化した。その得られたDNAをさらにPvu Iにより
消化し、そして680bpのHind III（ブラント）−Pvu Iフ
ラグメントをゲル精製した。
プラスミドpBM11M3/PADをまた、BamH I及びPvu Iによ
り消化し、そして5KbのBamH I−Pvu Iフラグメントを、
ゲル精製した。
3.pBM11/PAD/OncMの連結及び単離 700bpのNco I（ブラント）−BamH IオンコスタチンＭ
遺伝子フラグメント、pBM11M3/PADの680bpのHind III
（ブラント）−Pvu Iフラグメント及びpBM11M3/PADの5K
bのBamH I−Pvu Iフラグメントを、T4リガーゼを用いて
一緒に連結し、そしてそれを用いてコンピテントHB101
を形質転換せしめた。正しい構成体を、サンガー−ジデ
オキシ技法を用いてのヌクレオチド配列決定によりアッ
セイした。正しいコロニーを選択し、そしてpBM11/PAD/
OncMと命名した。
C.pBM11/PAD/nVGFaの調製 合成オリゴヌクレオチドは、上の極端なＮ−末端を示
す、天然のVGFにおけるシグナル配列切断部位のすぐ下
流に存在する追加のＮ−末端残基をコードすることによ
って最適なシグナル配列切断部位を付与するために、ア
ルカリホスファターゼ変性シグナル配列とVGFaの合成遺
伝子とを連結するように企画された。そのnVGFa配列
は、天然のVGF配列GDC及びGMYCRCの代わりに変性された
配列GTC及びGYACRCを含み、そして、天然の配列PNTの上
流での配列YQRで終結する。この発現システムにおいて
は、大部分の分子に関して、シグナル配列が、Ｃ−末端
でnVGFaを有する、融合タンパク質を形成するnVGFaに結
合したまま存続する。
1.Hind III−Pvu Iにより消化された0.5KbのpBM11/PAD
フラグメントの調製 プラスミドpBM11/PADをHind III及びPvu Iにより消化
し、そして0.5Kbのフラグメントをゲル精製した。Hind
III部位は、変性されたアルカリホスファターゼシグナ
ル配列のＣ−末端で位置する。
2.pBM11プラスミドの5.2KbのPvu I−BamH Iフラグメン
トの調製 プラスミドpBM11/NDP/VGFaをPvu I及びBamH Iにより
消化し、そして5.2Kbのプラスミドフラグメントをゲル
精製した。
3.170bpのNco I（ブラント）−BamH I合成VGFa遺伝子の
調製 プラスミドpBM11/NDP/VGFaをNco Iにより消化し、そ
して５′オーバーハングをS1−ヌクレアーゼによる処理
により除去した。これは、VGFa切断合成遺伝子の初めの
コドンでブラント末端を生成せしめた。次にそのDNAをB
amH Iにより消化し、そして170bpのNco I（ブラント）
−BamH Iフラグメントをゲル精製した。
4.pBM11/PAD/nVGFaの連結及び単離 オリゴヌクレオチドVGF105及び106、pBM11/PADの0.5K
bのHind III−Pvu Iフラグメント、pBM11の5.2KbのPvu
I−BamH Iフラグメント及び170bpのNco I（ブラント）
−BamH I合成VGFa遺伝子をDNAリガーゼを用いて一緒に
連結し、そしてその混合物を用いてコンピテントHB101
を形質転換せしめた。その形質転換体をネオマイシンに
対して選択し、そして制限分析及びサンザー−ジデオキ
シ技法を用いてのヌクレオチド配列決定によりスクリー
ンした。nVGFa遺伝子と読み枠を合わして変性されたア
ルカリホスファターゼシグナル配列を含む正しい構成体
を単離した。
D.pBM11/PAD/PF4（Lys/血小板因子４の代わりに残基２
としてAspを有するアルカリホスファターゼのシグナル
配列）の調製 変性されたアルカリホスファターゼシグナルペプチド
をコードするヌクレオチド配列の下流の融合体における
合成血小板因子４遺伝子のヌクレオチド配列及びその対
応するアミノ酸配列は、上記pBM11/PAD/nVGFaの調製法
と実質的に同じようにして調製された。但し、合成PF4
遺伝子が、段階３における合成VGFa遺伝子の代わりに使
用された。単離された構成体は次の通りである。予測さ
れる切断部位は、（＊＊＊）により示される。
例 VII. アルカリホスファターゼシグナル配列を有する融合タン
パク質としての対象のポリペプチドの発現 A.pBM11/PAK/nVGFa（アルカリホスファターゼシグナル
配列／天然のVGF N−末端及び配列GTC及びGYACRCを有す
るnVGFa）の調製 プラスミドpBM11/PAD/nVGFをインビトロで突然変異誘
発し〔Morinagaなど.,biotechnology（1984）２:636〜6
43〕、シグナル配列における第２アミノ酸をコードする
コドンを変更し、すなわち天然の配列に見出される残基
Lys（Ｋ）のためのコドンにAsp（Ｄ）コドンを変えた。
この突然変異誘発はまた、Pvu I部位をシグナル配列中
に導入した。
B.pBM11/PAK/EGFの調製 この発現カセットにおいて、EGF遺伝子は、アルカリ
ホスファターゼシグナル配列を有する融合体の一部であ
る。
プラスミドpBM11/PAD/EGFをインビトロで突然変異誘
発せしめ、シグナル配列における第２アミノ酸をコード
するコドンを変更し、すなわちAsp（Ｄ）コドンを天然
の配列に見出される残基Lys（Ｋ）のためのコドンを変
えた。この突然変異誘発はまた、Pvu I部位をシグナル
配列中にも導入した。
C.TacPak/EGF（アルカリホスファターゼシグナル配列／
ヒトEGF）の調製 1.プラスミドのフラグメントの調製 プラスミドp135−１は、プラスミドpDR540（Pharnaci
a）に由来し、そしてlacSDの下流に、croSD遺伝子及びB
gl II部位を含んだ。pDR540は、trp−lacハイブリッド
ベクターを含む発現ベクターである。p135−１をBgl II
及びBamH Iにより消化し、そして細菌性アルカリホスフ
ァターゼにより処理した。
プラスミドpBM11/PAK/EGFをPvu II及びBamH Iにより
消化し、そしてアルカリホスファターゼシグナル配列及
びヒトEGFの一部をコードする〜230bpのフラグメントを
単離した。
2.TacPak1及びTacPak2オリゴヌクレオチドの調製 合成オリゴヌクレオチドTacPak1及びTacPak2を、p135
−１のBgl II部位と適合できるオーバーハング及びアル
カリホスファターゼ/EGF Pvu II−BamH Iフラグメント
におけるPvu II部位と適合できるPvu IIオーバーハング
により企画した。そのオリゴヌクレオチドは、Applied
Biosystems Oligonucleotide synthesizerにより合成
された。
3.TacPak/EGFクローンの連結及び単離 Bgl II−BamH Iにより消化されたp135−1,230bpのPAK
/EGFフラグメント及びオリゴヌクレオチドTacPak1及びT
acPak2を、DNAリガーゼを用いて連結し、それを用いて
コンピテントHB101を形質転換せしめ、そして正しい構
成体をDNA配列決定により単離した。
例 VIII. 転写終結領域を含む発現カセットを用いて、アルカリホ
スファターゼシグナル配列を有する融合タンパク質とし
ての対象のポリペプチドの発現 A.pTCPt/EGF（〔trp−35〕16bp〔Lac−10〕〔lacSD〕11
bp〔ATG〕／アルカリホスファターゼシグナル／ヒトEGF
/翻訳終結−NEO）の調製 このプラスミドは、tacプロモーター成分を有し、そ
してアルカリホスファターゼシグナル配列の後ろに、ヒ
トEGFを発現するためにcroSDを利用するように企画され
る。それは、ネオマイシン耐性遺伝子を有するpBR322バ
ックグラウドを有する。
1.TacPak/EGFの420bpのHind III（ブラント）−BamH I
フラグメントの調製 TacPak/EGFをHind IIIにより消化し、そして次に、DN
Aポリマラーゼのクレノウフラグメントにより処理し、
ブラント末端を製造した。次にそのDNAをBamH Iにより
消化し、そしてtacプロモーター成分、及びアルカリホ
スファターゼシグナル配列及びヒトEGFのためのコード
領域を含む420bpのフラグメントを、アガロースゲル電
気泳動により単離した。
2.pBM16T/NDP/VGFaの2.8KbのEcoR I（ブラント）−BamH
Iフラグメントの調製 pBM16t/NDP/VGFaをEcoR Iにより消化し、そして次に
クレノウフラグメントにより処理し、ブラント末端化し
た。次にそのDNAをBamH Iにより消化し、そして2.8Kbの
フラグメントを単離した。このDNAフラグメントは、pBR
322起点、除去されるそのNco I部位を有するネオマイシ
ン耐性遺伝子及びBamH I部位の下流での遺伝子32様転写
ターミネーターを含む。
3.pTCPt/EGFの連結及び単離 pBM16t/NDP/VGFaの2.8KbのEcoR I（ブラント）−BamH
Iフラグメントを、TacPak/EGFの420bpのHind III（ブ
ラント）−BamH Iフラグメントに連結し、そしてその得
られたDNAを用いてコンピテントJM109（lacIq）を形質
転換せしめた。正しい構成体を、そのネオマイシン耐性
により及びDNA配列決定により単離した。
B.pTCPt/nVGFa（〔trp−35〕16bp〔lac−10〕〔lacSD〕
〔croSD〕11bp〔ATG〕／アルカリホスファターゼシグナ
ル／配列GTC及びGYACRCを有するｎ−末端VGFa/翻訳終結
−NEO）の調製 このプラスミドは、tacプロモーター成分を有し、そ
してアルカリホスファターゼシグナル配列の下流にＮ−
末端延長部を有する変性されたVGF遺伝子を発現するた
めにcroSDを使用する。このプラスミドは、ネオマイシ
ン耐性遺伝子を有するpBR322バッググランドを有する。
1.pBM11/PAK/nVGFaの350bpのPvu I−BamH Iフラグメン
トの調製 プラスミドpBM11/PAK/nVGFaをPvu I及びBamH Iにより
消化し、そして350bpのフラグメントをゲル電気泳動に
より単離した。このフラグメントは、アルカリホスファ
ターゼシグナル配列及びnVGFa遺伝子のほとんどを含
む。
2.pTCPt/EGFの2.8KbのPvu I−BamH Iフラグメントの調
製 プラスミドpTCPt/EGFをPvu I及びBamH Iにより消化
し、そして2.8Kbのフラグメントをゲル電気泳動により
単離した。
3.pTCPt/nVGFaの連結及び単離 前記2.8Kbのフラグメント及び350bpのフラグメント
を、DNAリガーゼを用いて連結し、そしてそのDNAを用い
てコンピテントJM109（lacIq）を形質転換せしめた。正
しい構成体を、制限分析を用いて単離した。
C.pTNPt/EGF（〔trp−35〕17bp〔lac−10〕〔nSD〕8bp
〔ATG〕／アルカリホスファターゼシグナル／ヒトEGF/
翻訳終結−NEO）の調製 このプラスミドは、tacプロモーター成分を有し、そ
してアルカリホスファターゼシグナル配列の後ろにヒト
EGFを発現するためにＮ−遺伝子SDを利用するように企
画された。それは、ネオマイシン耐性遺伝子を有するpB
R322バックグラウンドを有する。
1.pTNPtの2.8KbのPvu I−BamH Iフラグメントの調製 プラスミドpTNPtをPvu I及びBamH Iにより消化し、そ
してその2.8Kbのフラグメントをゲル電気泳動により単
離した。
2.pBM11/PAK/EGFの300bpのPvu I−BamH Iフラグメント
の調製 プラスミドpBM11/PAK/EGFをPvu I及びBamH Iにより消
化し、そして300bpのフラグメントを単離した。
3.pTNPt/EGFの連結及び単離 前記2.8Kbのフラグメント及び300bpのフラグメント
を、DNAリガーゼを用いて連結し、そしてそのDNAを用い
てコンピテントJM109（LacIq）を形質転換せしめた。正
しい構成体を制限分析及びDNA配列決定により選択し
た。
例 IX. 組換えポリペプチドの単離 A.PLプロモーター及びts CI リプレッサーを用いてpBM
−基礎のベクター中に産生される増殖因子 pBM11/NDP/増殖因子プラスミドを含むE.コリＢ（HB10
1）を、30℃でルリアブイヨン中で増殖した。その培養
物の密度を550nmで測定し、そしてその密度が0.7〜0.9
の吸光度に達した場合、増殖因子融合タンパク質の合成
が温度を42℃に高めることによって誘発された。その培
養物をこの温度で５〜20時間インキュベートし、次に細
菌を遠心分離により単離し、そして使用まで−70℃で凍
結した。
組換えタンパク質の単離のためには、細胞を、0.05M
のNaH2PO4,pH7.2,0.5MのNacl,0.01MのEDTAを含む緩衝液
中で融解した。150mlの緩衝液を、50gの細菌からの調製
のために使用した。細胞を、60ワットの電力で1/4−イ
ンチのプローブ、50％パルスを用いて氷上で15分間、音
波処理することによって破壊した。細胞の破壊の後、不
溶性タンパク質を、GSAローターで90分間、12,000rpmで
遠心分離することによって集めた。不溶性タンパク質を
含むペレットを、6Mのグアニジン塩酸塩50ml中に再懸濁
した。不溶性物質を、Beckmanタイプ30の超遠心機ロー
ターを用いて25,000rpmで２時間、遠心分離することに
よって集めた。その上清液を集め、そしてさらに使用す
るまで−20℃で貯蔵した。
融合タンパク質の精製を、1Mのグアニジン塩酸塩によ
り平衡化されたSephacryl S300又はFractugel HW−55カ
ラムのいづれかで行なった。融合タンパク質を含む画分
を、15％ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で決定される
場合、合成遺伝子によりコードされるポリペプチドの分
子量と一致する分子量を有するポリペプチドを含む画分
として同定した。
組換え増殖因子の活性形を得るために、融合タンパク
質を、1Mのグアニジン塩酸塩、1.25mMの還元されたグク
タチオン及び0.25mMの酸化されたグルタチオンを含む50
mMのTris−HCl衝撃液（pH8.7）中において40℃で３〜10
日間インキュベートすることによって再生せしめた。増
殖因子の生物学的活性を、上記（例I.Cを参照のこと）
のようにして競争受容体結合アッセイによりモニターし
た。最大レベルの活性が得られる場合、そのタンパク質
を蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥せしめた。
リーダー配列を除去したい場合、タンパク質を、70％
蟻酸中に再懸濁し、そして40℃で３日間インキュベート
することにより又は100倍モル過剰の臭化シアン中にお
いて室温で一晩インキュベートすることにより切断し
た。その切断された生成物を、蒸留水に対して透析し、
そして凍結乾燥せしめた。
組換え増殖因子をさらに精製するために、その増殖因
子を40％アセトニトリル、0.1％TFA中に再懸濁し、そし
てBioRad TSK−250カラムを用いてHPLCにより精製し
た。増殖因子を含む画分をプールし、そして逆相HPLC、
Waters μBonda−pak C−18又はRainin Dynamax C−８
を用いてさらに精製した。溶出液は、0.1％TFAを含む20
〜40％アセトニトリルの直線グラジエントであった。受
容体結合活性を含む画分をプールし、凍結乾燥せしめ、
そして使用するまで−20℃で貯蔵した。
1.TGF及び変性されたTGF a.N/TGF 変性された組換えヒトTGFが、プラスミドpBM11/N/TGF
から産生され、そしてＮ−末端でＮ−遺伝子の33個のア
ミノ酸及び天然のヒト配列QEDKの代わりに配列変性体QE
EKを含んだ。
2.変性され、そして切断されたVGF a.PAD/nVGFa 変性された組換えVGFを、VGFのＮ−末端配列及び天然
のVGF配列GDC及びGMYCRCの代わりに変性された配列GTC
及びGYACRCを含むプラスミドpBM11/PAD/nVGFaから製造
した。nVGFAフラグメントは、Ｎ−末端で変性されたア
ルカリホスファターゼシグナル配列を有する融合タンパ
ク質として発現され、そしてＣ−末端での配列YQRで切
断された。
b.NDP/VGFa 変性された組換えVGFを、DIPAIR配列で始まり、そし
てVGF中のYKQR配列で終結するプラスミドpBM11/NDP/VGF
aから製造した。それは、天然のVGF配列GDC及びGMYCRC
の代わりに変性された配列GTC及びGYACRCを有する。VGF
aフラグメントが、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の32個のアミ
ノ酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロ
リンを有する融合タンパク質として発現された。
c.VGFa VGFフラグメントを上記2.bに記載のようにして調製
し、そして酸処理により融合タンパク質から切断した
後、HPLCによりさらに精製した。
d.NDP/VGFA 変性された組換えVGFを、DIPAIR配列で始まり、そし
てVGFのYKQR配列で終結し、そして天然のVGF配列GDC及
びGMYCRCの代わりに変性された配列GTC及びGYACVCを有
するプラスミドpBM11/NDP/VGFAから製造した。そのVGFA
フラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の32個のアミノ
酸及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロリ
ンを有する融合タンパク質として発現された。
3.キメラTGF/VGFハイブリッド a.N/TTV（TGF/TGF/VGF） 変性された組換えTTVがpBM11/N/TTVから製造され、そ
して遺伝子のアミノ末端の2/3にヒトTGFのアミノ酸配列
を含んだ。但し、天然のヒト配列QEDKから変更された配
列QEEKを除く。カルボキシ末端は、VGFのアミノ酸配列
に由来し、そして天然の配列PNTの上流で配列YQRで終結
した。TTVフラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の33
個のアミノ酸を有する融合タンパク質として発現され
た。
b.NDP/TTV 組換えTTVを、プラスミドpBM11/N/TTVから製造し、そ
して（ａ）に記載のようにして変性した（但し、TTVフ
ラグメントは、Ｎ−末端でＮ−遺伝子の32個のアミノ酸
及び酸不安定性ジペプチド、アスパラギン酸−プロリン
を有する融合タンパク質として発現された）。
c.NDP/VTV 変性された組換えVTVが、プラスミドpBM11/NDP/VTVか
ら製造され、そして天然の配列QEDKに取って代わるアミ
ノ酸配列QEEKを有する中間ドメインにヒトTGFのアミノ
酸配列を含んだ。Ｎ−末端及びＣ−末端ドメインは、切
断されたVGF配列に由来し、そして配列DIPAIRで始ま
り、そして配列YQRで終結する。VTVフラグメントは、Ｎ
−末端でＮ−遺伝子の32個のアミノ酸及び酸不安定性ジ
ペプチド、アスパラギン酸−プロリンを有する融合タン
パク質として発現された。
d.NDP/TVV 変性された組換えVTVがプラスミドbBM11/NDP/TVVから
製造され、そして遺伝子のＮ−末端ドメインにヒトTGF
のアミノ酸配列を含んだ。中間及びＣ−末端ドメイン
は、切断されたVGF配列に由来し、そして配列YQRで終結
した。さらに、その合成遺伝子は、GMYCRCに代わる変性
配列GYACVCを有する。TVVフラグメントは、Ｎ−末端で
Ｎ−遺伝子の32個のアミノ酸及び酸不安定性ジペプチ
ド、アスパラギン酸−プロリンを有する融合タンパク質
として発現された。
B.tac又はlacプロモーターを含むベクター中に産生され
る増殖因子 tac又はlacプロモーターを含む発現カセットを含む細
菌宿主を、LBブイヨン又は化学的に定義された培地、た
とえばチアミン及びグルコースにより補充されたM9培地
のいづれか中において、30〜37℃でA600での光学密度が
0.2〜0.8になるように増殖せしめた。適切な抗生物質
が、発現カセットを含む宿主を選択するために培養培地
中に含まれた。細菌培養物が、100〜1000mM濃度のIPTG
により誘発され、そして30℃で16〜24時間、増殖せしめ
られた。lac I遺伝子を欠く発現カセットに関しては、
細菌宿主がlacIq遺伝子を有するＦ−因子、たとえばJM1
09,XL1,JM103、等を担持した。たlac I遺伝子を担持す
る発現カセットに関しては、細菌宿主の例はHB101,DH1,
DH5等である。細菌宿主が機能的なlacオペロン（lac+）
を有する場合、発現カセットは、１％ラクトースにより
誘発され得る。誘発期間の後、増殖因子が、培地又は細
菌ペレットのいづれかから単離される。
1.PAK/EGF 発現カセットTacPak/EGF及びpTcCPt/EGFから製造され
たヒトEGFも活性形で培地から単離し、そしてアルカリ
ホスファターゼシグナル配列を除去した。約85％の活性
EGFが培地中に見出され、そして残りは細菌ペレットに
関連した。これらの発現カセットは、4mg/lの活性EGFを
生成した。細胞を遠心分離により培地から除き、そして
その培地をAmicon SY30の30,000Mrカセットオフ螺施フ
ィルターに通し、そして次にＱ−セファロースカラムに
通し、そして高度に精製されたヒトEGFを０〜0.5MのNac
lグラジエントで20mMのNaPO4（pH7）中に溶出した。他
方、増殖因子は、浸透ショック法又は音波処理により細
胞ペレットから単離され、そして実質的に同じ方法によ
り精製した。
2.PAK/mVGFa 組換えnVGFaを、発現カセットpTCPt/nVGFaから生成し
た。nVGFaが音波処理により細胞ペレットから単離さ
れ、そして合計の細菌タンパク質のおよそ40％を構成す
ることが示された。
C.血小板因子４ 組換え血小板因子４を、増殖因子について上記に記載
されるようにして単離した。
1.N/PF4 組換え血小板因子４が、Ｎ−タンパク質の33個のＮ−
末端アミノ酸を有する融合体としてpBM11/N/PF4から生
成された。
2.NDP/PF4 組換え血小板因子４が、Ｎ−タンパク質の33個のＮ−
末端アミノ酸及びアスパラギン酸−プロリン切断部位を
有する融合体としてpBM11/NDP/PF4から生成された。蟻
酸による前記融合タンパク質の処理は、成熟PF4を開放
した。
D.オンコスタチンＭ 1.NDP/オンコスタチンＭ a.組換えオンコスタチンＭの精製 組換えOncM融合タンパク質を、次のようにしてE.コリ
から精製した:E.コリの培養物500mlからの細胞ペレット
をPNE緩衝液（0.5MのNaCl,10mMのEDTA、50mMのリン酸ナ
トリウム）40ml中に懸濁し、そして音波処理により溶解
した。凝集されたタンパク質を、次のように緩衝化され
た8Mの尿素溶液120mlによりそれぞれ16時間、連続的に
抽出した：溶液１）20mMのTris,pH5;溶液２）20mMのTri
s,pH8;溶液３）50mMのTris,pH11。最っとも凝集された
タンパク質を溶液１及び２により溶解し、そして組換え
OncoMは、溶液３より処理まで、不溶性のまま維持され
た。
b.組換え分子の再生 溶液３抽出物を、再生緩衝液（1Mのグアニジン塩酸
塩、1.2mMの酸化されたグルタチオニン、0.2mMの還元さ
れたグルタチオニン、20mMのTris Hcl,pH8.0〜9.0）に
対して24時間透析した。pHの8.0以下への低下は、生物
学的に活性するOncMの収量の100倍の低下をもたらし
た。再生の後、タンパク質を、増殖阻害アッセイ（例I.
E）での試験の前、1Nの酢酸に対して透析した。
2.PAD/オンコスタチンＭ PAD/OncoMを、発現カセットpBM11/PAD/OncoMから生成
した。培地が活性OncoMについて試験され、そして１
当たり20〜500μｇを含むことが示された。
例 X. 原核生物細胞中に生成される組換え増殖因子の生物学的
活性 A.EGF受容体結合 このアッセイは、EGFのその受容体への結合を阻害す
るその能力により測定されるように、EGF受容体に結合
する分子の能力を決定する。単離されたすべての増殖因
子及びキメラ性増殖因子は、変性されていても又は切断
されていてもいづれにせよ、EGF受容体結合阻害アッセ
イにおいて活性的であった。これらの結果の要約は、下
記に示される： 天然のマウスEGFのための結合阻害曲線及び細菌に発現
される組換えキメラ性増殖因子N/TTV（λＮ−遺伝子の3
2個のＮ−末端アミノ酸及び変性され、そして切断され
たTGF/VGFハイブリッドのペプチド融合体）の比較は、
結合活性に差異が存在しないことを示唆した。
B.マイトジェン活性 いくつかの精製された増殖因子の活性を試験し、そし
てすべての場合で決定された活性は、EGFにより引き起
こされる効果に匹敵した。試験された化合物は、下記に
示されたようなものである。
C.創傷の治癒 1.中間−皮膚損傷 中間−皮膚損傷に対する合成TGF,EGF及びVGF並びに組
換え増殖因子の効果を、例VE1に記載のようにして評価
した。治癒した元の熱傷部分の％を、コンピューター助
力の遠隔測定法により測定し、そして創傷の上皮形成率
を測定した。未処理創傷は約15％の再上皮形成率を示し
た。シルバデンのみ又はシルバデン及びEGFによる処理
は、およそ50％の上皮形成率をもたらし、そして合成TG
F又は天然のVGFによる処理は、およそ90％の上皮形成率
をもたらした。再上皮形成を促進するEGFの最適濃度は
１〜10μg/mlであり、そして合成TGF及び天然のVGFは、
0.1μg/mlで最大の応答を生ぜしめた。
上記実験に類似する実験が、TGF変性され、切断され
た形のVGF（VGFa）、又はTGF及びVGF（TTV）の変性さ
れ、切断されたキメラ性融合体（これらすべては、細菌
中において組換え技法により生成される）の創傷治癒に
おける効果を試験するために行なわれた。これらの組換
え増殖因子及びハイブリッド増殖因子は、合成TGF又は
天然のVGFと同じ程度に創傷の治癒を促進せしめ、そし
て0.1μg/mlで最適濃度を示した。
2.中間−皮膚供与体移植片損傷 変性され切断されたVGFaを、供与体移植片モデルにお
ける創傷の治癒を促進するその能力について検定した。
その処理法は、上記（例Ｉを参照のこと）と同じであ
り、そしてシルバデン20g中、５μg/mlのVGFa1mlを用い
た。毎日、写真が取られた。その結果の要約は、下記に
提供される： 変性され切断されたVGFaは、対照のキャリヤーと比べ
て、創傷の治癒を促進した。POD8での写真（提供されて
いない）は、食塩水とVGFaとの実質的な差異を示した。
例 XI. 原核生物細胞中に生成された組換え血小板因子４の生物
学的活性 種々の発現カセットを用いて生成された組換え因子４
の収率は、合計細胞タンパク質の約２％〜約20％であっ
た。これらの結果は下記に要約される： A.DNA合成の阻害 最っとも高い活性が、プラスミドpBM11/N遺伝子/PF4
からの融合タンパク質により見出された。A549細胞の最
大阻害の50％が、0.67μg/ウェルにより得られた。
B.ヌードマウスにおける腫瘍の増殖の阻害 雄のヌードマウスに、例1Cに記載されるように、血小
板因子４又はリン酸緩衝溶液を２〜３日間隔で注射し
た。下に示されるように、因子４は有意に腫瘍の増殖を
阻害した。
例 XII. 原核生物細胞において生成された組換えオンコスタチン
の生物学的活性 A.組換えオンコスタチンＭの生現化学的特徴 1.SDS−PAGE 培養物（50ml）を記載のようにして増殖し、そして誘
発せしめた。培養物をペレット化し、そしてその細胞ペ
レットを6Mのグアニジン塩酸塩中に溶解した。不溶性タ
ンパク質はこの点で除去されなかった。SDS−PAGE分析
のためのサンプルを、再生しないで1Nの酢酸に対して直
接透析した。
約６μｇの合計細菌タンパク質から成るアリコート
を、10〜20％のグラジエントゲル（５％積重ねゲル）上
でSDS−PAGEにより分析した。ゲルを、クーマシーブリ
リアントブルーにより染色し、脱色し、そして乾燥せし
めた。NDP−OncM融合タンパク質の見掛の分子量Ｍｒ
が、標準のタンパク質の分子量の移動性と比べることに
よって32,000であることがわかった。
B.組換えオンコスタチンＭ（Ｎ−遺伝子融合タンパク
質）の増殖阻害活性 天然のオンコスタチンＭの組換え体の存在下での細胞
の増殖を、未処理サンプル中の増殖と比較し、そして最
大（未処理）増殖の百分率として表わした。サンプルを
二重反復試験又は三重反復試験でアッセイし、そして一
般的にその変動お互い20％以下であった。オンコスタチ
ンＭの１つの増殖阻害アッセイ単位を、72時間のアッセ
イの間で、３〜４×103で接種されたA375細胞の増殖の5
0％阻害を引き起こすのに必要とされるタンパク質の量
として定義した。半分の最大増殖阻害のために必要とさ
れる濃度を、次のように形質転換の後の増殖データから
推定することによって測定した： ある場合、修飾された増殖アッセイが使用され、ここ
で標的細胞数及び血清濃度が減じられた。細胞を、５％
FBSを含むDMEM中に500個の細胞／ウェルの濃度で接種さ
れ、同じ媒体中、オンコスタチンＭにより処理し、そし
て未処理細胞が集密的になるまで（細胞系に依存して、
一般的に６〜10日間）、37℃でインキュベートした。次
に単層を染色し、そして上記のように処理した。
C.組換えオンコスタチンＭ（Ｎ−遺伝子融合タンパク
質）の受容体結合活性 A549ヒト肺癌細胞を、多量のラベルされていないオン
コスタチンＭの存在下で125I−オンコスタチンＭと共に
インキュベートした。少量（〜３）の添加された125I−
オンコスタチンＭが、ラベルされていないオンコスタチ
ンＭの存在下でこれらの細胞に結合した。結合がラベル
されていない天然の又は組換えオンコスタチンＭの存在
下で測定される場合、125I−オンコスタチンの結合の濃
度依存性阻害が観察された（〜300pMで半分の最大効
果）。125I−オンコスタチンＭの合計結合が、試験され
るラベルされていないオンコスタチンＭの最っとも高い
濃度で約90％阻害された。天然及び組換えオンコスタチ
ンＭは、125I−オンコスタチンＭの結合を阻害するそれ
らの能力においてお互い異ならなかった。その結果は、
下記に示される。
本発明の組成物は、原核生物細胞中でのポリペプチド
の効果的な発現のための発現カセットを含んで成る。そ
の発現カセットは、発現生成物の高められた安定性を付
与し、そして宿主細胞の増殖培地中に分泌される成熟し
た折りたたまれたポリペプチドを得ることによって多量
のポリペプチドの生成に使用される。
本明細書に言及されたすべての出版物及び特許出願
は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルの表示であ
る。すべての出版物及び特許出願は引例により本明細書
中に組込まれる。
本発明は今、十分に記載されたが、これによってこの
発明の範囲を限定するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７３６７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４１７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４１８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４１９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４３６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７４３７ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６７５４７ 前置審査 (72)発明者 ブルース，エー．グレゴリー アメリカ合衆国，ワシントン 98199, シアトル，サーティーシックス アベニ ュ ウエスト 2433 (72)発明者 リウ，スオ ウィン アメリカ合衆国，ニューヨーク 13214, デウィット，マーシュ ドライブ 225 (56)参考文献 特開 昭59−28479（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500212（ＪＰ，Ａ) 米国特許4565785（ＵＳ，Ａ) 英国特許4543329（ＧＢ，Ａ) 欧州公開196864（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開241446（ＥＰ，Ａ２) ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ. １ Ｎｏ．10，ｐ．1217−1224 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．97，ｐ．1429− 1436 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉ ｎ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．25，Ｎｏ．５，ｐ 542−546 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】大腸菌（E.coli）宿主細胞からその培養基
    中への、生物学的に活性で成熟した形態におけるジスル
    フィド結合含有ポリペプチドの分泌のための発現カセッ
    トであって、そのカセットが以下のような互いに作用可
    能な状態で連結されたDNAセグメント： Ｐ−−S.D.−−met−−Ｌ−−Ｇ−−Ｔ ｛ここで、 Ｐは、trpプロモーターからの−35コンセンサス調節配
    列及びlacプロモーターからの−10コンセンサス調節配
    列をもつプロモーターから本質的に成り； S.D.は、Cro遺伝子シャィン−ダルガルノ配列から本質
    的に成り； metは、開始メチオニンのためのコドンから本質的に成
    り； Ｌは、大腸菌（E.coli）アルカリ・ホスファターゼ・シ
    グナル配列又はその変異体であってその第２アミノ酸リ
    ジンがアスパラギン酸に変更されている変異体をコード
    する第1DNA配列から本質的に成り、ここで、上記シグナ
    ル配列及び上記変異体のアミノ酸のためのコドンが、上
    記S.D.に関連する生来のヌクレオチド配列のコドンを使
    用して、修飾されており、但し、Ｌは、上記変異体以外
    の、アミノ酸修飾された大腸菌（E.coli）アルカリ・ホ
    スファターゼ・シグナル配列をコードするDNA配列を含
    まない； Ｇは、上記成熟ポリペプチドをコードする第2DNA配引か
    ら本質的に成り；そして Ｔは、対応のRNA転写においてステム−ループ構造を形
    成することができるグアニン：シトシンに富む領域、そ
    の後のひと続きのチミンをもつ転写終結領域から本質的
    に成り、 上記S.D.は、上記Ｐの下流に、そして上記metの上流に
    作用可能な状態で連結されており、上記Ｌは、上記met
    から下流に、そして上記Ｇから上流に作用可能な状態で
    連結されており、そして上記Ｔは、上記Ｇの下流に作用
    可能な状態で連結されている。｝ を有する発現カセット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI891308A (fi) * 1988-03-24 1989-09-25 Oncogen Nya polypeptider med tillvaextfaktoraktivitet och dessa kodande nukleinsyrasekvenser.
US5086164A (en) * 1989-01-10 1992-02-04 Repligen Corporation Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases
IE901849A1 (en) * 1989-07-19 1991-06-19 Gruenenthal Gmbh Plasmids, their preparation and their use in the manufacture¹of a plasminogen activator
EP0423641A3 (en) * 1989-10-18 1992-01-15 Nippon Mining Company Limited Expression vector, transformed microorganism, fusion protein and method for the production of platelet factor 4 or tgfalpha
EP0467676A3 (en) * 1990-07-18 1992-11-19 Applied Immunesciences, Inc. Temperature-inducible secretion expression vectors and their use in prokaryotic cells
US6083686A (en) * 1990-10-26 2000-07-04 Johnson & Johnson Clinical Diagnostic Systems, Inc. Increased production of Thermus aquaticus DNA polymerase in E. coli
GB2253852B (en) * 1991-02-26 1995-03-22 Ici Plc Vector for expression of heterologous polypeptide comprising inducible selection system
AU1103900A (en) * 1998-10-07 2000-04-26 Stryker Corporation Modified tgf-beta superfamily proteins
EP1368483B1 (en) 2001-03-09 2012-10-24 Genentech, Inc. Process for production of polypeptides
US7153666B2 (en) 2003-07-17 2006-12-26 General Atomics Methods and compositions for determination of glycated proteins
US7022494B2 (en) 2003-09-19 2006-04-04 General Atomics Detection of potassium ions using ion-sensitive enzymes
US8187831B2 (en) 2003-09-19 2012-05-29 General Atomics Determination of ions using ion-sensitive enzymes
US7943385B2 (en) 2006-07-25 2011-05-17 General Atomics Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin
WO2008013874A1 (en) 2006-07-25 2008-01-31 General Atomics Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin
CN102076867A (zh) 2008-05-13 2011-05-25 通用原子公司 用于直接测定糖化血红蛋白百分比的电化学生物传感器

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565785A (en) 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL60184A (en) * 1979-05-31 1984-05-31 Schering Ag Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
EP0172194B1 (en) * 1984-02-08 1994-01-19 Cetus Oncology Corporation Control systems for recombinant manipulations
US4711845A (en) * 1984-08-31 1987-12-08 Cetus Corporation Portable temperature-sensitive control cassette
DE3430683A1 (de) * 1984-08-21 1986-03-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Synthetische regulationsregion
EP0196864A3 (en) * 1985-03-25 1988-03-23 Cetus Corporation Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences
CA1340091C (en) * 1986-03-27 1998-10-20 Peter Olafs Olins Enhanced protein production in bacteria by employing novel ribosome binding site

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4565785A (en) 1978-06-08 1986-01-21 The President And Fellows Of Harvard College Recombinant DNA molecule

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１ Ｎｏ．１０，ｐ．１２１７−１２２４
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．５，ｐ５４２−５４６
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７，ｐ．１４２９−１４３６

Also Published As

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EP0372005A1 (en) 1990-06-13
JPH04502851A (ja) 1992-05-28
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EP0372005A4 (en) 1990-06-26

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