DE3587307T2 - Transformierte hefen die lysozym produzieren, fuer diese transformation zu verwendende plasmide und deren verwendung. - Google Patents

Description

• Die Erfindung betrifft Hefen, die durch Transformation mit DNA fremden Ursprungs in die Lage versetzt wurden, Enzyme vom 1,4-β-N-Acetylmuramidase-Typ zu produzieren.
• Es ist bekannt, daß 1,4-β-N-Acetylmuramidasen Enzyme sind, die selektiv die glycosidische Bindung zwischen N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure in den Peptidoglycanen spalten können, weiche die Zellwand von Bakterien bilden. Diese Wand wird dadurch lysiert, was den Tod der Zellen nach sich zieht. Diese Enzyme, die gewöhnlich Lysozyme genannt werden, wirken somit als Bakterizide, und es ist anerkannt, daß diese Eigenschaft ihre generelle Anwesenheit in den meisten der biologischen Flüssigkeiten von höheren Tieren erklärt. Tatsächlich wird Lysozym in verschiedenen Konzentrationshöhen in Blut, Tränen, Speichel, Milch, . . . von Säugetieren gefunden. Es wird auch im Pflanzenreich gefunden, z. B. in Papaya. Die Gewinnung von Lysozym im industriellen Maßstab wird jedoch von Eiklar ausgehend durchgeführt, in welchem es in verhältnismäßig hoher Konzentration vorhanden ist, und zwar mit verschiedenen Adsorptions- und/oder Präzipitationsverfahren (belgisches Patent 694,538).
• Gegenwärtige Anwendungen von Hühner-Lysozym liegen meist auf dem pharmazeutischen Gebiet, wo es verwendet wird, um verschiedene Infektionen zu bekämpfen. Andere Anwendungen liegen in der Nahrungsmittelindustrie. Beispielsweise ist bekannt, daß Lysozym bei der Herstellung von gebackenem Preßteigkäse verwendet werden kann, um während der Reifung die Entwicklung von Buttersäurebakterien zu hemmen, die für Herstellungsmängel einschließlich sogar der Blasenbildung im Käse verantwortlich sind (französisches Patent 8003321). Es kann auch für die Konservierung von verschiedenen verderblichen Lebensmittein wie Fleischprodukten (A. Akashi, Jap. J. Zootechnical Sci. 42, 1971, 289), Weinen (japanisches Patent 3115/71, 1971) oder Sake (M. Yajima et al., J. Ferm. Technol. 46, 1968, 782) verwendet werden. Es kann außerdem verwendet werden, um Milchbestandteile für pediatrische Zwecke zu konservieren (japanisches Patent 16780/70, 1970), etc. . . .
• Diese verschiedenen Anwendungen stellen einen beachtlichen potentiellen Markt dar, und zwar insofern, als Lysozym einfach in großen Mengen und mit ausreichend geringen Kosten hergestellt werden kann. Die verschiedenen Verfahren, die gegenwärtig die Gewinnung von Lysozym aus Eiklar ermöglichen, sind nur dann wirtschaftlich akzeptabel, wenn das Eiklar nach der Behandlung als Nahrungsmittel wiederverwendet werden kann. Die Lysozym-Produktionskapazität wird daher teilweise vom Eiklarmarkt beherrscht, und dies wirft ein Problem auf, das schwieriger zu lösen ist als technische Schwierigkeiten, und in einigen Ländern limitieren sogar gesetzliche Beschränkungen die Verwendung von behandeltem Eiklar in Standardlebensmitteln.
• Diese Probleme, die mit der Verfügbarkeit von natürlichen Quellen für Lysozym verbunden sind, werden im Falle von Säugetier-Lysozymen unüberwindlich, und zwar entweder, weil deren Ausgangskonzentration zu niedrig ist, wie bei Kuhmilch-Lysozym, oder weil es das Rohmaterial praktisch nicht gibt, wie bei Human- Lysozym. Somit besteht ein Bedarf für eine Technik, die es ermöglicht, Lysozym herzustellen und bei der die oben beschriebenen Probleme vermieden werden.
• Hauptaufgabe dieser Erfindung ist,Hefen bereitzustellen, die mit klassischen Verfahren der Gentechnologie in die Lage versetzt wurden, Lysozym herzustellen. Insbesondere betrifft sie Hefen, die so transformiert wurden, daß ihre DNA mindestens eine Kopie eines Fragments enthält, das eine 1,4-ß-N-Acetylmuramidase codiert, und daß dieses Fragment darin in Form des korrespondierenden aktiven Proteins exprimiert wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Hefen, die wie oben beschrieben transformiert wurden, welche aber auch in der Lage sind, das Lysozym, das sie produzieren, auszuscheiden, um so dessen Abtrennung und Reinigung zu erleichtern. Die Plasmide, welche diese Transformation sicherstellen, bilden auch eine Aufgabe der Erfindung, genauso wie das Verfahren zur Herstellung von Lysozym durch Züchtung der transformierten Hefen. Diese Aufgaben wie auch andere Vorteile und Auswirkungen der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung klar.
• Es ist bekannt, Hefen genetisch umzuprogrammieren, indem sie mit einem DNA-Fragment transformiert werden, das einen aus einem heterologen Gen gebildeten codierenden Teil trägt, oder mit dem Produkt der reversen Transkription der korrespondierenden Boten-RNA. Zu diesem Zweck ist es üblich, als Vektoren für dieses Fragment Plasmide zu verwenden, die durch das Vorhandensein eines Replikationsursprungs, der von der Replikationsmaschinerie der Wirtszelle erkannt wird, zur autonomen Replikation in der Hefezelle in der Lage sind. Der Vektor muß auch ein Marker-Gen enthalten, das die Sichtbarmachung und Selektion von Zellen erlaubt, die wirksam mit dem Plasmid transformiert wurden. Schließlich muß der codierende Teil einen vorgeschalteten Promotor aufweisen, d. h. eine Sequenz, die von der RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannt wird, um effiziente Transkription des codierenden Teils in die korrespondierende Boten-RNA sicherzustellen.
• In der Praxis wurden diese Techniken hauptsächlich auf Hefen der Art Saccharomyces cerevisiae angewendet, für die eine große Anzahl von Expressionsvektoren konstruiert wurde, die derartige verschiedene Elemente enthalten. Diese Vektoren enthalten im allgemeinen den Replikationsursprung des 2-Micron-Plasmids, das in den meisten dieser Arten vorhanden ist, oder auch ein ARS-Segment der autonomen Replikation chromosomalen Ursprungs. Als Marker-Gen wird im allgemeinen ein Gen verwendet, das mit der Biosynthese eines essentiellen Metaboliten, z. B. einer Aminosäure, verbunden ist. In einem derartigen Fall handelt es sich bei der zu verwendenden Wirtszelle um einen Hefestamm, der durch Mutation auxotroph für diesen Metaboliten geworden ist. Durch Inokulieren dieses Stammes mit einem Medium, das frei von diesem Metaboliten ist, werden nur solche Zellen wachsen können, die mit einem Plasmid transformiert wurden, welches das fehlende Gen trägt. Typische Beispiele für derartige Marker sind die Gene LEU2 oder TRP1, die jeweils ein Enzym codieren, das mit der Biosynthese von Leucin und Tryptophan verbunden ist. Diese Expressionsvektoren müssen auch eine oder vorzugsweise mehrere Restriktionsstellen aufweisen, in die der interessierende codierende Teil insertiert werden kann, und die verschiedenen Elemente, die für die Optimierung und deren Expression erforderlich sind, d. h. Promotoren, Terminatoren und andere Kontrollelemente.
• Diese Plasmide enthalten oft weitere bakterielle Sequenzen, die ihre Replikation und ihre Selektion in einem bakteriellen Zwischenwirt, z. B. Escherichia coli, sicherstellen. Als klassische Beispiele derartiger Shuttleplasmide seien YEp13 (J. R. Broach etal. Gene 8, 1979, 121), pFL1-4 (M. R. Chevallier et al. Gene U, 1980, 11), pJDB207 (J. D. Beggs Alfred Benson Symposium No. 16, Muaksgaard, Copenhaegen, 1981, S. 383), pMH158 und pJO158 (M. Heuterspreute et al., Gene, 34 1985, 363) genannt.
• Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Plasmid verwendet, das mindestens die Replikations(REP)funktionen der Sequenz des endogenen 2-Micron-Plasmids enthält, und zwar hauptsächlich, wenn die Wirtszelle zur S. cerevisiae-Art gehört. Diese Funktionen verleihen allgemein dem Plasmid eine größere Stabilität, insbesondere wenn die Wirtszelle zuvor von ihren 2-Micron-Plasmiden kuriert wurde (C. P. Hollenberg, Curr. Top. Microbiol. Immunol. %, 1982, 119; R. M. Walmsley etal., Mol. Gen. Genet. 1983, 361). Klassische Beispiele für derartige Vektoren sind die Plasmide pIDB219 und pJDB248 (J. D. Eeggs, Nature 275 1978, 104). Ein weiterer Vektor dieses Typs wird in den im folgenden gegebenen Beispielen beschrieben.
• Um einen möglichst hohen Expressionsgrad des interessierenden codierenden Teils sicherzustellen, ist es schließlich erforderlich, ihn mit einem möglichst effizienten Promotor zu assoziieren. In Hefe sind verschiedene starke Promotoren bekannt, z. B. die Promotoren von Alkoholdehydrogenase (ADH1), Enolase (ENO8 und ENO46), Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP63 und GAP491), Phosphoglyceratkinase (PGK) (M. J. Dobson et al., Nucleic Acids Res. 10, 1982, 2625), akalische Phosphatase (PH03 und PH05) (Europäische Patentanmeldung 100,561) oder auch der Promotor p415, der im folgenden erwähnt werden wird.
• Diese verschiedenen Techniken, die erfolgreich für die Klonierung und die Expression vieler heterologer Gene in Hefe verwendet wurden, können natürlich auch zur Sicherstellung der Expression der Gene von Lysozymen oder jedes DNA-Teils, der eine 1,4-β-N-Acetyimuramidase codiert, verwendet werden. Zum Zwecke der Veranschaulichung werden in der vorliegenden Erfindung Beispiele für konkrete Konstruktionen angegeben, aber es ist klar, daß es viele andere Möglichkeiten gibt und daß verschiedene Kombinationen von Replikationsursprüngen, Marker-Genen, effizienten Promotoren und anderen strukturellen Elementen verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten. Die transformierten Zellen, die in diesen verschiedenen Fällen erhalten wurden, sind daher als im Schutzumfang der Erfindung enthalten anzusehen.
• Obwohl die meisten dieser Techniken hauptsächlich zur Transformation der Hefe S. cerevisiae verwendet wurden, sind von der Erfindung gleichermaßen auch die transformierten Zellen umfaßt, die aus anderen Arten und Gattungen von Hefen erhalten wurden, die mit Expressionsvektoren des gleichen Typs wie die oben erwähnten und ihren Varianten transformierbar sind. Als Beispiele anderer Hefen seinen Saccharomycopsis lipolytica, Schizosaceharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, etc. . . . erwähnt. Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch transformierbare Hefen der Gattung Saccharomyces als Wirtszellen verwendet, und außerdem vorzugsweise solche, die zur Art S. cerevisiae gehören. Als Beispiele für transformierbare Stämme, die zu dieser Art gehören, seien unter vielen anderen AH22 und GRF18 genannt.
• Die 1,4-β-N-Acetylmuramidasen, die nach der Erfindung durch diese verschiedenen Sorten von Hefen produziert werden, können unterschiedlichen Ursprungs sein. Es kann sich beispielsweise um Hühner- Lysozym handeln, das bereits im industriellen Maßstab produziert wird, wie oben beschrieben. Es ist jedoch klar, daß DNA-Teile, die Lysozyme aus anderen Quellen codieren, auf ähnliche Weise in Hefe exprimiert werden können, weil diese verschiedenen Lysozyme, in unterschiedlichem Ausmaß, ausgeprägte Homologien wiedergeben (P. Joll s et al., Mol. & Cell. Biochemistry 63, 1984, 165). Beispielsweise kann man in Hefe Gänse-Lysozym exprimieren, das eine bemerkenswert höhere spezifische Aktivität als Hühner-Lysozym hat (R. C. Cantield et al., in "Lysozyme", ed. E. E Ossermann et al., Academic Press 1974, S. 63). Man kann in Hefe auch Human-Lysozym exprimieren, ebenfalls sehr aktiv und besonders für pharmazeutische Zwecke angezeigt, wie beispielsweise bei der Herstellung von Milch für pediatrische Zwecke. Das Lysozym aus Papaya und das von Bakterienviren codierte seien ebenfalls genannt.
• Wenn nach der Erfindung ein Hefestamm durch Gentechnologie dazu gebracht wurde, Lysozym jedes Ursprungs zu produzieren, ist es, um Vorteil aus dieser neuen Eigenschaft zu ziehen, erforderlich, ihn durch Fermentation unter den günstigsten Bedingungen für sein Wachstum zu vervielfachen. So wird eine Biomasse erhalten, die als solche Anwendung bei der menschlichen und tierischen Ernährung finden kann. Es ist beispielsweise bekannt, daß Hefeautolysate in zunehmendem Maße als Zusätze in verschiedenen Lebensmitteln verwendet werden (Fleischpastete, Suppen, Soßen, . . .), und zwar nicht nur wegen ihres eigenen Nährwertes, sondern auch wegen ihrer organoleptischen Eigenschaften. Das Vorhandensein von Lysozym in den Originalhefen bringt den Vorteil mit sich, daß bis zu einem bestimmten Grad die bakterielle Kontamination der Autolysate verhütet werden kann, der diese wie die Lebensmittelprodukte, denen sie einverleibt wurden, ausgesetzt sind. Andererseits ist bekannt, daß die Gegenwart von Lysozym eine Verringerung der Sterilisationstemperatur von Lebensmittelprodukten erlaubt (britisches Patent 1,438,560).
• Hefen nach der Erfindung können auch als Quelle für gereinigtes Lysozym verwendet werden, und zwar indem das Lysozym von der Hefe abgetrennt wird. Es ist jedoch klar, daß dieser Vorgang beträchtliche Schwierigkeiten mit sich bringen kann, wenn das Lysozym innerhalb der Zelle mit anderen zellulären Proteinen assoziiert ist. Es ist somit ein wichtiger Aspekt der Erfindung, Hefen bereitzustellen, die in der Lage sind, das produzierte Lysozym auszuscheiden, sei es, daß es in das Kulturmedium freigesetzt wird, aus dem es mit klassischen Verfahren, z. B. durch Adsorption und/oder Präzipitation gewonnen wird (belgisches Patent 694,538), oder daß es mit der Zellwand assoziiert bleibt, von der es durch andere Verfahren abgelöst wird. Tatsächlich wurde überraschenderweise beobachtet, daß die Signalsequenz von 18 Aminosäuren, die am N-terminalen Teil des Prälysozyms vorhanden ist, und die die Sekretion von Lysozym in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums von Hulmer-Oviduktzellen erlaubt, auch von Hefezellen erkannt wird. Tatsächlich zeigen die folgenden Beispiele, daß, wenn die DNA, die Hühner-Prälysozym codiert, in Hefe exprimiert wird, das Produkt dieser Expression daraus ausgeschieden wird. Deshalb kann das Fusionieren des 54-Nukleotidfragments, das diese Signalsequenz codiert, mit der DNA, die den strukturellen Teil anderer Proteine codiert, einschließlich Lysozym anderen Ursprungs, zur Ausscheidung der Proteine aus den Hefezellen, in denen sie produziert wurden, führen.
• Der grundlegendste und überraschendste Aspekt der Erfindung ist jedoch die Tatsache, daß ein Lysozym- Gen in Hefe exprimiert werden kann, ohne daß darin irgendeine lethale Wirkung ausgeübt wird, z. B. durch Lyse der Zellen. Das einzige bekannte Beispiel der Klonierung und Expression eines Lysozym-Gens in einer heterologen Zelle ist die Klonierung des Hühner-Lysozym-Gens in Hela- und MCF-7-Human-Zellinien (P. D. Matthias et al., The EMBO J. L 1982, 1207), obwohl die Expression des Gens lediglich durch die Produktion der korrespondierenden Boten-RNA nachgewiesen wurde und nicht durch die Produktion des Proteins an sich. Jetzt ist bekannt, daß Lysozym auch in der Lage ist, Hefezellwände anzugreifen, hauptsächlich durch Hydrolyse ihres Chitin-Bestandteils (G. N. Maksimova et al., Prikl. Biochim. Mikrobiol. 18, 1982, 529). Da bekannt ist, daß das Knospen von Hefen mit der Bildung eines Septums aus purem Chitin zwischen der Knospe und der Mutterzelle begleitet wird, könnte man vermuten, daß die Produktion und Exkretion von Lysozym durch Hefezellen zu ernsthaften Veränderungen ihrer multiplikativen Funktion führen würde. Man könnte ebenso vermuten, daß die Regeneration der Zellwand von Protoplasten nach Transformation gefährdet ist. Es ist daher überraschend, daß nicht nur klassische Verfahren der Gentechnologie Hefen dazu bringen konnten, ein Lysozym-Gen zu exprimieren, sondern auch, daß so transformierte Zellen Lysozym produzieren und ausscheiden konnten, während sie aktiv wachsen.
• Obiges wird aus den folgenden Beispielen klar. Diese Beispiele sind lediglich zur Veranschaulichung gedacht, da jede andere Konstruktion, die zur Produktion irgendeiner 1,4-β-N-Acetylmuramidase durch irgendeinen Hefestamm führt, ebenfalls in den Schutzumfang der Erfindung fällt.
Kurze Beschreibung der Figuren
• In den folgenden Beispielen wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen:
• - Fig. 1 stellt die Konstruktion von Plasmid plys5 dar, das später zur Rekonstruktion der vollständigen cDNA von Hühner-Lysozym verwendet wird. Diese Konstruktion geht aus vom Cosmid pFF2-lys-16, welches ein 40 kb Insert enthält, das das vollständige Lysozym-Gen enthält. Ein 2,1 kb HindIII-Insert, welches das erste Exon dieses Gens enthält, wurde dann in Plasmid pEMBL8 insertiert. Das so erhaltene plys5-Plasmid ist lacZ&supmin; und kann dann von Plasmid pEMBL8 unterschieden werden, das lacZ&spplus; ist.
• - Fig. 2 zeigt, wie die vollständige cDNA von Lysozym innerhalb Plasmid plys10 rekonstruiert wurde, und zwar durch Ligation eines AccI-HgaI-Fragments, das von plys5 stammt und das 5'-terminale Ende des Lysozym-Gens enthält, mit zwei anderen Fragmenten, die vom Plasmid pBR-lys-1 stammen und den Rest der cDNA von Lysozyin enthalten.
• - Fig. 3 zeigt die Konstruktion von Plasmid plysΔ9, das die cDNA von Lysozym enthält, die durch Verdauung mit Exonuklease BAL31 des untranslatierten Teils ihres 5'-terminalen Endes deletiert wurde.
• - Fig. 4 zeigt die Konstruktion von Expressionsvektoren von Lysozym durch Ligation von gereinigten Fragmenten, die von den Plasmiden YEpZ415, YEpZ101Δ2 (oder 4 oder 5), plysΔ9, pK01 und pJDB207 stammen. Die Plasmide plysΔ29 (oder 49 oder 59) unterscheiden sich untereinander nur durch die Promotoren, die durch die Plasmide YEpZ101Δ2 (oder 4 oder 5) eingebracht wurden, um die Expression der Lysozym-cDNA sicherzustellen, die durch plysΔ9 eingebracht wurde.
• - Fig. 5 zeigt, daß zelluläre Extrakte von Hefen, die mit den Plasmiden plysΔ49 und plysΔ59 transformiert wurden, in der Lage sind, E. coli-Zellen zu lysieren, die mit EDTA behandelt wurden, um sie für die Wirkung von Lysozym empfänglich zu machen.
• - Fig. 6 stellt die Konstruktion von Plasmid YEpB2 durch Ligation von Fragmenten dar, die durch die Einwirkung des Restriktionsenzyms PstI auf das Plasmid pBR322 und auf das endogene 2-Micron- Hefeplasmid erhalten wurden.
• - Fig. 7 stellt die Konstruktion des Lysozym-Expressionsvektors plys50 dar, und zwar durch eindeutige Ligation von fünf gereinigten Fragmenten, die aus den Plasmiden YEpB2 und plysΔ49 erhalten wurden.
Beispiel 1 1.1 Konstruktion eines kompletten cDNA-Klons von Hühner-Lysozym: plys10
• Zuerst wurde zur Konstruktion eines vollständigen cDNA-Klons von zwei verschiedenen Klonen ausgegangen: pBR-lys-1, der Hühner-Lysozym-cDNA enthält, aber am 5'-Ende unvollständig ist (P. Baldacci et al., Nucleic Acid Res. 6, 1979, 2667) und pFF2-lys-16, der 40 kb genomischer Hühner-DNA enthält, die das vollständige Lysozym-Gen einschließlich Introns enthält (P. Baldacci et al., Nucleic Acid Res. 9, 1981, 3575) (Fig. 1). Keiner dieser zwei Klone ist zur Expression von Lysozym in Hefe geeignet, die nicht in der Lage ist, Transkripte von höheren Eucaryoten richtig zu prozessieren (J. D. Beggs et al., Nature 283, 1980, 835). Es war jedoch möglich, einen vollständigen cDNA-Klon durch Kombinieren des 3'-Endes der erhältlichen unvollständigen cDNA mit dem 5'-Ende des vollständigen Gens zu rekonstruieren; tatsächlich war aus veröffentlichten Daten klar (P. Balducci et al., 1979, op.cit.; A. Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, 5759; M. Grez et al., Cell 25, 1981, 743), daß das vollständige Gen in der 5'-Region keine Introns enthält, die zum fehlenden Teil der cDNA korrespondieren. Daher wurde ein 2,1 kb DNA-Fragment vom Cosmid pFF2-lys-16 in pEMBL8 (L. Dente et al., Nucleic Acid Res 11 1983, 1645) unter Erhalt von Plasmid plys5 (Fig. 1) subkloniert. Dieser Klon enthält das vollständige 5'-proximale Exon des Lysozym- Gens. Eine günstig gelegene HgaI-Stelle befindet sich in der Überlappungsregion zwischen plys5 und dem cDNA-Klon pBR-lys-1. Eine Dreifachligation mit den Fragmenten HgaI-MluI und MluI-AccI von pBR-lys-1 und Fragment AccI-HgaI von plys5 erlaubte die Konstruktion eines Klons (plys10), der das vollständige Lysozyin-Gen enthält, einschließlich des ATG-Initiationscodons, jedoch ohne Introns (Fig. 2).
1.2 Verkürzung des nicht translatierten Teils des 5'-Bereichs des Lysozym-Gens
• Der nicht kodierende Teil der 5'-Region des Lysozym-Gens, das im Plasmid plys10 vorhanden ist, wurde durch Öffnung des Plasmids an der einzigen Acd-Restriktionsstelle und Verdauung mit BAL31-Nuklease deletiert. So wurde eine Population von verkürzten Plasmiden erhalten, die dann an der einzigen PstI-Stelle gespalten wurden; die Fragmente, die zwischen der PstI-Stelle und dem durch BAL31 verdauten Ende enthalten waren, wurden zwischen die Stellen PstI und SmaI des Plasmids YEpZ100 insertiert, wie im belgischen Patent 901,222 beschrieben. Diese Maßnahme hat drei Konsequenzen:
• (1) der nicht translatierte Teil des 5'-Bereichs, der dem Lysozym-ATG-Codon vorangeht, wird deletiert,
• (2) die AccI- und SmaI-Stellen werden zerstört und
• (3) eine leicht zu handhabende BamHI-Stelle (unmittelbar benachbart zur u-Stelle in YEpZ100) wird am Anfang des Lysozym-Gens angefügt.
• Eines der sich ergebenden Plasmide wird plysΔ9 (Fig. 3) genannt.
1.3 Konstruktion des Lysozym-Expressionsvektors
• Die vollständige cDNA von Lysozym befindet sich nun zwischen einer einzelnen BamHI-Stelle am 5'-Ende und einer einzelnen SphI-Stelle am 3'-Ende. Da die cDNA ihr eigenes ATG-Initiationscodon trägt, sollte deren Fusion mit einem ATG-freien Promotor, an dessen Ende sich eine BamHI-Stelle befindet, eine funktionale Expressionseinheit ergeben, die nur noch in einem Plasmid mit dem Replikationsursprung und dem β-Lactamase-Gen von pBR322 (um seine Replikation und seine Selektion in E. coli sicherzustellen) und mit dem Replikationsursprung des 2-Micron-Plasmids und dem LEU2-Gen (zur Replikation und Selektion in Hefe) verbunden werden muß.
• Diese Konstruktion wurde durch simultane Ligation der im folgenden angebenen Fragmente durchgeführt:
• (a) ein HindIII-BamHI-Fragment vom Plasmid YEpZ101Δ2, welches das p415Δ2-Fragment enthält, das von einer Deletion des Promotors Δ415 stammt (belgisches Patent 901,222),
• (b) ein SphI-BamHI-Fragment von plysΔ9, welches die vollständige cDNA von Lysozym enthält,
• (c) ein EcoRI-SphI-Fragment von Plasmid pK01 (K. Mc Kenney et al., in "Gene amplification and analysis", J. G. Chririkjan & T. Panas editors, Elsevier/North Holland, New York, 1981, S. 383), das als Verbindung zwischen den Fragmenten (b) und (d) verwendet werden soll,
• (d) ein PstI-EcoRI-Fragment vom Plasmid YEpZ415, das den Replikationsursprung und eine Hälfte des β- Lactamase-Gens von pBR322 enthält, und
• (e) ein HindIII-PstI-Fragment von pJDB207, welches das 2-Micron-LEU2-Segment und die andere Hälfte des β-Lactamase-Gens enthält.
• Vor der Ligation wurden diese verschiedenen Fragmente gereinigt, und da sie verschiedene und komplementäre klebrige Enden tragen, kann nur ein lebensfähiges Plasmid das Ergebnis dieser Kombination durch einwandfreie Ligation sein: plysΔ29 (Fig. 4).
• Indem auf die gleiche Weise mit zwei anderen Fragmenten verfahren wurde, die durch Deletion vom Promotor p415 (p415Δ4 und p415Δ5) abgeleitet wurden, wurden zwei weitere Plasmide hergestellt: plysΔ49 und plysΔ59. Diese drei Plasmide unterscheiden sich daher nur durch die Tatsache, daß der Promotor in verschiedenen Entfernungen von der Lysozym-cDNA angeordnet ist, was während der Transkription zu verschiedenen Entfernungen zwischen dem Beginn (dem 5'-Ende) der korrespondierenden Boten-RNAs und der natürlichen AUG-Translationsstartstelle fährt.
1.4 Lysozym-Expression durch die Plasmide plysΔ29. plysΔ49 und plysΔ59
• Die wie oben beschrieben konstruierten Plasmide wurden dann in den GRF18-Stamm (Leu&supmin;, His&supmin;) der Hefe S.cerevisiae transformiert, gefolgt von Selektion auf Klone, die für Leucin (Leu&spplus;) prototroph sind.
• Diese Klone wurden dann mit Glasperlen zerrieben, und die erhaltenen Lysate wurden durch Zentrifugation geklärt. Ihre Lysozym-Aktivität wurde durch Bestimmung des Abfalls der optischen Dichte einer Suspension von E. coli-Zellen nach dem Verfahren von Mc Macken et al. (J. Mol. Biol. 49 1970, 639) bestimmt. In Fig. 5 sind die Auffangswerte der optischen Dichte bei 650 Nm (OD&sub6;&sub5;&sub0;) für alle Klone identisch (0,7), aber aus Gründen der Klarheit wurden sie auf dem Diagramm verschoben. Die Ergebnisse von Fig. 5 zeigen eine signifikante Aktivität für GRF18 (plysΔ49), etwas weniger für Zellen, die mit Plasmid plysΔ59 transformiert wurden, und praktisch keine für die mit plysΔ29 transformierten. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Verfahrens erhalten, bei dem es sich bei den als Indikator für die Wirkung von Lysozym verwendeten Zellen um die des Bakteriums Micrococcus lysodeikticus (G. Alderton et al., J. Biol. Chem. 157, 1945, 43) handelte.
• Bei einem anderen Assay-Typ wurde Lysozym um transformierten Kolonien nachgewiesen, die auf Petrischalen wuchsen, die mit einem Rasen von M. lysodeikticus bedeckt waren. In diesem Fall wurde die Lysozym-Expression durch einen transparenten Halo bakterieller Lysis um die Kolonien herum sichtbar gemacht. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die unter Verwendung von zellfreien Lysaten erhalten wurden, war der Lysis-Halo bei plysΔ49 am größten, was anzeigte, daß dieser Klon der beste Lysozym-Produzent war. Durch dieses Ergebnis wird auch gezeigt, daß das Lysozym aus der Hefezelle exportiert wird, das es notwendigerweise extrazellulär vorliegen muß, um den bakteriellen Indikator zu lysieren.
Beispiel 2 2.1 Konstruktion des Lysozym-Expressionsvektors plys50
• Der Vektor pJDB207, auf dem die Lysozym-Expressionsplasmide plysΔ29, plysΔ49 und plysΔ59 basieren (oben beschrieben), enthält nicht das vollständige 2-Micron-Hefeplasmid und ist folglich zur kontinuierlichen Erhaltung von der Gegenwart des endogenen 2-Micron-Plasmids abhängig (das in den meisten Stämmen von S. cerevisiae gefunden wird). Dies führt zu einer derartig unstabilen Situation, daß die Plasmide vom pJDB207-Typ häufig aus den Zellen verloren werden (E. Erhaert & C. P. Hollenberg, J. Bacteriol. 156, 1983, 625 und M. Jarayam et al., Cell 34, 1983, 95). Im Gegensatz dazu wird das natürliche 2-Micron- Plasmid stabil vererbt. Tatsächlich ist bekannt, daß Plasmide, die so konstruiert wurden, daß sie das vollständige 2-Micron-Plasmid pJDB219 enthalten, stabiler sind als die vom pJDB207-Typ (C. P. Hollenberg, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 96 1982, 119; R. M. Walmsley et al., Mol. Gen. Genet. 1983, 361). Derartige Plasmide sind daher für Langzeitzüchtungen wie beispielsweise bei industriellen Fermentationen zweckmäßiger.
• Um einen derartigen vollständigen 2-Micron-Vektor zu konstruieren, wurde das Plasmid YEpB2 (Fig. 6) verwendet, das zuvor durch Klonierung des vollständigen 2-Micron-Plasmids in pBR322 an ihren wechselseitig einzigen PstI-Stellen hergestellt wurde. Zwei Fragmente von YEpB2 und zwei Fragmente von plysΔ49 wurden dann unter Erhalt von plys50 (Fig. 7) kombiniert. In diesem Plasmid sind die drei 2- Micron-Gene A, B und C intakt, und das Lysozym-Gen wird vom p415Δ4-Promotor wie in plysΔ49 exprimiert, wie im vorherigen Beispiel beschrieben.
2.2. Expression von Lysozym durch den Vektor plys50
• Nach der Transformation des GRF18-Stamms (His&supmin;, Leu&supmin;) von S. cerevisiae mit den Plasmiden plys50 und pJDB207 wurden die in beiden Fällen erhaltenen transformierten Zellen separat auf einem Minimummedium gezüchtet, das mit Histidin (0,002 %) ergänzt war. Wenn die Kulturen die stationäre Phase erreicht hatten (Zelltrockengewicht = etwa 1,5 g/l Kultur), wurden die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt, in einem 0,1 M pH 7 Phosphat-Puffer suspendiert und mit Glasperlen zerrieben. Die Lysozym-Aktivität im Überstand und im Lysat beider Kulturen wurde durch deren Fähigkeit bestimmt, M. lysodeikticus-Zellen nach dem Verfahren von D. Shugar (Biochem. Biophys. Acta, 8, 1952, 302) zu lysieren.
• Bei dem mit dem Plasmid pJDB207 transformierten Stamm konnte keine Lysozym-Aktivität nachgewiesen werden. Im Falle des GRF18(plys50)-Stamms wurde im Gegensatz dazu eine Aktivität von 162 Einheiten pro Milliliter Kultur bestimmt, und zwar mit der folgenden Verteilung: 44 Einheiten/ml waren mit den Zellen verbunden und 118 Einheiten/ml befanden sich im Medium.
• Durch die Bestimmung des Gesamtproteins nach dem Verfahren von D. Herbert et al. (Methods in Microbiol. 5B, 1971, 209), modifiziert durch C. Wand und R. L. Smith (Anal. Biochem. 63, 1975, 414), unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität von kommerziell gereinigtem Lysozym (Boehringer Mannheim), konnte gezeigt werden, daß das Lysozym, das durch Hefe unter den obigen Bedingungen produziert wird, etwa 1 % der löslichen Hefeproteine ausmacht.
• Die Stämme GRF18(plysΔ49) und AH22cirº(plys50) wurde am 5. Dezember 1984 beim Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, P.O. Box 273, NL-3740 AG Baarn (Niederlande) hinterlegt, wo sie die entsprechenden Zugangsnummern CBS 7130 und CBS 7129 erhielten.

Claims (21)

1. Transformierte Hefe, dadurch gekennzeichnet, daß ihre DNA mindestens eine Kopie eines Fragments enthält, das eine 1,4-β-N-Acetyimuramidase codiert, und daß dieses Fragment darin als korrespondierendes aktives Protein exprimiert wird, wobei dem Fragment, das die 1,4-β-N- Acetylmuramidase codiert, eine Leadersequenz vorgeschaltet ist, die derart arbeitet, daß das Protein, das durch das Fragment codiert wird, durch die cytoplasmatische Membran der Hefezelle ausgeschieden wird.

2. Transformierte Hefe nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Leadersequenz um diejenige handelt, die mit dem Hühner-Lysozym-Gen verbunden ist.

3. Transformierte Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Fragment, das die 1,4-β-N- Acetylmuramidase codiert, in ein Vektorplasmid insertiert ist, das in der Lage ist, sich in Hefe autonom zu einer großen Anzahl von Kopien zu replizieren.

4. Transformierte Hefe nach Anspruch 3, wobei die Replikation des Vektorplasmids durch Sequenzen vom 2-Micron-Plasmid sichergestellt ist, die mindestens einen Replikationsursprung davon enthalten.

5. Transformierte Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Expression des Fragments, das 1,4-β-N-Acetylmuramidase codiert, durch einen starken Hefe-Promotor sichergestellt ist.

6. Transformierte Hefe nach Anspruch 5, wobei der starke Hefepromotor aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die Promotoren der Gene, die Alkoholdehydrogenase, Enolase, Glycerinaldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase, Phosphoglyceratkinase und alkalische Phosphatase kodieren, und den Promotor p415 und Varianten davon enthält.

7. Transformierte Hefe nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem starken Hefe-Promotor um den Promotor p415 oder Varianten davon handelt.

8. Transformierte Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Hefe zur Gattung Saccharomyces gehört.

9. Transformierte Hefe nach Anspruch 8, wobei die Hefe zur Art Saccharomyces cerevisiae gehört.

10. Transformierte Hefe nach Anspruch 9, wobei die Hefe aus der die Stämme GRF18 und AH22 enthaltenden Gruppe ausgewählt ist.

11. Transformierte Hefe nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Expression des Fragments, das die 1,4-β-N-Acetylmuramidase codiert, durch ein Plasmid sichergestellt ist, das aus der plysβ49 (erhältlich aus der Hinterlegung CBS-7130) und plys50 (erhältlich aus der Hinterlegung CBS-7129) enthaltenden Gruppe ausgewählt ist.

12. Hefe AH22cirº(plys50), hinterlegt unter der Nr. CBS-7129.

13. Hefe GRF18(plysΔ49), hinterlegt unter der NL CBS-7130.

14. Hefe AH22(plysΔ49), erhältlich aus den Hinterlegungen Nr. ATCC-38626 und CBS-7130.

15. Hefe GRF18(plys50), erhältlich aus den Hinterlegungen NL CBS-7130 und CBS-7129.

16. Verfahren zur Herstellung von Lysozym, dadurch gekennzeichnet, daß es daraus besteht, daß transformierte Hefen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 gezüchtet werden und das von der Hefe produzierte Lysozym gewonnen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Hefe Hühner-Lysozym produziert.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Hefe Human-Lysozym produziert.

19. Verfahren zur Herstellung von Hühner-Lysozym, dadurch gekennzeichnet, daß es daraus besteht, daß transformierte Hefen nach einem der Ansprüche 11 bis 15 gezüchtet werden und das von der Hefe produzierte Hühner-Lysozym gewonnen wird.

20. Vektorplasmid plysΔ49, erhältlich aus der Hinterlegung NL CBS-7130.

21. Vektorplasmid plys50, erhältlich aus der Hinterlegung NL CBS-7129.