NL8302935A

NL8302935A - Nieuwe polypeptiden, werkwijzen voor hun bereiding, farmaceutische preparaten die deze polypeptiden bevatten en hun toepassing.

Info

Publication number: NL8302935A
Application number: NL8302935A
Authority: NL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1982-08-24
Filing date: 1983-08-22
Publication date: 1984-03-16
Also published as: DE3328952A1; US4496543A; IT8322612A0; FR2532308B1; GB2125799B; SE8304573D0; JPS5962557A; BE897546A; GB8322529D0; PH19787A; IT1169770B; SE8304573L; CH655505B; GB2125799A; ZA836276B; JPH0615558B2; IL69540A0; FR2532308A1; AU1833383A

Description

4T ^

JP

Nieuwe polypeptiden, werkwijzen voor hun bereiding, farmaceutische preparaten die deze polypeptiden bevatten en hun toepassing.

5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op nieuwe polypeptiden, werkwijzen voor hun bereiding, farmaceutische preparaten die deze polypeptiden bevatten en hun toepassing als farmaceutisch aktieve middelen.

De onderhavige uitvinding verschaft in het 10 bijzonder een polypeptide met rechte keten of een mono- cyclisch polypeptide dat een heptapeptidegedeelte bevat, welk deel op de 1-plaats (eindstandige N) een o£ -N-fenyl- r" gealkyleerde, desgewenst in de ring gesubstitueerde, fenyl-alaninerest, op de 2-plaats een cysteinerest, op de 3-plaats 15 een fenylalaninerest waarvan de ring desgewenst gesubsti tueerd is, op de 4-plaats een tryptofaanrest waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd is, op de 5-plaats een desgewenst ge £ -N-alkyleerde lysinerest en op de 7-plaats (eindstandige C) een cysteine- of cysteinolrest, 20 waarbij de zwavelatomen van de cysteinerest op de 2-plaats en de cysteine-of cysteinolrest op de 7-plaats in het geval van monocyclische polypeptiden onder vorming van een -S-S-brug met elkaar verbonden zijn, bevat, waarbij de resten op de 1-, 2-, 4-, 6- en 7-plaats van dit heptapeptide-25 gedeelte elk in de (L)- of (D)-configuratie kunnen voorkomen en de resten op de 4-, 5- en 6-plaatsen van dit heptapeptidegedeelte elk desgwenst ge -N-alkyleerd kunnen zijn, welk polypeptide zich in de vrije of beschermde vorm kan bevinden, evenals zouten en complexen daarvan.

30 Aanbevolen polypeptiden volgens de uitvinding zijn die met formule 1, waarin A een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of de acylrest van een organisch of anorganisch zuur, Aj een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen,^een alkoxygroep met 1-3 35 r-* ^ -¾ -T.

- -j -J W

V

ί * - 2 - koolstofat omen, een halogeenatoom, een hydroxyl- of nitro- groep, een veresterde of geamideerde carhoxylgroep of een amidegroep, A2 een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen, een 5 halogeenatoom, een hydroxyl- of nitrogroep, een waterstof atoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen of een halogeenatoom, Q een alkyleen-groep met 1-4 koolstofatomen, ^N-CH(Z)-CO- een (L)- of (D)-fenylalaninerest, waarvan de ring desgewenst gesubsti-10 tueerd is door een of een aantal suhstituenten gekozen uit de groep bestaande uit halogeen, N02> NH^, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en alkoxy met 1-3 koolstofatomen, B een fenylgroep, waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is door een of een aantal substituenten gekozen uit de groep 15 bestaande uit halogeen, nitro, NH^, hydroxyl, alkyl met 1-3 koolstofatomen en alkoxy met 1-3 koolstofatomen, C -Trp- of -(D)-Trp-, desgewenst ge ¢( -N-methyleerd en waarvan de henzeenring desgewenst gesubstitueerd is door een of een aantal substituenten gekozen uit de groep bestaande uit 20 halogeen, nitro, NH2, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D -Lys-, dat desgewenst ge-dL-N-methyleerd en desgewenst ge ξ -N-alkyleerd met 1-3 koolstofatomen is, E de rest van een natuurlijk oC -aminozuur of van een overeenkomstig (D)-aminozuur, welke rest 25 desgewenst gefcC -N-methyleerd is, F een groep met formule /*3 -COORj, -CH20R2, -CO-N. of R4 een groep met formule 2, waarin Rj een waterstofatoom of 30 een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, R2 een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch, aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseerhare ester, R„ een waterstofatoom,* een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een C^_jq fenyl-alkylgroep, R^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 35 koolstofatomen of, indien R^' een waterstofatoom of een methyl- c ; i h o 5 * i - 3 - groep is, eveneens een groep met formule -CH(R^)-X, R^ een waterstofatoom, of een -(CH^-OH “(CE^) 3"0H-groep, of de substituent die aan het ol -koolstofatoom van een natuurlijk ei», -aminozuur is gehecht en X een groep met 5 formule -COORj, -CH20R2 of -CON(Rg}R7, waarin R} en R2 de hiervoor aangegeven betekenissen hebben, R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen en R^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een C^_jq fenylalkylgroep, zijn, weergeven, 10 waarbij de -CH(R,_)-X groep de (D)- of (L)-configuratie heeft en Y en Y2 elk een waterstofatoom voorstellen, of waarin . Yj en Y2 tezamen een direkte binding vormen, waarbij de resten op de 2- en 7-plaats elk, onafhankelijk van elkaar, de (L)- of (D)-configuratie bezitten, onder de voorwaarde 15 dat de (L)- en/of (D)-cysteineresten slechts op de 2- en 7-plaats aanwezig zijn, welk polypeptide met formule 1 zich in vrije of beschermde vorm bevindt, evenals de zouten en complexen daarvan.

In deze beschrijving en conclusies wordt 20 met "halogeen" een fluor-, chloor- of broomatoom bedoeld.

Volgens de gebruikelijke praktijk bezitten de aminozuur-resten, aangeduid met een afkorting, bijvoorbeeld -Phe-, -Cys- enz, de (L)-configuratie, tenzij anders aangegeven.

Onder acyIresten, zoals A, vallen in het 25 bijzonder de acylresten van organische carbonzuren (waaronder bijvoorbeeld aminozuren en di- en oligopeptiden met een eindstandige carboxylgroep vallen), sulfonzuren, sulfaminezuren en carbonzuren en de derivaten daarvan. Geschikte acylresten zijn bijvoorbeeld de groepen: 30 1. R^CO-, waarin R een alifatische, cyclo- alifatische, aromatische of heterocyclische groep is, in het bijzonder een alkylgroep met 1-20 koolstofatomen, een alkenylgroep met 3-20 koolstofatomen, een alkinylgroep met 3-20 koolstofatomen, een fenylgroep, een naftylgroep 35 of een (fenylalkyl) groep, .»» -> » ·»

- «; O

" - * - 3 * > - 4 -

II . II

2. R SO^-» waarin R een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen, een fenylgroep of een C^jq (fenylalkyl)-groep is,

III . III

3. R 0-C0-, waarin R . een alkylgroep met 5 1-10 koolstof atomen of een (fenylalky^groep voor- stelt, en EW R® 4. N-CO, N-C- of 10 RVX Sh R1^ N-SO^- , waarin R^ een waterstofatoom, een alkyl- RV^^* 15 groep met 1-10 koolstofatomen, een fenylgroep of een C^_jq (fenylalky^groep en R^ een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen weergeven.

De alifatische groepen als R* kunnen al of 20 niet verzadigd en al of niet vertakt zijn. Eveneens kunnen de alkyl-, alkenyl- en alkinylgroepen, evenals de alkyl-

I V

gedeelten van de onder R - R genoemde fenylalkylgroepen

. .. IV

alle al of niet vertakt zijn. Alle onder R - R genoemde groepen kunnen desgewenst verdere substituenten bevatten.

I V

25 Geschikte onder R - R genoemde groepen zijn niet gesub stitueerd.

De fenylring van de fenylalkylgroep aan het civ -N-atoom van de rest op de 1-plaat» van het heptapeptide-gedeelte van de . polypeptiden volgens de uitvinding kan 30 gesubstitueerd zijn, zoals bijvoorbeeld het geval is bij polypeptiden met formule 1, waarin een of een aantal van de substituenten Aj, A^ en A^ een andere betekenis dan waterstof heeft (hebben), of ongesubstituerd is (zijn).

Verder kan het alkyleengedeelte van dergelijke fenylalkyl-35 groepen, bijvoorbeeld de Q-groepen in formule 1, al of niet «w S* 45 U i ί w v * t - 5 -

In de polypeptideamet formule 1 verdienen de volgende betekenissen of combinaties daarvan aanbeve ling: vertakt zijn.

5 5. A stelt een waterstofatoom, een alkyl-

I II

groep met 1-3 koolstofatomen of een R CO- of R SC^groep, zoals hiervoor onder 1. en 2. gedefinieerd,, voor. Het verdient vooral aanbeveling dat A een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een R^CO-groep IQ is, in het bijzonder een waterstofatoom of een R CO-groep.

5.1 Indien A een R^CO-groep voorstelt, is

X

R bij voorkeur een alkylgroep met 1-15 koolstofatomen, een fenylgroep of een (fenylalkyl) groep, in het bij zonder een alkylgroep met 1-15 koolstofatomen, vooral een 15 alkylgroep met 1-10 koolstofatomen, bijvoorbeeld de CQ^CCH^g-groep.

5.2 Indien A een R^SO -groep weergeeft, . II ^ is R bij voorkeur een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen of een fenylgroep die desgewenst door een alkylgroep met 20 1-3 koolstofatomen is gesubstitueerd, in het bijzonder een fenylgroep of een mono- of di-C, «alkyl-gesubstitueerde

II

fenylgroep. Het verdient vooral aanbeveling dat R een alkylgroep met 1-10 koolstofatomen is.

6. Aj is een waterstofatoom, een veresterde 25 of geamideerde carboxylgroep met respektievelijk formule

RgO-CO- of Rg-NH-CO-, waarin Rg een alkylgroep met 1-16 koolstofatomen of een amidegroep met formule Rg-CO-NH- is, waarin Rg een alkylgroep met 1-15 koolstofatomen voorstelt.

Het verdient vooral aanbeveling dat Aj een waterstofatoom 30 of een Rg-NH-C0-groep weergeeft, waarin Rg een alkylgroep met 1-16 koolstofatomen, in het bijzondeijeem alkylgroep met I—10 koolstofatomen, bijvoorbeeld een Cïï^(CH^)^-groep is. Het heeft vooral de voorkeur indien Aj een waterstofatoom is.

35 7. stelt een waterstofatoom voor.

y-sr —j»

♦ V

- 6 - 8. geeft een waterstofatoom weer.

9. Q is een methyleengroep.

10. ^N-CH(Z)-C0- stelt een (D)-fenylalanine-rest voor (waarin Z een benzylgroep is).

5 11. B geeft een -Phe- of -Tyr-groep weer.

12. C is een -(D)Trp-groep.

13. D is een -Lys- of -MeLys-groep, in het hij zonder een -Lys-groep.

14. E stelt de rest van een natuurlijk -amino- 10 zuur, in het bijzonder -Thr-, voor.

15. F is een groep met formule -CO-NCR^)5.^, in het bijzonder een groep met formule -CO-NCR^-CIKR^-X (in welk geval R^ een waterstofatoom of een methylgroep is). In het laatste geval heeft het -CH(R^)-X bij voorkeur 15 de (L)-configuratie.

15.1 R^ stelt bij voorkeur een waterstofatoom voor.

15.2 Als substituent die a.an*L -koolstofatoom van een natuurlijk aminozuur is gehecht (dat wil zeggen 20 met formule H^N-CH(R^)-C00H, stelt R^ bij voorkeur een -CH^OH, -CH(0H)-CH^, een isobutyl- of benzylgroep voor, of is R,. een -(C^^-01* of -(C^^OH-groep. Ze is in het bijzonder een -CH^OR of -CH(0H)-CH2"gr°eP· 15.3 X is bij voorkeur een groep met formule 25 -CO-N(Rg)Ry of -CE^-OR^, in het bijzonder met formule -CH^OR^, terwijl R2 bij voorkeur een waterstofatoom weergeeft of de hierna onder 16 vermelde betekenis heeft. Het verdient vooral aanbeveling dat R^ een waterstofatoom is.

16. Met de uitdrukking "een fysiologisch 30 aanvaardbare , fysiologisch hydrolyseerbare ester" zoals toegepast hij de definitie van de R2~resten, worden esters van zuren die onder fysiologische omstandigheden hydroly- seerhaar zijn, onder vorming van zuren die zelf weer fysio- ; logisch in de toegepaste doseringen getolereerd worden, 35 bedoeld. Als rest van een fysiologisch aanvaardbare, fysio- ** ^ . *>, fa* Ό w iv.

- 7 - logisch hydrolyseerbare ester is bij voorkeur ECO, een C^_j ^-alkylcarbonylgroep , een cg_j 2 fenylalkylcarbonyl-groep of een benzoylgroep.

17. Bij voorkeur bezitten de resten op de 5 2- en 7-plaats de (L)-configuratie en 18. Bij voorkeur vormen Yj en tezamen een direkte binding.

Een bijzonder belangrijke groep polypeptiden met formule 1 zijn die waarin A een acylrest voor stelt

I IX

10 waarin een alifatisch gedeelte (bijvoorbeeld als R , R ,

III IV

R of R van de onder de hiervoor gedefinieerde groepen 1-4) met tenminste 7 koolstof atomen is opgenomen of waarin Aj een onder 6. hiervoor gedefinieerde RgCONH-gnoep is, waarin Rg tenminste 7 koolstof atomen bevat, welke 15 verbindingen van dit type (hierna aangeduid als polypeptiden van het T-type) gekarakteriseerd zijn door een langere werkingsduur indien ze subcutaan worden toegediend. Aanbevolen polypeptiden van het T-type zijn die waarin A een

I I

R CO-groep voorstelt, waarin R een alkylgroep met 7-15 20 koolstofatomen, bij voorkeur met 7-10 koolstofatomen, is.

Vooral aanbevolen worden polypeptiden van het T-type waarin de overige resten in formule 1 de onder 6-18 hiervoor vermelde betekenissen hebben.

De polypeptiden volgens de uitvinding, bij-25 voorbeeld met formule 1, kunnen zowel in vrije, dat wil zeggen onbeschermde, als beschermde vorm, dat wil zeggen waarin een of een aantal reaktieve groepen of atomen, bijvoorbeeld N-eindstandige aminogroepen, C-eindstandige carboxylgroepen of -SH-groepen een beschermende groep 30 bevatten, voorkomen. Geschikte beschermende groepen, bij voorbeeld N-, carboxyl- en S-beschermende groepen, zijn elk van de bekende en gewoonlijk op het gebied van de peptidechemie toegepaste beschermende groepen, waaronder die welke in de hierna volgende voorbeelden werden toegepast. 35 In het algemeen zullen de beschermde vormen voornamelijk ^ -J ü ♦ - 8 - van nut zijn als tussenprodukten, bijvoorbeeld ter verkrijging van de onbeschermde peptiden volgens de uitvinding.

Zijn dergelijke beschermde vormen zelf echter eveneens farmaceutisch aktief, dat wil zeggen bruikbaar als genees-5 middel, zoals hierna is beschreven en worden ze in de gewenste doseringen fysiologisch getolereerd, zoals bijvoorbeeld het geval is als de aanwezige beschermende groepen onder fysiologische omstandigheden kunnen worden gesplitst onder vorrang v. de vrije peptiden volgens de uitvinding, bijvoorbeeld ver-10 bindigen met formule 1 in vrije vorm en indien het daarbij verkregen verdere splitsingsprodukt of produkten zelf in » de toegepaste doseringen fysiologisch tolereerbaar zijn, zullen dergelijke beschermde vormen zelf bruikbaar zijn als geneesmiddel, bijvoorbeeld als voor-geneesmiddel.

15 Dergelijke beschermde vormen worden hierna gedefinieerd als farmaceutisch toepasbare vormen.

Polypeptiden volgens de uitvinding, in vrije of beschermde vorm, kunnen eveneens als zouten of complexen voorkomen. Met bijvoorbeeld organische zuren, polymere 20 zuren en anorganische zuren kunnen zuuradditiezouten worden gevormd. Onder dergelijke zuuradditiezoutvormen vallen bijvoorbeeld de hydrochloriden en acetaten. Met complexen worden verbindingen van het bekende type, gevormd door toevoegen van anorganische materialen, bijvoorbeeld an-25 organische zouten of hydroxyden, zoals calcium- en zink- zouten, en/of door toevoegen van polymere organische materialen, bedoeld.

De polypeptiden volgens de uitvinding, in vrije of beschermde vorm, evenals hun zouten en complexen, 30 kunnen volgens methoden die bekend zijn uit de stand van de peptidechemie, worden verkregen, bijvoorbeeld op de wijze als beschreven is in de hierna volgende voorbeelden.

De onderhavige uitvinding verschaft dus eveneens een werkwijze voor het bereiden van een hiervoor 35 gedefinieerd polypeptide, in het bijzonder een polypeptide * 'J ·- V '.} ύ - 9 -

V

met de hiervoor gegeven formule 1, in vrije of beschermde vorm, of als een zout of complex daarvan, welke werkwijze omvat: a) het verwijderen van tenminste een bescher-5 mende groep van een beschermd , hiervoor gedefinieerd, polypeptide met rechte keten of monocyclisch polypeptide (bijvoorbeeld een hiervoor gedefinieerd beschermd polypeptide met formule I) onder vorming van het overeenkomstige polypeptide in vrije vorm, 10 b) het via een amidebinding met elkaar ver binden van twee peptideeenheden, waarvan elk tenminste een aminozuur- of aminoalkoholrest in vrije of beschermde vorm bevat, welke peptideeenheden zodanig zijn dat een polypeptide met rechte keten of een monocyclisch polypep-15 tide, zoals hiervoor gedefinieerd (bijvoorbeeld een hier voor gedefinieerd polypeptide met formule 1) in vrije of beschermde vorm wordt verkregen, en, indien nodig, werkwijzestap a) uit te voeren, c) het omzetten van een funktionele groep aan 20 het eindstandige koolstofatoom van een hiervoor gedefinieerd polypeptide met rechte keten of monocyclisch polypeptide (bijvoorbeeld de groep F van een hiervoor gedefinieerd polypeptide met formule 1) in vrije of beschermde vorm in een andere funktionele groep met een eindstandig koolstofatoom 25 (bijvoorbeeld een andere groep F) en, indien gewenst, werk wij zes tap a) uit te voeren, d) oxydatie van een hiervoor gedefinieerd polypeptide met rechte keten (bijvoorbeeld een hiervoor gedefinieerd polypeptide met formule 1, doch waarin Yj en 30 Y2 elk een waterstofatoom voorstellen) in vrije of beschermde vorm tot een hiervoor gedefinieerd monocyclisch polypeptide (bijvoorbeeld een hiervoor gedefinieerd polypeptide met formule J, waarin echter Yj en Y^ tezamen een direkte binding vormen) in vrije of beschermde vorm en, indien nodig, 35 werkwij zestap a) uit te voeren en' het winnen van het aldus '7* "* "» «4 , v o ΰ * -10- verkregen polypeptide in vrije of beschermde vorm, als zodanig of als een zout of complex daarvan.

Voorzover de uitgangsmaterialen bij de hiervoor beschreven werkwijze niet eerder in de stand der 5 techniek, zijn beschreven, kunnen deze volgens in de stand der techniek bekende methoden worden bereid en gezuiverd.

20

In de volgende voorbeelden zijn de Kit-waarden niet gecorrigeerd. De volgende afkortingen worden toegepast: 10 BOC = tert.-butoxycarbonyl BTFA = borium-tris-trifluoracetaat 15 DMF = N,N-dimethylformamide

MbzI = p-methoxybenzyl ONP = 4-nitrofenoxy 20 TFA trifluorazijnzuur NH- /

25 Thr.-ol = de threoninolrest CH^-GEUOIO-CH

^^Ν]Η20Η Z = benzyloxycarbonyl.

30

Voorbeeld I: ' *

Benzy1-(D)Phe-^ys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-o1 o e

Men loste 0,^5 g benzyl-(D)Phe-Cys(MBzl)-Phe- ^ .Λ BW i!"· *·" "*-* ila ->v *-J ^ -II- ♦ (D)Trp-Lys(Z)-TtLr-Cys(MBzl)-Thr-ol en 3,5 ml thioanisool bij 0° C op in 5 ml TFA. Daarna koelde men de oplossing af tot -10° C, voegde 15 ml ongeveer 2 molair BTFA in TFA toe en roerde het geheel 1,5 uur bij -5° C. Daarna voegde men 5 onder roeren 50 ml koude (-60° C) absolute methanol toe en roerde het gehele mengsel met een mengsel van 12 ml van een ongeveer 5 N oplossing van waterstofchloride in ethylether en 3 1 ethylether. Men filtreerde het neergeslagen produkt af, waste het met ethylether en loste het 10 omniddellijk op in een mengsel van 3,5 1 dioxan en water (7:3) .Men stelde de pH door toevoegen van I N ammonium-hydroxyde in op 7,5-8,0 en roerde het mengsel in een open vat bij kamertemperatuur totdat het negatief reageerde op een onderzoek op -SH-groepen (bijvoorbeeld de Ellman-proef).

15 De pH werd door toevoegen van verdund zoutzuur ingesteld op ongeveer 4,0 en het gehele mengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd en gelyofiliseerd. Het gelyofiliseerde produkt werd chromatografisch over silicagel met een mengsel van chloroform, methanol ,ijsazijn en water als elutiemiddel 20 gezuiverd. Frakties die de produktverbinding bevatten werden samengevoegd, onder verminderde druk en onder toevoegen van water geconcentreerd en gelyofiliseerd, waardoor men de 2Q q in de titel genoemde verbinding verkreeg: ar* (c s 0,50 in 95 % azijnzuur).

25

Het uitgangsmateriaal kan als volgt worden bereid: a) BQC-Cys(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol 30

Men voegde 0,44 ml triethylamine en 1,6 g BQC-Cys(MBzl)-ONP toe aan 3,6 g H-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr- yerkregeyv

Cys(MBzl)-Thr-ol, HC1 (6p een "wijze analoog aan de voorbeelden la-lj van het Britse octrooischrift 2.095.26IA ieen 35 Nieuw Zeelandse octrooiaanvrage 199911, die op 4 maart 1982 * '*»·>·* ·π> : . :s - "-· - o ** -12- werd ingediend) en het gehele mengsel werd 15 uren geroerd bij kamertemperatuur. Het produkt werd onder verminderde druk geconcentreerd, verdund met methanol en een weinig water werd toegevoegd teneinde het neerslaan tot stand te 5 brengen. Het neerslag werd afgefilteerd, gewassen met metha nol en gedroogd, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: CU - '15,5° (c * 1,0 in DMF); smeltpunt = 175° C.

10 b) H-Cys(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl)-Thr-ol, HC1

Men loste 3,5 g van het produkt van stap a) bij 0° C op in 25 ml van een mengsel van TFA en water (9:1) en roerde gedurende 45 minuten eveneens bij 0° C. Het ver-15 kregen mengsel werd geroerd in een mengsel van 500 ml ethyl- ether en 5 ml van een ongeveer 5 N oplossing van waterstof-chloride in ethylether. Het neergeslagen peptide werd gewassen met ethylether en gedroogd, waardoor men de in de titel 20 o genoemde verbinding verkreeg: CoC 7·^ = -16U (c * 1,0 in 20 95 % azijnzuur); het produkt ontleedde bij 120° C.

c) Benzyl-(D)Phe-NH-NH-BOC, HC1

Men voegde 0,36 ml benzaldehyde en 4 g van 25 een 3 & molekulaire zeef toe aan 1 g H-(D)Phe-NH-NH-BOC

opgelost in 50 ml methanol en roerde het gehele mengsel ongeveer 15 uren bij kamertemperatuur. Daarna voegde men in totaal 650 mg NaCNBH^ in porties en in een stikstof-atmosfeer gedurende 20 uren toe, waarbij men door toevoegen 30 van een oplossing van waterstofchloride in ethylether de pH na elke toevoeging op ongeveer 6 hield. Het verkregen produkt werd afgefilteerd, het filtraat gewassen met methanol, geconcentreerd onder verminderde druk, verdund met ethylether, gewassen met water en de etherfase werd 35 gedroogd boven natriumsulfaat en toegevoegd aan 0,8 ml van Ö ’'T f'· η *7 £ w v y t) o 0 -13- een 5 N oplossing van waters tof chloride in ethylether. Het neergeslagen produkt werd afgefiltreerd, gewassen met ethylether en gedroogd, waardoor men de in.de titel genoemde verbinding verkreeg: £o( = -30,5° (c = 1,0 in IMF); 5 ontleding bij 180° C.

d) Benzyl-(D)Phe-NH-NH2, HC1

Men loste 0,50 g benzyl-(D)Phe-NH-NH-BOC, HC1 10 op in 5 ml TFA, liet deze oplossing 15 minuten staan bij kamertemperatuur en roerde haar vervolgens in een mengsel van ongeveer 100 ml ethylether en 1 ml van een ongeveer 5 N oplossing van waterstofchloride in ethylether. Het neergeslagen produkt werd afgefilteerd, gewassen met ethylether 15 en gedroogd, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: Crf. 7^ = -31° C (c = 1,0 in DMF); ontleding bij 130° C.

e) Benzyl-(D)Phe-Cy s(MBzl)-Phe-(D)Trp-Lys(Z)-Thr-Cys(MBzl·)- 20 Thr-ol

Men koelde 0,35 g benzyl-(D)Phe-NH-NH2, HC1 in 20 ml DMF af tot -20° C en voegde hieraan onder roeren 0,8 ml van een ongeveer 5 N oplossing van waterstofchloride 25 in ethylether gevolgd door 1,3 ml t.hutylnitriet toe. Daarna roerde men het mengsel 10 minuten bij -15° C, koelde af tot ongeveer -25° G en voegde 0,58 ml triethylamine gevolgd door een koude (-10° C) oplossing van 0,86 g van het produkt van stap b) en 0,12 ml triethylamine in 10 ml DMF toe. Daarna 30 roerde men het reaktiemengsel 20 uren bij -10° C en vervolgens ongeveer 16 uren bij een temperatuur tussen -5 en 0° C en hield de pH door toevoegen van triethylamine op een waarde tussen 8,5 en 9,0. Het produktmengsel werd onder verminderde druk geconcentreerd, verdund met methanol en het produkt 35 werd door toevoegen van water neergeslagen. Het neerslag $7- o ji 3 5 -14- werd afgefiltreerd, gewassen met een mengsel van gelijke delen methanol en water en gedroogd, waardoor men de in de titel genoemde verbinding verkreeg: CoUl° = -17,3° C (c = 1,0 in DMF); smeltpunt: 173° C.

5

De volgende verbindingen werden op analoge wijze verkregen: 10 De voorbeelden II-IV.

II: De verbinding met formule 3.

η a

CoLJ-q voor het acetaat = -22,7° (c = 0,48 15 in 95 % azijnzuur).

III: De verbinding met formule 4, 20

Cd 2D voor het acetaat = 6,2° (c = 0,5 in 20 95 % azijnzuur).

IV: De verbinding met formule 5.

20

Cd 2d voor het acetaat -21° (c * 1,0 in 25 95 % azijnzuur).

De voorbeelden V-VIII.

30 Analoog aan de voorbeelden I-IV, echter zonder de uiteindelijke oxydatiestap, werden de polypeptiden met rechte keten die elk overeenkomen met de genoemde, afzonderlijke monocyclische polypeptiden (dat wil zeggen waarin·(de -Cys-resten niet met elkaar verbonden zijn), bereid , als 35 de verbindingen 5-8.

C l J O o « -15-

De polypeptiden volgensr .de uitvinding, bijvoorbeeld met formule 1, in vrije of farmaceutisch toepasbare beschermde vorm, evenals de farmaceutisch aanvaardbare zouten en complexen daarvan, vertonen waardevolle 5 farmacologische eigenschappen, zoals uit proeven op dieren blijkt. Ze vertonen in het bijzonder een GH-sekretieremmende werking, zoals bijvoorbeeld blijkt uit een verlaging van serum GH-spiegels bij ratten.

Deze proef werd uitgevoerd onder toepassing 10 van mannetj esratten onder Nembutal-narcose. De te onderzoeken verbinding werd met variërende, logaritmisch verspringende doses, onder toepassing van tenminste 4 ratten per dosis, toegediend. Van de ratten werden 60 minuten na toediening van de betreffende verbinding de koppen afgesneden, het 15 bloed werd verzameld en de serum GH-spiegel werd door radio- immuno-assay bepaald.

De polypeptiden volgens de uitvinding zijn bij deze proef werkzaam indien ze in een dosis van 0,01-50 y,ug/mg s.c. werden toegediend.

20 De hiervoor beschreven proef kan worden aange past ter bepaling van de doeltreffendheid gedurende langdurige tijdsperioden, bijvoorbeeld door de koppen 6-18 uren na het toedienen af te snijden. De polypeptiden van het hiervoor gedefinieerde T-type blijken bij de hiervoor 25 beschreven onderzoekmethode aktief te zijn indien ze in doseringen binnen het hiervoor genoemde trajekt, gedurende langere tijdsperioden, bijvoorbeeld tot 18 uren, worden toegediend.

De genoemde polypeptiden (in vrije of bescherm-30 de vorm), alsmede de zouten en complexen daarvan zijn dien tengevolge bruikbaar voor het behandelen van ziekten of aandoeningen met een etiologie die omvat of gepaard gaat met een overmaat van GH-sekretie, bijvoorbeeld bij de behandeling van diabetes mellitus en angiopatie, evenals van 35 acromegalie.

~ -5 0 Λ . -16-

De genoemde polypeptiden (in vrije of beschermde vorm), alsmede de zouten en complexen daarvan remmen eveneens de sekretie van de maag. en de pancreas, zoals uit standaardproeven op dieren blijkt, bijvoorbeeld 5 volgens de méthode . beschreven door Doepfner en med., Triangle 16,2, 105 (1977) en door Konturek en med. Scand. J. Gastroent. 6, 423 (1971).

De polypeptiden volgens de uitvinding zijn bij deze proef werkzaam, indien ze in een dosering van 0,01-10 50 ^ug/kg worden toegediend.

De genoemde polypeptiden (in vrije of beschermde vorm), alsmede de zouten en complexen daarvan, zijn dus verder geïndiceerd voor toepassing bij het behandelen van maag-darmstoornissen, bijvoorbeeld voor het behandelen van 15 maagzweren, bloedingen in het maag-darmstelsel en acute pancreatitis.

Voor de hiervoor beschreven toepassingen zal een geïndiceerde dagelijkse dosis tussen ongeveer 2,0 ^ug tot ongeveer 10 mg polypeptide liggen, geschikt in gescheiden 20 doses 2-4 malen daags in een eenheidsdoseringsvorm of in een langzaam vrijkomende vorm toegediend. Geschikt eenheids-doseringsvormen bevatten ongeveer 0,5 ^ug tot ongeveer 5 mg van een polypeptide volgens de uitvinding, in vrije vorm of een equivalente hoeveelheid van een farmaceutisch toepas-25 bare, beschermde vorm of van een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex daarvan, desgewenst met een vast of vloeibaar, farmaceutisch verdunningsmiddel of drager daarvoor.

Volgens het voorgaande verschaft de uitvinding dus verder: 30 1) een polypeptide volgens, de uitvinding, bij voorbeeld met formule 1 (in vrije of in een farmaceutisch toepasbare, beschermde vorm) of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex daarvan, voor toepassing als geneesmiddel (bijvoorbeeld voor gebruik als een GH-sekretieremmer 35 bij het behandelen van ziekten of aandoeningen met een 85 C : 7 3 -17- ethiologie waaronder (een overmaat Gff-sekretie valt of daarmee gepaard gaat, zoals diabetes mellitus, angiopathie en acro-megalie, of voor toepassing als een remmer van de maag- of pancreassekretie bij het behandelen van maag-darmstoornissen, 5 zoals maagzweren, bloedingen in het maag-darmstelsel en acute pancreatitis), evenals 2) farmaceutische preparaten die een of een aantal polypeptiden volgens de uitvinding, bijvoorbeeld met formule 1, (in vrije vorm of in een farmaceutisch toepasbare, 10 beschermde vorm), en/of een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of complex daarvan, bevatten, desgewenst met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel en/of drager daarvoor.

15 v * ·* . ^ Lf

Claims

1. Monocyclisch-e polypeptiden of polypeptiden met een rechte keten die een heptapeptidedeel bevatten, welk gedeelte op de 1-plaats (einds-tandige N) een ge ai -N-fenylalkyleerde fenylalaninerest waarvan de ring desgewenst 5 gesubstitueerd is, op de 2-plaats een cysteinerest, op de 3-plaats een fenylalaninerest waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is, op de 4-plaats een tryptofaanrest waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd is, op de 5-plaats een desgewenst ge £ -N-alkyleerde lysinerest 10 en op de 7-plaats (eindstandige koolstof) een cysteine-of cysteinolrest bevat, waarbij de zwavelatomen van de cysteinerest op de 2-plaats en de cysteine-of cysteinolrest op de 7-plaats in het geval van de monocyclische polypeptiden onder vorming van een -S-S-brug met elkaar verbonden zijn, 15 waarbij de resten op de 1-, 2-, 4-, 6- en 7-plaats van dit beptapeptidegedeelte elk in de (L)- of (D)-configuratie aanwezig kunnen zijn en de resten op de 4-, 5- en 6-plaats van dit heptapeptidegedeelte elk desgewenst geo£ -N-alkyleerd kunnen zijn, welk polypeptide zich. in vrije of beschermde 20 vorm bevindt, of een zout of complex daarvan.

2. Polypeptiden volgens conclusie 1 met formule 1, waarin A een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of de acylrest.van een organisch of anorganisch zuur, Aj een waterstofatoom, een alkylgroep met 25 1-3 koolstofatomen, een alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen, een halogeenatoom, een hydroxylgroep, een nitrogroep, een veresterde of geamideerde carboxylgroep of een amidegroep, A2 sen waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen, een .halogeenatoom, 30 een hydroxyl- of nitrogroep, A^ een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een alkoxygroep met 1-3 koolstofatomen, Q een alkyleengroep met 1-4 koolstof- « T Λ --- « & 'S -J V, 'J sj r -19- u atomen, ^ N-CH(Z)-CO- een (L)- of (D)-fenylalaninerest waarvan de ring desgewenst door een of een aantal substi-tuenten gekozen uit de groep bestaande uit halogeen, nitro, hydroxyl, alkyl met 1-3 koolstofatomen en alkoxy met 5 1-3 koolstofatomen gesubstitueerd kan zijn, B een -Phe-groep, waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, nitro, NH^, hydroxyl, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, G -Trp- of -(D)Trp-, die desgewenst ge at -N-methyleerd is en waarvan de benzeen-10 ring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, nitro, NE2, hydroxyl, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D -Lys-, die desgewenst geC^ -N-methyleerd en desgewenst ge ^ -N-alkyleerd met 1-3 koolstofatomen is, E de rest van een natuurlijk oC-aminozuur 15 of van een overeenkomstig (D)-aminozuur, welke rest desge wenst ge eL -N-methyleerd is en F een groep met formule /R3 -COORj, -CH20R2, -CO-N^ of Xr4 20 een groep met formule 2 voorstellen, waarin Rj een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, R2 een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseerbare ester, R^ een waterstof-25 atoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylalkylgroep met 7-10 koolstofatomen, R^ een waterstofatoom , een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, of, indien R^ een waterstofatoom of een methylgroep is, eveneens een groep met formule -GÏÏ(R^)-X, R^ een waterstofatoom, 30 een -(CH2)2-0H of -(CH^^-OH-groep of de substituent die aan het -koolstofatoom van een natuurlijk öi. -aminozuur is gehecht en X een groep met formule -COORj, -CH20R2 of -C0N(Rg)R^, waarin Rj en R2 de hiervoor aangegeven betekenissen hebben, Rg een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 35 koolstofatomen is en R^ een waterstofatoom, een alkylgroep Λ Τ' -. -- ·· --· ra O v .*· w Λ. ** -20- met 1-3 koolstofatomen, een fenylgroep of een fenylgroep met 7-10 koolstofatomen is, voorstellen, waarbij de -CH(R^)-X-groep de (D)- of (L)-configuratie heeft en en elk een waterstofatoom voorstellen of tezamen een direkte 5 binding vormen, waarbij de resten op de 2- en 7-plaats, elk onafhankelijk van elkaar, de (I).- of (D)-configuratie bezitten, onder de voorwaarde dat (L)- en/of (D)-cysteine-resten slechts op de 2- en 7-plaats aanwezig zijn, welk polypeptide zich in de vrije of een beschermde vorm bevindt, 10 of een zout of complex daarvan.

3. Polypeptidmmet formule 1 zoals gedefinieerd in conclusie 3 in vrije vorm, of in de vorm van een zuurad-ditiezout of complex daarvan.

4. Polypeptiden volgens conclusie 2 met 15 formule 6, in vrije of beschermde vorm, of een zout of complex daarvan.

5. Polypeptiden volgens conclusie 2 met formule 3, 4 of 5, in vrije of beschermde vorm, of in de vorm van een zout of complex daarvan.

6. Polypeptiden volgens een der conclusies 1-5 in een farmaceutisch aanvaardbare., beschermde vorm.

7, Werkwijze voor het bereiden van een polypeptide, met het kenmerk, dat men een polypeptide als gedefinieerd in conclusie 1 of 2, in vrije of beschermde 25 vorm of in de vorm van een zout of complex daarvan, bereidt door a) tenminste een beschermende groep van een beschermd, monocyclisch polypeptide of polypeptide met rechte keten, zoals gedefinieerd in conclusie 1, of een beschermd 30 polypeptide met formule 1 zoals gedefinieerd in conclusie 2, te verwijderen, onder vorming van het overeenkomstige polypeptide in vrije vorm, b) twee peptideeenheden via een amidebinding met elkaar te verbinden, waarbij elke peptideeenheid ten- 35 minste een aminozuur- of aminoalkoholrest in vrije of bescherm- S* fl 9 f- 7t S u A n -21- de vorm bevat en de genoemde peptideeenhsden zodanig zijn gekozen dat een monocycliscb polypeptide of polypeptide met recbte keten, zoals gedefinieerd in conclusie 1, of een polypeptide met formule 1 zoals gedefinieerd in conclusie 2, 5 in vrije of beschermde vorm, wordt verkregen en desgewenst werkwijzestap a) uit te voeren, c) omzetting van een funktionele groep aan bet eindstandige koolstofatoom van een monocycliscb polypeptide of polypeptide met rechte keten, zoals gedefinieerd 10 in conclusie 1, of de F-groep van een polypeptide met formule 1 zoals gedefinieerd in conclusie 2, in vrije of beschermde vorm, in een andere funktionele groep aan het eindstandige koolstofatoom of een andere F-groep en desgewenst werkwijzestap a) uit te voeren, 15 d) oxydatie van een polypeptide met rechte keten zoals gedefinieerd in conclusie 1, of een polypeptide met formule 1 zoals gedefinieerd in conclusie 2, doch waarin Yj en elk waterstof voorstellen, in een vrije of beschermde vorm, tot een monocyclisch polypeptide zoals gede-20 finieerd in conclusie 1 of een polypeptide met formule 1 zoals gedefinieerd in conclusie 2, doch waarin Yj en tezamen een direkte binding vormen, in vrije of beschermde vorm, en desgewenst, werkwijzestap a) uit te voeren en het aldus verkregen polypeptide in vrije of beschermde vorm, 25 hetzij als zodanig, hetzij als een zout of complex daarvan, te winnen.

8. Polypeptiden volgens een der conclusies 1-4 in vrije, of in een farmaceutisch toepasbare, beschermde vorm, of een farmaceutisch aanvaardbaar, zout of complex 30 daarvan, voor toepassing als farmaceuticum.

9. Polypeptiden volgens een der conclusies 1-4 in vrije of farmaceutisch toepasbare, beschermde vorm, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex daarvan, voor toepassing als een GH-sekretieremmer.

10. Polypeptiden vólgens een der conclusies 1-4 £ r ' ,Λ - - ^ -v ·. -·} 3 u -22- rr in vrije of een farmaceutisch, toepasbare, beschermde vorm, of een farmaceutisch aanvaardbaar zout of complex daarvan, voor toepassing als remmer voor de maag- of pancreassekretie,

11. Farmaceutische preparaten die een of een 5 aantal polypeptiden als gedefinieerd in een der conclusies 1-4, in vrije en/of farmaceutisch toepasbare, beschermde vorm, en/of een farmaceutisch aanvaardbaar zout en/of complex daarvan, desgewenst tezamen met een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel en/of drager daarvoor, bevatten.

12. Werkwijzen als beschreven in de beschrij ving en/of voorbeelden. 15 ƒ P ” Λ η Λ «-> ··’ / ^ 'J « 0 0