DE3427494A1 - Verbessertes verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketosaeuren durch chargenweise gespeiste fermentation - Google Patents
Verbessertes verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketosaeuren durch chargenweise gespeiste fermentationInfo
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Description
Die Erfindung betrifft allgemein die biologische Herstellung von L-Aminosäuren. In der gleichzeitig eingereichten
deutschen Patentanmeldung "Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus a-Ketosäuren" mit der
Priorität der US-Anmeldung Serial Nr. 520 632 vom 5. 8. 1983 (Anwaltsakte 20665) ist offenbart, daß eine
L-Aminosäure aus der korrespondierenden ot-Ketosäure als Ausgangsverbindung hergestellt werden kann, indem man
die a-Ketosäure einer aktiven, in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Mikroorganismenkultur in
einem Nährmedium zuführt. Eine Vielzahl von Mikroorganismen sind in der Lage, a-Ketosäuren biologisch in
L-Aminosäuren umzuwandeln.
Es hat sich gezeigt, daß die optimale Zuführungsgeschwindigkeit
für die α-Ketosäuren direkt mit pH-Änderungen in der Kultur korreliert werden kann, die durch
Änderungen in der Wachstumsrate der Kultur verursacht werden. Eine derartige Zuführung der α-Ketosäuren kann
eine höheren Umwandlungsgrad der Ausgangsverbindung in die L-Aminosäure zur Folge haben. Ferner regelt das
erfindungsgemäße Verfahren das Kulturmedium in einer
Weise, daß durch optimale Umgebungsbedingungen für die Mikroorganismen eine Fortsetzung der logarithmischen
Wachstumsphase erreicht wird.
Es ist bekannt, daß α-Ketosäuren enzymatisch in ihre korrespondierenden L-Aminosäuren umgewandelt werden können.
Beispielsweise beschreibt die US-PS 2 749 279 ein
3Ä27494
Verfahren, bei dem a-Ketoglutarsäure und Ammoniak mit
einem biologischen Enzym-Coenzym-Katalysator behandelt
wenden. Geeignete biologische Katalysatoren können aus tierischem Gewebe, aus schnell wachsenden Pflanzen oder
aus Bakterien als Autolysate oder Zellkulturextrakte gewonnen werden. Die US-PS 4 3Θ4 858 beschreibt ebenfalls
die Umwandlung von wasserlöslichen a-Ketocarbonsäuren in die korrespondierenden Aminosäuren in Gegenwart
einer substratspezifischen Dehydrogenase, Ammoniumionen
und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+/NADH). Die Überführung von a-Ketosäuren in Aminosäuren unter
Verwendung von Suspensionen ruhender Zellen wurde von Yamada et al. "The Production of Amino Acids", Seiten
440-446 (1972) beschrieben.
Zahlreiche Mikroorganismen sind fähig, a-Ketosäuren biologisch in L-Aminosäuren umzuwandeln. Bei dem Verfahren
der oben genannten parallelen Patentanmeldung, wird das in diesen Mikroorganismen gefundene gekoppelte Enzymsystem
verwendet, um die Transaminierungsreaktion zu katalysieren, im Verlauf derer die a-Ketosäure in die
L-Aminosäure umgewandelt wird. Es hat sich gezeigt, daß durch die derartige Verwendung der aktiv wachsenden
Kultur die Reaktion im wesentlichen bis zum Ende katalysiert wird und daß eine kontinuierliche Rückführung des
Aminogruppendonators (L-Glutamat) und des Coenzyms (NADPH oder NADH) stattfindet. Die L-Aminosäure kann
aus der Kulturbrühe gewonnen werden.
Das beschriebene Verfahren wurde erfindungsgemäß verbessert,
indem die Rate der Beschickung mit a-Ketosäure an die Wachstumsrate der Kultur gekoppelt wurde. Es wurden
Mikroorganismen identifiziert, die in der aktiven Wachstumsphase verschiedene Säuren bilden. Das daraus resultierende
Absinken des pH-Wertes in der Kulturbrühe
dient als natürliches Regulativ für das Zellwachstum
und beeinflußt das Wachstum und den Metabolismus negativ, wenn er nicht kontrolliert wird. Die erfindungsgemäße
Verbesserung schließt die Zugabe einer basischen Lösung der a-Ketosäuren in solchen Mengen ein, daß das
natürlich auftretende Absinken des pH-Wertes korrigiert wird. Demgemäß wird die a-Ketosäure als Ausgangsverbindung
der Kultur mit einer Rate zugeführt, die der Wachstumsrate etwa proportional ist. Gleichzeitig ist
diese Rate etwa dem Maß proportional, in dem das gekoppelte Enyzmsystem der wachsenden Mikroorganismen für
die biologische Umwandlung zur Verfugung steht. Es hat sich ferner gezeigt, daß durch die Kontrolle der pH-Obergrenzen
der Kulturbrühe optimale Umgebungsbedingungen für aktiven Metabolismus aufrechterhalten werden.
Bei diesem erfindungsgemäß verbesserten Verfahren soll
der Zeitpunkt und die Rate der a-Ketosäuren-Zugabe durch die Kultur selbst reguliert werden.
20
Damit im Zusammenhang steht die Aufgabe der Erfindung,
ein Verfahren zu schaffen, bei dem optimale Umgebungsbedingungen für das Wachstum und den Metabolismus der
Mikroorganismen aufrechterhalten werden.
Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, bei der biologischen Umwandlung einen Verfahrensschritt einzusparen,
indem man der Kultur eine a-Ketosäurelösung zuführt, die nicht zuvor neutralisiert werden muß.
Eine damit im Zusammenhang stehende Aufgabe ist es, durch Weglassen dieses Neutralisationsschrittes den möglichen
Verlust aktiver Bestandteile zu vermeiden.
Es ist fenner vorgesehen, das erfindungsgemäße Verfahren
mit einen Vielzahl von Mikroorganismen und zun Herstellung einen Vielzahl von L-Aminosäuren zu verwenden.
5
5
Es ist ferner Aufgabe den Enfindung ein Venfahnen zu schaffen, bei dem ein einzelner Mikroonganismenstamm
ausneichende Mengen sämtlichen enfonderliehen Enzyme
zun Umwandlung einen bestimmten ot-Ketosäure in die L-Aminosäune pnoduzient.
Es ist fenner Aufgabe den Enfindung für einen hohen Umwandlungsgnad den a-Ketosäuren in L-Aminosäunen innerhalb
einer kurzen Reaktionszeit zu sorgen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es', ein Verfahren
zu schaffen, bei dem eine hohe L-Aminosäure-Ausbeute in Gegenwart einer niedrigen Konzentration des Aminogruppendonators
erhalten wird.
Bakteriumwachstum kann allgemein in drei aufeinanderfolgende Phasen eingeteilt werden. Die lag-Phase ist
ein Zeitraum, innerhalb dessen die Mikroorganismenzahl in der Kultur wenig oder gar nicht ansteigt. In der
logarithmischen oder exponentiellen Wachstumsphase steigt die Zellzahl exponentiell in Abhängigkeit von
der Zeit. In der stationären Phase findet wenig oder kein Zellwachstum oder Zellteilung statt.
Es wurde gefunden, daß die mikrobiologische Transaminierung einer a-Ketosaure in die L-Aminosäuren mit gesteigerter
Wirksamkeit durchgeführt werden kann, wenn man die σ-Ketosäune einer geeigneten Mikroorganismenkultur
in der logarithmischen Wachstumsphase zuführt.
Das Verfahren macht von einem in den wachsenden Mikro-
Organismen vorhandenen gekoppelten Enzymsystem Gebrauch, um die Transaminierungsreaktion vollständig ablaufen
zu lassen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das biologische Transaminierungs-Verfahren verbessert, indem man die Zuführungsrate
der a-Ketosäure so wählt, daß sie direkt mit der Säureproduktionsrate übereinstimmt, die ihrerseits
im wesentlichen mit der Wachstumsrate der Kultur übereinstimmt. Die a-Ketosäure wird der Kultur als wäßrige
basische Lösung zugeführt. Die Base wird in solchen Mengen zugegeben, daß die von den Mikroorganismen
während der Wachstumsphase gebildeten Säuren kompensiert werden. Als Ergebnis wird der pH-Wert des Kulturmediums
im wesentlichen in einem "steady state" gehalten. Dieses Verfahren der "Beschickung nach Bedarf"
(demand feeding) nutzt die gesteigerte metabolische Leistungsfähigkeit der Kultur bei Eintreten in die logarithmische
Wachstumsphase. Ferner schafft der stabile pH-Wert eine optimierte Umgebung für erhöhtes Bakterienwachstum
und -metabolismus. Nach vollständiger Fermentation
kann das L-Aminosäure-Produkt aus der Kulturbrühe gewonnen werden.
Bei der biologischen Umwandlung der α-Ketosäure in die L-Aminosäure handelt es sich um eine enzymatische Transaminierungsreaktion.
Die biologische Umwandlung wird durch ein gekoppeltes Enzym-Coenzym-System vermittelt,
das eine Transaminase, eine Glutamatdehydrogenase, das Coenzym NADP+/NADPH (oder NAD+/NADH) und eine Dehydrogenase
umfaßt. Alternativ kann letztere Komponente des Enzymsystems eine Hydrogenase für die Rückführung des
NADP+ (oder NAD+) in NADPH (NADH) sein.
Das gekoppelte Reaktionssystem kann wie folgt dargestellt
werden:
(NADPH)
oder (NADH)
\genase/
oder
/be- \
ι hydro-I \genase/
(3)
(NADP
oder (NAD+)
a-Ketoglutarat
I Gluta- 1
I mat- I
Vdehydro-I
\genase /
I mat- I
Vdehydro-I
\genase /
(2)
s Mure
> f
L-Glutamat
— /'Trans-Vaminase/
a-Ketosäure
(D
25
Die gewünschte Transaminierungsneaktion (Stufe 1), a-Ketosäure
zu L-Aminosäure, ist normalerweise reversibel und würde nur bis zur Einstellung des Gleichgewichts
fortschreiten, wodurch die Umwandlungseffizienz in die
Aminosäure begrenzt würde. Durch Kopplung der Transaminierungsreaktion an andere enzymatische Reaktionen kann
man die Transaminierung theoretisch vollständig ablaufen lassen; es können jedoch chemische Abbaureaktionen
stattfinden, die die tatsächliche Ausbeute senken.
30
35
Die oben als Stufe 2 bezeichnete gekoppelte enzymatische Reaktion führt eines der Transaminierungsprodukte,
das a-Ketoglutarat, zurück in L-Glutamat. Dieser Schritt, eine reduktive Aminierung, wird durch die GIutamatdehydrogenase
vermittelt und macht die Gegenwart von Ammoniumionen erforderlich. Das für die Transaminierung
der a-Ketosäure in die L-Aminosäure zur Verfügung
stehende L-Glutamat wind durch diesen RUckfUhrungsschritt
kontinuierlich ersetzt.
In Stufe 2) wird von einem der Coenzyme NADPH oder NADH Gebrauch gemacht, die zu NADP+ oder NAD+ umgewandelt
werden. In einer dritten enzymatischen Reaktion in Stufe 3) wird dieses NADP+ (NAD+) entweder durch eine
Dehydrogenasereaktion oder eine Hydrogenasereaktion wieder in NADPH (NADH) umgewandelt. Demgemäß wird auch das
in Stufe 2) erforderliche NADPH (NADH) kontinuierlich
aufgefüllt. Das in Stufe 2) erforderliche NH.+ wird
durch das Nährmedium bereitgestellt.
Das enzymatische Reaktionssystems selbst ist bekannt.
Bei den bekannten Anwendungen dieses Systems ist jedoch der Zusatz von drei verschiedenen Mikrorganismen, vgl.
US-PS 3 183 170, oder der Zusatz von Mikroorganismen, Aminogruppendonatoren und Cofaktoren, vgl. Yamada et
al., "The Microbial Production of Amino Acids", Seiten 440-446 (1972), erforderlich, um die Reaktionskomponenten
der vorstehend dargestellten drei Stufen bereitzustellen. Ferner werden bei diesen bekannten Verfahren
Suspensionen ruhender Zellen verwendet.
Gemäß dem Verfahren der parallelen deutschen Patentanmeldung mit der Priorität der US-Anmeldung Nr. 520 632
vom 5. 8. 1984 wird ein einzelner Mikroorganismenstamm verwendet, der das gesamte gekoppelte enzymatische Reaktionssystem
liefert. Eine Kultur geeigneter Mikroorganismen in der logar-ithmischen Wachstumsphase, mit Ammoniumionen
in dem Kulturmedium versorgt, vermittelt alle drei Stufen der biologischen Umwandlung der a-Ketosäuren
in ihre jeweiligen L-Aminosäuren. In dem Verfahren der oben genannten parallelen Patentanmeldung wird in
Stufe (3) des gekoppelten Enzymsystems von einer Dehy-
drogenasereaktion Gebrauch gemacht, um NADP+ (NAD+) in
NADPH (NADH) zu überführen.
Das beschriebene gekoppelte enzymatische Reaktionssystem
ist in aktiv wachsenden Mikroorganismen vorhanden. Dieses natürlich auftretende System kann nun für
eine effiziente Umwandlung von a-Ketosäuren in L-Aminosäuren
verwendet werden. Bei Einsatz geeigneter Mikroorganismen mit dem richtigen Substrat wird die Umwandlung
mit hohen Ausbeuten durch die Mikroorganismen selbst durchgeführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind sehr unterschiedliche
Mikroorganismentypen verwendbar. So ist beispielsweise in der parallelen Patentanmeldung (entsprechend
US 520 623) angegeben, daß als Glutaminsäurebildner bekannte Bakterienstämme verwendet werden können.
Diese schließen die Gattungen §£,ej£i~£Ji~i.ii!IL>
und Cor_y_- —^.————Li.— sowi-e E_j 9.2.Ü HBiOI ein. Es wurde gezeigt
(vgl. die angegebenen Beispiele), daß das erfindungsgemäße
verbesserte Verfahren mit Brevibacterium thiogeni-
tal.i_s_ ATCC Nr. 31723, Bu^ikaEiEILiuiH 1 actofermeηtum
ATCC Nr. 22420 und B^ev^bacte^u^flavum ATCC Nr. 13826
durchgeführt werden kann. Die ATCC-Nummern geben die
Hinterlegungsnummern an, unter denen jede der oben genannten Kulturen bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852 hinterlegt worden ist. Es wird davon ausgegangen, daß
andere Mikroorganismen, die fähig sind, die basische biologische Umwandlung durchzuführen und die signifikante
Säuremengen während der logarithmischen Wachstumsphase ausscheiden, ebenfalls in dem erfindungsgemäßen, verbesserten
Verfahren geeignet sind.
Es zeigt sich, daß eine große Vielzahl von Mikroorganismen in dem erfindungsgemäßen biologischen Umwandlungsverfahren
verwendbar sind. Es ist primär erforderlich, daß die Mikroorganismen fähig sind, eine a-Ketosäure zu
resorbieren und in die korrespondierende L-Aminosäure umzuwandeln. Um die biologische Umwandlung mit größter
Wirksamkeit durchzuführen, sollten die Mikroorganismen
in der Lage sein, die in den Stufen (1) bis (3) beteiligten Enzyme des gekoppelten Enzymsystems in ausreichenden
Mengen zu bilden, um die Transaminierungsreaktion über den Gleichgewichtspunkt hinaus im wesentlichen
bis zum Ende zu katalysieren. Schließlich sollten die Mikroorganismen vorzugsweise fähig sein, die
L-Aminosäure in das Kulturmedium abzugeben, um eine bequeme und ökonomische Gewinnung möglich zu machen.
Es ist zweitens erforderlich, daß die Mikroorganismen
während der logarithmischen oder exponentiellen Wachstumsphase signifikante Säuremengen bilden und ausscheiden.
Beispiele für die typischten Säuren, die ausgeschieden werden, sind Milchsäure, Glutaminsäure und
Bernsteinsäure, obgleich die Ausscheidung anderer Säuren für den Zweck des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls
geeignet ist.
Die ausgeschiedenen Mengen sollten genügen, um den pH-Wert des Kulturmediums bis in einen Bereich von etwa 4
bis 6 zu senken, wenn dieser nicht durch Zugabe einer Base von außen geregelt wird.
Die Auswahl der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten
a-Ketosäure hängt von dem gewünschten L-Aminosäureprodukt ab. Beispielsweise wird phenylbrenztraubensäure
zu L-Phenylalanin, a-Ketoisocapronsäure zu L-Leuein,
a-Ketoisovaleriansäure zu L-Valin, Brenztraubensäu-
re zu L-Alanin, Oxalessigsäure zu L-Asparginsäure, ß-Hydroxy-a-ketobuttersäure
zu L-Threonin, p-Oxyphenylbrenztraubensäure
zu L-Tyrosin, Indolbrenztraubensäure zu L-Tryptophan, a-Keto-ß-methylvaleriansäure zu L-Isoleuein
umgewandelt. Es ist offensichtlich, daß die herkömmlichen
Ausgangsverbindungen für L-Aminosäuren in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die a-Ketosäure
als wäßrige, basische Lösung verwendet. Beispielsweise kann die cx-Ketosäure bequem in 0,1 bis 0,6 M
wäßrigem Kaliumhydroxid gelöst werden. Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid oder Harnstoff können auch verwendet
werden, ebenso wie jegliche andere Base, die mit der wachsenden Kultur und der Transaminierungsreaktion kompatibel
ist. Es wurde gefunden, daß KOH bevorzugt ist, wenn Phenylbrenztraubensäure (PPA) als Ausgangsverbindung
benutzt wird, da PPA in KOH löslicher ist. Es wird davon ausgegangen, daß aus Gründen der Löslichkeit bestimmte
Basen für die Verwendung mit bestimmten a-Ketosäuren bevorzugt sind. Die Konzentration zur Aufrechterhaltung
des gewünschten pH-Werts in dem Fermenter kann schwanken, wobei die Beschickungsrate entsprechend angepaßt
wird. Im typischen Fall liegt die Konzentration der Base jedoch zwischen etwa 0,1 und etwa 20 Gew./
Vol.%.
Wird die a-Ketosäure als Natrium- oder Kaliumhydrolysat
verwendet, so wird es normalerweise nicht nötig sein, die a-Ketosäure in einer Base zu lösen. Beispielsweise
wird ein Natriumhydrolysat (Natriumphenylbrenztraubensäure) von 5-Benzylidenhydantoin (5-BH), hergestellt
durch Kochen des 5-BH mit Wasser und NaOH und anschliessendes Kühlen in einem Eisbad (vgl. Beispiel 3), eine
Lösung mit einem pH-Wert von etwa 13,5 liefern. In
gleicher Weise besitzt Natrium-a-ketoisocapronsäure als Hydrolysat von Isobutylidenhydantoin einen pH-Wert von
etwa 13,5 und Natrium-a-ketoisovaleriansäure als Hydrolysat
von Isopropylidenhydantoin einen pH-Wert von etwa 13,8. Diese sind erfindungsgemäß zur pH-Wert-Kontrolle
geeignet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die a-Ketosäure
der Kultur als wäßrige, eine geeignete Base enthaltende Lösung zugesetzt, da diese Form das Pumpen der
Ausgangsverbindung in die Kulturbrühe erleichtert. Falls gewünscht, kann die a-Ketosäure jedoch in einer
eine geeignete Base enthaltenden Aufschlämmung verwendet
werden .
Die Konzentration der wäßrigen a-Ketosäurelösung kann,
wenn dies die Form ist, in der sie in die Kultur eingespeist wird, erheblich variieren. Wird beispielsweise
das erfindungsgemäße Verfahren bei einer kontinuierliehen
Fermentation verwendet, so wird die Lösung verdünnter sein als für eine Batch-Fermentation. Die obere
Konzentrationsgrenze hängt in erster Linie von der Löslichkeit der a-Ketosäure in dem gewünschten Lösungsmittel
ab. Es wird davon ausgegangen, daß Spiegel von etwa 1,0 bis 200 g/l geeignet sind, wobei die Konzentration
von der jeweiligen α-Ketosäure sowie den zuvor diskutierten Faktoren abhängig ist. Es ist am bequemsten,
die α-Ketosäure in Wasser zu lösen, aber auch andere Lösungsmittel, die mit dem System verträglich sind,
beispielsweise Kulturmedium, können falls gewünscht verwendet werden.
Das Wachstumsmedium sollte so gewählt werden, daß optimale Wachstumsbedingungen für die verwendeten Mikroorganismen
geschaffen werden. Auswahl, Änderung und Anpas-
sung der Medien liegen im Rahmen der Fähigkeiten des
Fachmanns und müssen erfindungsgemäß nicht im einzelnen
diskutiert werden.
Zusätzlich zu den Nährstoff-Grunderfordernissen sollte
das Medium jedoch eine Quelle für NH.+ enthalten. Die Ammoniumionen werden von den Mikroorganismen sowohl zur
Steigerung der Zellmasse als auch für die Stufe (2) des gekoppelten enzymatischen Reaktionssystems verwendet.
Demgemäß sollte der Ammoniumionenspiegel in dem Kulturmedium im Hinblick auf die gewünschte Aminosäurenproduktion
und Zellmasse gesteuert werden. Die Einstellung des (NH.+)-Spiegels ist dem Fachmann ebenfalls geläufig.
Beispielsweise können die Ionen bequem durch Zusatz von Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa
10 bis etwa 50 g/l zu dem Nährmedium geliefert werden. Alternativ können Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat,
Ammoniumacetat usw. als (NH,+)-Donatoren verwendet werden.
Das erfindungsgemäße biologische Umwandlungsverfahren
erfordert eine Kultur von aktiv wachsenden Mikroorganismen. Diese Kultur kann hergestellt werden, indem man
steriles Nähr- oder Wachstumsmedium mit einer Impfkultür
des gewünschten Stammes animpft. Die zum Animpfen des Nährmediums verwendete Impfkultur läßt man vorzugsweise
6 bis 40 Stunden vor der Verwendung als Inokulum wachsen. Der Zeitraum, während dessen man die Impfkultur
vor dem Animpfen anzieht, variiert abhängig von dem verwendeten Bakterienstamm. Es ist wünschenswert, daß
die Impfkultur eine gesunde, wachsende Zellmasse enthält, die ausreicht, um eine gute Basis für die Bildung
und das Wachstum der Fermentationskultur zu bilden.
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Die Größe des Fermenters hängt von der speziellen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ab. Dem Fachmann
ist es geläufig, die Mengen des Mediums und der Impfkultur den Erfordernissen eines spezifischen Reaktors oder
der gewünschten Ausbeute anzupassen.
Man läßt die Kultur in dem Fermenter wachsen, bis sie sich an die Reaktorumgebung gewöhnt hat und sich zu
einer Zellmasse entwickelt hat, die ausreicht, um der Zugabe der a-Ketosäure standzuhalten. Dieses ist besonders
wichtig, wenn eine unreine Ausgangsverbindung verwendet wird. Die optische Dichte kann als geeignetes
Maß für das Zellwachstum dienen. Eine optische Dichte ("O.D.", 640 nm) von etwa 10 deutet im allgemeinen
daraufhin, daß die Kultur für die Zugabe der a-Ketosäure bereit ist. Dies entspricht einer Wachstumszeit von
etwa 6 bis 40 Stunden, abhängig von dem Organismus und den Wachstumsbedingungen. Dies kann jedoch etwas variieren
und sollte nicht als strenges Erfordernis angesehen werden, sondern eher der Erfahrung und dem Ermessen
des Ausführenden überlassen bleiben.
Die Kultur wird bei einer Temperatur angezogen, die mit maximalem Wachstum des verwendeten Bakterienstammes vereinbar
ist. Der allgemeine Bereich reicht von Raumtemperatur bis hinzu etwa 370C. Für Corj/;ne_bac^e_r_i^a und
die Gattungen §_r_e_v iba^e^r^^m beträgt die bevorzugte Temperatur
etwa 300C. Der pH-Wert der Kultur sollte vor
dem Absinken des pH-Wertes, der mit dem Beginn des logarithmischen Wachstums verbunden ist, vorzugsweise
etwa 7 bis 8 betragen. Falls dies für den gewählten Bakterienstamm notwendig ist, kann belüftet werden.
Während der lag- und logarithmischen Wachstumsphase bilden
zahlreiche Mikroorganismen, beispielsweise die
Gattungen Br^v^b^cj^ej^iüOl und Q. ο rjm e_b a^e_r.i_unn, verschiedene
Säuren und scheiden diese aus. Diese Säuren können Glutaminsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure und andere
einschliessen. Durch Zuführen dieser Säuren zu dem KuI-turmedium
wird äer pH-Wert auf etwa 4 bis 6 gesenkt, wenn er nicht durch Zugeben einer Base kontrolliert
wird. Dieser erniedrigte pH-Bereich hat eine signifikant nachteilige Wirkung auf die Raten des Bakterienwachstums
und des Metabolismus.
Umgekehrt wurde beobachet, daß dann, wenn das Wachstum in die stationäre Phase eintritt, die Säurproduktion
der Mikroorganismen zurückgeht und fast aufhört. Da Teile der Zellpopulation zugrundegehen, werden basische
Komponenten wie Amine in die Kulturbrühe entlassen. Ohne Kontrolle steigern diese freigesetzten Basen den
pH auf Werte oberhalb etwa 8. Hohe pH-Werte sind ebenfalls nachteilig für die Kultur und hemmen sowohl den
Metabolismus als töten auch zumindest Teile der verbliebenen lebensfähigen Zellpopulation.
Die aktiv wachsende und metabolisierende Zellkultur bildet das gekoppelte Enzymsystem, das die Transaminierungsreaktion
des erfindungsgemäßen Verfahrens katalysiert. Es wurde gefunden, daß dann, wenn man der Kultur
eine basische Lösung der a-Ketosäure als Ausgangsverbindung als Reaktion auf den pH-Bedarf zuführt, die Ausgangsverbindung
den Mikroorganismen mit einer Rate angeboten wird, die im wesentlichen ihrer Fähigkeit zur
Umwandlung derselben in das L-Aminosäureprodukt entspricht. Wenn die Kultur in die logarithmische Wachstumsphase
eintritt und der pH-Wert zu sinken beginnt, wird die basische Lösung der a-Ketosäure mit einer Rate
eingespeist, die den pH-Wert bei oder oberhalb einer bestimmten Grenze, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5
bis etwa 7,5 hält.
Es kann ferner erwünscht sein, eine Obergrenze für den pH-Wert in dem Bereich von etwa 7,5 bis etwa 8 zu
setzen. Dies dient dazu, die Gesundheit und metabolische Aktivität der Mikroorganismen auch nach Verlangsamung
des aktiven Wachstums aufrechtzuerhalten. Diese Obergrenze des pH-Wertes kann aufrechterhalten werden,
indem man der Kultur irgendeine mit der Fermentation kompatible Säure zuführt. Geeignete Säuren sind beispielsweise
konzentrierter Eisessig, Schwefelsäure, Zitronensäure
und Phosphorsäure. Es kann jegliche Säure verwendet werden, die mit dem Wachstum oder dem Metabolismus
der Mikroorganismen und mit der Transaminierungsreaktion kompatibel ist.
Es können jegliche geeignete Mittel verwendet werden, um den pH-Wert der Kulturbrühe kontinuierlich zu überwachen
und die zum Kontrollieren des pH-Wertes innerhalb bestimmter vorgegebener Grenzen notwendige Base
oder Säure zuzugeben. Aus Bequemlichkeits- und Genauigkeitsgründen ist es bevorzugt, ein automatisches pH-Meß-
oder -Regelgerät zu verwenden, das den Ausstoß der Base oder Säure in den Fermenter mit einer vorausbestimmten
Rate aus einer oder mehreren Pumpen signalisiert. Auf diese Weise wird eine sofortige und geeignete
Reaktion auf die Änderungen oder Fluktuationen des pH-Wertes der Brühe erhalten. Dies entspricht im wesentlichen
einer sofortigen Reaktion auf Änderungen der Zellwachstums- und Metabolismusraten.
Die Zuführgeschwindigkeit der Base oder Säure hängt selbstverständlich von dem pH-Wert und der Konzentration
der zuzugebenden Lösung sowie dem pH-Bedarf der Kulturbrühe ab. Es ist ferner vorgesehen, daß die Base
oder Säure entweder kontinuierlich oder portionsweise zugeführt wird, bis die gewünschte pH-Grenze erreicht
ist. Es hat sich gezeigt, daß für einen 700 ml Fermenter Zuführraten von etwa 1 bis 3 ml/min geeignet sind,
wobei die Zuführzeiten von 1 ,0 Sekunden bis etwa 10 Minuten basierend auf dem Bedarf betragen.
Während der anfänglichen lag-Wachstumsphase, d.h. nach
Animpfen mit der Impfkultur, können die Untergrenzen des pH-Wertes durch Zugabe jeglicher Base kontrolliert
werden, die mit der wachsenden Kultur kompatibel ist.
Während dieser Anfangsperiode hat die Kultur die logarithmische
Wachstumsphase, während derer die a-Ketosäure als Ausgangsverbindung aktiv in die L-Aminosäure
umgewandelt wird, noch nicht erreicht. Die basische a-Ketosäurelösung könnte zwar während der lag-Phase zur
-| 5 pH-Kontrolle verwendet werden, dies könnte sich jedoch
nachteilig auf die Gesundheit der Kultur auswirken, insbesondere wenn eine unreine Ausgangsverbindung verwendet
wird. Eine volle Verwertung der Ausgangsverbindung findet jedenfalls bis zum Erreichen der logarithmischen
Wachstumsphase nicht statt. Aus diesem Grunde ist es bevorzugt, während der anfänglichen Wachstumsphase
eine geeignete Base, d.h. eine mit der wachsenden Kultur kompatible Base zu verwenden, die die Ausgangsverbindung
nicht enthält. Beispiele für geeignete Basen sind Amrhoniumhydroxid , Harnstoff, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid
und Ammoniakgas.
Beginnend nach etwa 6 bis 10 Stunden, wenn der O.D. (640 nm) etwa 10 erreicht hat und der pH-Wert auf etwa
6,8 bis 7 gesunken ist, wird weiteres Absinken des pH-Wertes durch Zugeben der a-Ketosäuren in basischer
Lösung wie zuvor beschrieben kontrolliert. Die Zuführrate während dieser logarithmischen Wachstumsphase (oder
Säurebildungsphase) wird im wesentlichen durch den pH-Bedarf bestimmt, es ist jedoch ebenfalls wünschenswert,
die α-Ketosäurekonzentration in den Brühe unterhalb etwa 15 g/l zu halten. Konzentrationen oberhalb dieses
Wertes können sich nachteilig auf die wachsende Kultur auswirken, insbesondere wenn eine unreine Ausgangsverbindung
verwendet wird.
Als Reaktion auf den pH-Bedarf wird so viel als möglich von der Ausgangsverbindungslösung in das Kulturmedium
eingespeist. Wenn die Säurebildung durch die Bakterien soweit abnimmt, daß der pH-Wert des Mediums nicht mehr
unter etwa 6,8 bis etwa 7,5 und vorzugsweise etwa 7,2 sinkt, so kann die pH-Grenze angehoben werden, um zusätzliche
Ausgangsverbindung auf Basis des pH-Bedarfs einzuspeisen. Beispielsweise kann die untere pH-Grenze
auf etwa 7,8 angehoben werden.
Nach Abschluß der Zufuhr aufgrund des pH-Bedarfs wird das gesamte verbleibende Volumen der a-Ketosäure, die
in L-Aminosäure umgewandelt werden soll, in die Brühe eingespeist. Es hat sich gezeigt, daß dann, wenn die
verbleibende a-Ketosäure über einen Zeitraum bis zu 24 Stunden oder langer, vorzugsweise 2 bis 8 Stunden,
eingespeist wird, diese in wesentlichen Mengen in L-Aminosäure umgewandelt wird. Ist beispielsweise vorgese-
hen, 300 bis 400 cm einer 80 g/l Lösung der Ausgangs-
3
verbindung in 700 cm Medium einzuspeisen, so kann etwa ein Drittel oder die Hälfte der Ausgangsverbindung als Reaktion auf den pH-Bedarf während der logarithmischen Wachstumsphase eingespeist werden. Der Rest wird während der nächsten 2 bis 8 Stunden oder mehr eingespeist.
verbindung in 700 cm Medium einzuspeisen, so kann etwa ein Drittel oder die Hälfte der Ausgangsverbindung als Reaktion auf den pH-Bedarf während der logarithmischen Wachstumsphase eingespeist werden. Der Rest wird während der nächsten 2 bis 8 Stunden oder mehr eingespeist.
Die obere pH-Grenze wird auf einen vorbestimmten Wert im Bereich von etwa 7,5 bis 8,0, vorzugsweise etwa 7,8
festgesetzt. Wie oben beschrieben, wird auch diese Grenze zugunsten der optimalen Gesundheit und metabolischen
Aktivität der Kultur kontrolliert. Wie für die Kontrolle
der Untergrenze des pH-Wertes ist es bevorzugt,
einen automatischen pH-Sensor zu verwenden, der die Zugabe der Säure zu dem Kulturmedium auslöst. Die Säure
wird mit einer Rate zugegeben, die ausreicht, um den pH-Wert der Brühe unterhalb der vorgesehenen Obergrenze
zu halten. Die Konzentration der Säure kann variieren, beispielsweise von etwa 1 bis etwa 30 Gew. /Vol. %. Es
werden jedoch konzentrierte Lösungen bevorzugt, insbesondere in Batchverfahren, da sie das Gesamtvolumen der
Fermentationsmedien in geringerem Ausmaß steigern.
In einem Batchverfahren kann das L-Aminosäureprodukt
aus der Kulturbrühe gewonnen werden, nachdem die Kultur die stationäre Wachstumsphase erreicht hat, was durch
0.D.-Werte in dem Bereich von etwa 20 bis 70 angezeigt
wird. Wird das erfindungsgemäße Verfahren kontinuierlich durchgeführt, so kann das Produkt kontinuierlich
gewonnen werden. Die L-Aminosäure kann nach herkömmliehen Verfahren aus der Kulturbrühe gewonnen werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
Impfkultur- und Wachstumsmedien wurden je Liter entioni siertem Wasser wie folgt hergestellt:
30,0 g Glukose
2,5 g Maisquellflüssigkeit
(corn steep liquor)
NZ Amin B2
K2HPO4
MgSO4 · 7H2O
2,5 | g | g | g |
1,0 | g | cm | |
0,25 | cm | ||
10,0 | |||
1,0 | |||
1,0 |
1,0 cmw Thiamin-HCl-Stammlösung
20,0 g CaDO3
Biotinstammlösung i 5
100,0 | g | g |
2,5 | g | g |
2,5 | g | cm |
1,0 | g | cm |
0,25 | ||
40,00 | ||
1,0 | ||
1,0 |
1 - eine 70 Gew./Vol.%-ige Glukosestammlösung.
2 - Sheffield Company.
2 - Sheffield Company.
3 - 100 mg d-Biotin je Liter entionisiertem Wasser.
4-1,Og Thiamin-HCl je Liter entionisiertem Wasser.
5 - Dem Impfkulturmedium als Puffer zugegeben.
4-1,Og Thiamin-HCl je Liter entionisiertem Wasser.
5 - Dem Impfkulturmedium als Puffer zugegeben.
Alle Bestandteile wurden vereinigt und bei 1100C 10 Minuten
lang zum Sterilisieren autoklaviert. Nach dem Autklavieren wurde der pH-Wert der Medien mit NaOH auf
7,4 eingestellt.
3 3
50 cm Teilmengen des Impfkulturmediums in 250 cm
Schüttelkolben wurden mit Brevibacterium t hi og_e n_:i t al.is
ATCC Nr. 31723 beimpft. Man ließ die Kulturen bei 300C unter Schütteln bei 300 UpM (Umdrehungen pro Minute)
bei 30 C 17 Stunden lang wachsen, bevor sie als Inoku-Ium
für den Fermenter verwendet wurden.
Es wurde ein 2 Liter (Arbeitsvolumen 1 Liter) gerätegesteuerter MuItigen-Fermenter (New Brunswick Co.) verwendet.
Vor der Verwendung wurden etwa 0,2 ml Polyethylenglykol 2000 in den Fermenter gegeben, um Schaum-
bildung zu unterdrücken. Der Fermenter wurde anschließend 10 Minuten lang bei 1100C autoklaviert. Ein
Anfangsvolumen von 700 ml des Wachstumsmediums wurde in
den Fermenter gegeben. Es wurden etwa 50 ml der Impfkultür
(O.D. bei 640 nm = 22) zugegeben. Der Fermenter
wurde bei 30 C und 600 UpM betrieben, wobei 1,0 bis 1,25 Liter je Minute (LpM) Luft zum Belüften in den
Fermenter eingeführt wurden.
Der pH-Wert in dem Fermenter wurde während, der anfänglichen
8-stündigen Wachstumszeit manuell mit konzentrierter NH.OH-Lösung (29 %) kontrolliert.. Während der
ersten 4 Stunden änderte sich der pH-Wert wenig oder gar nicht. Während der zweiten 4 Stunden wurde das
pH-Meter ständig visuell beobachtet. Wenn nötig wurde NH.OH zugegeben, wobei während dieses Zeitraums ein
^ 3
Gesamtvolumen von etwa 2,0 cm zugegeben wurde.
Nach der Anfangszeit von 8 Stunden wurde der pH automatisch
kontrolliert, wobei ein pH-Kontrollgerät Modell 5997 (Horizon Ecology Co.) und eine pH-Elektrode
(200 mm, Ingold) verwendet wurde. Das System wurde so programmiert, daß der pH-Wert der Kulturbrühe oberhalb
6,8 und unterhalb 7,8 eingestellt wurde. Der pH-Regler war so programmmiert, daß dann, wenn der pH-Wert in dem
Medium unter 6,8 sank, ein Signal an eine peristaltische Pumpe (CoIe Parmer Co.) gegeben wurde, welches
die Zufuhr der Base mit einer Rate von etwa 1 bis 3 ml/min auslöste, um den pH-Wert oberhalb 6,8 zu halten.
Die Base enthielt Phenylpyruvat in wäßriger Kaliumhydroxidlösung.
Gereinigtes Phenylpyruvat (PPA) wurde von Aldrich Chemical Co. als Na-PPA-H2O (98 %,
MW 204,16) erhalten. Dieses wurde in 0,6 M wäßrigem KOH
gelöst, so daß eine Lösung mit einer Konzentration von
3 98 g/l oder 0,144 M in einem Gesamtvolumen von 300 cm gebildet wurde.
Nach etwa 8 Stunden wurde die wäßrige PPA-Lösung du,rch
das System zur Regelung des pH-Wertes in dem Fermentationsansatz verwendet und dies wurde nach etwa 24 Stun-
3
den beendet. Es wurden insgesamt 175 cm dieser Lösung während der logarithmischen Wachstumsphase automatisch in den Fermenter eingespeist. Die Gesamtmenge an Na*PPA'H2O, die während dieses Zeitraums eingespeist wurde, betrug 17,15 g (84 mM).
den beendet. Es wurden insgesamt 175 cm dieser Lösung während der logarithmischen Wachstumsphase automatisch in den Fermenter eingespeist. Die Gesamtmenge an Na*PPA'H2O, die während dieses Zeitraums eingespeist wurde, betrug 17,15 g (84 mM).
An diesem Punkt - nach 24-stündiger Fermentationzeit - reichte die Säureproduktion der Mikroorganismen
nicht länger aus, um den pH-Wert des Mediums auf oder unter 6,8 zu senken. Daher wurden die verbleibenden
3
125 cm der wäßrigen PPA-Lösung, die 12,25 g (60 mM) enthielten, während eines Zeitraums von 2 Stunden 3
(62,5 cm /h) in den Fermenter gepumpt. Die Fermentation wurde weitere 24 Stunden bis zu einer Gesamtfermentationszeit von 48 Stunden fortgeführt. Während der letz-
125 cm der wäßrigen PPA-Lösung, die 12,25 g (60 mM) enthielten, während eines Zeitraums von 2 Stunden 3
(62,5 cm /h) in den Fermenter gepumpt. Die Fermentation wurde weitere 24 Stunden bis zu einer Gesamtfermentationszeit von 48 Stunden fortgeführt. Während der letz-
3
ten 17 Stunden wurden 25 cm 5N KOH als Kontrollbase verwendet.
ten 17 Stunden wurden 25 cm 5N KOH als Kontrollbase verwendet.
Der pH-Regler wurde ferner so programmiert, daß der pH-Wert 7,8 nicht überschritt, indem an eine zweite
peristaltische Pumpe (CoIe Parmer Co.) ein Signal zur
Zugabe von konzentriertem Eisessig gegeben wurde. Es
3
wurden insgesamt 15 cm zugegeben.
wurden insgesamt 15 cm zugegeben.
Es wurde so viel Glukose (70 Gew./Vol.%-ige Stammlösung)
zugegeben, wie erforderlich war, um das Absinken der Glukosekonzentration in der Fermentationsbrühe auf
Null zu verhindern. Diese Maßnahme diente dazu, sicher-
Λ *
zustellen, daß Glukose anstelle der Ausgangsverbindung
oder des Produktes als Kohlenstoffquelle verwendet wur-
de. Das erhaltene Endvolumen betrug 1029 cm . Das berechnete
Endvolumen betrug:
Ausgangsmedium
Inokulum
wäßrige Na·PPA 10 Essigsäure NH4OH
Glukose
5 N KOH
wäßrige Na·PPA 10 Essigsäure NH4OH
Glukose
5 N KOH
Zwischensumme =
3
3
entnommen 7 χ 10 cm Proben =
3
Summe = 1122 cm
Summe = 1122 cm
700 | cm |
50 | cm |
300 | cm |
15 | cm |
2 | 3 cm |
100 | cm |
25 | cm |
1192 | cm |
70 | cm |
Der Verdampfungsverlust während der 58-stündigen Fermentationszeit
betrug etwa 8,3 %.
Proben der Fermentationsbrühe wurden mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) hinsichtlich L-Phenylalanin analysiert. Milliporenfiltrierte (0,22 [im Porengröße)
Mediumproben wurden vor der Injektion in den 25
HPLC nach einem Dansylchlorid-Verfahren derivatisiert.
Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
24 Stunden - 13,20 g/l L-Phenylalanin
28 Stunden - 17,06 g/l
31 Stunden - 19,20 g/l
48 Stunden - 18,69 g/l "
Die niedrigere Ausbeute nach 48 Stunden war auf den Abbau des Produktes zurückzuführen.
Während der Fermentation wurden aus insgesamt 144 mM Na'PPA'HpO (29,4 g) insgesamt 115,93 mM L-Phenylalanin
(19,15 g) gebildet. Die molare Ausbeute betrug:
m_M_L—P_ h e nj/_la. l_an_ i_n_
M NH
M NH
mM Na·PPA-H2O
Bei.spi.e^l^ 2
Es wurden die Medien, der Mikroorganismenstamm und die Grundverfahren gemäß Beispiel 1 verwendet, mit dem Unterschied,
daß die folgenden Änderungen in der Menge und der pH-Kontrolle vorgenommen wurden. Die wäßrige
Na»PPA-Lösung wurde etwa 7 Stunden nach dem Beimpfen des Fermenters als Kontrollbase verwendet. Die programmierte
pH-Kontrolle wurden auf die Werte 7,2 und 7,8 eingestellt.
Die wäßrige Na-ΡΡΑΉ O-Lösung enthielt 168 mMole
^ 3
(34,3 g) in einem Gesamtvolumen von 350 cm . Das Volumen
der während des nach 7 Stunden beginnenden und nach 24 Stunden endenden Zeitraums als Kontrollbase verwende-
3
ten wäßrigen Na·PPA-Lösung betrug 175 cm . Zur Kontrolle der PH-Obergrenze wurde gemäß Beispiel 1 Essigsäure
ten wäßrigen Na·PPA-Lösung betrug 175 cm . Zur Kontrolle der PH-Obergrenze wurde gemäß Beispiel 1 Essigsäure
3
zugegeben, wobei eine Gesamtmenge von 41 cm zu dem Fermenter gegeben wurde. Nach 24 Stunden wurde der untere eingestellte Wert auf dem pH-Regler für die restliche Fermentationszeit auf 7,5 angehoben. Beginnend mit diesem Zeitpunkt wurde der Rest der Na·PPA-Lösung
zugegeben, wobei eine Gesamtmenge von 41 cm zu dem Fermenter gegeben wurde. Nach 24 Stunden wurde der untere eingestellte Wert auf dem pH-Regler für die restliche Fermentationszeit auf 7,5 angehoben. Beginnend mit diesem Zeitpunkt wurde der Rest der Na·PPA-Lösung
3
(175 cm ) während eines Zeitraums von 2 Stunden in den
(175 cm ) während eines Zeitraums von 2 Stunden in den
Reaktor gepumpt. Die Fermentation wurde weitere 24 Stunden fortgeführt, wobei eine Gesamtfermentationszeit von
48 Stunden erreicht wurde.
35
35
Das erhaltene Endvolumen betrug 1025 | 29 % NH,) | cm . | Das berechne- |
te Endvolumen betrug: | Zwischensumme = | ||
Ausgangsmedium | 3 15 cm Proben = |
700 | cm |
Inokulum | Summe = | 50 | cm |
Na· PPA | 350 | 3 cm |
|
Essigsäure | 41 | cm | |
Glukose | 100 | 3 cm |
|
NH OH (konzentriert, | 2 | 3 cm |
|
1243 | cm | ||
entnommen 11 χ | 165 | cm | |
1078 | 3 cm |
||
Der Verdampfungsverlust während der 48-stündigen Fermentationszeit
betrug etwa 4,92 %.
15
15
Die Medienproben wurden gemäß Beispiel 1 analysiert. Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten:
24 Stunden - 16,7 g/1 L-Phenylalanin
26 Stunden - 17,4 g/l
29 Stunden - 19,5 g/l "
32 Stunden - 20,1 g/l
48 Stunden - 21,8 g/l
Aus insgesamt 168,00 mM Na-PPA-HpO (34,3 g) wurden wurden
während der Fermentation insgesamt 145,77 mM L-Phenylalanin (24,08 g) gebildet. Die molare Ausbeute betrug
86,8 %.
Es wurde das folgende Impfkulturmedium hergestellt:
~™ ™2.i ^ e _
Glukose
Bacto-Pepton (Difco) Hefeextrakt
NaCl
10
NaCl
10
Die Bestandteile wurden vereinigt und der pH-Wert mit 5N. NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Medium wurde 10 Minuten
lang bei 110 C autoklaviert.
Es wurde das folgende Wachstumsmedium hergestellt:
Zuckerrohrmelasse (10 % als Glukose) 100,00 g
K2HPO4 0,50 g
KH2PO4 0,50 g
MgS04«7H20 0,25 g
NH4SO4 20,00 g
Maisquellflüssigkeit
(Corn Steep Liquor) 5,00 g
CaCO3 20,00 g
Die Bestandteile wurden vereinigt und der pH-Wert mit 5N NaOH auf 7,2 eingestellt. Das Medium wurde 10 Minuten
lang bei 1100C autoklaviert.
Die Impfkultur wurde gemäß Beispiel 1 von einer 18 Stunden alten Auxo-Sy Agar (Difco )-Platte von Br_ey_:Lba_c--
te£i.um ^actofer^mentum ATCC Nr. 21420 übertragen. Man
ließ die Impfkultur 7 Stunden wachsen, wobei ein O.D.
(640 nm) von 25 erreicht wurde. Der pH-Wert des Fermen-
- 3-f -
termediums wurde mit Na4OH von 6,5 auf 7,0 eingestellt.
Es wurden 20 ml des Impfkulturmediums verwendet, um den
Fermenter nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 zu beimpfen. Der Fermenter wurde bei 30 C, 400 UpM (Umdrehungen
pro Minute) und 1,0 LpM (Liter pro Minute) betrieben. Für die ersten 24 Stunden wurde die untere pH-Grenze
auf 6,8 und die obere pH-Grenze auf 7,8 eingestellt.
Eine wäßrige Kaliumphenylbrenztraubensäurelösung (K-PPA) wurde als a-Ketosäurenausgangsverbindung verwendet.
Die Lösung war ein ungereinigtes Natriumhydroxidhydrolysat von 5-Benzylidenhydantoin. Die Herstellung
des Hydrolysats von 5-Benzylidenhydantoin (Hamsphire Chemical Co.) erfolgte nach folgendem Verfahren:
-j5 1598,85 g eritionisiertes Wasser und 168,3 g KOH wurden
in einem 3 Liter Becher aus rostfreiem Stahl vereinigt und bis zum Sieden erhitzt. Unter fortgesetztem Sieden
wurden 188,2 g 5-Benzylidenhydantoin zugefügt und bis zum Lösen gemischt. Der Siedevorgang wurde 2 Stunden
lang fortgesetzt. Es wurde nach Bedarf Wasser zugegeben, um das ursprüngliche Volumen aufrechtzuerhalten.
Nach dem Sieden wurde die Mischung schnell in einem Eiswasserbad abgekühlt. Eine 1 molare Lösung von Kaliumphenylpyruvathydrolysat
enthielt etwa 1,2M KOH, etwa 0,5M Kaliumcarbonat und etwa 0,5M Harnstoff. Das Hydrolysat
wurde anschließend unter Verwendung eines Milliporenfilters (0,22 μηη Porengröße)' sterilisiert.
Dieses Hydrolysat, dessen pH-Wert etwa 13 betrug, wurde 3Q von Beginn der Fermentation an als Kontrollbase verwendet.
Während 40 Stunden wurden insgesamt 225 ml zugegeben .
Zur Senkung des pH-Wertes wurde konzentrierter Eisessig verwendet. Während der ersten 17 Stunden wurden 5 ml
zugegeben. In den späteren Fermentationsstadien stieg der pH-Wert des Mediums nicht über 7,8 an, so daß keine
weiteren Säurezugaben erforderlich waren.
Nach einer Fermentationszeit von 24 Stunden wurden die festgesetzten pH-Grenzwerte auf 7,8 und 8,0 eingestellt.
An diesem Punkt wurde eine Glukosemenge von 50 ml zugegeben, um die Konzentration in dem Medium auf
10 % zu bringen. Nach 65 Stunden wurden 20 ml Glukose zugegeben.
Medienproben wurden gemäß Beispiel 1 analysiert.
Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten: 15
40 | Stunden | 6 | ,8 | g/ | 1 | L-Phenylalanin |
43 | Il | ,8 | g/ | 1 | it | |
45 | Il | 8 | ,4 | g/ | 1 | Il |
48 | Il | 9 | ,4 | g/ | 1 | Il |
65 | Il | - 10 | ,2 | g/ | 1 | Il |
Aus insgesamt 111,23 mM eingespeister K-Phenylbrenztraubensäure
wurden während der Fermentation insgesamt 75,67 mM L-Phenylalanin gebildet. Die molare Ausbeute
betrug 68,0 %. Der Verdampfungsverlust wurde in diesem
Versuch nicht berücksichtigt.
Die Impfkultur- und Wachstumsmedien gemäß Beispiel 1
wurden verwendet, mit dem Unterschied, daß sowohl in dem Impfkultur- als auch in dem Wachstumsmedium 30 g
(NH4J2SO4 und anstelle des CaCO 20,9 g MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)
als Puffer verwendet wurden. Die Kultivierungs- und Impfverfahren gemäß Beispiel 1
- 33 -
wurden unter Verwendung von Brevibacterium fl&vuro ATCC
Nr. 13626 durchgeführt. Den Fermenten wurde in diesem
Versuch für die ersten 18 Stunden bei 500 bis 600 UpM
und anschließend bei 650 UpM betrieben.
5
5
Die für die pH-Kontrolle verwendete Base war das K-Phenylpyruvathydrolysat
gemäß Beispiel. 3. Der pH-Wert wurde mit COp auf 10 eingestellt. Der untere pH-Grenzwert
wurde bei 7,2 und der obere bei 7,8 festgesetzt. Das
Ί0 Hydrolysat wurde von Beginn der Fermentation an als
Kontrollbase verwendet. Es wurden insgesamt 400 ml als Reaktion auf den pH-Bedarf in den Fermenter eingeführt.
Nach einer Fermentationszeit von etwa 25 Stunden wurden 50 ml Glukose zu den verbliebenen 60 ml Hydrolysat-Basenlösung
gegeben, die weiter als Kontrollbase zugegeben wurde. Nach etwa 48 Stunden wurden weitere 25 ml
Glukose zugegeben. Es wurde konzentrierter Eisessig verwendet,
um die obere pH-Grenze aufrechtzuerhalten und die Zugabe weiterer Hydrolysat-Basenlösung zu der KuI-tür
zu ermöglichen. Dem Fermenter wurden insgesamt 42 ml zugegeben.
Medienproben wurden gemäß Beispiel 1 analysiert.
Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten:
Es wurden die folgenden HPLC-Ergebnisse erhalten:
17 | Stunden | - 3,33 | g/ | 1 | L-Phenylalanin |
19 | Il | 3,96 | g/ | 1 | Il |
22 | It | 6,19 | g/ | 1 | ti |
24 | Il | 7,60 | g/ | 1 | " |
42 | It | - 11,60 | g/ | 1 | Il |
45 | Il | - 14,10 | g/ | 1 | Il |
65 | Il | - 11,90 | g/ | 1 | Il |
„j- Die geringere Ausbeute nach 65 Stunden war auf den
Abbau des Produktes zurückzuführen.
Aus insgesamt 176,33 mM eingespeistem K-Phenylpyruvat
wurden innerhalb von 45 Stunden insgesamt 111,99 mM L-Phenylalanin gebildet. Die molare Ausbeute betrug
nach 45 Stunden 63,5 %.
Der Verdampfungsverlust wurde in diesem Versuch nicht
berücksichtigt.
Claims (11)
- UEXKÜLL & STOLBERGPATENTANWÄLTEBESELERSTRASSE 4 D 2000 HAMBURG 52EUROPEAN PATENT ATTORNEYSDR JD FRHR von UEXKULL DR. ULRICH GRAF STOLBERG DIPL. ING. JÜRGEN SUCHANTKE DIPL ING. ARNULF HUBER DR. ALLARD von KAMEKEW.R. Grace & Co.1114 Avenue of the Americas New York, N.Y. 10036V.St.A.(Prio.: 5. August 1983US 520 631 672/ÜGS/VOE/wo)Juli 1984Verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
aus a-Ketosäuren durch chargenweise gespeisteFermentationPatentansprücheVerfahren zur Herstellung von !..--Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß mana) in einem Nährmedium Mikroorganismen anzieht, die a-Ketosäuren in die korrespondierenden L-Aminosäuren umwandeln und die während der Wachstumsphase Säuren bilden und ausscheiden,b) die gewünschten α-Ketosäuren der wachsenden Mikroorganismenkultur mit einer Rate zuführt, die im wesentlichen mit der Wachstumsrat'j der Kultur übereinstimmt, undc) die α-Ketosäuren durch die Mikrooganismen in die korrespondierenden Aminosäuren umwandeln läßt. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die L-Aminosäure aus dem Fermentationsmedium gewinnt.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zuführungsrate der a-Ketosäure in Stufe b) von dem pH-Wert des Kulturmediums abhängig macht.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man etwa 6 bis 10 Stunden nach dem Inokulieren-15 des Nährmediums mit den Mikroorganismen mit dem Zuführen der a-Ketosäure beginnt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen der α-Ketosäure beginnt, wenn die optische Dichte (640 nm) der wachsenden Kultur etwa 10 erreicht hat.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Kultur vor Beginn dera-Ketosäurezuführung durch Zugabe einer Base kontrolliert, die mit der Fermentation kompatibel ist, wobei man eine Base verwendet, die frei oder im wesentlichen frei von der α-Ketosäure ist.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Kultur vor Beginn der a-Ketosäurezuf ührung in dem Bereich von etwa 6,8 bis 7,2 hält.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Base Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydroxid, Harnstoff oder Ammoniakgas verwendet.
- 9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die ot-Ketosäure in einer Lösung zuführt, die eine mit der Fermentation kompatible Base enthält.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,daß man als Base Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Harnstoff verwendet.-J5
- 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen der a-Ketosäure beginnt, wenn der pH-Wert in dem Kulturmedium in den Bereich von etwa 7,2 bis etwa 7,5 sinkt.Ί2. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die a-Ketosäure so zuführt, daß der pH-Wert des Kulturmediums bei oder oberhalb einer vorbestimmten Grenze in dem Bereich von etwa 6,8 bis eta 7,5 gehalten wird.13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die basische a-Ketosäurelösung auf ein Signal aus einem automatischen pH-Regler hin in das Kulturmedium pumpt.14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pH-Regler verwendet, der das Zuführen der basischen Lösung automatisch durch ein Signal an eine Pumpe auslöst, wenn der pH-Wertoc in dem Kulturmedium unter eine vorbestimmte Grenzeinnerhalb des genannten Bereiches sinkt.15. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen einer mit der Fermentation kompatiblen Säure beginnt, wenn der pH-Wert des Kulturmediums in den Bereich von etwa 7,5 bis etwa 7,8 steigt.16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Säure so zuführt, daß der pH-Wert des Kulturmediums bei oder unterhalb etwa 8,0 gehalten wird.17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Kontrollieren des pH-Wertes des Kulturmediums einen automatischen pH-Regler verwendet.18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man einen pH-Regler verwendet, der das Zuführen der Säure zu dem Kulturmedium automatisch durch ein Signal an eine Pumpe auslöst, wenn der pH-Wert des ..Kulturmediums über eine vorbestimmte Grenze innerhalb des genannten Bereiches ansteigt.19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man der Kultur einen ersten Teil der a-Ketosäure-Gesamtmenge, die der wachsenden Kultur zur biologischen Umwandlung zugeführt werden soll, auf Basis des pH-Bedarfs zuführt und der Kultur einen zweiten Teil während eines Zeitraums von bis zu 24 Stunden nach Beendigung des Zuführens gemäß dem pH-Bedarf zuführt.20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als ersten Teil eine Menge verwendet, die 1/3 bis 1/2 der Gesamtmenge bildet.21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man der Kultur den zweiten Teil der■ a-Ketosäurelösung über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zuführt.22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man der Kultur den zweiten Teil in einer oder mehreren Portionen oder kontinuierlich zuführt.23. Verfahren zur biologischen Umwandlung von a-Ketosäuren als Ausgangsverbindungen in L-Aminosäuren durch Zuführen der Ausgangsverbindungen zu einer in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Mikroorganismenkultur, die zu der biologischen Umwandlung fähig ist und die während der aktiven Wachstumsphase Säuren ausscheidet, dadurch gekennzeichnet, daß mana) die pH-Änderungen in dem Medium der wachsendenKultur überwacht undb) die a-Ketosäure als Ausgangsverbindung in einer basischen Lösung in solchen Mengen zuführt, daß die durch die Mikroorganismen ausgeschiedenen Säuren kompensiert werden.24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man mit dem Zuführen der a-Ketosäure beginnt, wenn der pH-Wert in dem Kulturmedium bis auf eine vorbestimmte Grenze in dem Bereich von etwa 7,2 bis etwa 7,5 sinkt.25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die α-Ketosäure so zuführt, daß der pH-Wert des Kulturmediums bei oder oberhalb einer vorbestimmten Grenze in dem Bereich von etwa 6,8 bis etwa 7,5 gehalten wird.
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