DE3328952A1

DE3328952A1 - Neue polypeptide, verfahren zu ihrer herstellung, pharmazeutische praeparate welche sie enthalten, sowie ihre verwendung

Info

Publication number: DE3328952A1
Application number: DE19833328952
Authority: DE
Inventors: Wilfried 4431 Lampenberg Bauer; Janos Dr. 4054 Basel Pless
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1982-08-24
Filing date: 1983-08-11
Publication date: 1984-03-01
Also published as: FR2532308A1; GB2125799A; AU1833383A; BE897546A; GB8322529D0; JPH0615558B2; ZA836276B; NL8302935A; JPS5962557A; US4496543A; CH655505B; IT1169770B; FR2532308B1; PH19787A; IT8322612A0; SE8304573L; GB2125799B; IL69540A0; SE8304573D0

Description

- 8 - 10CHS873

Neue Polypeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung/ pharmazeutische Präparate, welche sie enthalten, sowie ihre Verwendung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische Präparate, welche diese Polypeptide enthalten, sowie ihre Verwendung als pharmazeutisch aktive Verbindungen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung geradkettige oder monocyclische Polypeptide enthaltend einen Heptapeptidteil, worin sich in Stellung 1 (N-terminal) ein a-N-phenylalkylierter, gegebenenfalls im Ring substituierter Phenylalaninrest,in Stellung ein Cysteinrest, in Stellung 3 ein gegebenenfalls im Ring substituierter Phenylalaninrest, in Stellung 4 ein gegebenenfalls im Benzolring substituierter Tryptophanrest, in Stellung 5 ein gegebenenfalls £-N-alkylierter Lysinrest und in Stellung 7 (C-terminal) ein Cystein- oder Cysteinol-rest befindet, wobei die S-Atome des Cysteinrestes in Stellung 2 und des Cystein- oder Cysteinolrestes in Stellung 7 im Falle des monocyclischen Polypeptides durch eine Bindung miteinander verbunden sind unter Bildung einer S-S-Brücke und wobei die Reste in den Stellungen 1,2, 4, 6 und 7 des Heptapeptidteiles in der (L)-oder (D)-Konfiguration vorliegen können und jeder der Reste in den Stellungen 4, 5 und 6 des Heptapeptidteiles gegebenenfalls ot-N-alkyliertsein kann und die erfindungsgemässen Polypeptide in freier oder geschützter Form vorliegen; sowie die Salze und Komplexe dieser Polypeptide.

9 100-5873

Bevorzugt sind Polypeptide der Formel I in freier oder geschützter Form

AZ CH-SY₁ Y₀SCH

QVc H -N-CH-CO-NH-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F I ^{XX;L 2} 3456 7

^A3
worin Ä für Wasserstoff, Alkyl mit 1-3 C-Atomen oder den Acylrest einer organischen oder anorganischen Säure

A für Wasserstoff, Alkyl mit 1-3 C-Atomen, Alkoxy mit 1-3 C-Atomen, OH, Halogen, NO , eine ve Carboxylgruppe oder eine Amidgruppe

C-Atomen, OH, Halogen, NO , eine veresterte oder amidierte

A_ für Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen, OH oder NO

A für Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen

χ für 1 bis 4

^N-CH(Z)-CO für einen gegebenenfalls durch Halogen, NO , NH„, OH, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen und/oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen substituierten (L)- oder (D)Phenylalaninrest B für Phe oder im Phenyirest durch Halogen, NO , NH_, OH, Älkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen substituiertes Phe

C für gegebenenfalls im Benzolring durch Halogen, NO₇, NH-, OH, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen substituiertes L- oder D-Trp, wobei die a-Aminogruppe durch Methyl substituiert sein kann

^ 10 τ 100-5873

D für Lys, wobei die ct-Aminogruppe durch Methyl und/oder die £-Aminogruppe durch Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen substituiert sein kann

E für den Rest einer natürlichen (L)-α-Aminosäure oder einer entsprechenden (D)-Aminosäure, wobei die a-Aminogruppe eine Methylgruppe tragen kann

F für COOR₁, CH₂OR₂, CO-NR R₄ oder -CO-N

R für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen

R₂ für Wasserstoff oder den Rest eines physiologisch akzeptablen, physiologisch hydrolysierbaren Esters

R für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen, jedoch falls R für -CH(R )-X steht, nur für Wasserstoff oder Methyl

R für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder

-CH-X _ιτ

R₅ für den am cx-C-Atom befindlichen Rest einer natürlichen α-Aminosäure (inklusive Wasserstoff) oder für einen HO-CH₂-CH₂- oder HO(-CH₃J₃-ReSt, wobei die Gruppe II die (L)- oder (D)-Konfiguration haben kann

X für COOR , CH₀OR. oder CON-" ^R6

^NR7

R₆ für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen

R₇ für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen

τ 11 τ- 100-5873

und Y und Y_? beide für Wasserstoff oder zusammen für eine Bindung stehen, wobei die Reste in den Stellungen 2 und 7 in (D)- oder (L)-Form vorliegen können, mit der Massgabe, dass (D)- und/oder (L)-Cysteinreste nur in den Stellungen 2 und 7 vorliegen
sowie die Salze und Komplexe dieser Polypeptidderivate.

In der vorliegenden Beschreibung und Ansprüchen steht "Halogen" für Fluor, Chlor und Brom.

Steht A für einen Acylrest, so sind darunter besonders die Acylreste der organischen Carbonsäuren (inklusive Aminosäuren oder Di- und Oligopeptide) oder Sulfonsäuren, der Sulfaminsäuren sowie der Kohlensäure und ihrer Derivate zu verstehen.

Als Beispiele für solche Acylreste können genannt werden:

1.) RCO worin R für einen aliphatischen, cycloaliphatisehen, aromatischen oder heterocyclischen Rest steht, besonders für Alkyl mit 1 bis 20 C-Atomen, Alkenyl oder Alkinyl mit 3 bis 20 C-Atomen, Phenyl, Naphthyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen.

2.) R¹SO₂ worin R' für Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen steht

3.) R¹¹OCO worin R" für Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen steht

12 ,- 100-5873

TV ^ IV -** " IV-^

R^1V R NH R

worin R¹¹¹ für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen

IV
und R für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen

stehen.

Die aliphatischen Reste R können gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein. So können auch die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylreste sowie die Alkylgruppen der Phenylalkylreste in R, R', R", R und R geradkettig oder verzweigt sein. Alle oben erwähnten

IV
Gruppen R bis R können auch gegebenenfalls weitere Substituenten tragen, vorzugsweise sind diese Gruppen jedoch unsubstituiert.

Der Phenylring der Phenylalkylgruppe am a-N-atom des Aminosäurerestes in Stellung 1 des Heptapeptidteiles der erfindungsgemässen Polypeptide kann gegebenenfalls substituiert sein, z.B. wie in den Polypeptiden der Formel I, worin Ä , A und/oder A eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben können- Weiter kann der Alkylenrest in den Phenylalkyl gruppen, z.B. der Rest C H in der Formel I, geradkettig oder verzweigt sein.

In den Polypeptiden der Formel I sind die nachfolgenden Bedeutungen oder deren Kombinationen bevorzugt:

5. A ist Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder ein RCO- oder R¹SO -Rest wie unter 1. und 2, definiert. A steht besonders für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder RCO, speziell für Wasserstoff oder RCO.

- 13 _ 100-5873

5.1 Falls A für den RCO-Rest steht, ist R vorzugsweise Älkyl mit 1 bis 15 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen, besonders Alkyl mit 1 bis 15 C-Atomen, speziell Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen, z.B. CH -(CH_n) -.

3 2 8

5.2 Falls A für den R¹SO -Rest steht, bedeutet R¹ vorzugsweise Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen oder gegebenenfalls durch Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen substituiertes Phenyl, besonders Phenyl oder durch Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen mono- oder disubstituiertes Phenyl. Eine besonders bevorzugte Bedeutung für R¹ ist Alkyl mit 1 bis 10 C-Atomen.

6. A ist Wasserstoff, eine veresterte oder amidierte Carboxylgruppe der Formel R O-CO resp. R NH-CO, worin R Alkyl mit

8 8 8

1 bis 16 C-Atomen bedeutet oder eine Amidgruppe der Formel R CONH-, worin R Alkyl mit 1 bis 15 C-Atomen bedeutet. Besonders

bevorzugt steht A für Wasserstoff oder eine R NH-CO-Gruppe, 1 8

worin R für Alkyl mit 1 bis 16 C-Atomen, besonders mit 1 bis ο

10 C-Atomen steht, z.B. CH -(CH ) -. Ganz besonders bevorzugt steht A für Wasserstoff.

7. A ist Wasserstoff

8. A ist Wasserstoff

9. C H_n ist CH_n

x 2x 2

10. ^N-CH(Z)-CO- steht vorzugsweise für den (D)-Phenylalaninrest

11. B ist Phe oder Tyr

12. C ist (D)-Trp

13. D ist Lys oder MeLys, besonders Lys

14. E ist der Rest einer natürlichen α-Aminosäure, besonders Thr

- 14 - 100-5873

15. F ist ein -^CO-N^ 3-Rest

besonders eine Gruppe der Formel ^CO-N^ 3

(R = H oder CH₃). Im letzten Fall hat der Rest -CH(R )-X vorzugsweise die L-Konfiguration.

15.1 R. steht vorzugsweise für Wasserstoff

15.2 R steht als am ot-C-Atom befindlicher Rest einer natürlichen

α-Aminosäure (der Formel H NtCH(R )-COOH) vorzugsweise für CH OH, CH(CH )-OH, iso-Butyl oder Benzyl oder R steht für einen -CH₉-CH-OH oder -(CH ) -OH-Rest. R steht besonders für CH OH oder CH(CH )-OH.

•R,

15.3 X ist vorzugsweise ein Rest der Formel Co-W'' 6 oder

^R7

CH OR., besonders der Formel CH OR und R ist bevorzugt Wasserstoff oder hat die hierunter angegebene Bedeutung. Besonders bevorzugt steht R₉ für Wasserstoff.

16. Unter dem Ausdruck'physiologisch akzeptable, physiologisch hydrolysierbare Ester" wie verwendet bei der Definition des Restes R sind solche Ester zu verstehen, welche unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbar sind zu Säuren, welche selber bei den verwendeten Dosen physiologisch verträglich sind. Als Rest eines physiologisch akzeptablen, physiologisch hydrolysierbaren Esters steht R vorzugsweise für HCHO Alkylcarbonyl mit 2 bis 12 C-Atomen, Phenylalkylcarbonyl mit 8 bis 12 C-Atomen oder Benzoyl.

17. Die Reste in den Stellungen 2 und 7 haben vorzugsweise die (L)-Konfiguration.

18. Y und Y„ stehen vorzugsweise zusammen für eine Bindung.

- ¹⁵ - 100-5873

Interessant sind solche Polypetide der Formel I, worin entweder A für einen Acylrest steht und dieser Acylrest einen aliphatischen Rest (z.B. als R, R', R" oder R (siehe oben) mit mindestens 7 C-Atomen enthält oder A für eine R CONH'-Gruppe steht und der Rest R mindestens 7 C-Atomen enthält. Diese Verbindungen (weiterhin als Polypeptide des Typus T bezeichnet), zeigen subkutan verabreicht eine länger anhaltende Aktivität. Bevorzugte Polypeptide des Typus T sind solche, welche einen Alkanoylrest mit 8 bis 16 C-Atomen, besonders mit 8 bis 11 C-Atomen, enthalten.

Besonders bevorzugt sind "Polypeptide des Typus T", worin die übrigen Reste in der Formel I die oben unter 6. bis 18. angegebenen Bedeutungen haben. Die erfindungsgemässen Polypeptide, z.B. der Formel I, können in freier, d.h. ungeschützter, oder in geschützter Form, wobei eine oder mehrere reaktive Gruppen oder Atome, z.B. N-terminale Aminogruppen, C-terminale Carboxylgruppen oder SH-Gruppen durch eine Schutzgruppe geschützt sind, vorliegen. Geeeignete Schutzgruppen, z.B. Amino-, Carboxy- oder S-Schutzgruppen, sind solche, die in der Peptidchemie bekannt oder üblich sind, z.B. die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Schutzgruppen. Im allaemeinen sind die geschützten Formen besonders als Zwischenprodukte nützlich, z.B. zur Gewinnung der erfindungsgemässen ungeschützten Polypeptide. Falls jedoch die geschützten Formen selber pharmazeutisch aktiv sind, d.h. nützlich sind als Arzneimittel wie nachher beschrieben, und bei den gewünschten Dosen physiologisch verträglich sind, z.B. wenn die vorhandenen Schutzgruppen unter physiologischen Bedingungen abspaltbar sind, wobei die erfindungsgemässen freien Peptide entstehen, z.B. Verbindungen der Formel I in freier Form, und wobei die weiter entstandenen Spaltprodukte bei den verwendeten Dosen selber physiologisch verträglich sind, können diese geschützten Formen selber als Arzneimittel nützlich sein, z.B. als "pro-drugs". Diese geschützten Formen werden weiter als "pharmazeutisch anwendbar" bezeichnet.

- 16 - 100-5873

Die erfindungsgemässen Polypeptide in freier oder geschlitzter Form können auch als Salze oder Komplexe vorliegen.

Als Säureadditionssalze kommen solche mit organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren in Frage, Als Beispiele für Säureadditionssalze seien die Hydrochloride und Acetate genannt. Unter Komplexen sind solche an sich bekannte Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz anorganischer Substanzen, wie Salze oder Hydroxide (z.B. Ca-, Zn-Salze) und/oder beim Zusatz polymerer organischer Stoffe entstehen.

Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Polypeptide in freier oder geschlitzter Form, sowie deren Salze und Komplexe. Sie können nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, z.B. wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Beispielsweise können die erfindungsgemässen Verbindungen, besonders die Verbindungen der obigen Formel I, in freier oder geschützter Form, sowie deren Salze und Komplexe hergestellt werden, indem man

a) mindestens eine Schutzgruppe, die in einem geschützten geradkettigen oder monocyclischen Polypeptid wie oben definiert, z.B. in einem geschützten Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Sequenz vorhanden ist, entfernt oder

b) zwei Peptideinheiten, von denen jede mindestens eine Aminosäure oder einen Aminoalkohol in geschützter oder ungeschützter Form enthält und eine Peptideinheit den Phenylalkylrest enthält, durch eine Amidbindung miteinander verknüpft, wobei die Peptidbindung in der Weise erfolgen soll, dass die oben für die erfindungsgemässen geradkettigen oder monocyclischen Polypeptide definierte Aminosäuresequenz, z.B. die in der Formel I enthaltene Aminosäuresequenz hergestellt wird und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder

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c) eine C-terminale funktioneile Gruppe eines wie oben definierten geradkettigen oder monocyclischen Polypeptide, z.B. die Gruppe F eines Polypeptides der Formel I, in freier oder geschlitzter Form in eine andere C-terminale funktioneile Gruppe, z.B. eine andere Gruppe F, überführt und gegebenenfalls anschliessend die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder

d) ein wie oben definiertes geradkettiges Polypeptid, z.B. ein Polypeptid der Formel I, worin Y und Y. beide Wasserstoff sind, in freier oder geschützter Form oxidiert zur Gewinnung eines monocyclischen Polypeptids, wie oben definiert, z.B. eines PoIypeptids der Formel I, worin Y und Y zusammen für eine direkte Bindung stehen, in freier oder geschützter Form und gegebenenfalls anschliessend die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird,

und die so erhaltenen freien oder geschützten Polypeptide als solche oder als Salz oder Komplex gewinnt.

Insofern die Herstellung der Äusgangsprodukte nicht besonders beschrieben wird, sind die Verbindungen bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt und gereinigt werden.

In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in

20
Celsiusgraden. Die [α] -Werte sind unkorrigiert.

- 18 - 100-5873

Es werden folgende Abkürzungen verwendet;

AcOH	= Essigsaure
BOC	= tert. Butyloxycarbonyl
BTFA	= Bor-tris-trifluoracetat
DMF	= N,N-Dimethylformamid
MBzI	= p-Methoxybenzyl
MeOH	= Methanol
NEt₃	= Triäthylamin
ONP	= 4-Nitrophenoxy
TFA	= Trifluoressigsäure
Thr-ol	= ThreoninolrestCH -CH(OH)-CH^
Z	= Benzyloxycarbonyl
Zp	= Zersetzungspunkt

OH

- 19 - 100τ5873

I Γ

Beispiel 1: Benzyl-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-öl

0,95 g Benzyl-(D)Phe-Cys(MBzI)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzI)-Thr-ol und 3,5 ml Thioanisol werden in 5 ml TFA bei 0° gelöst. Man kühlt auf -10°, gib 15 ml/v2m BTFA in TFA zu und rührt 1 1/2 Stunden bei -5⁰C. Anschliessend versetzt man unter Rühren mit 50 ml kaltem (-6O⁰C) abs. MeOH. Man verrührt mit einer Mischung von 12 mln/5n HCl/Aether in 3 It Aether. Ausgefallenes Produkt wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und anschliessend sofort in einem Gemisch von 3,5 It Dioxan/H O (7:3) gelöst. Man gibt 1 η NH OH zu bis zu einem pH von 7,5-8,0. Man rührt im offenen Gefäss bei Raumtemperatur bis zur negativen Probe auf - SH Gruppen (z.B. Ellmann-Test). Man gibt verd. HCl zu bis zum ph,-\/4, engt im Vakuum ein und hyophilisiert. Das Lyophilisat wird gereinigt durch Chromatographie an Kieselgel in einem Gemisch von Chloroform/ Methanol/Eisessig/H O. Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt, im Vakuum unter Zugabe von HO eingeengt, dann lyophilisiert. Man erhält die Titelverbindung.

20
[α] = - 31° (c = 0,50 in 95% AcOH)

Das Ausgangsprodukt kann wie folgt hergestellt werden:

a) BOC-Cys(MBzI)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzI)-Thr-ol

3,6 g H-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzI)-Thr-ol, Hydrochlorid (hergestellt wie in der DOS 3.207.311, Beispiel Ia-Ij beschrieben), j._n 40 ml DMF wird mit 0,44 ml NEt , dann 1,6 g BOC-Cys(MBzI)-ONP versetzt und ca. 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Man engt im Vakuum ein, verdünnt mit MeOH und gibt wenig H 0 zu bis Produkt ausfällt. Man filtriert, wäscht mit MeOH, trocknet und erhält die Titelverbindung.

[α] = -15,5° (c = 1.0 DMF); Smp. 175°

- 20 - 100.-5873

b) H-Cys(MBzI)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzI)-cThr^ol, Hydrochlorid 3,5 g BOC-Cys(MBzI)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr^Cys(MBzI)-Thr-ol werden

einem Gemisch von 25 ml TFA-H O (9:1) bei 0° gelöst und

45 Minuten bei 0° gerührt. Anschliessend verrührt man in einem Gemisch von 500 ml Aether und 5ml^5N HCl in Aether. Ausgefallenes Peptid wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung,
[α] = -16° (c = 1,0 in 95% AcOH) ; Zp. 120°

c) Benzyl-(D|Phe-NH-NH-BOC, Hydrochlorid

1 g H-(D)Phe-NH-NH-BOC in 50 ml MeOH wird versetzt mit 0,36 ml Benzaldehyd und 4 g Molekularsieb 3 £ und dann ca. 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend gibt man unter N in Portionen innert 20 Stunden total 650 mg NaCNBH zu, wobei jeweils durch Zugabe von HCl in Aether der pH aufλ/6 gehalten wird (Kontrolle auf feuchtem pH-Papier). Man filtriert, wäscht mit MeOH und engt das FiItrat im Vakuum ein. Man verdünnt mit Aether, wäscht mit H O und trocknet die Aether-Phase über Na SO . Die Aether-Phase wird mit 0,8 ml HCl/Aether (5n) versetzt. Ausgefallenes Produkt wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung .

20

= - 30,5° (c = 1.0 DMF) ; Zp. = 180°

d) Benzyl-(D)Phe-NH-NH , Hydrochlorid

0,50 g Benzyl-(D)Phe-NH-NH-BOC, Hydrochlorid werden in 5 ml TFA gelöst, bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen, dann mit -ν 100 ml Aether und 1 ml *y5n HCl/Aether verrührt. Ausgefallenes Produkt wird abfiltriert, mit Aether gewaschen und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

[α] = -31° (c = 1.0 in DMF) ; Zp ab 130°

- 21 - 100-5873

e) Benzyl-(D)Phe-Cys(MBzI)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzI)-Thr-ol

0,35 g Benzyl-(D)Phe-NH-NH₂, Hydrochlorid in 20 ml DMF werden auf -20⁰C gekühlt und unter Rühren versetzt mit 0,8 ml ca. 5n HCl in Aether,dam total 1,3 ml tert. Butylnitrit. Man rührt 10 Minuten bei-15°/ kühlt auf ca. -25° und versetzt mit 0,58 ml NEt₃, dann mit einer kalten (-10°) Lösung von 0,86 g H-Cys(MBzI)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzI)-Thr-ol, Hydrochlorid und 0,12 ml NEt₃ in 10 ml DMF. Man rührt 20 Stunden bei -10°, dan /1/I6 Stunden bei -5° -? O⁰C.

Der pH wird dabei mit NEt₃ auf 8,5-9 gehalten (Kontrolle auf feuchtem pH-Papier). Man engt im Vakuum ein, verdünnt das Reaktionsgemisch mit MeOH und fällt das Produkt durch Zugabe von H O. Ausgefallenes Produkt wird abfiltriert, mit einem Gemisch von MeOH/H O (1:1) gewaschen, dann getrocknet. Man erhält die

Titelverbindung.

[α]²⁰ = - 17,3 ° (c = 1,0 DMF)? Smp. = 173°.

Auf analoge Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden aus den entsprechenden Ausgangsverbindungen folgende Polypeptide hergestellt:

H

Beispiel 2: (Xj Ve- (D) Phe-Cys-Tyr- (D) Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, Acetat [α]²⁰ = -22,7° (c = 0,48 in 95% AcOH)

,Z₁/ , ,

Beispiel 3: CH (CH) CON CH-CO-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol,

3 2 8

3 2'8
Acetat

20
[α] = + 6,2° (c= 0,5 in 95% AcOH)

- 22 - 100-5873

Beispiel 4; CH- (CH₂) -NHCo/QVcH - (D) Phe-Cys-Tyr- (D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol, Acetat

20
[α] = -21° (c = 1,0 in 95% AcOH)

Beispiele 5-8:

Analog zu den Beispielen 1 bis 4, jedoch unter Weglassung der abschliessenden Oxidationsstufe, werden die den oben erwähnten monocyclischen Polypeptiden entsprechenden geradkettigen Polypeptide (d.h. worin die Cys-Reste nicht miteinander verbunden sind) als Verbindungen 5 bis 8 erhalten.

Die erfindungsgemässen Polypeptide, ζ.B, die Polypeptide der Formel I, in freier oder pharmazeutisch anwendbarer geschützter Form, sowie ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze und Komplexe, weisen im Tierversuch wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf. Insbesondere bewirken sie eine Hemmung der GH-Sekretion _r die z.B. durch die Herabsetzung des GH-Gehalts im Serum der Ratte nachgewiesen werden kann.

Diese Hemmung der GH-Sekretion kann an Ratten unter Nembutal-Narkose bestimmt werden. Bei diesen Ratten wird eine Stunde nach Verabreichung des Peptides in mehreren logarithmisch gestaffelten Dosen an je mindestens 4 Tieren nach Dekapitation Blut entnommen. Die Bestimmung des GH-Spiegels in Serum erfolgt mittels Radio-immuno-assay. Bei diesen Versuchen sind die erfindungsgemässen Polypeptide aktiv in Dosen von 0,01 bis 50 /jg/kg. s.c.

" ²³ ~ lQCh:5873

Der oben genannte Test kann abgeändert werden, um die Wirkung über längere Zeitspannen, z.B. bei Dekapitation 6 oder 18 Stunden nach Verabreichung der Testsubstanz, zu bestimmen. "Polypeptide des Typus T", wie vorher definiert, zeigen im oben erwähnten Test bei Verabreichung im gleichen Dosisbereich wie oben angegeben/ auch nach längerer Zeit, z.B. bis zu 18 Stunden, eine Aktivität. Die erfindungsgemässen Polypeptide (in freien oder geschützten Formen), ihre Salze und Komplexe sind daher wertvoll bei der Brehandlung von Erkrankungen hervorgerufen durch oder zusammenhängend mit überhöhter GH-Sekretion, z.B. bei der Behandlung von Diabetes mellitus, Angiopathie und Acromegalie.

Die erfindungsgemässen Polypeptidderivate in freier oder geschützter Form, sowie ihre Salze und Komplexe hemmen auch die Magen- und Pankreas-sekretion. Diese Hemmung kann in Tierversuchen z.B. mit den Methoden beschrieben in Triangle 16_ (2), 105 (1977) durch W. Doepfner und U. Briner bzw. in Scand. J. Gastroint6_, 423 (1971) durch S.J. Konturek et al., ebenfalls in Dosen von 0,01 bis 50 ;ug/kg, nachgewiesen werden.

Die erfindungsgemässen Verbindungen CLn freier oder geschützter Form), ihre Salze und Komplexe können daher auch bei gastro-intestinalen Erkrankungen wie Ulcera, gastrointestinalen Blutungen und akuter Pankreatitis Verwendung finden.

Für die obigen Anwendungen ist eine Tagesdosis von ca. 2,0/Ug bis ca. 10 mg Polypeptid geeignet. Diese Dosis kann in 2 bis 4 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden. So enthalten die Teildosen etwa 0,5/ug bis 5 mg der erfindungsgemässen Polypeptide in freier Form oder eine äquivalente Menge einer pharmazeutisch anwendbaren geschützten Form oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Komplexes einer solchen Verbindung neben festen oder flüssigen Trägersubstanzen.

" ²⁴ ~ 10CK5873

Die Erfindung betrifft auch

a) die erfindungsgemässen Polypeptide, ζ.B, der Formel I (in freier oder pharmazeutisch anwendbarer geschützter Form) oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze oder Komplexe zur Verwendung als Arzneimittel (z.B. zur Verwendung als GH^Hemmer bei der Behandlung von Erkrankungen hervorgerufen durch oder zusammenhängend mit überhöhter GH-Sekretion, wie Diabetes mellitus, Angiopathie und Acromegalie oder zur Verwendung als Magen- oder Pankreassekretionshemmer bei der Behandlung von gastrointestinalen Erkrankungen wie Ulcera, gastrointestinale Blutungen und akuter Pankreatitis.

b) Pharmazeutische Präparate enthaltend ein erfindungsgemässes PoIypeptid, z-.B. der Formel I (in freier oder pharmazeutisch anwendbarer geschützter Form) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Komplex einer solchen Verbindung, zusammen mit einer pharmazeutisch verträglichen, flüssigen oder festen Trägersubstanz.

Claims

SANDOZ-PATENT-GMBH

Lörrach 100-5873

Patentansprüche

\ 1-) Geradkettige oder monocyclische Polypeptide enthaltend einen Heptapeptidteil, worin sich in Stellung 1 (N-terminal) ein a-N-phenylalkylierter, gegebenenfalls im Ring substituierter Phenylalaninrest, in Stellung 2 ein C.y.steinrest, in Stellung 3 ein gegebenenfalls im Ring substituierter Phenylalaninrest, in Stellung ein gegebenenfalls im Benzolring substituierter Tryptophanrest, in Stellung 5 ein gegebenenfalls £-N-alkylierter Lysinrest und in Stellung 7 (C-terminal) ein Cystein- oder Cysteinol-rest befindet, wobei die S-Atome des Cysteinrestes in Stellung 2 und des Cystein- oder Cysteinolrestes in Stellung 7 im Falle des monocyclischen Polypeptides durch eine Bindung miteinander verbunden sind unter Bildung einer S-S-Brücke und wobei die Reste in den Stellungen 1,2, 4, 6 und 7 des Heptapeptidteiles in der (L)- oder (D)-Konfiguration vorliegen können und jeder der Reste in den Stellungen 4, 5 und 6 des Heptapeptidteiles gegebenenfalls a-N-alkyliert sein kann und die erfindungsgemässen Polypeptide in freier oder geschützter Form vorliegen? sowie die Salze und Komplexe dieser Polypeptide,

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2. Polypeptide geraäss Anspruch 1 der Formel I in freier oder geschützter Form

A Z CH SY Y SCH.

Il . I * ^X * I '

C H -N-CH-CO-NH-CH-CO-B-C-D-E-NH-CH-F A ^-j-' ^XX1 2 3456

^A3
worin A für Wasserstoff, Alkyl mit 1-3 C-Atomen oder den Acylrest einer organischen oder anorganischen Säure

A^ für Wasserstoff, Alkyl mit 1-3 C-Atomen, Alkoxy mit 1-3

C-Atomen, OH, Halogen, NO , eine veresterte oder amidiert· Carboxylgruppe oder eine Amidgruppe

A- für Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen, OH oder NO

A " für Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen

χ für 1 bis 4

^N-CH(Z)-CO für einen gegebenenfalls durch Halogen, NO , NH-, OH, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen und/oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen substituierten (L)- oder (D)Phenylalaninrest B für Phe oder im Phenylrest durch Halogen, NO, NH , OH, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen substituiertes Phe

C für gegebenenfalls im Benzolring durch Halogen, N0_?, NH-, OH, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 C-Atomen substituiertes L- oder D-Trρ, wobei die a-Aminogrupp· durch Methyl substituiert sein kann

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D für Lys, wobei die a-Aminogruppe durch Methyl und/oder die S-Aminogruppe durch Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen substituiert sein kann

E für den Rest einer natürlichen (L)-α-Aminosäure oder einer entsprechenden (D)-Aminosäure, wobei die a-Aminogruppe eine Methylgruppe tragen kann

F für COOR , CH OR , CO-NRR oder -CO-N

R für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen

R_ für Wasserstoff oder den Rest eines physiologisch akzeptablen, physiologisch hydrolysierbaren Esters

R für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen, jedoch falls

R. für" -CH(R₁.)-X steht, nur für Wasserstoff oder 4 5

Methyl
R für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen oder

-CH-X _ιτ

für den am a-c-Atom befindlichen Rest einer natürlichen α-Aminosäure (inklusive Wasserstoff) oder für einen HO-CH₂-CH₂- oder HOi-CH₃)₃-Rest, wobei die Gruppe II die (L)- oder (D)-Konfiguration haben kann

für COOR₁, CH₂OR₃ oder C0N-^R6

R₆ für Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen

R₇ für Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 C-Atomen, Phenyl oder Phenylalkyl mit 7 bis 10 C-Atomen

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und Y und Y_ beide für Wasserstoff oder zusammen für eine Bindung stehen, wobei die Reste in den Stellungen 2 und 7 in (D)- oder (L)-Form vorliegen können, mit der Massgabe, dass (D)- und/oder (L)-Cysteinreste nur in den Stellungen 2 und 7 vorliegen
sowie die Salze und Komplexe dieser Polypeptidderivate.
3. Polypeptide der Formel I, wie in Anspruch 2 definiert, in freier Form oder ein Säureadditionssalz oder Komplex davon.
4. Ein Polypeptid gemäss Anspruch 2 der Formel

1 I

Benzyl-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

in freier oder geschützter Form oder ein Salz oder Komplex davon.
5. Polypeptide gemäss Anspruch 2 der Formel

5\^-(D)Phe-c_ys-Tyr-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

j I

CH (CH ).CON CH-CO-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

3 2 8

(D)

τ. 5 - 100-5873

CH -(CH ) -mco^Qy-CE -

3 2' 9

Thr-ol

in freier oder geschlitzter Form oder ein Salz oder Komplex davon.
6. Polypeptide gemäss Ansprüchen 1 bis 5 in pharmazeutisch anwendbarer geschlitzter Form.
7. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide definiert in Ansprüchen und 2 in freier oder geschützter Form oder von Salzen oder Komplexen dieser Polypeptide, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) mindestens eine Schutzgruppe, die in einem geschützten geradkettigen oder monocyclischen Polypeptid wie in Anspruch 1 definiert, oder in einem geschützten Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Sequenz, wie in Anspruch 2 definiert, vorhanden ist, entfernt zur Herstellung der entsprechenden Polypeptide in freier Form oder

b) zwei Peptideinheiten, von denen jede mindestens eine Aminosäure oder einen Aminoalkohol in geschützter oder ungeschützter Form enthält und eine Peptideinheit den Phenylalkylrest enthält, durch eine Amidbindung miteinander verknüpft, wobei die Peptidbindung in der Weise erfolgen soll, dass die im Anspruch 1 für die geradkettigen oder monocyclischen Polypeptide definierte Aminosäuresequenz, oder die in der Formel I des Anspruches 2 enthaltene Aminosäuresequenz hergestellt wird und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder

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c) eine C-terminale funktionelle Gruppe eines wie im Anspruch 1 definierten geradkettigen oder monocyclischen Polypeptids, oder die Gruppe F eines Polypeptides der Formel I, wie im Anspruch 2 definiert, in freier oder geschlitzter Form in eine andere C-terminale funktionelle Gruppe, oder eine andere Gruppe F, überführt und gegebenenfalls anschliessend die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder

d) ein wie im Anspruch 1 definiertes geradkettiges Polypeptid, oder ein Polypeptid der Formel I, wie im Anspruch 2 definiert, worin Y und Y„ beide Wasserstoff sind, in freier oder geschützter Form oxidiert zur Gewinnung eines monocyclischen Polypeptids, wie im Anspruch 1 definiert, oder eines Polypeptids der Formel I, wie im Anspruch 2 definiert, worin Y und Y zusammen für eine direkte Bindung stehen, in freier oder geschützter Form und gegebenenfalls anschliessend die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird,

und die so erhaltenen freien oder geschützten Polypeptide als solche oder als Salz oder Komplex gewinnt.
8. Polypeptide gemässeinem der Ansprüche 1 bis 5 in freier oder pharmazeutisch anwendbarerer geschützter Form, oder ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze oder Komplexe zur Verwendung als Arzneimittel.
9. Polypeptide gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 in freier oder pharmazeutisch anwendbarer, geschützter Form, oder ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze oder Komplexe zur Verwendung als GH-Hemmer bei der Behandlung von Erkrankungen hervorgerufen durch oder zusammenhängend mit überhöhter GH^-Sekretion oder zur Verwendung als Magen- oder Pankreassekretionshemmer,

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10. Pharmazeutische Präparate enthaltend ein Polypeptid in freier oder pharmazeutisch anwendbarer, geschützter Form, oder ein pharma·' zeutisch annehmbares Salz oder Komplex davon, gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, zusammen mit einer pharmazeutisch annehmbaren flüssigen oder festen Trägersubstanz.