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Plasmid-Vektoren zur Klonierung, Identifizierung und
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Expression von Genen Im Bereich der Arbeiten mit rekombinanter DNA
sind Klonierungen von DNA immer mit der Identifizierung von Klonen verbunden, d.h.
eine Klonierung hat keinen Sinn, wenn es keine Möglichkeit gibt, den gesuchten Klon
aus einer Vielzahl von Klonen zu erkennen und zu isolieren.
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Die vorliegende Erfindung betrifft nun neue Plasmidvektoren und ein
Verfahren zur Identifizierung von für Proteine kodierenden Genen, in dem die neuen
Plasmidvektoren verwendet werden können.
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Die erfindungsgemäßen Plasmidvektoren enthalten ein intaktes und aktives
Indikatorgen, an dessen 3'-Ende sich eine multifunktionelle Klonierungsregion befindet,
in die unter Beibehaltung der Indikatorfunktion des Genproduktes Fremd-DNA insertiert
werden kann.
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Bevorzugte erfindungsgemäße Plasmidvektoren sind dadurch gekennzeichnet,
daß die multifunktionelle Klonierungsregion ein DNA-Stück ist, das mehrere für den
Plasmidvektor
einzigartige Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen
enthält. Diese Erkennungsstellen können in allen drei möglichen Leserastern im Bezug
zum Indikatorgen existieren. Ganz besonders bevorzugt ist das lac Z-Gen als Indikatorgen.
Als multifunktionelle Klonierungsregionen kommen besonders die Restriktionsschnittstellen
BamHI, SalI, PstI-und HindIII bzw. BamHI, SalI, XbaI und HindIII in Betracht.
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Beispiele für erfindungsgemäße Plasmid-Vektoren sind pUR 278, 288,
289, 290, 291 und 292.
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Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren im Prinzip mit beliebiger DNA
durchführbar ist, wird im folgenden die Anwendung am Beispiel der cDNA-Klonierung
beschrieben.
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Prokaryontengene können nach Klonierung von genomischer DNA durch
ihr Genprodukt mit genetischen Methoden identifiziert werden (z.B. Büchel et al.
1980, Nature, 283, 541 - 545).
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Eukaryontengene sind nicht immer von einer kontinuierlichen DNA-Region
kodiert wie die Prokaryontengene, sondern bestehen aus Exons und Introns (Gilbert
(1978) Nature, 271, 501).
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Aus diesem Grunde kann aus klonierter eukaryontischer DNA das gesuchte
Gen nicht über das Genprodukt (z.B. in E.coli) isoliert werden.
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Bei der Expression von Genen in Eukaryontenzellen wird aber die zerstückelte
Geninformation durch das Prozessieren zu mRNA zusammengesetzt. Diese mRNAs haben
an ihren 3'-Enden eine charakteristische polyA Sequenz, über die sie isoliert werden
können. Diese mRNA Population kann mit Hilfe von Reverser Transkriptase in die cDNA
überführt werden (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, S.211 Cold Spring Harbor,
N.Y.). Die cDNA stellt damit, entsprechend wie bei den Prokaryonten, die Geninformation
an einem Stück dar. Diese DNA kann kloniert werden, d.h. in ein bakterielles Plasmid
eingebaut und dann in Bakterien (z.B. E.coli) vermehrt werden. Die Identifizierung
des gesuchten Gens aus einer solchen cDNA Klon Bank kann meist nicht über das Genprodukt
erfolgen, da nur in seltenen Fällen eine Expression dieser DNA in den Bakterienzellen
stattfindet. Eine gängige Methode der Klonidentifizierung ist die "Hybridization-Release-Methode"
(Goldberg et al., 1979, Methods in Enzymology, 68, 206 ff.).
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Bei einer anderen Methode wird die cDNA so in Plasmiden kloniert,
daß in den Bakterienzellen eine Expression erfolgt. Die cDNA wird dazu in einem
bakteriellen Gen so insertiert, daß sie zusammen mit dem Gen exprimiert wird. Dabei
entstehen Fusionsproteine, die aus dem inaktiven bakteriellen Proteinteil und dem
von der cDNA kodierten Teil bestehen. Solche Fusionsproteine können mit Antikörpern,
die gegen das cDNA Produkt gerichtet sind, nachgewiesen werden.
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Hierzu werden diese Antikörper an eine Plastikfolie gebunden und auf
die lysierten Bakterienkolonien gelegt.
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Nur von Kolonien, die die gesuchte cDNA enthalten, kann das Protein
an der.Folie gebunden werden. Solche gebundenen Proteine können über einen zweiten
Antikörper nachgewiesen werden. Damit wird die Position der gesuchten Bakterienkolonien
festgestellt, die die gewünschte cDNA enthalten (Broome & Gilbert, 1978, Proc.
Natl. Acad.
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Sci. USA, 75, 2746 - 2749).
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Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges und einfaches Verfahren
zur Identifizierung von DNA, insbesondere cDNA, zur Verfügung. Die cDNA wird in
speziell hierfür konstruierte Plasmid-Vektoren so insertiert, daß ein Fusionsprotein
entsteht, welches sich aus einem aktiven Indikatorprotein, z.B. B-Galaktosidase,
und dem von der cDNA kodierten Protein zusammensetzt. Diese chimeren Proteine können
über Antikörper an Plastikfolie gebunden werden. Diese Immunkomplexe werden durch
eine Indikatorprotein-spezifische Reaktion nachgewiesen.
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Im Falle der 8-Galaktosidase als Indikatorprotein erfolgt der Nachweis
durch die Umsetzung von 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-8-D-Galaktosid (X-gal) in ein
unlösliches blaues Indigoderivat (Davies & Jacob, 1968, J.
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Mol. Biol. 36, 413).
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1. Verfahren zur Herstellung der Plasmid-Vektoren Die Vektoren der
vorliegenden Erfindung wurden-aus verschiedenen Vektoren zusammengesetzt. Die jeweiligen
Manipulationen sind nachfolgend beschrieben.
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1.1 pUR270 Das Plasmid pUR270 wird in dieser Erfindung als Empfänger-Plasmid
für bestimmte manipulierte DNA-Fragmente benutzt.
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1.1.1 Entfernung von Restriktionsstellen aus dem 5'-Teil des Z-Genes.
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Das Plasmid pUK230 (Koenen et al. 1982, EMBO Journal, 1, 509 - 512
// F'llrecA pUK230 DSM Nr. 2617) war Ausgangsplasmid für die Konstruktion von pUR270.
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Das Plasmid pUK230 trägt im 5'-Teil des lac Z Genes (von E.coli)
eine Leseraster-Mutation und ist deswegen lac (Figur 1).
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Das Plasmid pUK230 wurde in E.coli BMH611z (lac+) (DSM Nr. 2615)
transformiert und die Transformanten in üblichen Vollmedium Flüssigkulturen über
Nacht vermehrt, 1:104 verdünnt, und über Nacht inkubiert.
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Diese Art der Verdünnung und Inkubation wurde dreimal durchgeführt.
Hierbei finden Rekombinationen zwischen dem Plasmid und der E.coli-DNA statt. Die
Plasmid-DNA wurde dann präpariert und in E.coli F'11recA (ein lac Stamm) (DSM Nr.
2616) transformiert (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, S. 363 + S. 249 ff.,
Cold Spring Harbor N.Y.). Die Transformanten wurden auf Indikatorplatten ausgestrichen
(Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y.), auf
denen zwischen lac und lac Kolonien unterschieden werden kann. Unter 1000 Transformanten
waren 3 - 5 lac+
Kolonien. Die Plasmid-DNA aus diesen Tranformanten
zeigte nach Restriktions-Analyse, daß die drei Restriktionsstellen aus der 5'Region
des Z-Genes herausgekreuzt worden sind (Fig. 1). Diese Plasmide wurden als pUK230
lac bezeichnet.
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1.1.2 Entfernung des C-terminalen Teiles des Z-Gens Das Plasmid pUK230
lac wurde mit EcoRI verdaut, ligiert und in F'11recA transformiert. Plasmid DNA
aus lac Kolonien wurde isoliert. Die Restriktions-Analyse zeigte die erwartete Konstruktion,
pUR270 (Fig. 1). Dieses Plasmid trägt das Ampicillinresistenz-Gen sowie die Regulator-Region
des lac Operons von E.coli und dessen lac Z Gen, jedoch nur bis zur bei Kodon 1006
vorkommenden EcoRI Schnittstelle. Das Plasmid pUR270 ist 5100 Bp groß und hat Ai
einzigartige Restriktionsenzymschnittstellen, PstI und EcoRI.
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1.2 Einführung einer multifunktionellen Klonierungsregion in den C-terminalen
Teil eines Genes Dieses Verfahren wird am Beispiel des lac Z Genes am E.coli dargestellt.
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Das Z-Gen endet nach 1023 Kodonen mit 3 Stop Kodonen (3 x TAA),'gefolgt
von einer kleinen intrazistronischen Region (Büchel et al., 1980, Nature 283, 541
-545).
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Die C-terminale DNA-Sequenz des lac Z Genes ist in Figur 2 dargestellt.
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1.2.1 pUR259 Das EcoRI-HaeIII Fragment der C-terminalen Z-Gen Region
(Fig. 2) wurde aus Plasmid pUK230 isoliert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning
S. 178, Cold Spring Harbor, N.Y.). Dieses Fragment wurde in einen EcoRI-HincII gespaltenen
pUR250 kloniert (Rüther (1982) Nucleic Acids Res. 10, 5765) (DSM Nr. 2618). Das
Plasmid mit dem Fragment pUR259 ist Ausgangsplasmid für Manipulationen am C-Terminus
des Z-Gens (Fig. 3).
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1.2.2 Entfernung der Stop Kodone des Z-Gens im Plasmid pUR259 10 Ag
pUR259 wurden mit HindIII vollständig verdaut (Fig. 4). Nach Chloroform-Extraktion
wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert und in 50 ßl Bal31-Puffer aufgenommen (600
mM NaCl, 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 80 mM Tris-HCl, pH 8.0). Die DNA-Enden wurden
mit 0,1 Einheiten Bal31 (Biolabs, Schwalbach) bei 370C für 10' inkubiert. Gestoppt
wurde die Enzymreaktion durch Zugabe von 50 Al H2O und 250 ßl Ethanol.
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Die DNA wurde präzipitiert und mit EcoRI verdaut (Fig. 4).
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Die Verteilung der Abbaulängen wurde kontrolliert.
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Die Fragmentlängen überstrichen einen. Bereich von 82 bp bis-ungefähr
20 bp.
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0,5 ßg Plasmid pUC9 (Vierra & Messing, 1982, Gene 19, 259) wurde
mit SmaI und EcoRI verdaut (Fig. 4) und zusammen mit 1/10 der Bal31-EcoRI Fragmente
ligiert. E.coli K12 BMH 71-18 (DSM Nr. 2614) wurde transformiert und die Transformanten
auf Indikator-
platten (Rüther 1980, Molec. gen. Genet. 178, 475)
plattiert. Bakterienkolonien, die ein Plasmid mit Fragment beinhalten, sind weiß;
solche, wo im Plasmid keine DNA insertiert ist, erscheinen als blaue Kolonien auf
diesen Platten. Die Plasmid DNA (pUR266) aus 200 weißen Kolonien wurde isoliert
und mit HindIII und EcoRI geschnitten. Die Größe der DNA-Fragmente wurde auf Polyacrylamidgelen
analysiert. DNA-Fragmente der gewünschten Größe (ca. 70 bp) wurden sequenziert (Maxam
& Gilbert, 1980, Methods in Enzymology 65, S. 499 - 560 Acad. Press. N.v.).
Die Verteilung der DNA-Enden nach Bal 31-Reaktion ist in Fig. 9 erkennbar. An diesen
Enden ist durch die Klonierung in pUC9 die Klonierungs-Region in verschiedene Leseraster
fusioniert worden. Die Isolate von pUR266 (12, 25, 69), die sich im Leseraster unterschieden,
wurden für weitere Konstruktionen verwendet.
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1.2.3 Konstruktion von Z -Plasmiden mit einer Klonierungs-Region (K.R.)
im C-Terminus des Z-Genes in allen drei Leserastern (pUR274, pUR276, pUR286) Die
Konstruktion der obengenannten Plasmide wurde nach dem folgenden Schema durchgeführt
und hier am Beispiel der Konstruktion von pUR274 ausführlich beschrieben (Fig. 5).
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0,5 ßg pUR270, 1 ßg pBR322 und 0,5 ßg pUR266/25 wurden mit EcoRI
und HindIII verdaut. Die entstandenen DNA-Fragmente wurden ligiert und dann in F'11recA
transformiert. Unter 5000 Transformanten waren 20
- 30 lac . Die
Plasmid DNA von lac Bakterienkolonien wurde isoliert und das C-terminale Z-Gen Fragment
sequenziert. Die Klonierungsregion hatte die erwartete Sequenz. Nach dem gleichen
Schema unter Verwendung von pUR266/12 und 69 wurden pUR276 und pUR286-konstruiert
und analysiert.
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1.2.4 Konstruktion von Vektoren mit einer modifizierten Klonierungs-Region
im C-Terminus vom Z-Gen in allen drei Leserastern (pUR278, pUR288, pUR289) Die Konstruktion
dieser drei obengenannten Plasmide erfolgte nach dem beschriebenen Schema und wird
am Beispiel von pUR278 dargestellt (Figur 6).
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0,5 ßg pUR274 und 2 ijg pUR250 wurden gemischt und mit BamHI und
HindIII zur Vollständigkeit verdaut, ligiert und diese DNA in F'llrecA transformiert
und auf Indikatorplatten plattiert. Plasmid DNA aus lac Kolonien wurde auf XbaI-Sensitivität
getestet. Von 8 Plasmidisolaten waren 3 mit XbaI schneidbar. Diese Plasmide wurden
näher analysiert und die Klonierungsregion sequenziert (pUR278).
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Nach dem gleichen Schema wurden aus pUR276 und 286, pUR288 und pUR289
konstruiert. Die Klonierungsregionen dieser drei Plasmide sind im Detail in Fig.
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9 dargestellt.
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1.2.5 Kontruktion von Vektoren mit einer einzelnen PstI-Klonierungsstelle
in allen drei Leserastern (pUR290, pUR291, pUR292)
a) Konstruktion
von pUR280 Die Vektoren pUR274, 276 und 286 können für Klonierungen in die PstI-Stelle
nicht benutzt werden, da noch eine PstI-Stelle im Ampicillin-Gen existiert.
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Um diese Stelle zu entfernen wurde pUR278 in BMH 71-18 4' bei 330C
mit Nitrosoguanidin (40 Rg/ml) mutagenisiert. Die Kultur wurde dann 1:104 verdünnt
und über Nacht inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde isoliert, mit PstI verdaut und in
F'11recA transformiert.
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r lac Kolonien wurde selektioniert und Kolonien wurden selektioniert
und aus diesen erneut die Plasmid DNA präpariert. Nach PstI Verdauung erfolgte wiederum
Transformation in F'11 recA mit anschließende Ampr -lac + -Selektion. Nach 3-maliger
Wiederholung dieser Anreicherung waren nur noch Plasmide ohne PstI-Stelle vorhanden
(pUR278/ N.G.).
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Diese Plasmide (pUR278/NG) wurden mit EcoRI verdaut und ligiert. Nach
Transformation in F'llrecA wurde aus lac Bakterienzellen die Plasmid DNA isoliert
und analysiert. Die Plasmide mit nur einer EcoRI-Stelle wurden pUR280 genannt (Fig.
7).
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b) Konstruktion von pUR290, 291, 292 Die Konstruktion dieser drei
obengenannten Plasmide wird hier beispielhaft am Plasmid pUR290 dargestellt (Fig.
8).
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0,5 Ag pUR280 wurden mit EcoRI verdaut, 0,5g pUR274 wurde mit EcoRI
und HinfI verdaut. Beide Ansätze wurden gemischt, ligiert und in F'11recA transfor-
miert.
Plasmid DNA aus lac Kolonien wurde präpariert, analysiert und die Klonierungsregion
sequenziert. Für die Konstruktion von pUR291 und pUR292 wurden die Plasmid pUR276
und pUR286 benutzt. Die Klonierungsregionen von den drei obengenannten Plasmiden
sind in Fig. 9 im Detail dargestellt.
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2. Klonierung und Identifizierung von cDNA in den Vektoren dieser
Erfindung 2.1 Allgemeine Darstellung des Verfahrens Die Klonierung und Identifizierung
in diesen Vektoren ist für jede cDNA möglich, unabhängig von der Art der cDNA Synthese
(Maniatis et al. 1982), Molecular Cloning, S. 217 - 223, Cold Spring Harbor, New
York).
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Die so erzeugten Klone können z.B. nach folgendem Schema analysiert
und die richtigen identifiziert werden: Bakterienzellen, transformiert mit den Vektoren
dieser Erfindung, werden aus Lactose-Platten ausplattiert. Von den gewachsenen Kolonien
wird im Replica-Verfahren ein Abdruck auf eine Lactose-Glasplatte und eine andere
Lactose-Platte vorgenommen. Nach Inkubation über Nacht wird die Glas-Lactose-Platte,
wie bei Koenen et al. (1982), EMBO J.
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1, 509 - 512 beschrieben, behandelt.
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Nach einstündiger Kühlung bei 6"C werden die Kolonien mit Chloroform
lysiert, 2' bei RT.
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Nach Entfernen der Chloroform-Reite werden die Platten bei 60C gelagert,
um Proteaseeinwirkungen so gering wie möglich zu halten.
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Zur Bindung der Antikörper an Plastikfolie (jede Art von Polyvinylfolie
kann benutzt werden, z.B. von Firma Benecke 3000 Hannover, Vinnhorst, Bestell Nr.
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147 898) werden diese in 0,2 M NaHCO3-Lg pH 9.2 mit 40 ßg/ml Antikörpern
bei RT für 2' inkubiert. Um die verbliebenen freien Proteinbindungsstellen auf der
Plastikfolie abzusättigen, werden die Folien 3 x in 0,5 % BSA Lösung (in 10 mM KPO4-Puffer
pH 7.0 mit 150 mM NaCl) für 2' inkubiert. Diese Folien werden auf die lysierten
Kolonien gelegt und mit diesen bei 60C für 1 Stunde inkubiert. Zur Entfernung der
unspezifisch gebundenen Proteine werden die Folien in obiger BSA-Lösung gewaschen.
Die Folien werden, mit den Antikörpern beschichteten Seiten nach oben, in Petrischalen
gelegt und mit jeweils 20 ml Identifizierungslösung übergossen wie (Koenen et al.
(1982) EMBO Journal 1, 509 - 512) beschrieben. Die Folien werden dann bei 370C inkubiert.
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Nach 2 - 12 Stunden zeigt eine Blaufärbung die Position des gebundenen
Immunkomplexes. Hieraus lassen sich die Positionen der entsprechenden Kolonien auf
der zweiten Replica-Platte ableiten. Der allgemeine Gang des Experimentes ist in
Figur 10 dargestellt.
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2.2 Spezielle Anwendung der Erfindung am Beispiel des Hühner-Lysozym-Genes
Zur Demonstration dieser Erfindung wurde die DNA des Hühner-Lysozym-Genes (Sippel
et al., 1978, Nucleic Acids Res. 5, 3275 - 3294) in pUR289 kloniert und unter 500
getesteten Kolonien wurden 8 immuno-histochemisch nachgewiesen, die dieses Gen enthielten
(vergleiche f. Gang des Experimentes auch Fig. 10).
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Die in der Beschreibung erwähnten Mikroorganismen-Stämme (DSM 2614
bis 2618) wurden am 14.03.1983 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen
hinterlegt.