LU84930A1

LU84930A1 - Antibiotique antitumoral

Info

Publication number: LU84930A1
Application number: LU84930A
Authority: LU
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1982-07-26
Filing date: 1983-07-26
Publication date: 1984-03-22
Also published as: DK339683D0; FI832676A; ZA835337B; KR840005484A; GB2124234B; CA1215337A; AU1720083A; PT77091B; DK339683A; IT8322219A0; CS251077B2; IL69313A0; OA07503A; HU192165B; SE8304132L; DE3326917A1; SE8304132D0; AU567105B2; FR2530663A1; JPH0526799B2

Description

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MÉMOIRE DESCRIPTIF

DÉPOSÉ A L’APPUI D'UNE DEMANDE

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BREVET D’INVENTION

FORMÉE PAR

BRISTOL-MYERS COMPANY, pour

Antibiotique antitumoral.

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La présente invention concerne un nouvel antibiotique antitumoral/ de même que sa production et son isolement.

L’antibiotique antitumoral faisant l'objet de l'invention, dit aussi BBM-1644, est une nouvelle CD.YD.MdC.8 - 1 - SY-1711 » substance appartenant aux antibiotiques antitumoraux protéiques dont des exemples sont la néocarzinostatine, la macromomycine et 1'auromomycine.

La néocarzinostatine (dite aussi zinostatine) est une macromolécule protéique acide d'un poids moléculaire de 10.700 consistant en une chaîne polypeptidique unique de 109 aminoacides unis par deux ponts disulfure. La production de la. néocarzinostatine par fermentation de différentes souches de Streptomyces carzinostaticus var. neocarzinostaticus est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.334.022 et dans Antibiotics 18: 68-76 (1965). La séquence des aminoacides dans la néocarzinostatine a été décrite dans Cancer Treatment Reviews _6, 239-249 (1979).

La macromomycine est un polypeptide neutre ou faiblement acide d'un poids moléculaire d'environ 15.000. La production de la macromomycine par fermentation de Streptomyces macromomyceticus est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.595.954 et dans Antibiotics 21: 44-49 (1968). La purification de la macromomycine et la caractérisation du composé purifié sont décrites dans Antibiotics 29 : 415-423 (1976).

L'auromomycine est un polypeptide faiblement acide ayant un poids moléculaire d'environ 12.500 et un point isoélectrique de pH 5,4. Elle consiste en 16 ami-noacides différents. L'isolement de 1'auromomycine du bouillon de culture de Streptomyces macromomyceticus et la caractérisation du produit purifié sont décrits dans Antibiotics 32: 330-339 (1979).

Le BBM-1644 peut être différencié des antibiotiques antitumoraux polypeptidiques connus tels que la néocarzinostatine, la macromomycine et 1'auromomycine par ses propriétés physico-chimiques, comme le poids moléculaire, la composition en acides aminés et l'élec- CD.YD.MdC.8 - 2 - SY-1711 * trophorèse sur papier.

La présente invention concerne un nouvel antibiotique antitumoral protéique appelé BBM-1644 qui est préparé par culture d'une nouvelle souche d'Acti-nomadura dite Actinomadura sp. souche H717-49 (ATCC 39144) dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote, en aéro- * biose en submersion jusqu’à production d'une quantité sensible de BBM-1644 par ce micro-organisme dans ce milieu de culture et éventuellement par isolement du BBM-1644 à partir du milieu de culture. L'invention concerne aussi l'antibiotique BBM-1644 en solution diluée, à l'état de concentré brut, à l'état de solide brut et à l'état de solide purifié.

• Dans les dessins :

Fig. 1 montre le spectre infrarouge du BBM-1644 (pastille de KBr), et

Fig. 2 montre les spectres d'absorption dans l'ultraviolet du BBM-1644 dans l'eau, le HCl 0,01 N et le NaOH 0,01 N.

L'invention a pour objet un nouvel antibiotique antitumoral protéique dit BBM-1644 et sa préparation par fermentation d'une nouvelle souche ; d * Actinomadura dite Actinomadura sp. souche H710-49.

L'organisme ci-dessus a été isolé d'un échantillon de - * terre recueilli en République Fédérale d’Allemagne. Une culture biologiquement pure de cet organisme a été * déposée à 1'American Type Culture Collection, Washington, D.C., (Etats-Unis d'Amérique) sous le n° ATCC 39144 dans sa collection permanente de microorganismes .

Le BBM-1644 inhibe la croissance de différentes bactéries gram-positives et résistantes aux acides. Cet antibiotique tend aussi à conférer certaines propriétés des phages aux bactéries lysogenes et CD.YD.MdC.8 - 3 - SY-1711 *· inhiber la croissance des tumeurs lymphatiques et solides telles que la leucémie P388 chez la souris. Le nouvel antibiotique peut donc être administré comme agent antibactérien ou comme agent antitumoral pour inhiber les tumeurs chez les mammifères.

La souche d’actinomycète H710-49 a été isolée d'un échantillon de terre et préparée suivant les techniques habituelles sous la forme d'une culture biologiquement pure en vue de sa caractérisation. La souche H710-49 forme du mycélium en substrat et du mycélium aérien. Le mycélium en substrat est long, ramifié et non fragmenté en filaments courts. De courtes chaînes de spores sont portées à l'extrémité ou ramification du mycélium aérien. Les chaînes de spores comptent 2 à 15 spores assemblées en une chaîne (le plus souvent 4 à 8 spores) et sont droites, anguleuses ou bouclées. lies spores présentent une surface verru-queuse et sont d'une forme ovale à elliptique (0, 5^ 0, 6x0, 7*V 1, 2 /um) avec une extrémité ronde ou pointue. Les spores à maturité sont souvent séparées par des hyphes vides. Des turgescences terminales des hyphes sont observées occasionnellement sur le mycélium en substrat dans la gélose de Czapek et la gélose de Bennett. Des spores mobiles, des sporanges ou des granules sclérotiques n'ont été observés sur aucun milieu.

Au contraire des espèces ordinaires appartenant au genre Streptomyces, la souche H710-49 croît lentement et forme un mycélium aérien peu abondant dans les milieux chimiquement définis et les milieux organiques naturels. La couleur du mycélium aérien est le blanc qui vire au rosé après sporulation dans la gélose à la farine d'avoine, la gélose à l'amidon avec sels inorganiques et la gélose à l'asparagine avec glycérol. Le mycélium en substrat est en masse incolore, jaune, CD.YD.MdC.8 - 4 - SY-1711 * brun rougeâtre ou brun grisâtre foncé. Il ne se forme pas de pigment mêlanoïde, mais un pigment diffusible jaune citrin est observable sur gélose à l'asparagine avec glycérol, sur gélose à la tyrosine et sur gélose de base de Pridham-Gottlieb additionnée de l'une ou * l'autre source de glycérol, de L-arabinose, de D-xylose, de L-rhamnose, de D-glucose, de D-fructose, de tréhalose et de D-mannitol. La souche H710-49 croît à 20°C, à 28°C et 37°C, mais non à 10°C ni à 41 °C. Elle est sensible au NaCl à 10%, mais non à 7% et résistante au lysozyme à 0,001%. Le D-galactose, le D-mannose, la saccharose, le raffinose et l’inositol ne sont pas utilisés par la souche. Les caractéristiques de culture et caractéristiques physiologiques de la souche H710-49 sont rassemblées aux tableaux I et II respectivement. La tableau III indique le profil d'utilisation des sources de carbone par la souche.

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TABLEAU III

Utilisation des sources de carbone par la souche H710-49

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Lactose

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Raffinose - D(+)-Mélézitose

Amidon soluble +

Cellulose

Dulcitol -

Inositol - D-Mannitol + D-Sorbitol Salicine 1 CD.YD.MdC.8 - 11 - SY-1711

Observation après 3 semaines d'incubation à 28°C. Milieu de base : milieu inorganique de Pridham-Gottlieb.

La paroi cellulaire purifiée de la souche H719-49 contient de l'acide mésodiaminopimélique mais pas de glycine. L'hydrolysat de cellule entière révèle la présence de madurose (3-0-méthyl-D-galactose), de glucose, de ribose et d'une petite quantité de mannose. La composition de la paroi cellulaire et les sucres , constitutifs de la cellule entière de la souche H710-49 montrent que cette dernière appartient au type de paroi cellulaire IIIB.

Les caractéristiques énumérées ci-dessus de la souche H710-49 ressemblent à celles du genre Actinoma-dura. Conformément à la taxonomie numérique d1Actino-madura et d'actinomycètes apparentés établie par Goodfellow et al. dans Jj^ Gen. Microbiol. 112; 95-111 (1979), la plupart des espèces d1Actinomadura existant dans le sol entrent dans le groupe 7 (Cluster 7) parmi les 14 qui sont décrits. La souche H710-49 est fort apparentée à l'espèce du groupe 7. Nonomura et Ohara dans Ferment. Technol. 49: 904-912 (1971) décrivent cinq espèces saprophytes du genre Actinomadura et Nonomura £~J. Ferment. Technol. 52: 71-77 (1974)_^ et

Preobrazhenskaya et al. ^ÇActinomycetes and related Organisms 12: 30-38 (1977)_^ décrivent l'identification ; et la classification des espèces Actinomadura. D'après la comparaison avec les espèces d1Actinomadura connues décrites dans la littérature, la souche H710-49 est considérée comme appartenant à une nouvelle espèce d'Actinomadura semblable à A^_ roseola, A. salmonea, A. vinacea ou A^_ corallina, dont la description est donnée par Preobrazhenskaya et al. ci-dessus et dans le document japonais Kokai 55/9491.

Il convient de noter que pour la production du BBM-1644, la présente invention, bien que décrite en détail avec référence à la souche particulière H710-49 d'Actinomadura sp. (ATCC 39144), n'est pas limitée à ce CD.YD.MdC.8 - 12 - SY-1711 micro-organisme ni aux micro-organismes décrits complètement par les caractéristiques de culture précisée dans le présent mémoire. Le cadre de 1'invention s'étend spécifiquement à la souche H710-49, de même qu'à ses variants et mutants naturels et artificiels produisant du BBM-1644.

L'antibiotique BBM-1644 conforme à l'invention « peut être préparé par culture d’une souche productrice de BBM-1644 appartenant au genre Actinomadura, de préférence une souche d1Actinomadura sp. ayant les caractéristiques d'identification de la souche ATCC 39144 ou d'un mutant de celle-ci, dans un milieu aqueux nutritif classique. L'organisme est mis en culture dans un milieu nutritif contenant des sources connues d'éléments nutritifs pour les actinomycètes, à savoir des sources assimilables de carbone et d'azote, outre des sels inorganiques éventuels et divers autres facteurs de croissance connus. La culture en aérobiose en submersion est préférée pour la production de grandes quantités de l'antibiotique, mais pour la production de quantités limitées, les cultures en surface et les cultures en flacon conviennent. Les techniques générales appliquées à la culture des autres actinomycètes sont applicables aux fins de la présente invention.

- Le milieu nutritif doit contenir une source de carbone assimilable appropriée, par exemple du glycé-rol, du L(+)-arabinose, du D-xylose, du D-ribose, D-glucose, du D-fructose, de l'amidon soluble, du D-mannitol ou du cellobiose. Comme source d'azote, le chlorure d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'urée, le nitrate d'ammonium, le nitrate de sodium, etc., conviennent, tant isolément que conjointement avec des sources d'azote organique comme la peptone, l'extrait de viande, l'extrait de levure, la liqueur de macéra- CD.YD.MdC.8 - 13 - SY-1711 tion de maïs, la farine de soya, la farine de graines de coton, etc. Le milieu peut être additionné aussi, si nécessaire, de sels inorganiques nutritifs constituant des sources de sodium, de potassium, de calcium, d'ammonium, de phosphate, de sulfate, de chlorure, de bromure, de carbonate, de zinc, de magnésium, de j manganèse, de cobalt, de fer, etc.

La production de l'antibiotique BBM-1644 peut être amenée à toute température assurant une croissance satisfaisante de l'organisme producteur, par exemple 20 à 37°C, et est avantageusement effectuée à une température d'environ 27 à 32 eC. D'ordinaire, la production est optimale après environ 6 à 7 jours d'incubation dans des flacons secoués. Pour une fermentation en cuve, il est intéressant de produire un inoculum végétatif dans du bouillon nutritif en inoculant le bouillon de culture avec une culture sur gélose ou sur terre ou avec une culture lyophilisée de l'organisme. Après avoir obtenu de la sorte un inoculum actif, on transfère celui-ci aseptiquement dans le milieu que contient la cuve de fermentation. La production de l'antibiotique peut être surveillée par dosage par diffusion sur gélose avec disque de papier en présence de Bacillus subtilis M45 £” mutant Rec~; Mutation Res. 16: 165-174 (1972)J comme organisme d'épreuve.

Au terme de la fermentation, le BBM-1644 se trouve principalement dans la fraction liquide du bouillon de fermentation, après que la fraction solide en a été séparée par filtration ou centrifugation. Le bouillon collecté peut donc être séparé par centrifugation en un gâteau de mycélium et en un bouillon surnageant. Le filtrat est ensuite concentré et dialysé contre de l’eau de distribution à l'aide d'une membrane semi-perméable, par exemple un tube de Cellophane, pour éliminer les impuretés perméables. La solution retenue CD.YD.MdC.8 - 14 - SY-1711 du côté intérieur (après élimination des insolubles) contenant le BBM-1644 peut être saturée ensuite d'un agent de relargage comme le sulfate d'ammonium qui fait précipiter le BBM-1644 sous la forme d'un solide brut.

Cè dernier peut être dissous dans de l'eau, puis “ dessalé par dialyse contre de l'eau de distribution.

La purification du BBM-1644 brut peut être poursuivie suivant les techniques habituelles pour les autres polypeptides acides. Par exemple, la solution aqueuse contenant le BBM-1644 peut être adsorbée sur un échangeur d'ions, comme le DEAE-Sephadex, la DEAE-

Cellulose, le CM-Sephadex ou la CM-Cellulose, puis en être éluée avec une solution saline neutre. Il est préférable d'effectuer des chromatographies successives avec un gradient de concentration de la solution saline servant d'êluant. Les fractions aqueuses contenant le BBM-1644 purifié sont ensuite concentrées à siccité, par exemple par lyophilisation.

Le BBM-1644 est isolé par lyophilisation sous la forme d'une poudre blanche amorphe. Examiné par

électrophorèse sur papier sous haute tension (4500 V

dans du tampon au barbital 0,05 M à pH 8,6), le BBM- 1644 migre comme un acide à la vitesse de 8,7 cm par heure vers l'anode. Le BBM-1644 n'a pas de point de fusion défini et se décompose graduellement au-delà de 240°C. Il est soluble dans l'eau, mais pratiquement insoluble dans les solvants organiques courants tels que le mêthanol, 1'éthanol, 1'acétone, 1'acétate d'éthyle et le n-hexane. L'antibiotique a une rotation

optique /o( 72® de -75,6° en solution aqueuse à 0,25%. D

Comme le montre la Fxg. 2, le spectre UV du BBM-1644 1% présente des maxima d'absorption à 275 nm (Eicm 8,2) et 1% 310 nm (E^cm 4,6, épaulement) en solution aqueuse. Il présente un spectre UV pratiquement identique en solution dans l'eau et dans le HCl 0,01 N, mais un seul CD.YD.MdC.8 - 15 - SY-1711 1% maximum à 285 nm (Eicm 8,9) en solution dans le NaOH 0,01 N. Le spectre IR du BBM-1644, relevé sur KBr, constitue la Fig. 1. Le spectre révèle la présence de radicaux NH et OH (3300^ 2980 cm“l) et de radicaux amide (1650 et 1540 cm”l). L'antibiotique donne des * réactions positives de Folin-Lowry, à la xantho- protéine, au biuret et à la ninhydrine et décolore la J solution de permanganate de potassium. Il est négatif à la réaction à l'antbrone et à la réaction de Sahaguchi. Lors de la cochromatographie sur Sephadex G-75 avec de l'ovalbumine (PM 43.000), du chymotrypsinogène (PM 25.000) et de la ribonucléase A (13.700), le BBM-1644 est élué juste après le chymotrypsinogène et son poids moléculaire est dès lors estimé à une valeur voisine de 22.000. L'analyse élémentaire du BBM-1644 révèle 46,60% de carbone, 6,45% d'hydrogène, 13,34% d'azote et 0,20% de soufre. Le dosage des aminoacides dans la molécule de BBM-1644 révèle la présence de treize variétés d'aminoacides indiqués au tableau IV. Le BBM-1644 ne contient pas d*aminoacides basiques tels que la lysine, l'histidine et l'arginine.

TABLEAU IV

Composition en aminoacides du BBM-1644

Aminoacide Composition relative ; des aminoacides *

Alanine 8,8 - Acide aspartique 6,0 Hémicystine 1,0

Acide glutamique 5, 7

Glycine 8,7

Isoleucine 2,3

Leucine 1,0

Phénylalanine 1,4

Proline 4,1 Sérine 1,6 CD.YD.MdC.8 - 16 - SY-1711

Thréonine 7,2

Tyrosine 0,6

Valine 11il * La teneur en leucine est arbitrairement choisie à 1,0.

«

Le BBM-1644 est relativement stable dans l'intervalle de pH d'environ 2 à 9, mais la stabilité diminue rapidement au-delà de cet intervalle. La solution aqueuse de BBM-1644 est stable pendant 2 heures à 50°C au pH de la neutralité. Par exposition à la lumière ultraviolette, l'activité antibiotique du BBM-1644 se perd dans les 20 minutes.

Les propriétés physico-chimiques du BBM-1644 énumérées ci-dessus indiquent qu'il appartient aux antibiotiques antitumoraux protéiques parmi lesquels on trouve la néocarzinostatine, la macromomycine et l'auromomycine. Toutefois, le BBM-1644 peut être différencié des antibiotiques antitumoraux protéiques connus par son poids moléculaire, sa teneur en amino-acides et son électrophorèse sur papier. Les mobilités électrophorétiques sur papier du BBM-1644, de la néocarzinostatine et de la macromomycine sont données » au tableau V.

TABLEAU V

Electrophorèse sur papier 1

Mobilité 2 BBM-1644 +87 Néocarzinostatine +31

Macromomycine -20 CD.YD.MdC.8 - 17 - SY-1711 4. 500 V, 1 heure, tampon au barbital de pH 8,6.

2

En mm depuis la tache initiale.

Les antibiotiques du groupe de la néocarzino-statine présentent habituellement deux maxima d'absorption dans l'UV à peu près à 275 et 350 nm, tandis que le BBM-1644 présente des maxima dans l'UV à environ 275 et 310 nm. Il a été récemment avancé dans Biochem. Res. Commun. 95: 1351-1356 (1980) que le maximum à 350 nm des néocarzinostatines antibiotiques pourrait être dû aux chromophores non protéiques qui sont essentiels pour leur activité biologique. Il convient de rappeler que le BBM-1644 comprend un chromophore qui est différent de celui des néocarzinostatines antibiotiques connues.

L'activité antibactérienne du BBM-1644 est mesurable par dilution en série de raison deux dans de la gélose. La gélose nutritive est utilisée pour les bactéries gram-positives et gram-négatives, la gélose nutritive additionnée de 4% de glycérol pour les bactéries résistantes aux acides et la gélose de Sabouraud pour les champignons. L'activité est exprimée par la concentration inhibitrice minimale (CIM) dans la gélose et les résultats sont présentés au tableau VI en comparaison de ceux de la néocarzinostatine. Le BBM-1644 manifeste une activité inhibitrice puissante

S

contre les bactéries gram-positives et résistantes aux acides, mais il inhibe pas la croissance des bactéries gram-négatives ou des champignons. Le spectre antibactérien du BBM-1644 est semblable à celui de la néocarzinostatine, mais l'activité intrinsèque du BBM-1644 l'emporte sur celle de la néocarzinostatine pour certains des micro-organismes d'épreuve.

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CD.YD.MdC.8 r 19 - SY-1711 L'aptitude du BBM-1644 à induire le caractère prophage chez une bactérie lysogene (ILB) est déterminable par la technique de Lein et al. (Nature 196; 783-784, 1962) au moyen de néocarzinostatine comme composé témoin. Le comptage des plaques est effectué sur de la *· gélose contenant le composé expérimental (E) et le ; composé témoin (T). Un rapport E/T des comptes de plaques supérieur à 3 est considéré comme significatif et 11 activité ILB est exprimée par la concentration inductrice minimale du composé expérimental. Comme il ressort du tableau VII, l'activité ILB du BBM-1644 est semblable à celle observée sur la néocarzinostatine dont la concentration inductrice minimale est de 1 microgramme par ml.

TABLEAU VII

Induction d'une bactérie lysogene par BBM-1644

Activité ILB E/T * 100 10 JL 0,1 /ug/ml BBM-1644 10,4 10,3 6,0 1,2 Néocarzinostatine 28,6 20,4 10,8 0,7 * Activité significative E/T >3,0.

L'activité antitumorale du BBM-1644 est déterminée chez la souris (souche BDFj) contre la leucémie lymphocytaire P388. On inocule par voie intrapéritonéale à chaque souris 3x105 cellules de la tumeur. On administre des doses échelonnées de l'antibiotique aux souris par voie intrapéritonéale 24 heures après l'implantation de la tumeur. On effectue les traitements une fois par jour aux jours 1, 4 et 7 (programme q3dx3) ou bien 9 jours consécutifs (programme qd 1-^·9). On administre la néocarzinostatine comme agent antitumoral témoin, les résultats étant CD.YD.MdC.8 - 20 - SY-1711

V

rassemblés au tableau VIII. Le BBM-1644 est hautement efficace contre la leucémie de la souris à des doses s'échelonnant d'environ 0,03 à environ 1,0 mg par kg et par jour suivant les deux programmes thérapeutiques. L'activité antitumorale du BBM-1644 est à peu près la ' même (programme qd 1—>9) ou 3 fois plus importante (programme q3dx3) que celle de la néocarzinostatine, à exprimer en dose efficace minimale.

TABLEAU VIII

Activité antitumorale contre la leucémie P388 E/T (%) en TSM *

Dose en mg/kg/jour, ip, q3dx3 1_ CL_3 CL_1 0,03 0,01 BBM-1644 188 188 138 125 113 Néocarzinostatine 163 150 125 113 E/T (%) en TSM *

Dose en mg/kg/jour, ip, qd 1-» 9 0,3 0,1 0,03 0,01 BBM-1644 125 175 138 113 Néocarzinostatine 163 138 125 113 * Temps de survie moyen; activité significative E/T ^125.

L’activité antitumorale du BBM-1644 est mise en évidence aussi par un second test contre la leucémie P388 chez la souris, dont les résultats sont rassemblés au tableau IX. Les détails relatifs aux techniques appliquées pour cette épreuve ont été décrits dans Cancer Chemother. Rep. 3i 1-87 (Part 3), 1972.

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La toxicité aiguë du BBM-1644 est déterminée chez la souris (souche dd Y) par administration intrapéritonéale unique, la DL50 calculée étant de 5,8 mg par kg.

Comme il ressort des indications données ci-dessus, le BBM-1644 manifeste une activité antibactérienne puissante contre les bactéries gram-positives et * résistantes aux acides et est donc utile pour le traitement des mammifères et autres animaux chez lesquels de telles bactéries ont provoqué des infections. De plus, il peut être administré utilement dans d'autres applications traditionnelles des agents antibactériens, comme la désinfection du matériel médical ou dentaire.

L'induction du caractère prophage dans les bactéries lysogènes et l'activité antitumorale marquée contre la leucémie P388 de la souris révèlent que le BBM-1644 est aussi thérapeutiquement utile pour inhiber la croissance des tumeurs chez les mammifères.

L'invention a donc pour objet un procédé de traitement thérapeutique d'un animal hôte atteint d'une infection bactérienne ou d'une tumeur maligne, suivant lequel on administre à cet animal hôte, en quantité efficace antibactérienne ou inhibitrice de tumeur, du « BBM-1644 ou une composition pharmaceutique en contenant.

Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique qui comprend, en quantité efficace antibactérienne ou inhibitrice de tumeur, du BBM-1644 conjointement avec un excipient ou diluant inerte pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions peuvent être présentées sous toute forme pharmaceutique se prêtant à l'administration par voie parentérale.

Les préparations conformes à 1'invention qui CD.YD.MdC.8 - 25 - SY-1711 sont destinées à l'administration par voie parentérale comprennent notamment des solutions, suspensions ou émulsions aqueuses ou non aqueuses stériles. Elles peuvent être présentées également sous la forme de compositions solides stériles à dissoudre dans de l'eau ou de la solution physiologique salée stérile ou un . autre milieu injectable stérile immédiatement avant 1'administration.

Il convient de noter que les quantités préférées en fait de l'antibiotique BBM-1644 varient avec la nature de la composition, le mode et le site d'administration, l'affection traitée et la nature de l'hôte. De nombreux facteurs qui modifient 1'effet du médicament doivent être pris en compte par le spécialiste, comme l'âge, le poids du corps, le sexe, l'alimentation, le moment de l'administration, la voie d'administration, la voie d'excrétion, l'état du patient, les combinaisons médicamenteuses, les réactions de sensibilité et la gravité de l'affection. L'administration peut être effectuée de manière continue ou périodique dans les limites de la dose maximale tolérée. Le programme thérapeutique optimal dans un ensemble déterminé de conditions peut être évalué par le spécia-i liste à l'aide des épreuves classiques de détermination des doses, compte tenu des indications données ci-1 dessus.

L'invention est illustrée sans être limitée par les exemples suivants. La DEAE-Cellulose est une diéthylaminoéthylcellulose échangeuse d'ions. Le SEPHADEX G-50 est un gel filtrant produit par la Société Pharmacia Fine Chemicals, Inc. Le DEAE SEPHADEX A-50 est un gel diéthylaminoéthylé échangeur d'anions fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals, Inc. SEPHADEX® est une marque déposée de la Société Pharmacia Fine Chemicals, Inc.

CD.YD.MdC.8 - 26 - SY-1711 EXEMPLE l.-

Préparation du BBM-1644 par fermentation.

On utilise une culture sur gélose inclinée portant une colonie bien établie d1Actinomadura sp. H710-49 pour inoculer un milieu d'ensemencement (100 ml * dans un erlenmeyer) contenant 1% de mannitol, 2% de peptone et 1% d'extrait de levure, le pH ayant été ajusté à 7,2 avant stérilisation. On met la culture d'ensemencement à incuber à 32°C pendant 72 heures sur une secoueuse rotative (250 tours par minute) et on transfère 5 ml de la culture dans le second milieu d'ensemencement (100 ml) ayant la même composition que le premier. On effectue la culture d'ensemencement dans les mêmes conditions que la première. On utilise 5 ml de 1'inoculum résultant pour amorcer la fermentation dans des erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de milieu de fermentation contenant 2,5% de mannitol, 0,5% de glucose, 1% de farine de soya, 0,5% de peptone, 1% d'extrait de viande, 0,3% de CaCÛ3 et 0,2% de NaCl. On exécute la fermentation à 28°C sur une secoueuse rotative à 250 tours par minute. On surveille la production de l'antibiotique par dosage par diffusion sur gélose avec disque de papier en présence de Bacil-. lus subtilis M45 (mutant Rec”) comme organisme d'épreuve. L'activité antibiotique dans le bouillon de culture augmente graduellement avec 1'avancement de la fermentation et atteint environ 300 /ug par ml après 6 ou 7 jours.

EXEMPLE 2.-

On sépare le bouillon recueilli (18 litres) obtenu par fermentation dans 1'exemple 1 en un gâteau de mycélium et en un bouillon surnageant en utilisant une centrifugeuse du type Sharpless (Kokusan n° 4A). On concentre le filtrat au-dessous de 40°C au dixième du volume initial et on dialyse le concentré dans un tube CD.YD.MdC.8 - 27 - SY-1711 λ de Cellophane (Union Carbide) contre de l'eau de distribution en chambre froide. On concentre la solu-tion retenue du côté intérieur jusqu'à environ 1,5 litre et on la centrifuge (à 8000 G) pour séparer les insolubles. On sature le liquide surnageant limpide * avec du sulfate d'ammonium et on le laisse reposer pendant 5 heures à 5eC. On recueille par centrifugation « le précipité résultant qu'on dissout dans de l'eau (300 ml) et qu'on dessale par dialyse contre de l'eau de distribution. La solution dialysée (700 ml) contenant 22 g de BBM-1644 solide brut, comme l'indique la lyophilisation d'une aliquote de la solution. On utilise le reste de la solution pour la purification sans la concentrer afin d'éviter la décomposition. On fait passer la solution de l'antibiotique sur une colonne de DEAE-Cellulose (Cl-, 400 ml) et on lave la solution à l'eau (1 litre), puis on la développe avec du tampon au phosphate 1/15 M (pH 7,0) contenant du chlorure de sodium 0,3 M. On combine les fractions actives (300 ml) et on les dialyse pendant 18 heures contre de l'eau de distribution, puis on les chromatographie sur une colonne de DEAE-Cellulose (400 ml) qu'on a mise à l'équilibre avec du tampon au phosphate 1/15 M (pH 7,5). On développe la colonne avec le même tampon contenant des quantités croissantes de chlorure de sodium (0 jusqu'à 0,2 M). On dessale l'éluat par dialyse et on le dépose sur une colonne de DEAE-Sephadex A-50 (17 ml). On développe la colonne avec du tampon au phosphate 1/15 M (pH 7,5) en établissant un gradient de concentration en chlorure de sodium (0 jusqu'à 0,3 M). On rassemble les fractions apparaissant actives contre B^ subtilis M45 et on les dialyse contre de 1'eau de distribution pendant 18 heures. On chromatographie la solution dessalée sur une colonne de DEAE-Sephadex A-50 (18 ml) en utilisant un système tampon au CD.YD.MdC.8 - 28 - SY-1711 phosphate 1/15 M (pH 7, 0)-NaCl (0 jusqu'à 0,3 M) comme éluant. On recueille les fractions appropriées, on les concentre à 10 ml et on dépose le produit sur une colonne de Sephadex G-50 pour le dessaler. On élue la colonne à l'eau dêsionisêe et on lyophilise l'êluat actif pour recueillir 120 mg d'une poudre blanche.

* L'échantillon de BBM-1644 ainsi obtenu est homogène, comme l'indique l'électrophorèse sur gel de polyacryl-amide.

* » CD.YD.MdC.8 - 29 - SY-1711

Claims

1,- L'antibiotique BBM-1644 qui (a) est efficace pour inhiber la croissance de bactéries grain-positives et résistantes aux acides, (b) est efficace pour inhiber la croissance de i la leucémie P388 chez la souris, (c) induit le caractère prophage ches des bactéries lysogènes, (d) est soluble dans l'eau mais pratiquement insoluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone, l'acétate d'éthyle et le n-hexane, * (e) présente un spectre d'absorption infra rouge (KBr) sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 1, (f) présente un spectre d'absorption ultraviolet dans l'eau, le HCl 0,01 N et le NaOH 0,01 N sensiblement tel qu'illustré à la Fig. 2, (g) a une rotation optique de -75,6° en solution aqueuse à 0,25%, (h) n'a pas de point de fusion défini, mais se décompose graduellement au-delà de 240°C, (i) se déplace d'environ 8,7 cm vers l'anode pendant l'électrophorèse sur papier sous 4500 V pendant 1 heure dans du tampon au barbital 0,05 M de pH 8,6, » (j) présente l'analyse élémentaire suivante : a C, 46,60%, H, 6,45%, N, 13,34%, S, 0,20% et O (par différence) 33,41%, (k) est un peptide de haut poids moléculaire dont le poids moléculaire est estimé à environ 22.000, (l) décolore la solution de permanganate de potassium et donne des réactions positives de Folin-Lowry, à la xanthoprotéine, au biuret et à la ninhy-drine et des réactions négatives à 1 ' anthrone et de Sakaguchi, et (m) révèle par hydrolyse la composition CD.YD.MdC.8 - 30 - SY-1711 relative suivante en aminoacides, sur base d'une teneur en leucine arbitrairement fixée à 1,0: alanine (8,8), acide aspartique (6,0), hémicystine (1,0), acide glutamique (5,7), glycine (8,7), isoleucine (2,3), leucine (1,0), phénylalanine (1,4), proline (4,1), sérine (1,6), thréonine {7,2), tyrosine (0,6) et valine (11,1). %

2. Procédé de production de l'antibiotique BBM-1644, caractérisé en ce qu'on cultive une souche d'Actinomadura sp. productrice de BBM-1644 dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote en submersion en aérobiose jusqu'à production d'une quantité sensible de BBM-1644 par cet organisme dans ce milieu de culture.

3. Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce qu'on isole le BBM-1644 hors du milieu de culture.

4. Procédé suivant la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que l’organisme produisant le BBM-1644 a les caractéristiques d'identification d'Actino-madura sp. H710-49 (ATCC 39144).

5. Culture biologiquement pur du microorganisme d1 Actinomadura sp. ATCC 39144, cette culture étant capable de produire l'antibiotique BBM-1644 en quantité isolable par mise en culture dans un milieu » * nutritif aqueux contenant des sources assimilables d'azote et de carbone.

6. Procédé de traitement thérapeutique d'un animal hôte atteint d'une infection bactérienne, caractérisé en ce qu'on administre à cet animal hôte du BBM-1644 en dose efficace antibactérienne.

7. Procédé de traitement thérapeutique d'un animal hôte atteint d'une tumeur maligne sensible au BBM-1644, caractérisé en ce qu'on administre à cet animal hôte du BBM-1644 en dose inhibant la tumeur. CD.YD.MdC.8 - 31 - SY-1711 * 4

8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend du BBM-1644 en quantité efficace antibactérienne, conjointement avec un excipient ou diluant pharmaceutique.

9. Composition pharmaceutique, caractérisé en * ce qu'elle comprend du BBM-1644 en quantité efficace * inhibant les tumeurs, conjointement avec un excipient % ou diluant pharmaceutique. kr « H c CD.YD.MdC.8 - 32 - SY-1711