DE3521733C2 - - Google Patents

Description

Alle bekannten Interferone werden auf Grund von Homologien sowohl zwischen den Nukleotidsequenzen ihrer Strukturgene als auch zwischen ihren Aminosäuresequenzen eindeutig in drei Gruppen eingeteilt, die als IFN-alpha, IFN-beta und IFN-gamma bezeichnet werden.

Die verwendeten Bezeichnungen folgen der neuesten Empfehlung des "Interferon Nomenclature Commitee", die von J. Vilcek 1983 in Archives of Virology Vol. 77, S. 283-285, veröffentlicht wurden. Zusätzlich zu den genannten Hauptkriterien kann zur Charakterisierung der IFN-gammma-Gruppe herangezogen werden, daß keine immunologische Kreuzreaktion mit den beiden anderen Gruppen erfolgt sowie ihre biologische Instabilität bei pH 2 im Gegensatz zu IFN-alpha und IFN-beta.

IFN-gamma wird nach Stimulation der Gesamtpopulation der Leukozyten, nach der Art der Präparation üblicherweise als buffy coats bezeichnet, durch Mitogene, Antigene oder spezifische Antikörper in einem komplexen Prozeß zusammen mit einer großen Anzahl weiterer Faktoren (Mediatoren) ausgeschüttet wie Interleukin 1 (IL 1), Interleukin 2 (IL 2), koloniestimulierender Faktor (CSF), migrationsinhibierender Faktor (MIF), Makrophagen aktivierender Faktor (MAF), Tumor nekrotisierender Faktor (TNF) Lymphotoxin (LT) und Fibroblastenwachstums-Faktor (FGF). Weitere Faktoren sind beschrieben von J.A. Georgiades et al. in Came, P.E. und Carter, W. A. (eds.), Interferons and Their Applications, Springer Verlag, 1984, und von Waksman, B. H. in Cohen, S. et al. (eds.), Biology of the Lymphokines, Academic Press Inc., 1979.

Diejenigen Faktoren, die von der Untergruppe der Lymphozyten gebildet werden, bezeichnet man allgemein als Lymphokine. Zu dieser Gruppe wird auch IFN-gamma gerechnet, das hauptsächlich von T-Lymphozyten produziert wird. Die Syntheseleistung der IFN-gamma produzierenden T-Lymphozyten wird ihrerseits wieder von dem Vorhandensein der oben erwähnten Faktoren beeinflußt.

Weiterhin existieren etablierte bzw. transformierte Zellinien, die IFN-gamma konstitutiv produzieren, wie von N. Fujii et al. in J. Immunology 130, S. 1683-1686, und A. Zlotnik et al. in J. Immunology 131, S. 794-800, beschrieben.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung von humanem Roh-IFN-gamma wird nachfolgend beschrieben. Als Ausgangsmaterial dienen lymphozytenreiche Plasmafraktionen von Blutkonserven, sogenannte "buffy coats", die gepoolt und durch schonende Zentrifugation bei 600-800 g von Plasmaresten befreit werden. Die pelletierten Gesamtleukozyten werden in vorgewärmtem Medium mit einer Dichte von 5 Millionen Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension wird in aliquots in geeigneten Kultivierungsgefäßen nach Zugabe eines Mitogens (z. B. Phythämagglutinin) und Phorbolester (z. B. Phorbolmyristylacetat (PMA) bis zu 70 Stunden bei 37 Grad C auf einem Schüttler inkubiert. Die IFN-gamma-haltigen Kulturüberstände werden durch Zentrifugation gewonnen und können bis zur Weiterverwendung bei 4 Grad C gelagert werden. Üblicherweise enthalten die so gewonnenen Präparationen etwa 10 000 Internationale Referenzeinheiten (I.E.) IFN-gamma pro ml.

Der IFN-gamma-Gehalt wird durch einen CPE-Reduktionstest in geeigneten Indikatorzellen (z. B. WISH) mit einem Testvirus (z. B. EMC der Maus) gegen den Referenzstandard Gg 23-901-530 des National Institure of Health (USA) als antivirale Aktivität des Präparates bestimmt.

Weitere Methoden zur Gewinnung von IFN-gamma-Präparationen werden von Y.K. Yip et al. in "Infection and Immunity", Okt. 1981, S. 131-133, Vol. 34 und in den US-PS 43 76 821 und 43 76 822 sowie 44 60 685 beschrieben.

Ein grundsätzlich anderer Weg zur Gewinnung von humanen IFN-gamma- Präparaten wird mit der Einschleusung des humanen Strukturgens mit Hilfe geeigneter Vektoren in heterologe Wirtszellen beschritten. Diese rekombinanten Gene werden konstitutiv oder nach Zugabe spezifischer Induktoren von der Wirtszelle exprimiert.

Auch wenn es sich bei dem Strukturgen um eine eindeutig definierte Sequenz aus Nukleotiden handelt, die zwingend zur Synthese einer daraus ableitbaren Aminosäuresequenz führt, ist das IFN-gamma-Molekül des mit Hilfe der Wirtszelle hergestellten Präparates nicht notwendigerweise mit einem natürlich vorkommenden IFN-gamma identisch. Diese Möglichkeit der Variation unter Erhaltung der spezifischen Wirkung durch "post processing" wird durch das sogenannte Proteindesign erweitert, durch das das Strukturgen durch chemische bzw. biochemische Vollsynthese oder Modifikation verändert werden kann.

Als Wirtszellen zur Aufnahme des Humangens können außer Bakterien (z. B. E. coli von G. Simons et al. in Gene 28, S. 55-64, 1984, beschrieben) auch Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, wie von R. Derynck et al. in Nucleic Acids Research 11, S. 1819-1837, 1983, beschrieben) oder eukaryotische Zellen (wie z. B. Chinese Hamster Ovary Cells, wie von S.J. Scahill et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, S. 4654-4658, 1983, Affenzellen, wie von P. W. Gray et al in Nature 295, S. 503-508, 1982, beschrieben) dienen.

In einigen dieser Systeme reichert sich entweder IFN-gamma bis zu einer Konzentration von mehr als 100 000 I.E. pro ml in der Kulturflüssigkeit an oder es wird im Wirt selbst angereichert und stellt dort bis zu 25 Prozent des Proteingehalts der Zelle dar.

Die Anreicherung bzw. Reinigung der nach den vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen IFN-gamma-Präparationen kann nach den folgenden Methoden einzeln oder in Kombination erfolgen:

• 1. Controlled Pore Glass (CPG) oder Silica-Gel;
• 2. Gelfiltration (z. B. AcA 54 oder Sephacel S 200);
• 3. Ionenaustauschchromatographie (CM-Sepharose oder Phosphocellulose oder DEAE cellulose);
• 4. Affinitätschromatographie (Con A-Sepharose oder Poly-U-Sepharose oder Cu-Chelat-Sepharose);
• 5. Immunaffinitätschromatographie (Anti-IFN-gamma-Sepharose);
• 6. HPLC (z. B. mit Reversed Phase Materialien).

Entsprechende Verfahren wurden von Y. K. Yip et al. "Partial Purification and Characterization of Human Gamma (Immune) Interferon" in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, S. 1601-1605, 1981, oder von D. Novick et al., EMBO Journal 2, S. 1527-1530, 1983, oder in der DE-PS 31 36 166 A 1 beschrieben.

Durch geeignete Kombinationen ist eine Reinigung bis zur elektrophoretischen Homogenität möglich, z. Zt. liegt die dabei erreichte maximale spezifische Aktivität bei 50 Millionen I. E., während die beschriebenen Durchschnittswerte bei 10 bis 20 Millionen I.E. liegen.

Die Interferone (IFN-alpha, IFN-beta, IFN-gamma) wurden bisher in sehr unterschiedlichen Dosen und Applikationsweisen bei Patienten therapeutisch eingesetzt. Ein- oder mehrmalig pro Woche verabreichte Dosen bis zu ca. 10 Millionen I. E. werden gemeinhin als niedrig, Dosen ab 20-50 Millionen I. E. als hoch bezeichnet.

In der Anfangszeit der therapeutischen Anwendung der Inferferone standen aufgrund des Fehlens geeigneter biotechnologischer Herstellungsverfahren diese Substanzen lediglich in so geringen Mengen zur Verfügung, daß nur Dosen von weniger als 3 Millionen I. E. verabreicht werden konnten. Der Einsatz höherer Dosen ist beim IFN-alpha und IFN-beta seit Mitte der siebziger Jahre, beim IFN- gamma seit 1983 möglich. Seither werden bei einer systemischen Behandlung Dosen von weniger als 3 Millionen I. E. in der Regel nur in Toleranz- und Toxizitätsprüfungen sowie in pharmakokinetischen Studien eingesetzt.

Aufgrund der antiviralen, antiproliferativen und immunmodulierenden Wirkung werden die Interferone vornehmlich bei Tumoren und Viruserkrankungen klinisch eingesetzt. Für IFN-alpha und IFN-beta gilt, daß bei der systemischen Behandlung dieser Erkrankungen Dosen bis zu ca. 3 Millionen I. E. entweder unwirksam oder höheren Dosen unterlegen sind (Tumoren: Kirkwood, J. M. und Ernstoff, M. S. J. Clin. Oncol. 2, 336-352, 1984; Billiau, A.: Contr. Oncol. 20, 251-269, 1984; Bonnem, E. M. und Spiegel, R. J.: J. Biol. Resp. Modif. 3, 580-598, 1984; Viruserkrankungen: Merigan, T. C. et al.: N. Engl. J. Med. 298, 981-987, 1978; Heidemann, E. et al. Dtsch. Med. Wschr. 107, 695-697, 1982; Levin, S.: Isr. J. Med. Sci. 19, 955-958, 1983; Billiau, A.: s. o., Greenberg, S. B. und Harmon, M. W., Armstrong, J. A. in Came, P. E. und Carter, W. A.: Interferons and Their Applications. Springer Verlag, Berlin 1984). Lediglich bei lokaler Behandlung (intratumorale, peritumorale, intraventrikuläre intrathekale, intraläsionale, periläsionale oder intranasale Applikation) zeigen Dosen von weniger als 3 Millionen I. E. örtlich eine vergleichbare Wirksamkeit wie eine systematische Applikation höherer Dosen (Literatur s. o.).

Bei akuten Viruserkrankungen wie Herpes zoster hat sich eine Dosis von 0,5 Millionen I. E. IFN-alpha oder IFN-beta pro kg Körpergewicht und Tag bewährt, d. h. bei Erwachsenen täglich ca. 30 Millionen I. E. (Merigan, T. C.: s.o.; Heidemann, E. et al.: Onkologie 7, 210-212, 1984). Bei chronischen Viruserkrankungen wie der chronisch aktiven Hepatitis B werden in der Regel 3-10 Millionen I.E. IFN- alpha oder IFN-beta täglich oder 3mal wöchentlich gegeben (Müller, R. et al.: Z. Gastroenterologie 20, 105-109, 1982; Billiau, A.: s.o.; Levin, S.: s.o.).

Die amyotrophische Lateralsklerose (ALS) ist eine Systemerkrankung des Zentralnervensystems, bei der es zu einer fortschreitenden Degeneration des 1. und 3. Neurons der Willkürmotorik kommt. Klinisch ist das Krankheitsbild durch die Kombination von atrophischen und spastischen Lähmungen charakterisiert, die in der Regel symmetrisch bilateral auftreten. Die mittlere Krankheitsdauer beträgt 3-4 Jahre, die Prognose ist infaust. Eine Therapie der ALS gibt es nicht. Die Ätiologie der Erkrankung ist unbekannt, diskutiert werden eine slow virus-Infektion und autoimmune Prozesse (Poeck, K. Neurologie. Springer Verlag Berlin 1977). Der Nachweis viraler Antigene konnte bislang aber nicht erbracht werden (Färkkilä, M. A. Act. Neur. Sci. 69, 184-185, 1984).

Aufgrund der möglichen virusbedingten Genese der ALS wurde ein Therapieversuch mit IFN-alpha unternommen. In den zunächst durchgeführten pharmakokinetischen Untersuchungen, bei denen intravenös und subcutan 3-6 × 10⁶ I. E. appliziert wurden, konnte keine Interferonaktivität in der Cerebrospinalflüssigkeit des Gehirns festgestellt werden (Jablecki, C. et al. Ann. Neurol. 10, 82, 1981). Da die antiviale Wirkung der Interferone einen direkten Kontakt mit dem Zielgewebe erfordert, schlagen die Autoren für weitere Untersuchungen vor, IFN-alpha intrathekal, d. h. lokal, zu applizieren bzw. bei systematischer Verabreichung sehr hohe Dosen zu verwenden. Diese Lehre wurde von Färkkilä et al. (s.o.) aufgegriffen, die ihren Patienten 100-200 × 10⁶ I.E. pro Tag über 6 Tage intravenös verabreichten. Mit dieser ungewöhnlichen hohen Dosis war bei einigen Patienten ein Therapieeffekt zu beobachten.

Ausgehend von vorklinischen Untersuchungen, in denen sich IFN-gamma stärker antiproliferativ bzw. antitumoral zeigte als IFN-alpha oder IFN-beta, wurden bislang nur Patienten, die an malignen Erkrankungen litten, mit IFN-gamma behandelt (Yamazaki, S.: Jpn. J. Med. Sci. Biol. 37, 209-223, 1984; Sherwin, S.A. et al.: J. Biol. Resp. Modif. 3, 599-607, 1984; Guttermann, J. U. et al.: Cancer Res. 44, 4164-4171, 1984; Niederle et al. in Kirchner, H. und Schellekens H.: The Biology of the Interferon System 1984, Elsevier, Amsterdam 1985).

Aufgrund von In-vitro-Untersuchungen gilt IFN-gamma als weniger antiviral wirksam als IFN-alpha oder IFN-beta (z. B. Munoz, A., Carrasco, L.: FEMS Microbiol. Letters 21, 105-111, 1984). Aus diesem Grunde wurde IFN-gamma für die systematische Behandlung von Viruserkrankungen bislang nicht eingesetzt.

Bei Autoimmunerkrankungen gilt IFN-gamma als kontraindiziert. Es verstärkt die Expression von Oberflächenantigenen sowohl der Klasse I als auch der Klasse II (Trinchieri, G.T. und Perussia, B.: Immunology Today 6, 131-136, 1985). Lokale aberrante Expression der Oberflächenantigene der Klasse II gilt u. a. als Ursache für die Bildung von Auto-Antikörpern und somit lokaler Destruktion (Editorial, Lancet ii, 78-79, 1985). Außerdem stimuliert IFN-gamma generell die Bildung von Antikörpern (Trinchieri, G.T. und Perussia, B. s. o.; Leibson, H. J. et al.: Nature 309, 799-801, 1984).

Die DE-OS 30 01 585 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von IFN-gamma in Human-Lymphoblasten-Zellinien. Es werden weiterhin in vitro und in vivo Versuche beschrieben, in denen die bekannte antivirale, antiproliferative und antitumorale Wirkung von IFN-gamma gezeigt wird.

In Praxis-Kurier 19, 12. Mai 1980, S. 10 wird berichtet, daß IFN-gamma möglicherweise für die Behandlung des Myeloms und des Kaposi-Sarkoms geeignet ist.

In der Münch. Med. Wschr. 126, 1984, Nr. 17, S. 28 wird ausgesagt, daß IFN-gamma das Wachstum von Tumoren hemmt und andererseits das Immunsystem zur Abwehr gegen Tumorzellen stimuliert.

In der US-PS 45 07 281 wird eine Zusammensetzung, die bevorzugt IFN- alpha enthält zur topischen Behandlung von durch Herpes simplex hervorgerufenen Infektionen beschrieben.

Von G. R. Adolf werden in einem Abstract, präsentiert auf dem 3rd European Conference on Clinical Oncology and Cancer Nursing, Stockholm, 17. Juni 1985 im Abschnitt "Rekombinant Interferon-alpha 2 and Gamma" die für diese Substanzen bekannten biologischen Eigenschaften aufgelistet, u. a. die antivirale in vitro als auch in vivo Wirkung von IFN-gamma, sowie dessen cytostatische und toxische Aktivität auf Tumorzellen in vitro und im Tiermodell.

Jablecki berichtet in Ann. of Neurology Vol. 10, Nr. 1, Juli 1981, S. 82 über den Nachweis von IFN-alpha im Serum und in der cerebrospinalen Flüssigkeit von ALS- und Multiple Sklerosis Patienten bei wiederholter Gabe von 3 bis 6 × 10⁶ IU von IFN. Über irgendwelche Behandlungserfolge wird nichts berichtet.

Färkkilä berichtet in The Biology of the Interferon System 1984, Elsevier Science Publishers Amsterdam, New York, Oxford, 1985, S. 575 über die Behandlung von ALS Patienten mit hohen Dosen von IFN-alpha. Obwohl hohe Dosen von 100 bis 200 × 10⁶ I. U. pro Tag für 2 1/2 bis 5 Tage verabreicht wurden, war eine eindeutig positive Behandlung nicht erkennbar, wobei sich außerdem zeigte, daß IFN-alpha neurologische Wirkungen besitzt.

Aufgrund der geringeren antiviralen Aktivität als IFN-alpha und der Wahrscheinlichkeit, autoimmune Prozesse zu verstärken, galt IFN-gamma als nicht wirksam bzw. kontraindiziert bei der ALS; für den Fachmann war daher ein Therapieversuch mit IFN-gamma a priori ausgeschlossen.

Um so mehr mußte es überraschen, daß bei systemischer Verabreichung von IFN-gamma in der niedrigen Dosis von 0,1-1,0 × 10⁶ I.E. dieses Krankheitsbild gebesser werden konnte (s. Beispiel 1 u. 2). Aufgrund der bisher bekannten, oben dargestellten Eigenschaften dieser Substanz kann für den therapeutischen Effekt bei der ALS bisher keine Hypothese formuliert werden. Es muß daher weiteren In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen vorbehalten bleiben, für die Wirkungsweise von IFN-gamma bei der ALS eine Erklärung zu finden.

Für die systemische Behandlung können natürliches IFN-gamma und rekombinantes IFN-gamma wie folgt dosiert werden: intravenös als Bolus oder über mehrere Minuten, Stunden, Tage oder Wochen, intramuskulär und/oder subkutan. Die IFN-gamma enthaltende Präparation kann in einer Depotform für Polypeptidtherapeutika verabreicht werden. Außerdem ist eine systemische Verabreichung von IFN-gamma auch mit einem Nasenspray, Inhalationsspray oder mit einer Sublingualtablette möglich.

Eine Dosis von 20 000 I. E. bzw. ca. 2 µg bis zu 2 Millionen I. E. bzw. ca. 200 µg kann pro Tag einmalig gegeben werden oder portioniert mehrmalig. Bei mehrtägiger Gabe kann die Dosis von 0,02-2,0 × 10⁶ I. E. bzw. ca. 2-200 µg wie folgt verabreicht werden:

• a) an aufeinanderfolgenden Tagen
• b) alle 2 bis 6 Tage
• c) 1mal pro Woche
• d) alle 2 bis 4 Wochen
• e) 1mal pro Monat

Die Dosis von 0,02-2,0 × 10⁶ I.E. bezieht sich auf einen Patienten von 60 kg Körpergewicht und 170 cm Körpergröße, entsprechend 1,74 qm Körperoberfläche (Dubois u. Dubois, Arch. intern. Med. 17, 863, 1916). Entsprechend wird für den einzelnen Patienten die individuelle Dosis ermittelt.

Zur Steigerung der Effektivität der Interferon-gamma-Präparationen können folgende Substanzen zusätzlich gegeben werden: andere Interferone und/oder andere von Leukozyten gebildete bzw. durch gentechnologische Verfahren hergestellte Zell-Mediatoren wie IL 1, IL 2, CSF, MIF, MAF, TNF, LT und FGF.

Zur Herstellung der jeweiligen Darreichungsform werden die dem Fachmann bekannten Hilfsstoffe verwendet.

Beispiel 1
Patient:
W.W., männlich, 61 J., 65 kg, 175 cm
Diagnose:	Amyotrophische Lateralsklerose
Substanz:	humane IFN-gamma-Präparation aus E. coli
Applikationsweise:	intramuskulär
Therapieschema:	3mal pro Woche über 4 Wochen, Dosis von 0,1 × 10⁶ auf 1 × 10⁶ I. E. steigernd. Danach 1mal pro Woche 0,5 × 10⁶ I. E. über 4 Wochen.
Ergebnis:	Unter Therapie besserten sich die Funktionen der oberen Extremität. Die Hände konnten wieder gebeugt und gestreckt werden, auch waren mäßige Streckungen und Beugungen sowie geringfügige Rotationen im Ellenbogengelenk möglich. Beim Schultergelenk war wieder eine geringe Elevation möglich.

Beispiel 2
Patient:
W. S., männlich, 62 J., 73 kg, 170 cm
Diagnose:	Amyotrophische Lateralsklerose fortgeschrittenes Stadium mit kompletter Paralyse der unteren Extremitäten und Teilparalyse der oberen Extremitäten
Substanz:	humane IFN-gamma-Präparation aus menschlichen Leukozyten
Applikationsweise:	subcutan
Therapieschema:	0,1-1,0 × 10⁶ I.E. 3×/Woche über 6 Monate
Ergebnis:	Während der Therapiedauer war die Erkrankung nicht weiter progredient. Die Sprache war gebessert.

Claims (5)

1. Verwendung von Interferon-gamma enthaltenden Präparationen mit einer Dosiseinheit von 20 000 bis 2 Millionen Internationalen Referenzeinheiten (I.E.) (entspr. ca. 2 bis 200 µg) zur systemischen Behandlung der amyotrophischen Lateralsklerose.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Interferon-gamma enthaltende Präparation zusätzlich andere Interferone und/oder andere durch Leukozyten gebildete bzw. durch gentechnologische Verfahren hergestellte Zell-Mediatoren enthält.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation in einer intravenös, intramuskulär oder subkutan zu verabreichenden Applikationsform vorliegt.

4. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation in einer Depotform für Polypeptidtherapeutika verabreicht wird.

5. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparation als Nasenspray, Inhalationsspray oder als Sublingualtablette vorliegt.