DE69018529T2 - Phospholipase A2-Inhibitor, Mikroorganismen, die diesen Inhibitor erzeugen und mehrere Verfahren zu seiner Herstellung. - Google Patents

Phospholipase A2-Inhibitor, Mikroorganismen, die diesen Inhibitor erzeugen und mehrere Verfahren zu seiner Herstellung.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Phospholipase A&sub2;-Inhibitor und Verfahren zu seiner Herstellung. Sie betrifft besonders eine physiologisch aktive Verbindung, die Phospholipase A&sub2; inhibieren kann, wobei die Verbindung durch Züchtung von Circinotrichum falcatisporum RF-641 oder einer Variante davon, die diese Verbindung erzeugen kann, hergestellt wird.
  • Die neue erfindungsgemäße Verbindung wird durch die Formel (I) dargestellt:
  • in der R¹, R² und R³ die Reste -COOR&sup4;, -COOR&sup5; bzw. -COOR&sup6; bedeuten, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; jeweils ein Wasserstoffatom, einen Niederalkylrest oder ein Alkalimetall darstellen, W eine Hydroxylgruppe ist, X, Y und Z jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten, die gestrichelte Linie das Vorliegen oder Nichtvorliegen einer Einzelbindung anzeigt, und wobei W/R³, X/R¹ und/oder Z/R³ zu einem Lacton kombiniert sein können. Eine Verbindung der Formel (I) wird als "Cinatrin" bezeichnet.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt ist ein Verfahren zur Herstellung von Cinatrin, das die Züchtung von Circinotrichum falcatisporum oder einer Variante davon, die Cinatrin unter aeroben Fermentationsbedingungen produzieren kann, bis Cinatrin produziert ist, die Isolierung der erhaltenen Produkte aus der Kultur und gegebenenfalls die Hydrolyse und/oder Veresterung dieser Produkte umfaßt. Der Mikroorganismus ist vorzugsweise Circinotrichum falcatisporum RF-641, der unter der FERM- Hinterlegungsnr. BP-2752 erhältlich ist, oder eine Variante davon.
  • Die hier nachstehend als PLA&sub2; bezeichnete Phospholipase A&sub2;, die in Zellen oder Sekretbestandteilen von unterschiedlichen Organismen vorkommt, ist eine Esterase mit einer spezifischen Aktivität für Phosphor enthaltende Lipide. Insbesondere hydrolysiert PLA&sub2; einen Fettsäureester spezifisch an der C-2-Position eines 1,2-Diacylglycerinphospholipids, wobei ein Lysoglycerinphospholipid und die Fettsäure entstehen.
  • Die enzymatische Aktivität von PLA&sub2; wirkt häufig toxisch auf Nervensystem, Muskeln und Herz und außerdem oft antikoagulierend, wodurch Krämpfe, eine arterielle Hypotension, Hämolyse, Hämorrhagie und Ödeme induziert werden. Die Esterase ist ferner möglicherweise entweder direkt oder indirekt an anderen Krankheiten beteiligt. Daher gibt es einen allgemeinen Konsens darüber, daß eine die Enzym-Aktivität von PLA&sub2; hemmende Substanz zur Überwachung oder Behandlung von einigen, von der Enzym-Aktivität der Esterase verursachten oder mit ihr in Zusammenhang stehenden Krankheiten sowie zur Erforschung der physiologischen Funktion von PLA&sub2; nützlich ist. Diese vorstehend beschriebenen inhibierenden Substanzen werden hier nachstehend als PLA&sub2;- Inhibitoren bezeichnet. Beispiele für bekannte PLA&sub2;-Inhibitoren sind Quinacrin (Merck-Index), p-Bromphenacylbromid (Merck-Index) und Manoalid (J. B. C. 260 (1985), 7234). Es wurden jedoch neue PLA&sub2;-Inhibitoren benötigt, um den vorstehend beschriebenen Anforderungen gerecht zu werden.
  • Die Anmelder haben viele Organismen im Hinblick auf die Produktion von PLA&sub2;-Inhibitoren untersucht und festgestellt, daß ein Circinotrichum-Stamm, besonders der Stamm Circinotrichum falcatisporum RF-641, sehr selektive und starke PLA&sub2;-Inhibitoren erzeugen kann. Der Organismus wurde in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, und die Produkte mit einer PLA&sub2;-inhibierenden Wirkung wurden mit organischen Lösungsmitteln extrahiert. Das Rohprodukt wurde chromatographisch in fünf Bestandteile, die sich in ihren physiologischen und physikochemischen Eigenschaften voneinander unterschieden, getrennt. Die jeweiligen Verbindungen wurden als Cinatrin A, B, C&sub1;, C&sub2; bzw. C&sub3; bezeichnet. Die Struktur jeder der verwandten Verbindungen wurde mit üblichen Analyseverfahren, beispielsweise Röntgenstrukturanalyse, Infrarotspektroskopie und Kernspinresonanzspektroskopie, Massenspektroskopie und chemische Umwandlung, ermittelt. Sie werden durch die nachstehend dargestellten Formeln (i), (ii) , (iii) , (iv) bzw. (v) dargestellt.
  • Bei der hydrolytischen Spaltung der jeweiligen, vorstehend beschriebenen Verbindungen in Gegenwart einer Base entsteht die entsprechende Secosäure (mit einem hydrolytisch geöffneten Ring) mit der Formel Cinatrin A-Secosäure Cinatrin B-Secosäure Cinatrin C&sub1;-Secosäure Cinatrin C&sub2;-Secosäure Cinatrin C&sub3;-Secosäure
  • in der R¹, R² und R³ die vorstehend beschriebene Bedeutung aufweisen und die gestrichelten Pfeile die Stellen des Ringschlusses zeigen.
  • Es wurde nachgewiesen, daß Cinatrine als Secosäure sowie als Lacton auf PLA&sub2; inhibierend wirken.
  • Es ist selbstverständlich, daß Cinatrine als Lacton und Secosäure durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren in Ester oder Salze umgewandelt werden können. Derivate von Cinatrin A können beispielsweise gemäß dem im nachstehenden Reaktionsschema dargestellten Verfahren hergestellt werden Veresterung Cinatrin A Hydrolyse Spaltung Tricarbonsäure Mono-, Di- oder Triester
  • in dem R¹, R², R³ und R&sup5; die vorstehend beschriebene Bedeutung aufweisen und X ein Halogenatom ist.
  • Cinatrin B, C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; können in der gleichen, vorstehend beschriebenen Weise umgesetzt werden.
  • Diese Ester und Salze sowie Lactone und Secosäuren zeigen eine PLA&sub2;-inhibierende Aktivität.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen der vorstehend dargestellten, allgemeinen Formel (I) bereit.
  • Der Begriff "Niederalkyl" bezeichnet eine unverzweigte oder verzweigte Alkylkette, die ein bis drei Kohlenstoffatome, beispielsweise eine Methyl-, Ethyl-, n- Propyl- und Isopropylgruppe, aufweist.
  • Der Begriff "Alkalimetall" bezeichnet Natrium, Kalium und Lithium.
  • Obwohl davon auszugehen ist, daß alle erfindungsgemäßen Verbindungen PLA&sub2; inhibieren können, sind einige davon für eine derartige Verwendung besonders bevorzugt. Es sind Cinatrine bevorzugt, in denen R¹, R² und R³ - COOR&sup4;, -COOR&sup5; bzw. -COOR&sup6; bedeuten, wobei R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; jeweils aus der aus einem Wasserstoffatom, einem Niederalkylrest oder einem Alkalimetallatom bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  • Eine Hydrolyse und Veresterung von Cinatrin A bis C&sub3; kann gemäß allen im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie nachstehend erläutert, durchgeführt werden.
  • Hydrolyse: Die Cinatrine A bis C&sub3; (Lacton) können jeweils in einer wäßrigen Lösung einer starken Base, beispielsweise einem Alkalimetallhydroxid, beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Lithiumhydroxid, hydrolysiert werden. Die Umsetzung wird unter Rühren etwa 5 Minuten bis etwa 12 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 100ºC, vorzugsweise etwa 5 Minuten bis etwa 10 Stunden bei 100 bis 60ºC oder etwa 1 bis etwa 12 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Unter diesen Bedingungen erfolgen Hydrolyse und Ringöffnung, und die Ausgangsverbindung wird in das entsprechende Seco-Cinatrin (Tricarbonsäure) umgewandelt.
  • In einer anderen Ausführungsform kann ein einen Lactonring aufweisender Ester einer Ringöffnung unterzogen werden, und der erhaltene, eine oder zwei Carboxylgruppen enthaltende Ester wird anschließend unter Verwendung eines Alkylhalogenids in einen Triester umgewandelt. Der so erhaltene Triester kann zu einer Tricarbonsäure hydrolysiert werden.
  • Veresterung: Das jeweilige, einen Lactonring aufweisende Cinatrin wird mit einem 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisenden Alkohol in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen oder anorganischen Säure etwa 30 Minuten bis etwa 5 Stunden bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 200ºC umgesetzt. Beispiele für eine geeignete organische oder anorganische Säure sind Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Toluolsulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Methansulfonsäure, Trifluorborsäure und Acetanhydrid. Saure Ionenaustauscherharze oder Enzyme können als Katalysatoren ebenfalls verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Veresterung bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Diazoalkans, beispielsweise Diazomethan, durchgeführt werden.
  • Lösungsmittel, die bei der Veresterung verwendet werden können, sind beispielsweise Methanol, Ethanol, Propanol und Tetrahydrofuran.
  • Wenn ein einen Lactonring aufweisendes Cinatrin mit einem Alkoholat und dem entsprechenden Alkohol umgesetzt wird, können eine Ringöffnung und Veresterung gleichzeitig erfolgen, wobei ein Ester der Secosäure erhalten wird.
  • Die Züchtung des den PLA&sub2;-Inhibitor Cinatrin erzeugenden Stamms Circinotrichum falcatisporum RF-641 wird nachstehend näher beschrieben. Die Kultur des Cinatrin erzeugenden Stamms wurde am 21 April 1989 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-10681 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, hinterlegt und die Hinterlegung danach am 6. Februar 1990 in eine den Bestimmungen des Budapester Vertrages gemäße Hinterlegung mit der Hinterlegungsnr. FERM BP-2752 umgewandelt.
  • Die Züchtungseigenschaften von Circinotrichum falcatisporum RF-641 sind nachstehend beschrieben.
  • Der Stamm zeigt auf dem Agarmedium keine typischen morphologischen Eigenschaften. Die morphologischen Eigenschaften auf Blättern sind nachstehend beschrieben.
  • Die Kolonien sind punktförmig bis ausgebreitet, dunkelbraun bis schwarz und behaart und bestehen aus dunklen, verzweigten und anastomosierenden Hyphen, die Kapselstiele und sporogene Zellen tragen. Die Kapselstiele, die sich von dunkelbraunen, dickwandigen und angeschwollenen Zellen des äußerlichen Mycels erheben, sind zahlreich, einfach, aufrecht, dickwandig, dünn und ununterscheidbar septiert, rauh, dunkelbraun, undurchsichtig, an der Basis dunkler und zur ringförmigen oder spiralförmiggedrehten Spitze hin heller. Sporogene Zellen sind zahlreich, wobei sie sich seitlich von den äußerlichen Hyphen erheben, invers keulenförmig bis flaschenförmig, dünnwandig und subhyalin. Konidien sind verwachsen, persistierend an der Basis der Stiele in der Form eines weißlichen Häutchens, sichelförmig mit spitzen Enden, 18,5 bis 20,0 x 1,7 um.
  • Ausgehend von den vorstehend beschriebenen taxonomischen Eigenschaften wurde der Stamm RF-641 als Circinotrichum falcatisporum Pirozynski (1962) identifiziert, der in Mycological Papers 84 (1962), 7-8, beschrieben ist.
  • Wie bei anderen Organismen auch kann die Cinatrin erzeugende Kultur Circinotrichum falcatisporum RF-641 Varianten bilden.
  • Eine Mutation des Stamms kann natürlich vorkommen, sie kann jedoch auch durch eine Behandlung mit unterschiedlichen physikalischen und chemischen Mutagenen leicht induziert werden. Der Fachmann versteht daher, daß Varianten von Circinotrichum falcatisporum RF-641 in den Schutzbereich der erfindungsgemäßen Verfahrensansprüche fallen, sofern sie weiter signifikante Mengen des PLA&sub2;-Inhibitors erzeugen können.
  • Die Züchtung von Circinotrichum falcatisporum RF-641 kann durch übliche aerobe Fermentationsverfahren durchgeführt werden.
  • Es werden die Kulturinedien und -bedingungen gewählt, die üblicherweise auf dem Gebiet der Antibiotika-Herstellung verwendet werden.
  • Das Medium enthält Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalze. Vitamine und Vorläuferverbindungen können gegebenenfalls zugesetzt werden. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen eines Kulturmediums sind Glucose, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melasse, organische Säuren und ein Gemisch davon. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen eines Kulturmediums sind Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Pepton, Weizenkeime, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und ein Gemisch davon. Beispiele für Mineralsalze sind Calciumcarbonat, Magnesium-, Kupfer- oder Zinksulfat, Natrium-, Kalium-, Mangan- oder Kobaltchlorid und verschiedene Phosphate. Diese Mineralsalze können bei Bedarf dem Medium zugesetzt werden.
  • Bei einer Züchtung von Circinotrichum falcatisporum RF-641 unter aeroben Kulturbedingungen in dem jeweiligen Medium bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25 bis 30ºC akkumulieren signifikante Mengen Cinatrin in der Kultur. Das erzeugte Cinatrin wird anschließend durch auf dem Gebiet der Fermentation üblicherweise verwendete Verfahren aus der Kultur gewonnen. Cinatrin kann durch Extraktion des Fermentationsmediums mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel unter sauren Bedingungen effizient abgetrennt werden. Der Extrakt wird anschließend konzentriert. Der Rohextrakt, der ein Gemisch von Cinatrinen enthält, wird anschließend gereinigt, und durch chromatographische Trennung werden Cinatrin A, B, C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; erhalten.
  • So erhaltene gereinigte Cinatrine können gegebenenfalls in Secosäuren und Ester umgewandelt werden.
  • Beispiele für organische Lösungsmittel, die zur Extraktion verwendet werden können, sind Ethylacetat, n-Butanol, Methylethylketon und ähnliche. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Ethylacetat. Die Extraktion wird unter sauren Bedingungen, üblicherweise bei einem pH-Wert von 1 bis 5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 2, durchgeführt.
  • Die Struktur jeder Verbindung wurde durch Röntgenstrukturanalyse, chemische Umwandlung und IR-, NMR- und MS-Spektroskopie ermittelt.
  • Erfindungsgemäße Cinatrine (Lacton, Ester und Secosäure) inhibierten die Aktivität von PLA&sub2;, das von Ratten- Thrombozyten stammte. Die Cinatrinmenge (ug/ml), die die PLA&sub2;-Aktivität zu 50 % inhibierte (IC&sub5;&sub0;), wurde ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Inhibibierende Wirkung von verschiedenen Cinatrinderivaten auf PLA&sub2; von Ratten-Thrombozyten IC&sub5;&sub0; (ug/ml) Cinatrine Lacton Methvlester Secosäure (Na-Salz) Cinatrin A Cinatrin B Cinatrin C&sub1; Cinatrin C&sub2; Cinatrin C&sub3;
  • Die vorstehend dargestellte Tabelle 1 zeigt, daß Cinatrin B und C&sub3; besonders wirksam sind. Obwohl C&sub1; als Lacton mäßig aktiv ist, steigt seine Aktivität nach seiner Umwandlung in einen Ester oder die Secosäure.
  • Es wird davon ausgegangen, daß die erfindungsgemäßen Cinatrine zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung von unterschiedlichen, durch die enzymatische Aktivität von PLA&sub2; verursachten Erkrankungen, sowie zur Erforschung der physiologischen Aktivitäten von PLA&sub2; klinisch nützlich sind.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft daher die Bereitstellung eines als Inhibitor der Phospholipase A&sub2; verwendeten Arzneimittels, das eine Verbindung gemäß Anspruch 1 umfaßt.
  • In den angefügten Figuren zeigt Fig. 1 IR-Spektren von Cinatrin A und C&sub1;, Fig. 2 IR-Spektren von Cinatrin B, C&sub2; und C&sub3;. Fig. 3 zeigt IR-Spektren von Cinatrin A und B (Secosäuren, Na-Salze). Fig. 4 zeigt IR-Spektren von Cinatrin C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; (Secosäuren, Na-Salze).
  • Die nachstehend beschriebenen Beispiele geben eine nähere Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
    • Beispiel 1 Herstellung von Cinatrin 1) Fermentation von Circinotrichum falcatisporum RF-641
  • Eine Kartoffel/Glucose enthaltende Schrägagarkultur wurde hergestellt, indem 10 ml Kartoffel/Glucose enthaltender Agar in mittelgroße Teströhrchen gefüllt und sterilisiert wurden. Jedes Röhrchen wurde inokuliert und 10 bis 14 Tage bei 25 bis 28ºC inkubiert. Ein bis zwei Impfösen der Schrägagarkultur wurden in 100 ml Kulturmedium (1,0 % Polypepton, 2,0 % Glucose, 0,3 % Fleischextrakt, 0,2 % Hefeextrakt, 0,1 % Natriumchlorid und Leitungswasser (pH-Wert 7,0, vor der Sterilisierung)) in einer 500 ml Sakagushi- Flasche inokuliert. Die Flasche wurde anschließend 72 Stunden bei 28ºC inkubiert, wobei mit 120 Upm geschüttelt wurde. Ein Teil (jeweils 3,2 ml) der geschüttelten Kultur wurde in 500 ml-Erlenmeyerkolben (x 130) inokuliert, die jeweils 80 ml Kulturmedium (das durch Vermischen von 1 000 ml Kartoffel-Dekokt und 20 g Saccharose hergestellt worden war) enthielten. Jeder Kolben wurde 96 Stunden bei 28ºC inkubiert, wobei mit 180 Upm geschüttelt wurde.
  • Das Kartoffel-Dekokt wurde durch Schneiden der Kartoffeln (200 g) in etwa 1 cm große Würfel, 15-minütiges Kochen der Würfel in Wasser (1 000 ml) bei 105ºC und Filtration des Gemisches durch Gaze hergestellt.
    • 2) Isolierung A. Extraktion des Rohprodukts
  • 10 l Fermentationsbrühe (pH-Wert 7,0 bis 6,8), die in der gleichen, vorstehend beschriebenen Weise erhalten wurde, wurde mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und unter Verwendung von 3 l Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit etwa 30 % NaCl gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wurde anschließend in 500 ml Hexan gelöst und Hexan-lösliche Substanzen entfernt, wobei 14,5 g Hexan-unlöslicher Rohextrakt erhalten wurden.
    • B. Isolierung von Cinatrin
  • Zu 14,5 g des vorstehend beschriebenen, in 40 ml Methanol gelösten Rohextrakts wurden 60 ml 0,1 % Trifluoressigsäure (Gesamtvolumen 100 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde anschließend auf eine CHP-20P-Säule (Mitsubishi Chemicals, Tokyo, Japan, 75 x 150 um, 400 ml Volumen) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 40 % Methanol bis 90 % Methanol in 0,1 % Trifluoressigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von 15 ml/min. eluiert, wobei 15 g Fraktionen gesammelt wurden. Das Eluat wurde mit UV- Licht von 210 nm überwacht. Die Fraktionen, die Cinatrin A und B (Pools A und B) bzw. Cinatrin C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; (Pool C) enthielten, wurden getrennt gesammelt, indem jede Fraktion durch Dünnschichtchromatographie (TLC) und analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (analytische HPLC), wie nachstehend beschrieben, überwacht wurde.
    • TLC
  • Platte: Mit Kieselgel 60 F-254 von beschichtete TLC- Platten (Merck)
  • Lösungsmittel: Chloroform/Methanol/H&sub2;O (2/2/1) (niedrigere Phase) : Essigsäure = 9 : 1
  • Nachweis: UV-Licht von 254 nm und Phosphormolybdänsäure (P&sub2;O&sub5; x 24 MoO&sub3; x nH&sub2;O)
  • Rf: Cinatrin A=B=0,47, C&sub1;=C&sub2;=C&sub3;=0,29
    • Analytische HPLC
  • Säule: Cosmosil 5C&sub1;&sub8; (4,6 x 250 mm)
  • Nachweis: UV-Licht von 210 nm
  • Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min.
  • Lösungsmittel: Acetonitril aq./0,1 % TFA (55:45)
  • Retentionszeit (min.): Cinatrin A=12,7, B=20,2, C&sub1;=12,4, C&sub2;=13,1 und C&sub3;=14,8
  • Die vorstehend beschriebenen Systeme wurden auch in den nachstehenden Verfahren verwendet.
    • C. Isolierung und Reinigung von Cinatrin
  • (1) Isolierung von Cinatrin A (C A-Name: 1,2,3,5- Tetrahydroxy-14-pentadecen-1,2,3-tricarbonsäure, (1 T 3) - - Lacton, (3 T 5)- -Lacton. Allgemeine Bezeichnung: 8-(Dec-9- en-1-yl)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxo-1,7-dioxaspiro-[5, 5]-nonan- 4-carbonsäure).
  • Die wie vorstehend in B beschrieben hergestellten Pools A und B wurden unter reduziertem Druck konzentriert, wobei 1,07 g eines Gemisches von Cinatrin A und B erhalten wurden. Das Konzentrat wurde auf eine Säule aufgetragen, die mit einem Gemisch aus Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure (55:45) eluiert wurde.
    • Säulenchromatographie
  • Säule: Lichroprep RP-18 (Merck), 25 bis 40 um (20 x 500 mm)
  • Fließgeschwindigkeit: 5 ml/min.
  • Nachweis: UV-Licht von 210 nm
  • Gewinnung: 15 g Fraktion
  • Die eluierten Fraktionen wurden, wie vorstehend beschrieben, durch TLC und analytische HPLC überwacht. Die Cinatrin A bzw. B enthaltenden Fraktionen wurden getrennt vereinigt. Die Cinatrin A enthaltenden Fraktionen wurden unter reduziertem Druck konzentriert, wobei 320 mg Cinatrin A-Rohprodukt erhalten wurden. Dieses wurde anschließend durch präparative HPLC unter Verwendung von Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure (55:45) als Elutionsmittel gereinigt.
    • Präparative HPLC
  • Säule: Cosmosil 5C&sub1;&sub8; (20 φ x 150 mm), (Nakarai Chemicals, Inc.)
  • Nachweis: UV-Licht von 210 nm
  • Fließgeschwindigkeit: 8 ml/min.
  • Retentionszeit: 20 min. (Cinatrin A)
  • Cinatrin A enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und im Vakuum verdampft, wobei 140 mg eines sauren, amorphen und farblosen Pulvers erhalten wurden. Die physikalischchemischen Eigenschaften von gereinigtem Cinatrin A sind nachstehend aufgeführt.
  • 1. Löslichkeit: in Wasser und organischen Lösungsmitteln löslich
  • 2. Molekülformel: C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub6;O&sub8; (MG 370) SIMS: m/z 371 [M+Z]&spplus;, für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub6;0&sub8;+H berechnet
  • 3.[α]25.5/D: -20,1 ± 2,0º (c = 0,303, MeOH)
  • 4. UV-Spektrum UV λ MEOH/max (E1%/1cm): 220 nm (11)
  • 5. IR-Spektrum IR ν KBr/max cm&supmin;¹: 3420, 2928, 2856, 1776, 1747, 1641, 1468, 1446, 1349, 1226, 1151, 1063, 992, 908, 840, 780, 720
  • 6. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard TMS) : 1,27 (12H,m), 1,64 (2H,m), 2,03 (2H,m), 2,37 (2H,m) 4,54 (1H,m), 4,74 (1H,s), 4,90-5,04 (2H,m), 5,69-5,90 (1H,m), 6,7 (1H,br,OH), insgesamt 24H.
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard TMS): 18 Kohlenstoffsignale; 9 Methylen-Kohlenstoffatome (24,4 (t), 28,2 (t), 28,5 (t), 28,6 (t), 28,7 (t), 28,8 (t) 33,2 (t), 34,4 (t), 36,2 (t)), 2 Methin-Kohlenstoffatome (72,8 (d), 77,3 (d)), 2 quaternäre Kohlenstoffatome (83,8 (s), 84,3 (s)), Olefin-Kohlenstoffatome (114,9 (t), 139,1 (d)), Carbonyl-Kohlenstoffatome (169,9 (s), 172,7 (s), 172,8 (S)).
  • 7. Strukturanalyse: Die Struktur wurde auf der Basis der SIMS- und NMR-Daten ermittelt. Die ¹H-NMR- und ¹³C-NMR- Spektren, die 9 CH&sub2;-Methylengruppen zeigen, gleichen denen von Cinatrin B (nachstehend beschrieben), ausgenommen, daß sie die Existenz einer terminalen Doppelbindung (-¹³CH&sub2;- ¹&sup4;CH=¹&sup5;CH&sub2;) anstelle einer terminalen Methylgruppe (¹&sup5;CH&sub3;¹&sup4;CH&sub2;-) anzeigen. Durch eine katalytische Reduktion (H&sub2; auf 5 % Pd-C in Methanol) wurde Cinatrin A in Cinatrin B umgewandelt. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß Cinatrin A einen zu Cinatrin B analogen Spirodilactonring und eine Seitenkette mit einer terminalen Bindung 14 CH=¹&sup5;CH&sub2; aufweist.
  • (2) Isolierung von Cinatrin B (C A-Name: 1,2,3,5- Tetrahydroxypentadecan-1,2,3-tricarbonsäure, (1 T 3)-γ- Lacton; Allgemeine Bezeichnung: 8-(Decan-1-yl)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxo-1,7-dioxaspiro[5,5]nonan-4-carbonsäure).
  • Die restlichen vorstehend in (1) erhaltenen Fraktionen wurden unter reduziertem Druck konzentriert und das Konzentrat (440 mg) durch eine Lichroprep RP-18-Säule in der gleichen, vorstehend in (1) beschriebenen Weise chromatographiert. Die Säule wurde mit einem Gemisch von Trifluoressigsäure und Methanol (30:70) entwickelt. Das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 270 mg gereinigtes Cinatrin B als eine saures, amorphes und farbloses Pulver erhalten wurden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von gereinigtem Cinatrin B sind nachstehend aufgeführt.
  • 1. Löslichkeit: in organischen Lösungsmitteln löslich
  • 2. Molekülformel: C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub8;O&sub8; (MG 372)
  • SIMS: m/z 373 [M+Z]&spplus;, für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub8;O&sub8;+H berechnet
  • Theoret. Wert (%) für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub8;O&sub8; x 1/2H&sub2;O C, 56,68, H, 7,66
  • Gemessener Wert (%): C, 56,68, H, 7,53 3. [α]24/D: -24,4 ± 2,1º (C = 0,308, MeOH.)
  • 4. UV-Spektrum UV λ MeOH/max: 220 nm (E 1%/1cm =12)
  • 5. IR-Spektrum
  • IR ν KBr/max: 3394, 2918, 2850, 1795, 1767, 1750 (Schulter), 1470, 1362, 1229, 1195, 1150, 1084, 1052, 993, 973, 837. 780, 719, 447
  • IR CHCl/max 3 (cm&supmin;¹): frei: 3600-2200, 2924, 2852, 1805 (Schulter) , 1784, 1737, 1464, 1357, 1150, 1071, 1038, 1011, 870, 838
  • 6. NMR-Spektrum
  • ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard TMS): 0,86 (3H,t), 1,25 (16H,s-ähnlich), 1,63 (2H,m), etwa 2,38 (2H,dd x 2), 4,52 (H,m), 4,73 (IH,s)
  • ¹³C-NMR (100 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard TMS): 13,85 (q), 21,98 (t), 24,36 (t), 28,52-28,84 (t x 4-5), 31,18 (t), 34,30 (t), 36,17 (t), 72,60 (d), 77,06 (d) 83,57 (s), 84,05 (s), 169,46 (s,c=O), 172,28 (s,c=O), 172,37 (s,C=O)
  • 7. Farbreaktion: negativ: 2, 4-Dinitrophenylhydrazin, Ehrlich, Ninhydrin, Dragendolff; positiv: Bromkresolgrün (BCG), I&sub2;, H&sub2;SO&sub4;-Hitze und Phosphormolybdänsäure
  • 8. Strukturanalyse: Die NMR- und IR-Spektren zeigen, daß das Molekül drei -C=O-Gruppen enthält. Eine ist Teil der -COOH-Gruppe und die übrigen gehören vermutlich zu Dilactonoder Anhydridresten.
  • (3) Isolierung von Cinatrin C&sub1; (C A-Name: 1,2,3,5- Trihydroxypentadecan-1,2,3-tricarbonsäure, (1 T 3)-γ- Lacton; Allgemeine Bezeichnung: 2-Dodecyl-3,4-dihydroxy-5- oxotetrahydrofuran-2,3-dicarbonsäure).
  • Der wie vorstehend in B beschrieben hergestellte Pool B wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei 2,85 g eines Gemisches von Cinatrin C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; erhalten wurden. Das Konzentrat wurde auf eine Lichroprep RP-18-Säule aufgetragen und in der gleichen, vorstehend in (1) beschriebenen Weise mit einem als Elutionsmittel verwendeten Gemisch aus 0,1 % Trifluoressigsäure und Methanol (50:50) chromatographiert. Das Eluat wurde mit TLC überwacht, und Cinatrin C&sub1;, C&sub2; oder C&sub3; enthaltende Fraktionen getrennt vereinigt.
  • Das Cinatrin C&sub1; enthaltende Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der Rückstand (600 mg) in der gleichen, vorstehend in (1) beschriebenen Weise über eine Lichroprep RP-18-Säule (Merck, 25 - 40 um (20 φ x 500 mm)) mit einem als Elutionsmittel verwendeten Gemisch aus 0,1 % Trifluoressigsäure und Acetonitril (50:50) erneut chromatographiert. Die Cinatrin C&sub1; enthaltenden Fraktionen wurden unter reduziertem Druck verdampft, wobei ein Rückstand von 260 mg erhalten wurde, der anschließend durch präparative HPLC unter Verwendung einer Cosmosil 5C&sub1;&sub8;-Säule in der gleichen, vorstehend in (1) beschriebenen Weise gereinigt wurde, ausgenommen, daß die Retentionszeit 28 Minuten war. Die Cinatrin C&sub1; enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert, konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 159 mg gereinigtes Cinatrin C&sub1; als ein saures, amorphes und farbloses Pulver erhalten wurden. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von gereinigtem Cinatrin C&sub1; sind nachstehend aufgeführt.
  • 1. Löslichkeit: in organischen Lösungsmitteln löslich und in Wasser wenig löslich
  • 2. Molekülformel: C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8; (MG 374) SIMS: m/z 375 [M+Z] , für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8;+H berechnet
  • 3. [α]24/D : -11,2 ± 1,6º (C = 0,314, MeOH)
  • 4. UV-Spektrum UV λ MeOH/max (E 1%/1cm): 220 nm (11)
  • 5. IR-Spektrum IR KBr/max: 3536, 3460, 3288, 2920, 2852, 1785, 1739, 1661, 1467, 1434, 1403, 1378, 1243, 1225, 1186, 1169, 1123, 1037, 1016, 984, 920, 879, 822, 777, 759, 719, 668, 638, 602, -500
  • 6. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: 0,84 (3H,t) , 1,22 (16H,m), 1,55 (1H,m), 2,04 (1H,m), 4,54 (1H,s), 6,34 (1H,b,OH)
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: 18 Kohlenstoffsignale; 1 Methyl-Kohlenstoffatom 13,9 (q), 11 Methylen- Kohlenstoffatome (22,1 (t), 23,5 (t), 28,7-29,3 (tx7), 30,8 (t), 31,3 (t)), 1 Methin-Kohlenstoffatom (73,1 (d)), 2 quaternäre Kohlenstoffatome (84,0 (s), 86,6 (s)), 3 Carbonyl- Kohlenstoffatome (170,4 (s), 170,6 (s), 173,6 (s)).
  • 7. Strukturanalyse
  • a) Da die Verbindung durch Umsetzung mit Diazomethan Dimethylester bildet, enthält sie zwei Carboxylgruppen.
  • b) Die durch SIMS erhaltene Molekülformel stimmt mit der für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8; überein.
  • c) Das ¹³C-NMR-Spektrum zeigt 18 Signale. Das Spektrum gleicht dem von Cinatrin C&sub3; (nachstehend beschrieben), d. h., es zeigt ein Methyl-Kohlenstoffatom (CH&sub3;), 11 Methylen-Kohlenstoffatome (CH&sub2;), 1 Methin-Kohlenstoffatom (CH), 2 quaternäre Kohlenstoffatome und 3 Carbonyl-Kohlenstoffatome (C=O), die zu zwei Carbonsäuren gehören.
  • d) Durch 2-stündige Inkubation in 0,05 N NaOH bei Raumtemperatur wurde die Verbindung zu einer Secosäure gespalten. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit 1 N HCl auf einen ph-Wert von 1 eingestellt und über Nacht stehengelassen, wobei ein Gemisch aus Cinatrin C&sub3; und Cinatrin C&sub1; (1:1, durch HPLC gemessen) erhalten wurde. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß die Verbindung durch erneute Lactonbildung aus Cinatrin C&sub3; entsteht. Daraus wurde geschlossen, daß es ein (1 T 3)-γ-Lacton ist, das -0H- und - COOH-Gruppen in anderen Positionen als Cinatrin C&sub3; besitzt.
  • (4) Isolierung von Cinatrin C&sub2;:
  • (1, 2 , 4-Trihydroxypentadecan-1,2,3 -tricarbonsäure, (3 T l)-γ-Lacton, oder 3-Hydroxy-4-(1-hydroxydodecyl)-5- oxotetrahydrofuran-2,3-dicarbonsäure).
  • Die Cinatrin C&sub2; enthaltenden Fraktionen wurden, wie vorstehend in (3) beschrieben, hergestellt, kombiniert und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand (330 mg) wurde zur Durchführung einer präparativen HPLC auf eine Cosmosil 5C&sub1;&sub8;-Säule aufgetragen, wobei diese in der gleichen, vorstehend in (3) beschriebenen Weise verwendet wurde, ausgenommen, daß die Retentionszeit 33 Minuten betrug (Cinatrin C&sub2;). Die Cinatrin C&sub2; enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und unter reduziertem Druck verdampft, wobei 100 mg Rohprodukt erhalten wurden, das anschließend durch Umkristallisierung aus Methanol/Wasser gereinigt wurde, wobei 73 mg gereinigtes Cinatrin C&sub2; als saure, farblose und feine Nadeln erhalten wurden. Fp. 152 bis 154ºC. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von gereinigtem Cinatrin C&sub2; sind nachstehend aufgeführt.
  • 1. Löslichkeit: in organischen Lösungsmitteln löslich
  • 2. Molekülformel: C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8; (MG 374) SIMS: m/z 375 [M+H]&spplus;, für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8;+H berechnet Theoret. Wert (%) für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8; x 1/4H&sub2;&sub0; C, 57,05, H, 8,11 Gemessener Wert (%): C, 57,23, H, 8,07
  • 3. [α]24/D : -54,5 ± 3,0º (c = 0,312, MeOH)
  • 4. UV-Spektrum UV λ MeOH/max: Endabsorption
  • 5. IR-Spektrum IR max cm¹: Frei (KBr); 3504, 3420, 3120, 2916, 2846, 1779, 1725, 1688, 1467, 1407, 1371, 1347, 1166, 1077, 1016, 867, 754-660 (5 Banden), 551
  • 6. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS): 0,86 (3H,t), 1,24 (etwa 20H,s-ähnlich), 1,53 (2H,m), 3,15 (IH,d), 3,81 (1H,s-ähnlich), 5,12 (1H,s)
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS) : 13,92 (q), 22,06 (t), 25,06 (t), 28,70-29,03 (tx3-6) 31,28 (t), 33,34 (t), 53,69 (d), 66,99 (d), 80,60 (s), 81,21 (d), 166,86 (s,C=O), 172,10 (s,C=0), 173,61 (s,C=O)
  • Es wird aufgrund der vorstehend beschriebenen Daten angenommen, daß die Verbindung einen Lacton-Fünfring aufweist.
  • 7. Farbreaktion: negativ: 2, 4-Dinitrophenylhydrazin, Ehrlich, Ninhydrin, Dragendolff; positiv: Bromkresolgrün (BCG), I&sub2;, H&sub2;SO&sub4;-Hitze und Phosphormolybdänsäure
  • (5). Isolierung von Cinatrin C&sub3;:
  • (1,2,3-Trihydroxypentadecan-1,2,3-tricarbonsäure, (3 T 1)-γ-Lacton, oder 4-Dodecyl-3,4-dihydroxy-5-oxotetrahydrofuran-2,3-dicarbonsäure).
  • Die Cinatrin C&sub3; enthaltenden Fraktionen, die wie vorstehend in (3) beschrieben hergestellt worden waren, wurden unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand (550 mg) wurde aus Methanol/Wasser umkristallisiert, wobei 463 mg gereinigtes Cinatrin C&sub3; als saure, farblose und feine Nadeln erhalten wurden. Fp. 205 bis 207ºC (in THF-n-Hexan). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von gereinigtem Cinatrin C&sub3; sind nachstehend aufgeführt.
  • 1. Löslichkeit: in organischen Lösungsmitteln löslich
  • 2. Molekülformel: C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8; (MG 374) SIMS: m/z 467 [M+Gly]&spplus;, für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8;+Gly berechnet Theoret. Wert (%) für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub0;O&sub8; C, 57,74, H, 8,08 Gemessener Wert (%): C, 57,51, H, 8,00
  • 3. [α]24/D: -86,1 ± 2,4º (c = 0,519 %, MeOH)
  • 4. UV-Spektrum UV λ MeOH/max: 220 nm (Schulter) (:E 1%/1cm =10)
  • 5. IR-Spektrum IR KBr/max cm&supmin;¹: 3526, 3376, 3154, 2952, 2910, 2846, 1824, 1723, 1695, 1463, 1438, 1380, 1254, 1226, 1163, 1115, 1059, 967, 920, 806, 723 (Lacton-Fünfring)
  • 6. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS): 0,86 (3H,t), 1,24 (etwa 18H,s-ähnlich), 1,43 (2H,m), 1,70 (2H,m), 5,32 (IH,s)
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS): 13,95 (q), 21,10 (t), 22,11 (t), 28,76 (t), 29,07- 29,12 (tx5), 29,70 (t), 30,59 (t), 31,34 (t), 78,92 (s) 79,68 (d), 81,51 (s), 167,93 (s), 170,90 (s), 175,05 (s)
  • Es wurde durch Röntgenstrukturanalyse nachgewiesen, daß die Verbindung die Struktur einer Carbonsäure mit einem Lacton-Fünfring aufwies. Die ermittelte Struktur stimmt mit der Struktur überein, die aus IR- und NMR-Daten abgeleitet werden kann.
  • 7. Farbreaktion: negativ: 2,4-Dinitrophenylhydrazin, Ehrlich, Ninhydrin, Dragendolff; positiv: Bromkresolgrün (BCG), I&sub2;, H&sub0;SO&sub4;-Hitze und Phosphormolybdänsäure
    • Beispiel 2 Herstellung des Cinatrin-Methylesters
  • Zu mit Eis gekühltem, in einem Gemisch aus 5 ml Tetrahydrofuran und 10 ml Diethylether gelöstem Cinatrin A (50 mg, gemäß Beispiel 1 hergestellt) wurde eine Lösung aus Diazomethan in Ether im überschuß zugesetzt. Nach 30-minütigem Stehen bei Raumtemperatur wurden drei Tropfen Eisessig zugesetzt. Das Gemisch wurde zur Trockne konzentriert, wobei ein Rohprodukt erhalten wurde, das anschließend durch TLC gereinigt wurde (Platte: Mit Kieselgel F-254 vorbeschichtete (0,5 mm) TLC-Platten, Merck, Lösungsmittel: Dichlormethan/Methanol (95:5), Rf = 0,32). Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert und das Konzentrat (48 mg) durch präparative HPLC gereinigt. Das Eluat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei 28 mg (Ausbeute 54 %) an gereinigtem Cinatrin A-Methylester erhalten wurden.
    • Präparative HPLC
  • Säule: Cosmosil 5C&sub1;&sub8; (20 φ x 150 mm), (Nakarai Chemicals) Lösungsmittel: 80 % wäßriges Acetonitril Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min. Retentionszeit: 5,3 min.
  • Die Methylester der Cinatrine B, C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; wurden in der gleichen, vorstehend beschriebenen Weise hergestellt. Die Menge an Ausgangsmaterial und Ausbeute in jeder Umsetzung sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Cinatrin Menge (mg) Methylester (mg) Ausbeute
  • Die Rf-Werte der TLC und die Retentionszeiten (Rt) der präparativen HPLC der jeweiligen Ester sind nachstehend dargestellt: Cinatrin-Methylester
  • Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Methylesters des jeweiligen Cinatrins sind nachstehend beschrieben.
    • Methylester von Cinatrin A
  • 1. SIMS: m/z 385 [M+H]&spplus;, für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub8;O&sub8;+H berechnet
  • 2. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (CDCl&sub3;) ppm (interner Standard: TMS) : 1,29 (12H,m), 1,56-1,88 (2H,m), 2,04 (2H,m), 2,32 (2H,m), 3,95 (3H,s), 4,32 (1H,s,OH), 4,47 (1H,m), 4,89-5,06 (2H,m), 5,26 (1H,s), 5,71-5,92 (1H,m), insgesamt 27H
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (CDCl&sub3;) ppm: (interner Standard: TMS): 19 Kohlenstoffsignale; 9 Methylen-Kohlenstoffatome (25,1 (t), 29,1 (t), 29,3 (t), 29,4 (t), 29,5 (2xt), 34,0 (t), 35,7 (t), 36,7 (t), 54,7 (q, OCH&sub3;)), 2 Methin-Kohlenstoffatome (73,4 (d), 78,1 (d)), 2 quaternäre Kohlenstoffatome (83,9 (s), 84,7 (s)), 2 Olefin-Kohlenstoffatome (114,6 (t), 139,7 (d)) und 3 Carbonyl-Kohlenstoffatome (170,2 (s), 171,7 (s), 172,1 (s)).
    • Methylester von Cinatrin B
  • 1. SIMS: m/z 387 [M+H]&spplus;, für C&sub1;&sub9;H&sub3;&sub0;O&sub8;+H berechnet
  • 2. IR-Spektrum IR max (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹ : 3550, 3502, 3022, 2924, 2852, 1814, 1785, 1746, 1462, 1439, 1370, 1279, 1150, 1118, 1069, 1014, 959, 834
  • 3. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS) : 0,86 (3H,t), 1,23 (16H,s-ähnlich), 1,63 (2H,m), etwa 2,36 (2H,ddx2), 3,76 (3H,s,OCH&sub3;), 4,53 (1H,m), 4,76 (1H,d) 6,85 (1H,d,OH), 7,39 (1H,s,OH)
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS) : Me-Ester (50 MHz) : 13,89 (q), 22,05 (t), 24,38 (t) 28,60 (t), 28,67 (t), 28,81 (t), 28,91 (t), 28,95 (t), 31,27 (t), 34,39 (t), 36,01 (t), 52,98 (q), 73,16 (d), 77,39 (d), 88,44 (5x2), 169,13 (s,C=0), 172,43 (s,C=0), 172,55 (s,C=O)
    • Dimethylester von Cinatrin C&sub1;
  • 1. SIMS: m/z 403 [M+H]&spplus;, für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub4;O&sub8;+H berechnet
  • 2. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (CDCl&sub3;) ppm: 0,85 (3H,t), 1,22 (16H,m), 1,30-1,70 (1H,m), 2,08 (1H,t), 3,81 (3H,s,OCH&sub3;), 3,89 (3H,s,OCH&sub3;), 4,05 (1H,b,OH), 4,88 (1H,s), insgesamt 29H
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (CDCl&sub3;) ppm: 20 Kohlenstoffsignale; Methyl-Kohlenstoffatom 14,3 (q), 11 Methylen-Kohlenstoffatome (22,9 (t), 24,1 (t), 29,4 (t), 29,5 (t), 29,6 (t) 29,7 (t), 29,9 (tx3), 31,7 (t), 32,1 (t), 53,6 (q,OCH&sub3;) 54,2 (q,OCH&sub3;)), 1 Methin-Kohlenstoffatom (73,4 (d)), 2 quaternäre Kohlenstoffatome (84,8 (s), 87,3 (s)) und 3 Carbonyl-Kohlenstoffatome (169,0 (s), 170,2 (s), 173,0 (s)).
    • Dimethylester von Cinatrin C&sub2;
  • 1. SIMS: m/z 403 [M+H]&spplus;, für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub4;O&sub8;+H berechnet
  • 2. IR-Spektrum IR max (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹:3355, 3505, 2957, 2927, 2855, 1781, 1751, 1602, 1457, 1441,1352, 1317, 1273, 1171, 1145, 1098, 1038, 509 (Lacton-Fünfring)
  • 3. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS): 0,82 (3H,t), 1,23 (etwa 20H,s-ähnlich), 1,45 (2H,m), 3,21 (IH,d), 3,66 (3H,s,OCH&sub3;), 3,76 (3H,s,OCH&sub3;), 3,82 (1H,q), 4,96 (1H,d,OH), 5,25 (1H,s), 6,66 (1H,s,OH)
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS) : 13,95 (q), 22,11 (t), 25,04 (t), 28,74 (t), 28,89 (t) 28,70-29,04 (tx4), 31,34 (t), 33,29 (t), 52,40 (q), 53,15 (q), 53,75 (d), 66,86 (d), 81,07 (s), 81,14 (d), 165,88 (s) 170,86 (s), 172,88 (s)
    • Dimethylester von Cinatrin C&sub3;
  • 1. SIMS: m/z 403 [M+H]&spplus;, für C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub4;O&sub8;+H berechnet
  • 2. IR-Spektrum IR max (CHCl&sub3;) cm&supmin;¹: 3373, 3506, 2958, 2927, 2855, 1801, 1754, 1602, 1457, 1440, 1362, 1275, 1175, 1129, 1102, 507, 494 (Lacton)
  • 3. NMR-Spektrum ¹H-NMR (200 MHZ) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS): 0,86 (3H,t), 1,23 (etwa 18H,s-ähnlich), 1,40 (2H,m), 1,70 (2H,m), 3,67 (3H,s,OCH&sub3;), 3,73 (3H,s,OCH&sub3;), 5,51 (1H,s,OH), 6,41 (1H,s), 6,74 (1H,s,OH)
  • ¹³C-NMR (50 MHz) (d&sub6;-DMSO) ppm: (interner Standard: TMS) : 13,94 (q), 21,05 (t), 22,10 (t), 28,75 (t), 29,00- 29,12 (tx5), 29,61 (t), 30,41 (t), 31,33 (t), 52,33 (q), 52,68 (q), 78,82 (d), 79,55 (s), 82,37 (d), 166,95 (s), 169,43 (s), 174,44 (s)
    • Beispiel 3 Herstellung der Secosäure von Cinatrin
  • In 1 ml 0,5 N NaOH gelöstes Cinatrin A (4,9 mg, gemäß Beispiel 1 hergestellt) wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nachdem mit Aceton, Methanol und destilliertem Wasser gewaschen worden war, wurde das Reaktionsgemisch auf eine zuvor mit einer 20 % NaCl-Lösung äquilibrierte 75 - 150 um CHP-20P-Säule (Mitsubishi Chemical) aufgetragen. Die Säule wurde mit 25 ml 20 % NaCl-Lösung gewaschen und mit destilliertem Wasser entwickelt. Das Eluat wurde mit Silbernitrat sorgfältig auf vorhandene Cl&supmin;-Ionen untersucht. Nach einem negativen Testergebnis wurden etwa 15 ml Eluat gesammelt und unter Verwendung der präparativen HPLC (Säule: Cosmosil 5C&sub1;&sub8;, 4,6 φ x 150 mm) (Nakarai Tesk Inc.), Lösungsmittel: 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure : Acetonitril = 45 : 55, Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min., Nachweis: UV-Licht von 220 nm, Retentionszeit: 9,1 min. (Cinatrin A) und 2,7 min. (Secosäure)) gereinigt. Die die Secosäure enthaltenden Fraktionen wurden konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 4,8 mg des Na-Salzes der Secosäure erhalten wurden.
  • Die Cinatrine B, C&sub1;, C&sub2; und C&sub3; wurden ebenfalls in der gleichen, vorstehend beschriebenen Weise hydrolysiert, wobei die entsprechenden Secosäuren erhalten wurden. Die Menge des jeweiligen Ausgangsmaterials und der Ausbeute sind nachstehend in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Secosäure-Derivate der Cinatrine Cinatrin Menge (mg) Secosäure Na-Salz (mg)
  • *Die Secosäure von C&sub1; entspricht der von C&sub3;
  • Die durch präparative HPLC ermittelten Retentionszeiten (min.) von Cinatrin bzw. der entsprechenden Secosäure sind nachstehend dargestellt: Cinatrin Secosäure (min.)
  • Die Daten der IR-Spektren für Secosäuren (Na-Salz) von Cinatrin sind nachstehend und in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Secosäure (Na-Salz) IR (KBr) cm&supmin;¹ Cinatrin A Cinatrin B Cinatrln C&sub1; Cinatrin c&sub2; Cinatrin C&sub3;
  • Die SIMS-Daten des Na-Salzes der jeweiligen Secosäure sind nachstehend in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4: SIMS des Na-Salzes der Secosäure von Cinatrin Seccsäure Na-Salz Mol. Formel Mol. Gewicht
    • Experiment 1
  • Die PLA&sub2; inhibierenden Aktivitäten von Cinatrin und seinen Derivaten wurden gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren ermittelt.
    • Verfahren
  • PLA&sub2;, das von Thrombin-stimulierten Ratten-Thrombozyten freigesetzt wurde, wurde durch Immunaffinitätschroniatographie unter Verwendung von Sepharose, an die der Antikörper MD 7.1 gekuppelt war (Murakami et al., J. Biochem. 104 (1988), 884-888), gewonnen. Die Standardtestbedingungen schlossen 250 ul Tris-HCl-Puffer (100 mM, pH 7,4), CaCl&sub2; (3 mM), 40 uM [¹&sup4;C]Phosphatidylethanolamin und das Enzym ein. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Enzymlösung in Gang gesetzt. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,25 ml Dole-Reagens (V. P. Dole & H. Meinerts, J. Biol. Chem. 235 (1960) , 2595-2599) beendet. Die freigesetzte freie Fettsäure wurde extrahiert und in "Liquiflour" (Du Pont-New England Nuclear) gezählt, um die freigesetzte Radioaktivität zu messen. Die inhibierende Aktivität wird prozentual auf die Enzymkontrolle bezogen.
    • Testergebnisse
  • Die Konzentration der aktiven Verbindungen, die für eine 50 % Inhibitionswirkung erforderlich ist, ist nachstehend in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5: PLA&sub2;-inhibierende Aktivität von Cinatrinen (IC&sub5;&sub0;, ug/ml) Cinatrin Lacton Methylester Secosäure (Na-Salz)
  • Die vorstehend dargestellte Tabelle 5 zeigt, daß Cinatrin B und C&sub3; als Lacton wirksam sind. Sie zeigt außerdem, daß die Modifikation von Lactonen, das heißt, die Veresterung oder hydrolytische Spaltung, die Aktivität etwas verbessern kann. Dies bedeutet, daß ein stärker wirksamer und weniger toxischer PLA&sub2;-Inhibitor durch geeignete chemische Modifikationen der erfindungsgemäßen Cinatrine hergestellt werden kann.
  • Die PLA&sub2;-inhibierende Aktivität der Cinatrine beruht auf der direkten Wirkung auf PLA&sub2;.

Claims (8)

1. Verbindung der Formel (I)
in der R¹, P² und R³ die Reste -COOR&sup4;, -COOR&sup5; bzw. -COOR&sup6; bedeuten, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; jeweils ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;-C&sub3;-Alkylrest oder ein Alkalimetall darstellen, W eine Hydroxylgruppe ist, X, Y und Z jeweils ein Wasserscoifatom oder eine Hydroxylgruppe bedeuten, die gestricbelte Linie das Vorliegen oder Nichtvorliegen einer Einzelbindung anzeigt, und wobei W/R³, X/R¹ und/oder Z/R³ zu einem Lacton kombiniert sein können; oder ein Ester oder Salz davon.
2. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich:
3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, umfassend das Züchten von Circinotrichum falcatisporum oder einer Variante davon, die zur Produktion der Verbindung fähig ist, bis diese Verbindung produziert ist, Isolieren des Produkts aus der Kultur, und falls gewünscht, Mydrolyse und/oder Veresterung der Verbindung.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die folgenden Verbindungen produziert werden:
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Mikrorganismus Circinotrichum falcatisporum RF-641 ist, erhältlich von ERM unter der Hinterlegungsnummer BP-2752, oder eine Variante davon, aie die Verbindung produzieren kann.
6. Arzneimittel zur Verwendung als Inhibitor von Phospholipase A&sub2;, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1, zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Verdünnungsmitteln oder Trägern und gegebenenfalls in Dosierungseinheitsform.
7. Arzneimittel nach Anspruch 6, wobei die Verbindung die folgende ist:
8. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 als Inhibitor der Phospholipase A&sub2;.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132320A (en) * 1990-03-21 1992-07-21 Merck & Co., Inc. Squalene synthetase inhibitors
US5096923A (en) * 1990-03-21 1992-03-17 Merck & Co., Inc. Novel squalene synthetase inhibitors
US5278064A (en) * 1991-08-01 1994-01-11 Eli Lilly And Company Amycolatopsis mediterranei strains useful to prepare A87689 compounds
US5350579A (en) * 1991-08-01 1994-09-27 Eli Lilly And Company A87689 compounds employed as a phospholipase A2 (PLA2) inhibitor to treat inflammatory diseases
US5254727A (en) * 1992-10-19 1993-10-19 Merck & Co., Inc. Acyclic tricarboxylic acid compounds
GB9226724D0 (en) * 1992-12-22 1993-02-17 Xenova Ltd Pharmaceutical compounds
US5631365A (en) * 1993-09-21 1997-05-20 Schering Corporation Hydroxy-substituted azetidinone compounds useful as hypocholesterolemic agents
AR023463A1 (es) * 1999-04-16 2002-09-04 Schering Corp Uso de compuestos de azetidinona
US6982251B2 (en) * 2000-12-20 2006-01-03 Schering Corporation Substituted 2-azetidinones useful as hypocholesterolemic agents
US20020183305A1 (en) * 2001-01-26 2002-12-05 Schering Corporation Combinations of nicotinic acid and derivatives thereof and sterol absorption inhibitor(s) and treatments for vascular indications
RS50406B (sr) * 2001-01-26 2009-12-31 Schering Corporation, Upotreba supstituisanih jedinjenja azetidinona za lečenje sitosterolemije
DE60221798T2 (de) * 2001-01-26 2008-06-05 Schering Corp. Kombinationen von gallensäure sequestriermitteln und hemmern der sterol absorption zur behandlung von kardiovaskulären indikationen
BR0206654A (pt) * 2001-01-26 2004-02-25 Schering Corp Combinações de ativador(es) de receptor ativado por proliferação de peroxisoma (ppar) e inibidor(es) de absorção de esterol e tratamentos para indicações vasculares
US20060287254A1 (en) * 2001-01-26 2006-12-21 Schering Corporation Use of substituted azetidinone compounds for the treatment of sitosterolemia
US7071181B2 (en) * 2001-01-26 2006-07-04 Schering Corporation Methods and therapeutic combinations for the treatment of diabetes using sterol absorption inhibitors
HUP0303917A2 (hu) * 2001-01-26 2004-03-01 Schering Corporation Szterin abszorpció inhibitor(ok) kombinációi vérmódosítókkal és ezek alkalmazása vaszkuláris kondíciók kezelésére
PL369033A1 (en) * 2001-01-26 2005-04-18 Schering Corporation Combinations of sterol absorption inhibitor(s) with cardiovascular agent(s) for the treatment of vascular conditions
AR038956A1 (es) * 2001-05-25 2005-02-02 Schering Corp Uso de un compuesto que regula la produccion o niveles de peptidos beta amiloides para la manufactura de un medicamento para tratar la enfermedad de alzheimer y/o para regular dichos niveles de peptidos amiloides beta en un sujeto
US7053080B2 (en) * 2001-09-21 2006-05-30 Schering Corporation Methods and therapeutic combinations for the treatment of obesity using sterol absorption inhibitors
ES2312624T3 (es) * 2001-09-21 2009-03-01 Schering Corporation Metodos para tratar o prevenir la inflamacion vascular usando un inhibidor (inhibidores) de la absorcion de esterol.
US20030119808A1 (en) * 2001-09-21 2003-06-26 Schering Corporation Methods of treating or preventing cardiovascular conditions while preventing or minimizing muscular degeneration side effects
DE60216300T2 (de) * 2001-09-21 2007-06-28 Schering Corp. Behandlung von xanthom mittels azetidinon-derivate als hemmer der sterol absorption
US7056906B2 (en) * 2001-09-21 2006-06-06 Schering Corporation Combinations of hormone replacement therapy composition(s) and sterol absorption inhibitor(s) and treatments for vascular conditions in post-menopausal women
AU2003237397A1 (en) * 2002-06-04 2003-12-19 Sequenom, Inc. Diagnosing predisposition to fat deposition and therapeutic methods for reducing fat deposition and treatment of associated conditions
WO2004002295A2 (en) * 2002-06-27 2004-01-08 Sequenom, Inc. Diagnosing predisposition to fat deposition and associated condition
WO2004002296A2 (en) * 2002-06-27 2004-01-08 Sequenom, Inc. Therapeutic methods for reducing fat deposition and treating associated conditions
JP2006508189A (ja) * 2002-11-06 2006-03-09 シェーリング　コーポレイション 自己免疫障害の処置のためのコレステロール吸収インヒビター
EP1606287B1 (de) 2003-03-07 2013-10-02 Merck Sharp & Dohme Corp. Substituierte azetidinon-derivate, deren pharmazeutische formulierungen und deren verwendung zur behandlung von hypercholesterolemia
US7235543B2 (en) 2003-03-07 2007-06-26 Schering Corporation Substituted azetidinone compounds, processes for preparing the same, formulations and uses thereof
US7459442B2 (en) * 2003-03-07 2008-12-02 Schering Corporation Substituted azetidinone compounds, processes for preparing the same, formulations and uses thereof
DE602004018617D1 (de) 2003-03-07 2009-02-05 Schering Corp Substituierte azetidinon-derivate, deren pharmazeutische formulierungen und deren verwendung zur behandlung von hypercholesterolemia
JP2007510659A (ja) * 2003-11-05 2007-04-26 シェーリング　コーポレイション 脂質調節剤および置換アゼチジノンの組み合わせならびに血管状態の処置
JP4606209B2 (ja) * 2005-03-10 2011-01-05 ダイセル化学工業株式会社 ラクトン化合物及びラクトン化合物の製造法
US7897800B2 (en) * 2006-02-03 2011-03-01 Jr Chem, Llc Chemical compositions and methods of making them
US7687650B2 (en) 2006-02-03 2010-03-30 Jr Chem, Llc Chemical compositions and methods of making them
ES2328214B1 (es) 2008-05-06 2010-07-23 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Procedimiento de obtencion de las cinatrinas c3 y c1.
CA2750636C (en) 2009-01-23 2017-07-25 Jr Chem, Llc Rosacea treatments and kits for performing them
US8952057B2 (en) 2011-01-11 2015-02-10 Jr Chem, Llc Compositions for anorectal use and methods for treating anorectal disorders
JP2013249293A (ja) * 2012-06-04 2013-12-12 Kao Corp リパーゼ活性阻害剤、抗真菌剤、及びフケ抑制剤

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3943165A (en) * 1972-07-14 1976-03-09 Lever Brothers Company Esters of carboxymethyloxysuccinic acid and derivatives thereof
US4145437A (en) * 1975-08-21 1979-03-20 Imperial Chemical Industries Limited Hydroxy acids
GB8401149D0 (en) * 1984-01-17 1984-02-22 Fujisawa Pharmaceutical Co Furanone derivatives
IT1213330B (it) * 1986-08-28 1989-12-20 Rol Spa Tensioattivi derivati da idrossiacidi bi- o tri-carbossilici.
DE3830068A1 (de) * 1988-09-03 1990-04-05 Hoechst Ag Amidoamin-salze von alkenylbernsteinsaeurederivaten, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als korrosionsinhibitoren

Also Published As

Publication number Publication date
DK0405864T3 (da) 1995-07-03
ES2073529T3 (es) 1995-08-16
US5099034A (en) 1992-03-24
DE69018529D1 (de) 1995-05-18
EP0405864A3 (en) 1992-01-08
EP0405864A2 (de) 1991-01-02
KR910001037A (ko) 1991-01-30
EP0405864B1 (de) 1995-04-12
ATE121091T1 (de) 1995-04-15
JPH03108490A (ja) 1991-05-08
US5120647A (en) 1992-06-09

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