DE69108192T2 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von GRF(1-44)NH2. - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Herstellung von GRF(1-44)NH2.Info
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- Es wird angenommen, dass das Wachstum bei Tieren über eine Kaskade biologisch regulatorischer Moleküle gesteuert wird. Der Hypothalamus produziert eine Substanz, die Wachstumshormon freisetzender Faktor (GRF) genannt wird, die wiederum auf die Hypophyse einwirkt, um die Freisetzung von Wachstumshormon (GH) zu bewirken. GH stimuliert die Sekretion von Insulin-Wachstumsfaktor (IGF) von der Leber und anderen Organen der Peripherie, der an verschiedene zelluläre Rezeptoren bindet und die Ereignisse stimuliert, die zum linearen Wachstum benötigt werden. Die Hypophyse wird unter negativer Feedbackkontrolle durch Somatostatin und IGF gehalten. Es wurde gefunden, dass GRF ausserordentlich aktiv ist und die Freisetzung von Mikrogramm pro ml Mengen an Wachstumshormon in das Blut stimulieren kann. GRF kann therapeutisch in den meisten Bereichen angewendet werden, die heute als Kandidaten für die Anwendung des Wachstumshormons betrachtet werden, z.B. Behandlung von hypophysärem Zwergwachstum, Diabetes, die durch Wachstumshormon- Produktion entsteht, zur Verbesserung der Wundheilung, Behandlung von Brandwunden oder Verlangsamung des Alterungsprozesses.
- Die erfolgreiche Isolierung von GRF basiert teilweise auf der Entdeckung, dass Pankreastumoren, die mit Akromegalie in Verbindung stehen, ektopisch grosse Mengen an GRF erzeugten. Drei Formen von GRF bestehend aus Peptiden homolog vom Aminoterminus von 44, 40 und 37 Aminosäuren wurden von Guillemin et al. [Science 218, 585-587 (1982)] und Rivier et al. [Nature 300, 276-278 (1982)] isoliert. Die 44 Aminosäuren amidierte Form von GRF wird als das Stammolekül angesehen und zeigt die volle, wahre Aktivität und höchste Potenz der zuvor genannten Formen dieses Moleküls. Der amidierte Carboxyterminus ist eine Schlüsselstrukturvoraussetzung für diesen hohen Grad an Aktivität, da die entsprechende freie Säure (GRF (1-40)-OH) eine wesentlich niederere Aktivität hat. Das ist ein wichtiger Faktor in der Entwicklung von Prozessen mit niedrigen Kosten, um diese klinisch wichtigen Moleküle zu produzieren.
- Da die Amidierung mittels Methoden, die in einfacher Weise in Schritten mit hoher Ausbeute verwendet werden können, von durch rekombinante DNS hergestellten Peptiden bislang nicht möglich war, konnte das gewünschte Produkt GRF (1-44)-NH&sub2; bislang nur durch die Verwendung konventioneller Festphase- oder Flüssigphasenpeptidsynthesemethoden hergestellt werden. Die Herstellung von solch einem grossen Peptid mittels dieser Methoden stellt immer noch eine ausgesprochene, technische Herausforderung dar und die Kosten der Herstellung bleiben relativ hoch.
- Es ist gut bekannt in der Technik, dass Peptide in grosser Menge und bei niedrigsten Kosten durch die Verwendung rekombinanter DNS Technologie hergestellt werden können. Somit würde es eine wichtige Entwicklung in der Kommerzialisierung von GRF(1-44)-NH&sub2; darstellen, wenn es möglich wäre, rekombinant hergestellte Peptide als Substrat für die Einführung der Amidfunktion zu verwenden.
- Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass GRF(1-44)- NH&sub2; in bequemer Weise in guten Ausbeuten unter Verwendung von GRF(1- 43)-OH als Ausgangsmaterial hergestellt werden kann. Letztere Verbindung kann durch bekannte Methoden der DNS, die in der Technik vorhanden sind, hergestellt werden. Die Umwandlung von GRF(1-43)-OH in das gewünschte Produkt GRF(1-44)-NH&sub2; wird begleitet durch die Trypsin katalysierte Kupplung von Leu-NH&sub2; an GRF(1-43)-OH gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Trypsin ist gut bekannt in der Technik, um die Transpeptidierung von Peptiden, die Arginin oder Lysin carboxyterminal enthalten, zu katalysieren [J. Markussen, "Human Insulin by Transpeptidation of Porcine Insulin and Biosynthetic Precursors", MTP Press, Ltd., Boston (1987); H. Tsuzuti et al., J. Biochem. 88, 669-675 (1980); und L. Riechmann und V. Kasche, Biochemica und Biophysica Acta 830, 164 (1985)]. Das Produkt GRF-(1-44)-NH&sub2; kann sofort aus dem Reaktionsmedium nach Abstoppen mit Essigsäure unter Verwendung von in der Technik bekannten Peptidreinigungsmethoden, am bevorzugtesten durch HPLC, gefolgt von Entsalzen in bekannter Weise isoliert werden.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in bequemer Weise durch Herstellen einer Mischung enthaltend eine Lösung von Trypsin und Leu-NH&sub2;, zu der GRF(1-43)-OH, bevorzugt erhalten durch rekombinante DNS Synthese, zugegeben wird, durchgefiihrt werden. Als Lösungsmittel fifr die vorliegende Erfindung kann jedes Lösungsmittel, das in der Trypsinkatalyse verwendet wird und das mit der Peptidsynthese kompatibel ist, verwendet werden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel für den Zweck der Erfindung ist Dimethylacetamid (DMAC).
- Bevorzugt wird die Leu-NH2 Lösung durch Lösen von Leu-NH&sub2; Mineralsalz (z.B. HCl) in Wasser, Zugabe verdünnter Base (z.B. NaOH) bis pH 8.0 hergestellt, lyophilisiert und der Rückstand in dem gewünschten Lösungsmittel, z.B. DMAC, aufgenommen.
- In gleicher Weise kann die Trypsinlösung bequem durch Lösen von Trypsin in verdünnter, wässerigem CaCl&sub2; (0.1M) hergestellt werden. Die Trypsin und Leu-NH&sub2; Lösungen werden gemischt (25:75 v/v) und die Reaktion durch Zugabe von GRF(1-43)-OH gestartet. Die Reaktion kann in bequemer Weise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Überführung der Ausgangsverbindung in das gewünschte Endprodukt kann in bequemer Weise durch Entfernen von Teilen der Reaktionsmischung, Verdünnen mit Essigsäure, um die Reaktion abzustoppen, und dann Aufgeben der Lösung auf eine HPLC Säule verfolgt werden. Gewöhnlicherweise ist die Reaktion in etwa 3.5 Stunden vollständig erfolgt.
- Die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von vereister Essigsäure und durch Verdünnen mit Wasser abgestoppt. Auftrennen mittels HPLC (z.B. Lichrosorb RP-8 Säule) gefolgt durch Entsalzen (z.B. Waters Bondapak C-18 Säule) und Lyophilisierung stellen das gereinigte Produkt GRF(1-44)-NH&sub2; in guter Ausbeute zur Verfügung.
- Die vorliegende Erfindung wird im folgenden Beispiel, dass nur zum Zwecke der Veranschaulichung dient, in einer bevorzugten Ausführungsform veranschaulicht.
- Alle Aminosäurederivate zeigten die L-Konfiguration und wurden von Bachem (Torrance, CA, USA) bezogen. Schweine-Trypsin Sigma Type IX (Sigma, Chemical Company, St. Louis, MO, USA) wurde gegen Nα Benzoyl-L-Arginin Ethylester (BAEE) getestet, und die spezifische Aktivität auf 1.85 x 10&sup4; U/mg bestimmt. Es wurde mit N-Tosyl-L-Phenylalaninchlormethylketon (TPCK) [G. Schoellman und E. Shaw, Biochemistry 2, 252 (1983)] behandelt und extensiv gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, um 2.02 x 10&sup4; U/mg zu geben. N,N-Dimethylacetamid (Kodak, Spectro Grade) und 1,4- Butandiol (Sigma, Gold Label) wurden über 3A Siebe getrocknet. Die tryptischen Verdauungen wurden in Lösungen der Peptide (1 mg/ml) und Rindertrypsin (Millipore, Bedford, MA, USA 0.1 mg/ml) in 0.5M NH&sub4;HCO&sub3; (pH 8.0) in 20 Stunden durchgeführt. Alle pH Messungen wurden mit einer Glaselektrode gemacht. In vitro Bioassays wurden mittels Rattenhypophysenzellkulturen und mittels eines spezifischen Rattenwachstumshormons-Redioimmunassay wie kürzlich beschrieben [P. Brazeau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7909 (1982)] durchgeführt. GRF(1-43)-OH wurde durch Festphasensynthese wie folgt hergestellt:
- Boc-Leu-Phenylacetamidmethyl (PAM)-Harz (4.0 g, 0.33 mmol/g, 1.32 mmol) wurde in zwei 50 ml Reaktionsgeüässen hergestellt und die Festphasensynthese wurde mittels des BOP Verfahrens [A. Fournier, C.-T. Wang, und A.M. Felix, Int. J. Peptide Protein Res. 31, 86-97, (1988)] durchgeführt. Die Kopplungen wurden mittels des in situ Neutralisierungskopplungsprotokolls [D. Le-Nguyen, A. Hertz, und B. Castro, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1915-1919 (1987)] für 42 Zyklen durchgeführt, um 5.3 g geschütztes GRF(1-43)-PAM-Harz zu erhalten. Eine 1 g Menge des Peptidharzes wurde mit wasserfreiem HF (enthaltend 23 % n-Propanthiol) 2 Stunden bei 0ºC behandelt, verdampft bei 0ºC (Hoch-Vakuum; CaO-Falle), mit EtOAc tritiert, mit TFA extrahiert und gefiltert. Das Filtrat wurde evaporiert und der Rückstand getrocknet, um 421 mg von rohem GRF(1-43)- OH zu geben. Das rohe Peptid wurde in 25 ml 0.5% TFA/H&sub2;O gelöst, gefiltert (0.45 u Typ HA Millipore-Filter) und auf eine Dupont Pro-10 C-8 Säule (2.2 x 25 cm) geladen. Die Säule wurde mit (A) H&sub2;O (0.5% TFA) - (B) CH&sub3;CN (0.25% TFA) mittels eines linearen Gradienten von 20% (B) bis 45% (B) in 60 Min. mit einer Fliessgeschwindigkeit von 21 ml/Min eluiert. Fraktionen wurden gesammelt (1 Min./Fraktion) und Teile davon mittels eines analytischen HPLC Systems analysiert: Säule: Lichrosorb RP-8 (5M); (A) 0.1 M HClO&sub4; (pH 2.5) - (B) CH&sub3;CN; 40% (B) bis 60% (B) in 20 Min. bei 1 ml/Min; 0.2 AUFS: 206 nm. Das Produkt befand sich in Fraktion 70, die getrocknet und lyophilisiert wurde, um 17 mg Material zu ergeben. Das Produkt war nach Nachweis mittels analytischer HPLC homogen und gab die erwartete Aminosäurezusammensetzung nach saurer Hydrolyse: (Aminosäureanalyse: 6N HCl; 110ºC; 24 h): Asp, 4.09 (4); Thr, 0.91 (1); Ser, 3.96 (4); Glu 7.78 (7); Gly, 3.11 (3); Ala 4.82 (5); Val 0.95 (1); Met 1.03 (1); Ile, 1.76 (2); Leu, 4.29 (4); Tyr, 1.80 (2); Phe, 0.82 (1); Lys, 2.15 (2); Arg, 6.06 (6). Die Bestätigung der Struktur erfolgte durch die FAB Massenspektrometrie. Berechnet: (M+H)&spplus;, 4928.5, gefunden 4928.5.
- A. 1.25M Lösung von Leu-NH&sub2; in DMAC wurde durch Auflösen von Leu-NH&sub2; HCl(1.33g, 7.98 mmol) in 5.0 ml Wasser hergestellt mit 1M NaOH, auf pH 8.0 titriert, lyophilisiert und der Rückstand in 6.4 ml DMAC aufgenommen. Der NaCl Niederschlag wurde durch Filtrieren durch eine feine Glasfritte entfernt, um eine klare Lösung von pH 9.25 zu geben.
- Eine Lösung von Trypsin (14.5 uM) und Leu-NH&sub2; (0.95 M) im Verhältnis 76:24 (v:v) DMAC/H&sub2;O (pH 8.3) wurde durch Auflösen von Trypsin (0.205 mg, 8.72 mmol) in 0.1M CaCl&sub2; (300 ul) gefolgt durch die Zugabe von obengenannten 1.25 M Leu-NH&sub2; in DMAC (950 ul) hergestellt. GRF(1-43)-OH (5.15 mg, 0.864 umol) wurde in 0.600 ml der obengenannten Enzympreparation gelöst und bei Raumtemperatur (ca. 22ºC) gehalten. Der Fortgang der Reaktion wurde durch Entfernen von 1 ml Portionen (16 ul total) verdünnt in 200 ml 20% Essigsäure und die Auftragung auf HPLC verfolgt.
- Die Reaktion wurde nach 3.5 Stunden durch Zugabe von eisiger Essigsäure (0.20 ml) und durch Verdünnung auf 2.4 ml mit Wasser angehalten. Die Ausbeute an diesem Punkt der Reaktion betrug 60 % bestimmt mittels analytischer HPLC. Eine kleine Menge (5 ml) der Reaktionsmischung wurde beiseite gestellt, um den weiteren Verlauf zu verfolgen, bevor mit Essigsäure abgestoppt wurde. Die Raaktionsmischung wurde in der folgenden Weise gereinigt:
- Analytische und präparative HPLC wurde auf einer Lichrosorb RP-8 (5u) Säule (0.4 x 25 cm) durchgeführt. Eluate: (A) 0.1 M NaClO&sub4; (pH 2.5) - (B) CH&sub3;CN. Die Fliessgeschwindigkeit war 1.5 ml/Min. und Gradienten von 38-41% (B) in 10 Min. und 31-35% (B) in 90 Min. wurden für die analytischen und präparativen Läufe entsprechend verwendet. Fraktionen von der Lichrosorb RP-8 Säule wurden auf einer Water uBondapak C-18 Säule (0.4 x 30 cm) entsalzt. Eine Eluationslösung (A) H&sub2;O (0.025% TFA) -(B) CH&sub3;CN (0.025% TFA) und eine Fliessrate von 2.0 ml/Min. wurden verwendet. Die Probe wurde auf die Säule aufgetragen und mit 15% (B) 20 Min. gewaschen und eluiert mittels eines Gradienten von 15-40% (B) in 20 Min. und die produktenthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert.
- Die endgültige Ausbeute von GRF(1-44)-NH&sub2; war 1.95 mg (0.322 umol, 37%). FAB-MS: (M+H)&spplus;, berechnet: 5040.7, gefunden: 5040.5.
- Aminosäureanalyse (6M HCl; 110ºC, 72 Stunden): Asp, 4.12(4); Thr, 0.97(1); Ser, 3.65(4); Glu, 7.54(7); Gly, 2.99(3); Ala, 5.27(5); Val, 1.04(1); Met, 0.92(1); Ile, 2.0(2); Leu, 5.13(5); Tyr, 1.87(2); Phe, 0.91(1); Lys, 2.03(2); Arg, 5.54(6). Die in vitro biologische Potenz: 0.92 ± 0.22 [Rattenhypophysen in vitro Bioassay, in dem die Potenz von GRF (1-44)-NH&sub2; 1.00 ist]. Das tryptische Mapping durch analytische HPLC war identisch zu dem eines durch chemisch synthetisierten Standards von GRF(1-44)-NH&sub2;.
Claims (6)
1. Ein Verfahren zur Herstellung von GRF(1-44)NH&sub2;, welches
Verfahren die Umsetzung von GRF(1-43)OH mit Leu-NH&sub2; in der
Gegenwart von katalytischen Mengen von Trypsin und die Isolierung
von GRF(1-44)NH&sub2; aus der Reaktionsmischung umfasst.
2. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Reaktion in einer Lösung
von Dimethylacetamid durchgeführt wird.
3. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Reaktion bei
Raumtemperatur durchgeführt wird.
4. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Reaktionsmischung nach
vollständiger Reaktion durch Mischung mit Essigsäure abgebrochen wird.
5. Das Verfahren von Anspruch 1, worin besagtes GRF(1-44)NH&sub2; durch
Verwendung von HPLC isoliert wird.
6. Das Verfahren von Anspruch 1, worin besagtes GRF(1-44)NH&sub2; nach
der HPLC Isolierung entsalzt und lyophilisiert wird.
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