DD203331A5

DD203331A5 - Verfahren zur erzeugung eines polypeptids

Info

Publication number: DD203331A5
Application number: DD82239417A
Authority: DD
Inventors: Kimber G Hardy; Allistair H A Bingham
Original assignee: Biogen Nv
Priority date: 1981-04-29
Filing date: 1982-04-29
Publication date: 1983-10-19
Also published as: EP0063953A3; EP0063953A2; JPS57181099A; PT74811A; PT74811B; GR75411B; FI821466L; DK188582A; AU8300282A; FI821466A0; ZA822855B; BR8202422A; ES511741A0; NO821391L; ES8306797A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Erzeugung eines Polypeptids unter Verwendung von Bazillenwirten, die mit Rekombinant-DNA-Molekuelen transformiert sind. Durch die Erfindung koennen Bazillenwirte erstmals zur Expression fremder DNA-Segmente, vor allem solche eukaryotischen Ursprungs oder von Viren stammende verwendet werden und eukaryotische oder Virus-Polypeptide erzeugt werden, die in Vakzinen, pharmazeutischen Produkten und in der Industrie vorteilhaft eingesetzt werden koennen. Erfindungsgemaesz wird ein Bazillus-Wirt gezuechtet, der mit einem mit dem Bazillus-Wirt vertraeglichen Rekombinant-DNA-Molekuel transformiert wurde und im wesentlichen aus einem intakten Replikon, mindestens einer Endonuclease-Erkennungsstelle, an der das Molekuel in bestimmbarer Weise ohne damit verbundenen Verlust einer wesentlichen biologischen Funktionabgebrochen werden kann und einer DNA-Sequenz, von der zumindest ein Teil fuer ein Nicht-Bazillus-Polypeptid kodiert, besteht, wobei die DNA-Sequenz in die Endonuclease-Erkennungsstelle eingefuegt und dort operativ mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz verknuepft wird.

Description

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Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptide

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids unter Verwendung von Bazillenwirten, die mit Rekombinant-DNA-Molekülen transformiert sind. Ganz allgemein bezieht sich die Erfindung auf Bazillencloningvektoren, Rekombinant-DNA-Moleküle, mit ihnen transformierte Bazillenwirte und Verfahren zur Expression von fremden DNA-Sequenzen und zur Erzeugung von durch diese Sequenzen kodierten Polypeptiden. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Cloningvektoren, die in Bazillenwirten für Cloning und die Expression fremder Gene geeignet sind, und Verfahren für derartiges Cloning und solche Expression. Die erfindungsgemäßen Vektoren, Rekombinant-DNA-Moleküle, Wirte und Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie das Cloning.und die Expression fremder DNA-Sequenzen, vor allem solcher eukaryotischen Ursprungs oder von Viren stammender in Bazillenwirten ermöglichen. Wie durch die folgende Beschreibung deutlich werden wird, sind die erfindungsgemäßen Vektoren, Rekombinant-DNA-Moleküle, Wirte und Verfahren für die Erzeugung von Polypeptiden von Nutzen, die

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normalerweise nicht in Bazillenwirten erzeugt werden. Diese Polypeptide sind in.Vakzinen, pharmazeutischen Produkten und Industrieprodukten und als Ausgangsstoffe oder Vorläufer für die Herstellung anderer ähnlicher Produkte mit Hilfe herkömmlicherer chemischer Verfahren nützlich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Zahlreiche eukaryotische oder Virengene sind in dem gramnegativen Bakterien Escherichia coli verwirklicht worden. Beispiele für eine solche Expression umfassen die Erzeugung von Polypeptiden, die eine biologische oder immunologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweisen (S. Nagata, u.a., "Synthesis In E. coli Of A Polypeptide With Human Leukocyte Interferon Activity" (Synthese eines Polypeptide mit Humanleukouyten-Interferon-Aktivität in E. coli), Nature, 284, S. 316 - 320 (1980)), von Antigenen, die die Spezifi- ' tat von Human-Hepatitis-B-Virusantigenen aufweisen (CJ. Burrell, u.a., Expression In Escherichia coli; Of Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E, coli" (Expression in Escherichia coli: Von Hepatitis-B-Virusgenen und ihre Expression in E. coli), Nature, 282, S. 575 - 579 (1979)) und von Polypeptiden, die die Antigenwirkung von FMD-Virusantigenen aufweisen (H. Küpper, u.a., "Cloning Of cDNA Of Major Antigen Of Foot And Mouth Disease Virus and Expression In E. coli" (Cloning von cDNA des Hauptantigens des Maul- und Klauenseuchevirus und Expression in E. coli), Nature, 289, S. 555 - 559 (1981)).

Die Herstellung solcher nützlicher eukaryotischer oder Virenprodukte in E. coli ist jedoch durch verschiedene Nachteile gekennzeichnet. Da E. coli beispielsweise immer im Darmkanal von Tieren und Menschen vorhanden sind, ist der sorgfältige Umgang mit E. coli-Wirten, die zur Erzeugung eines verlangten Produktes modifiziert wurden, erforderlich, um eine unbeabsichtigte Infektion zu verhüten. Gegen-

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v/ärtig sind die für die Transformation zur Erzeugung verlangte Produkte zugelassenen E. coli-Wirte auf diejenigen beschrankt, die sich außerhalb der Laboratoriumsumgebung nicht vermehren werden. Darüber hinaus müssen die transformierten E. coli-Wirte in geschlossenen Systemen unter streng abgeschlossenen Bedingungen gezücht-et werden (wie es jetzt durch die Richtlinie des Nationalen Gesundheitsinstitutes und andere ähnliche staatliche Organisationen' gefordert wird). Die resultierenden E. cöli-KuItüren müssen auch, so verarbeitet werden, daß die Bakterien vor Öffnen des Systems zur Umgebung getötet worden sind. Durch diese Bedingungen v/erden die Kosten für Material und Ausrüstungen der Fermentationsprozesse bei Verwendung von E. coli ganz erheblich erhöht. Außerdem sind einige der Bakterienprodukte von E. coli Endotoxine. Daher müssen, bevor in E. coli-Wirten erzeugte eukaryotische und Virenprodukte bei Tieren oder Menschen angewandt v/erden können, die E. coli-Endotoxine gänzlich aus dem verlangten Produkt ausgeschaltet werden. Selbstverständlich sind dafür teure und aufwendige Reinigungs- und Isolationsverfahren erforderlich.

Schließlich werden, obwohl einige von E. coli-Wirten erzeugte Produkte, zum Beispiel das Produkt des Gens für Penicillinase-Resistenz, in den periplasmischen Raum der E. coli-Zelle abgesondert werden können, die von E. coli-Wirten erzeugten Produkte gewöhnlich nicht in den extrazellulären Raum der E. coli- Zelle abgesondert. Daher müssen die E. coli-Zellen zur Gewinnung der verlangten Produkte aufgebrochen oder anderweitig lysiert werden. Durch eine solche unsanfte Behandlung werden natürlich auch alle anderen Zellprodukte und E. coli-Membranproteine von dem E. coli-Wirt entfernt. Daher verlangen auch diese Verfahren eine gründliche Reinigung des Produktgemischs, um die verlangten eukaryotischen oder Virusprodukte in einer für Tiere und Menschen verwendbaren Form zu isolieren und zu gewinnen.

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Diese vielen Nachteile von E. coli-Wirten können in großem Umfang durch die Verwendung von Bazillenwirten zur Erzeugung der verlangten eukaryotischen und Virusprodukte vermieden werden. Der Bazillus ist ein gram-positiver Wirt. Die meisten Bazillenwirte sind auch nicht-pathogen. Er besitzt nicht die Fähigkeit, Menschen oder Tiere zu infizieren. Bazillenwirte erzeugen auch keine Endotoxine. Daher wird die Erzeugung von eukaryotischen und von Virusproteinen in Bazillenwirten durch die Förderung der Züchtung und Abtötung unter Bedingungen strenger Abgeschlossenheit nicht beinträchtigt. Außerdem ist es leichter, alle Spuren toxischer Produkte aus Bazillenkulturen zu entfernen, bevor die Produkte bei Tieren und Menschen angewendet werden dürfen. Bazillenwirte besitzen außerdem keinen periplasmischen Raum, und auf ihrer Zelloberfläche fehlen Lipopolysaccharide. Sie sondern außerdem auf natürlichem Wege verschiedene ihrer Proteinprodukte in den extrazellulären Raum ab. Daher können die abgesonderten Bakterienprodukte aus dem extrazellulären Raum ohne Aufbrechen oder Lysis der Zelle gewonnen werden. Durch ein solches Vorgehen werden selbstverständlich die Verunreinigungs- und Reinigungsproblerne, die mit der Produktgewinnung von E. coli-Wirten verbunden sind, ausgeschaltet. Des weiteren sind Bazillenwirte gut gekennzeichnet, und sie v/erden umfassend bei industriellen Fermentationen angewandt, zum Beispiel bei der Herstellung des Bazillenproduktes σ^ -Amylase.

Doch trotz der vielen durch die Verwendung von Bazillenwirten für die Expression fremder Genprodukte erzielten Vorteile und der vielen Versuche, Bazillenwirte für die Her- ' beiführung einer solchen Expression zu verwenden, ist über keine erfolgreiche Expression von eukaryotischen oder Virusgenen in Bazillenwirten berichtet worden.

- 5 Darlegung-des Wesens der Erfindung:

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Durch die Erfindung können im allgemeinen die oben erläuterten Probleme gelöst werden, indem Bazillen-Cloningvektoren, Rekombinant-DNA-Moleküle, mit ihnen transformierte Bazillenwirte und Verfahren für das Cloning und die Expression fremder DNA-Sequenzen und die Erzeugung dadurch kodierter Polypeptide in Bazillenwirten zur Verfügung gestellt werden. Genauer gesagt wird durch die Erfindung ein Bazillencloningvehikel geschaffen, das durch ein intaktes Replikon, das mit Bazillenwirten verträglich ist, und wenigstens eine Endonuclease-Erkennungsstelle gekennzeichnet ist, an der dieses Cloningvehikel in einer bestimmbaren Form ohne damit verbundenen Verlust einer \7ichtigen biologischen Funktion abgebrochen werden kann, gekennzeichnet dadurch, daß nach Insertion einer DNA-Sequenz, wobei zumindest ein Teil dieser Sequenz für eine fremde Aminosäuresequenz kodiert, in die Endonuclease-Erkennungsstelle und der Transformation eines Bazillenwirtes mit dem resultierenden Rekombinant-DlIA- -Kolekül, der resultierende transformierte Bazillenwirt in der Lage ist, wenigstens einen Abschnitt der DNA-Sequenz zu verwirklichen und zumindest einen Abschnitt der fremden Aminosäuresequenz zu erzeugen.

Mit Hilfe der Erfindung ist es zum ersten Mal möglich, Bazillenwirte zur Expression fremder DNA-Sequenzen zu verwenden, vor allem solcher eukaryotischen Ursprungs, oder von Viren stammender und in solchen Wirten eukaryotische oder Virus-Polypeptide zu erzeugen, die sich als nützlich in Vakzinen und pharmazeutischen Produkten erweisen und die verschiedenartige Verwendung in der Industrie finden. Die erfindungsgemäßen Wirt-Cloningvektor-Systeme, Rekombinant- -DNA-Moleküle und Verfahren gestatten die Transformation von Bazillenwirten mit fremden Genen, die für solche Polypeptide kodieren, und die Replikation und Expression derartiger Gene durch Bazillenwirte. Daher werden durch die erfindungsgemäßen Wirt-Cloningvektor-Systeme, Rekombinant-DNA-Moleküle

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und Verfahren nicht nur die mit der Verwendung von E. coli-Y/irten für die Replikation und Expression solcher Gene unweigerlich verbundenen Nachteile vermieden, sondern durch die erfindungsgemaßen Cloningvektoren, Rekombinant-DHA-Moleküle, Bazillenwirte und Verfahren werden die Vorteile erzielt, die die Fermentation, Erzeugung und Gewinnung von Produkten in Bazillenwirten charakterisieren.

Wie aus der folgenden Beschreibung hervorgehen wird, sind die erfindungsgemaßen Wirt-Cloningvektor-Systeme und Verfahren für die Replikation und Expression von Genen fremden Ursprungs geeignet, so daß eukaryotische und Viruspolypeptide in Bazillenwirten erzeugt werden können. In den Zeichnungen stellen dar:

Pig. 1 eine schematische Skizze einer erfindungsgemaßen Ausführungsform eines Wirt-Cloningvektor-Systems und eines Verfahrens für die Erzeugung von Polypeptiden, die die Spezifität von Hepatitis-B-Kernantigenen in Bazillenwirten haben;

Pig. 2 eine schematische Skizze einer anderen erfindungsgemaßen Ausführungsform eines Wirt-Cloningvektor-Systems und eines Verfahrens für die Herstellung von Polypeptiden, die eine biologische oder immunologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon in Bazillenwirten haben.

Fig. 3 eine schematische Skizze einer anderen erfindungsgemäß.en Ausführungsform eines Wirt-Cloningvektor-Systems und eines Verfahrens für die Herstellung von Polypeptiden, die die Spezifität von Maul- und Klauenseuche ("PMD")-Virusantigenen in Bazillenwirten haben.

Zum besseren Verständnis der hier erläuterten Erfindung wird die folgende ausführliche Beschreibung gebracht.

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In der Beschreibung werden die folgenden Bezeichnungen angewandt:

Polypeptid — Eine lineare Anordnung von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen denoC-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind.

Expression — Der Prozeß, den ein DNA-Fragment oder Gen zur Erzeugung eines Polypeptids durchläuft. Es handelt sich um eine Kombination von Transcription (den Prozeß zur Erzeugung von mRNA von einem DNA-Fragment) und Translation (den Prozeß zur Erzeugung eines Polypeptids von mRNA).

Plasmid — Eine nicht-chromosome,-doppelstrangige DNA-Sequenz, die ein intaktes "Replikon" aufweist, so daß sich das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert. Wenn sich das Plasmid in einem einzelligen Organismus befindet, können die Charakteristika dieses Organismus infolge der DNA des Plasmids verändert oder transformiert v/erden. Zum Beispiel transformiert ein Plasmid, das das Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tet ), trägt, eine vorher gegenüber Tetracyclin empfindliche Zelle in eine, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als "Transformant" bezeichnet.

Phage oder Bakteriophage — Bakterienviren, von denen viele aus DlIA-Sequenzen bestehen, die in eine Proteinhülle oder ein Coat ("Capsid-Protein") eingehüllt sind.

Bazillen-Cloningvektor — Ein Plasmid, eine Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenz, die (a) ein intaktes Replikon hat, so daß sich das CloningVehikel in einem Bazillenwirt replizieren kann, und (b) eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen hat, an denen derartige DNA-Sequenzen in einer vorausbestimmbaren Weise abgebrochen v/erden können, ohne daß sich daraus der Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion des Cloningvehikels ergibt, z.B. Replikation, Erzeugung von Coat-Proteinen oder Verlust

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von Promotor- oder Bindestellen. Vorzugsweise kann der Bazillen-Cloningvektor in seiner ursprünglich konstruierten Form oder nach Einfügen eines DNA-Fragmentes von einem anderen Genom auch eine Karkierungssubstanz enthalten, die sich zur Verwendung bei der Identifizierung von transformierten Zellen eignet, z.B. Tetracyclin-Resistenz, Ampicillin-Resistenz oder die Erzeugung eines nachweisbaren Polypeptidproduktes. Ein Bazillen-Cloningvektor wird häufig als Bazillen-Cloningvehikel bezeichnet.

Cloning — Der Prozeß zur Gewinnung einer Population von Organismen oder DNA-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer derartigen DNA-Sequenz durch ungeschlechtliche Fortpflanzung abgeleitet wurde.

Rekombinant-DNA-Moleküle oder Hybrid-DNA — Ein Molekül, das aus Segmenten von DNA von verschiedenen Genomen besteht, die außerhalb lebender Zellen hintereinander miteinander verbunden wurden und die Fähigkeit besitzen, einige Wirtszellen zu infizieren und darin festgehalten werden können.

Bazillen-Expressions-Kontroll-Sequenz — Eine Sequenz von Nucleotiden, die die, Expression von Strukturgenen in einem Bazillenwi/rt kontrollieren und regulieren, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft sind. Sie enthalten das Bazillen- |i -lac-System, das Erythromycin-Resistenzsystem, das Bazillen-^-Amylase-System, die Kontrollregion von fd-Coat- -Protein und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen und deren Viren kontrollieren.

Bazillenwirt— Ein grampositiver mikrobiologischer Stamm, der zu der Gattung Bacillus gehört. Er kann Stämme von Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus circulans und andere Bakterienstämme umfassen. Die erfindungsgemäßen Bazillen-Cloningvektoren, Rekombinant-DNA-MoIe-

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küle, transformierten Wirte und Verfahren ermöglichen die Expression von fremden DNA-Sequenzen, vor allem derjenigen eukaryotischer oder viraler Herkunft, in Bazillenwirten und die Erzeugung der Produkte, die durch diese DNA-Sequenzen kodiert wurden. Beispiele derartiger Produkte umfassen Polypeptide, die eine biologische oder immunologische Aktivität von Leukozyten-Interferon, Pibroblast-Interferon, anderen Interferonen, Insulin, Human- und Tierwachstumshormonen, Hepatitis-B-Yirus-Oberflächenantigenen,; PMD-Virus-Antigenen und anderen Human-, Tier- und Viruspolypeptiden aufweisen. i

Erfindungsgemäß werden die obigen DNA-Sequenzen dadurch verwirklicht und die fremden Produkte dadurch erzeugt, daß eine DNA-Sequenz, von der zumindest ein Teil für das verlangte Produkt kodiert, in einen erfindungsgemäßen Bazillen-Cloningvektor in einer solchen Weise eingefügt wird, daß dadurch die Fähigkeit des resultierenden Rekombinant-DNA-T.loleküls, in Bazillenwirten festgehalten zu werden und sich darin zu replizieren, nicht zerstört wird, und daß es operativ mit einer Bazillen-Expressions-Kontroll-Sequenz verknüpft werden kann. Die erfindungsgemäßen Cloningvektoren weisen ein intaktes Replikon auf, das mit dem Bazillenwirt verträglich ist, und mindestens eine Endonuclease-Erkennungsstelle, an der der Cloningvektor in einer vorausbestimmbaren Weise abgebrochen werden kann, ohne daß damit ein Verlust an einer wesentlichen biologischen Punktion verbunden ist. Sie sind dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Bazillenwirt nach der Einfügung der fremden DNA-Sequenz in die Endonuclease-Erkennungsstelle und der Transformation eines Bazillenwirtes mit dem resultierenden Rekombinant- oder Hybrid-DNA-Molekül in der Lage ist, zumindest einen Teil der DNA-Sequenz zu verwirklichen und v/enigstens einen Teil der durch die fremde DNA-Sequenz kodierten Aminosäuresequenz zu erzeugen.

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Noch günstiger ist es, wenn der Bazillen-Cloningvektor, entweder in seiner ursprünglich konstruierten Form oder nach Einfügen der fremden DNA-Sequenz, auch durch eine Markierungssubstanz gekennzeichnet ist, um die Selektion von Bazillenwirten zu ermöglichen, die mit einem von dem Bazillen-Cloningvektor abgeleiteten Rekombinant-DNA-Kolekül transformiert wurden.

Am vorteilhaftesten ist es, wenn der erfindungsgemäße Bazillen-Cloningvektor aus einer Kombination von mindestens einem Toil einer DNA-Sequenz, die die Fähigkeit zur Replizierung ⁱⁿ E. coli hat, und wenigstens einem Teil einer DNA-Sequenz, die sich in Bazillen replizieren kann, besteht. Dieser bevorzugte Cloningvektor ermöglicht es, daß die Transformation und Selektion anfangs in E. coli vorgenommen v/erden können, worin die Transformation leichter und gewöhnlich mit höherer Frequenz erfolgt und dann das ausgewählte Rekombinant-DNA-Molekül zu Bazillenwirten transformiert v/erden kann.

Ausführungsbeispiele:'

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden die folgenden Beispiele zur Erläuterung gebracht.

Beispiel I

In Fig. 1 werden eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Ausführungsform eines Bazillenwirt-Cloningvektor-Systems und eines erfindungsgemäßen Verfahrens gezeigt. Bei diesem Ausführungsbeispiel werden Polypeptide mit der Spezifität von Hepatitis-B-Kernantigenen ("HBcAg") durch Einfügen eines für das Polypeptid kodierenden DNA-Fragmentes in einen erfindungsgemäßen Bazillen-Cloningvektor und durch Transformieren eines Bazillenwir-tes mit einem solchen Vektor erzeugt, um das eingefügte DNA-Fragment zu replizieren und zu verwirklichen und das HBcAg-Produkt zu erzeugen.

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Wie aus Pig. 1 zu sehen ist, wurde ein Bazillen-Cloningvektor durch Kombinieren von B» coli Plasmid pBR322 (P. Bolivar, u.a., "Construction And Characterization Of New CIoningvehicles II. A Multi-Pucpose Cloning System" (Konstruktion und Charakterisierung neuer Cloningvehikel II. Ein Mebrzweck-Cloning-System), Gene S. 95 - 113 (1977); J.G. Sutcliffe, "pBR 322 Restriction Map Derived Prom The DNA Sequence: Acurate DNA Size Markers Up To 4361 Nucleotide Pairs Long" (Von der DNA-Sequenz abgeleitete pBR322 Restriktionskarte: Genaue DNA-Größenmarkierungssubstanzen bis zu 4361 Nucleotid-Paare lang) Nucleic Acids Research, 5, S. 2721 - 2728 (1978); J.G. Sutcliffe, "Complete'Nucleotide Sequence Of The Escherichia coli Plasmid pBR322; (Vollständige Nucleotid-Sequenz des Escherichia coli Plasmids pBR322), Cold Spring Harbor Symposium, 43, I. S. 77 - 90 (1978)) mit Plasmid PBD9, einem Plasmid, von dem bekannt ist, daß es sich in Bakterienwirten repliziert, konstruiert ("Construction And Properties Of Chimeric Plasmids In Bacillus Subtilis" (Konstruktion und Eigenschaften von chimärischen Plasmiden in Bacillus subtilis) Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 75, S. 1423 - 1428 (1978):"Characterizitation Of Chimeric Plasmid Cloning Vehicles In Bacillus Subtilis" (Charakterisierung chimärischer Plasmid-Cloningvehikel in Bacillus subtilis), J. Bacteriol. 141, S. 246 253 (1980)). .

Die Ligation der beiden Plasmide wurde durch Spalten jedes der Plasmide mit Restriktions-Exonuclease EcoRI und Vereinigen der beiden linearisierten Plasmide in Gegenwart von T4 DNA-Ligase herbeigeführt. Da pBR322 die für Penicillinase-Resistenz (Amp ) und Tetracyclin-Resistenz (Tet ) kodierenden Gene trägt und pBD9 die für Kanamycin-Resistenz (Km^u) und Erythromycin-Resistenz- (Em ) kodierenden Gene trägt und keines dieser Gene durch die Fusion der beiden Plasmide inaktiviert worden ist, trägt das vereinigte als pKH80 bezeichnete Plasmid alle vier Resistenz-Markierungssubstanzen.

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C~Erythromycin-Resistenz wird durch ein Polypeptid mit einer relativen Molekülmasse von etwa 29 000 verlieben. Die Erzeugung des Polypeptide wird durch sub-inhibitoriscbe Konzentrationen von Erythromycin induziert. )

Da es sich bei Plasmid pKH80 um eine Kombination von E. coli und Bazillenplasmid handelt, können von diesen Stämmen beide als Wirt für das Plasmid verwendet werden. Da die Trans- " formation von E. coli-Wirten etwas leichter ist als die Transformation von Bazillenwirten und da vor allem die Frequenz der Transformation gewöhnlich höher ist, ist es besser, anfangs einen E. coli-7/irt mit dem oben konstruierten Plasmid zu transformieren und richtig konstruierte Plasmide in diesem Wirt zu selektieren. Diese Plasmide können dann zum. Transformieren des verlangten Bazillenwirtes verwendet werden.

Einwandfrei konstruierte Plasmide wurde durch Transformie-, :.-on von E. coli HB 101 mit den obigen Plasmiden und die Selektion hinsichtlich der Resistenz gegenüber Ampicillin (40/Ug/ml), Tetracyclin (25/Ug/ml) und Kanamycin (5/Ug/ml) auf L-Agarplatten ausgewählt. Die relative Orientierung von pBR322 und pBD9 in PKH80 wurde durch Digestion mit Pstl bestimmt, weil die beiden Pstl-Stellen in pKH80 asymmetrisch in bezug auf die pBD9- und pBR322-Abschnitte von pKH80 sind (Fig. 1). pKH80 hat auch Erythromycin-Resistenz an damit transformierte E. coli HB101-Wirte verliehen. Darüber hinaus wurde das durch das Gen für Erythromycin-Recistenz kodierte 29 000 WM-Protein in E. coli-Minizellen entdeckt, die mit pKH80 transformiert und mit 2/Ug/ml Erythromycin induziert worden waren.

Zur Demonstration der Brauchbarkeit von pKH80 als Cloningvektor in Bazillenwirten wurde ein DNA-Fragment, das für ein die Antigenwirkung von HBcAg aufweisendes Polypeptid kodiert, gewählt und in den Cloningvektor und in mit dem Rekombinant- oder Hybrid-DNA-J.lolekül transformierte Bazil-

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lenwirte eingefügt, um die Antigenwirkung von HBcAg aufweisende Polypeptide zu erzeugen.

Wie in Fig. 1 dargestellt ist, wurde Plasmid pHBV-139A (eines einer Gruppe von Rekombinant-DNA-Moleküle, die als pHBV139 von CJ. Buri'ell, u.a. supra bezeichnet werden), mit Pstl digeriert, um eine ein HBcAg-verwandtes DNA-Fragment enthaltende DNA-Sequenz herauszuschneiden. Das herausgeschnittene Fragment wurde unter Standardbedingungen so mit Exonuclease Ba131 behandelt, daß im Durchschnitt 100 Basenpaare von jedem Ende der DNA-Sequenz entfernt wurden. Ein Gemisch von BamHI- und Hindlll-Linkern wurde dann an die Enden des digierierten Fragmentes gebunden. Nach der BamHI-Digestion wurde das Fragment in die BamHI-Stelle von p*BR322 eingefügt (Fig. 1). E. coli HB101 wurde mit diesen Hybridplasmiden transformiert, und es wurden gegenüber Ampicillin (40/Ug/ml) resistente und gegenüber Tetracyclin (15 /ug/ml)⁺ empfindliche Wirte ausgewählt. Plasmid-DNA wurde von den ausgewählten transformierten Wirten in einer herkömmlichen Weise isoliert, und die Nucleotid-Sequenz an der Verbindungsstelle zwischen pBR322 und dem 5'-Ende des eingefügten HBcAg-Kodierungsfragmentes wurde nach der Methode von A.M. I.Iaxam und W. Gilbert, "A New Methode For Sequencing DNA" (Ein neues Verfahren zur Sequenzierung von DNA), Proc. Natl. Acad, Sei. USA, 74, S. 60 - 64 (1977) bestimmt.

(+ DieBamHI-Stelle befindet sich in dem für Tetracyclin-Resistenz in pBR322 kodierenden Gen. Daher wird durch die Insertion eines DNA-Fragmentes an dieser Stelle das für Tetracyclin-Resistenz kodierende Gen inaktiviert und ein mit dem resultierenden Rekombinant-DNA-Molekül transformierter Wirt wird empfindlich gegenüber Tetracyclin gemacht.)

Die Nucleotid-Sequenz eines der isolierten Plasmide (pH98), zusammen mit der bekannten Sequenz des für Erythromycin-Resistenz kodierenden Gens sowie die Lage der Bcll-Stelle

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in dem für Erythromycin-Resistenz kodierenden Gen ermöglichten die Voraussage, daß das BamHI-Fi-agment von pH98 in die Bcll-Stelle des für Erythromycin-Resistenz in pKH80 kodierenden Gens so in ein richtiges Orientierungssystem (reading frame) eingesetzt v/erden kann, daß das Terminationscodon, das dem AUG-Startcodon des HBcAg-verwandten DNA-Fragmentes in dem BamHI-Fragment von pH98 mit drei Nucleotiden vorausgeht, mit dem Gen für Erythromycin-Resistenz in pKH80 übereinstimmen würde. Daher war zu erwarten, daß die Expression des Erythromycingens in diesen Konstruktionen an seinem gewöhnlichen Startcodon beginnen und an dem durch den HBcAg-Insert geschaffenen Stoppcodon enden würde. Die neue Expression würde dann wieder an dem AUG-Startcodon des HBcAg-verwandten DNA-Fragmentes zur Erzeugung eines nicht verschmolzenen die Antigenwirkung von HBcAg aufweisenden Produktes beginnen.

Daher wurde das BamHI-Fragment von pH98 in die Bcll-Stelle von pKH80 eingefügt. Wie zuvor wurden einwandfreie konstruierte Rekombinant-DNA-Moleküle nach der Transformation von E. coli HB101 ausgewählt (jetzt durch die Resistenz gegenüber Ampicillin (40 /ug/ml) und Tetracyclin (25/Ug/ml) und die Sensibilität gegenüber Erythromycin (60 /Ug/ml)). Diese Kombination von antibiotischer Sensibilität und Resistenz demonstriert, daß der E. coli-Wirt mit einem Plasmid transformiert wurde,, das Resistenz gegenüber Tetracyclin und Ampicillin überträgt und keine Resistenz gegenüber Erythromycin überträgt (d.h. einem Hy- · bridmolekül, abgeleitet von pKH80, aber mit dem für Erythromycin-Resistenz kodierenden Gen, das durch die Insertion eines fremden DlTA-Fragmentes inaktiviert wurde).

(+ Die durch Digestion mit BamHI und Bell erzeugten DNA-Fragmente haben die Sequenz GATC an ihren 5'-Enden, so daß ein durch Digestion mit BamHI erzeugtes Fragment in eine Bcll-Stelle eingefügt werden kann.)

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Die ausgewählten Rekombinant-DIIA-Moleküle wurden von Z. coll-"/ir ten mit Hilfe herkömmlicher Methoden der Isolierung von Plar:mid-DITA isoliert und die Hybridmoleküle mit Xbal digeriert, um die Orientierung der eingefügten Plasmide su bestimmen. Von den drei gewählten Plasmiden hatten zwei, pICII01 und pKH82, das DNA-Fragment, das für HBcAg in dor gleichen Orientierung kodiert wie das für Erythromycin-Rcsistenz kodierende Gen. Das andere isolierte Plasmid pXH83 wies das in der entgegengesetzten Richtung eingefügte HBcAgverwcndte DlJA-Pragment auf (Fig. 1).

Die Beeillua aubtili.s Stämme MH19 (leu ü6,trpC2, r", m") ("Restriction Of Plasmid Mediated'Transformation In Bacillus subtilis 168" (Restriktion von durch Plasmid vom.it·!; el ton Transformationen in Bacillus subtilir; 168, LoI. Gen. Oene_l. , 175, S. 235 - 237 (1979)) und SL65O (spoIIA69, trpC2, rif-2) (ein Geschenk von R. Piggot)⁺ wurden mit pKIIOl , J)kII82 und pKH83 unter Anwendung herkömmlicher T'othoden transformiert (Contente und Dubnau "Characterization Of Plasmid Transformation in Bacillus subtilis: Kinetic Properties And The Effect Of DNA Conformation" (Charakterisierung von Plasmid-Transformationen In Bacillus subtilis;Kinetische Eigenschaften und der Einfluß der DNA-Anordnung), I'ol. Gen. Genet., 167, S. 251 - 258 (1979)). Entsprechend transformierte Bazillenwirte wurden dann mit Hilfe von Resistenz gegenüber Kanamycin und Sensibilität gegenüber Erythromycin ausgewählt. Die Struktur der Plasmide in diesen ausgewählten transformierten Bazillenwirten wurde ebenfalls durch Isolierung, der Plasmid-DNA von dem Wirt (Lovett und Keggin "Bacillu3 subtilis As A Host For Molecular Cloning" (Bacillus subtilis als Wirt für Molekülcloning)in Methods of Engymol. , 68, S. 342 - 347 (1979)) und Digerieren der Plrirmid-DIIA mit Xbal bestätigt.

(+ Stamm SL65O -erzeugt nicht die Sporen oder Proteasen, die gewöhnlich durch die gut sporenbildenden B.subtilin erzeugt werden.)

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Die Bazillenwirte, die mit pKH81, pKH82 und pKH83 transformiert worden waren, wurden nach der Induktion mit sub-inhibierenden Konzentrationen (0,05/Ug/ml) Erythromycin (um die Synthese von Polypeptiden zu induzieren, die in das für Erytbromycin-Resistenz kodierende Gen eingefügt wurden) auf die Erzeugung von Produkten, die die Antigenwirkung von HBcAg aufweisen, mit Hilfe der Festphasen-Radxoimmunoanalyse hin untersucht (siehe z.B. CJ. Burrell, u.a., supra). Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Transformierter Stamm B. subtilis MH19 (pKH81) B. subtilis MH19 (pKH82) B. subtilis MH19 (pKH83)

B. subtilis SL65O (pKH81) B. subtilis SL65O (pKH82) B. subtilis SL65O (pKH83)

Beispiel II Radioimmunoanalyse (HBcAg)

In Pig. 2 wird eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform eines erfindungsgemaßen Bazillenwirt-Cloningvektor-Systems und eines erfindungsgemaßen Verfahrens gezeigt. In diesem Ausführungsbeispiel werden eine biologische oder immunologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon ("IFN-ot. ") aufweisende Polypeptide dadurch erzeugt, daß für das Polypeptid kodierendes DNA-Fragment in einen erfindungsgemaßen Bazillenwirt-Cloningvektor eingesetzt und ein Bazillenwirt mit derartigen Vektoren transformiert wird, damit sich das eingefügte DNA-Fragment replizieren kann und in dem Bazillenwirt verwirklicht werden kann und das IFN-oC-Produkt erzeugt werden kann.

7/ie in Fig. 2 dargestellt wird, wurde ein anderer erfindungsgemäßer Bazillen-Cloningvektor durch Vereinigen von Plasmid pAB124, isoliert aus einem thermophilen Bazillen-

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stamm, und seiner Deletion-Derivate pAB224 und pAB424 (A.H.A. Bingham, u.a., Jour. Gen. Microbiol., 114, S. 401 408 (1979), A.H.A. Bingham u.a., Jour. Gen. Microbiol., 119, S. 109 - .115 (1980) mit Plasmid pBR325 konstruiert. Die Ligation der beiden Plasmide wurde durch Spalten jedes der Plasmide mit EcoRl und Vereinigen der beiden linearisierten Plasmide in Gegenwart von T4-DHA-Ligase herbeigeführt. Da pBR325 die für Penicillinase-Resistenz (Amp ) und Tetracyclin-Resistenz (Tet ) kodierenden B. coli-Gene trägt und pAB124, pAB224 und pAB424 das für Tetracyclin-Resistenz

(Tet )kodierende Bazillengen tragen und keines dieser Gene durch die Fusion inaktiviert worden ist, tragen die als pAH2 (von pAB124), pAH49 (von pAB224) und pAH42 (von pAB 424) bezeichneten kombinierten Plasmide eine Ampicillin-Resistenz-Markierungssubstanz und die E. coli- und Bazil-r len-Tetracyclin-Reeistenz-Markierungssubstanzen. Einwandfrei konstruierte Plasmide wurden durch Transformation ^von E. coli HB 101 mit den Plasmiden und Selektion hin- ; sichtlich Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetracyclin und Sensibilität gegenüber Chloramphenicol gewählt.

(+ Die richtig konstruierten Plasmide sind gegenüber Chloramphenicol ("Cm^R") empfindlich, weil pBR325 das für Chloramphenicol-Resistenz kodierende Gen enthält, aber dieses Gen wurde durch die Insertion der Bakterienplasmide in seine E. coli-Stelle inaktiviert.)

Die oben erzeugten chimärischen Plasmide oder Cloningvektoren waren in den E. coli-Stämmen HB101, DS410 und DB11 und in den Bazillenstämmen BD224 und MH19 beständig. Es waren keine Deletionen oder Umlagerungen in aus diesen Stämmen nach der anfänglichen Transformation erneut isolierten Plasmiden zu beobachten.

Um die Brauchbarkeit von pAH49 als Cloningvektor in Bazillenwirten demonstrieren zu können, wurde ein DM-Fragment,

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das für eine biologische oder immunologische Aktivität von IFN- aufweisende Polypeptide kodiert, ausgewählt und in den Cloningvektor und in mit dem Rekombinant- oder Hybrid-DlTA-Molekül transformierte Bazillenwirte eingesetzt, um Polypeptide, die eine biologische oder immunologische Aktivität von IFiT-ö( aufweisen, zu erzeugen.

Plasmid pLM/UlF-8, ein Plasmid, das ein DNA-Fragment enthält, das für IFIT-(A(I) oder 2b (S. Nagata, u.a. , supra) mit Unterstützung durch pLM /U (Fig. 2) kodiert, wurde mit EcoRI und Psti zur Entfernung des das IFN-oC-Gen enthaltenden 1,8 Kb EcoRI-PstI-Fragmentes digeriert. Dieses Frag ment wurde danach zum Ersetzen des 0,98 Kb EcoRI-Psjtl-Frag mentes von pHA49 verwendet. Das resultierende Hybrid- oder Rekombinant-DNA-Molekül wurde durch Größenbestimmung selek tiert und als pAH49-G4 bezeichnet.-

( Plasmid pAH49-Ei6 stammte von der Deletion des EcoRI-

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EcoRI-Fragmentes, das das Bakterien-Tetracyclin-Resistenz-Gen enthielt (Fig. 2).)

E. coli HB101 wurde mit pAH49-G4 und einem Deletions-Derivat des Plasmids pAH49-Ei6 transformiert. Außerdem wurden Wirte von Bacillus subtilis SL65O und MH19 mit pAH49-G4 transformiert. Die Interferon-Erzeugung mit Hilfe dieser transformierten Wirte wurde in einer herkömmlichen Weise beurteilt (S. Nagata, u.a., supra). Es wurden folgende Ergebnisse ermittelt:

Transformierter Stamm Einheiten IFN/Liter

E. coli. IiB101 (pAH49-G4 100-200 χ 10

) ,6

E. coli. HB101 (pAH49-Ei6) 5- 10 χ 10⁶

B. subtilis MH19 (pAH49-G4) 1- 5 x

B. subtilis SL65O (pAH49-G4) 1- 2 χ 10⁶

- 19 - Beispiel III

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In Fig. 3 wird eine scheinet is ehe Skizze einer anderen erfindungsgemaßen Ausführungsform eines Bazillen-Cloningvektor-Systems und Verfahrens gezeigt. In diesem Ausführungsbeispiel werden Polypeptide, die die Spezifität von FMD-Virusantigeneh aufweisen, so erzeugt, daß ein für das PoIypeptid kodierendes DNA-Fragment in einen Bazillen-Cloningvektor eingesetzt wird und ein Bazillehwirt mit einem derartigen Vektor transformiert wird, damit sich das eingefügte DNA-Fragment ,replizieren kann und in einem Bazillenwirt verwirklicht werden kann, und damit das Antigenprodukt erzeugt wird.

Wie in Fig. 3 gezeigt wird, wurde Plasmid pBD9 (supra) mit Bell linearisiert und das linearisierte Plasmid mit BamHI-linearisiertem Plasmid pP^VPl-I (Küpper, u.a., supra) in Gegenwart von T4-DNA-Ligase vereinigt. Bacillus subtilis BD170 (Contente und Dubnau, supra) wurde dann mit dem resultierenden Rekombinant-DNA-Molekül transformiert und entsprechend konstruierte Plasmide anhand der Sensibilität der transformierten Wirte gegenüber Erythromycin (5/Ug/ml) ausgewählt. Diese würden als pEVP-1 bezeichnet.

Bei keinem der oben beschriebenen Polypeptide konnte beobachtet werden, daß es extrazellulär von dem Bakterienwirt, der mit den in den Beispielen I - III beschriebenen Plasmiden transformiert worden war, abgesondert wurde. Ein solches Verhalten war jedoch vorauszusehen, da keine der für derartige Produkte kodierenden DNA-Sequenzen eine DNA-Signalsequenz enthielt oder mit ihr verschmolzen war, die erkannt und für die Sekretion durch Bazillenwirte einwandfrei verarbeitet würde. Signalsequenzen, die von Bakterienwirten erkannt werden, sind bekannt. Sie umfassen beispielsweise die Signalsequenz für' das Penicillinasegen von Bacillus · lichenoformis (bestimmt von H. Schaller, private Mitteilung·)

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und die Signalsequenz für das für c*. -Amy la se kodierende Gen. Daher wird die Konstruktion eines Plasmids, um ein fremdes Gen mit einer solchen Signalsequenz zu schaffen, die Sekretion des Produktes des fremden Gens aus dem Bazillenwirt ermöglichen. Derartige Konstruktionen stellen keine Abweichungen vom Geltungsbereich der Erfindung dar und sollten als ein zu ihr gehörender Teil angesehen v/erden.

!lach der Induktion mit Erythromycin (0,05 /ug/ml) wurden Polypeptide durch die ausgewählten transformierten Bazillenv/irte erzeugt, die die Spezifität von FMD-Virusantigenen bei Untersuchungen aufweisen, wie sie im wesentlichen von Küpper, u.a., supra beschrieben wurden.

ITach den hier beschriebenen Verfahren hergestellte Mikroorganismen und Reko'mbinant-DNA-Moleküle werden durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung 'der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen, BRD, am 27. April 1^81 hinterlegt und als A bis C identifiziert wurden:

A: Bacillus subtilis MH19 (pKH81) B: Bacillus subtilis BD170 (pBVP-1) C: Bacillus subtilis MH19 (pAH49-G4)

TTc.chdem bisher eine Anzahl von erfindungsgeraäßen Ausführungs beispielen erläutert worden ist, wird deutlich, daß die grundlegende Konstruktion zur Schaffung anderer Ausfübrungsformen unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verändert werden kann. Daher wird der Geltungsbereich der Erfindung durch die angeführten Ansprüche und nicht durch spezifische Ausführungsformen, die oben als Beispiele angeführt wurden, bestimmt.

Claims

5008 58 Erfindungsanspruch,; 239417

1. Verfahren zur Herstellung eines Polype ptids durch Züchten eines durch ein Rekombinant-DNA-Molekül, das eine für das Poiypeptid kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierten Wirtes und Sammeln des Polype pt ids, gekennzeichnet dadurch, daß es die Schritte umfaßt: Züchten eines Bazillus-Wirtes, der mit einem mit dem Bazillus-Wirt verträglichen Rekombinant-DNA-Molekül transformiert wurde und im wesentlichen aus einem intakten Replikon, mindestens einer Endonuclease-Erkennungsstel-Ie, an der das Molekül in bestimmbarer V/eise ohne damit verbundenen Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion abgebrochen werden kann und einer DNA-Sequenz, von der zumindest ein Teil für ein Nicht-Bazillus-Polypeptid kodiert, besteht, wobei die DNA-Sequenz in die Endonuclease-Erkennungsstelle eingefügt und dort operativ mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz verknüpft wird; und Sammeln des durch den Bazillus-Wirt erzeugten Polypeptide.

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Rekombinant-DNA-Molekül, entweder in der ursprünglichen Konstruktion oder nach Einfügen der DNA-Sequenz, mindestens eine Markierungssubstanz enthält, die für die Indent ifizierung von mit dem Rekombinant-DNA-Molekül transformierten Bazillus-Wirten geeignet ist.

3. Verfahren nach. Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem Rekombinant-DNA-Molekül um eine Kombination von mindestens einem Abschnitt einer DNA-Sequenz, die die Fähigkeit zur Replikation in Ε_^ cοIi besitzt, und mindestens einem Abschnitt einer DNA-Sequenz, die die Fähigkeit zur Replikation in Bazillus besitzt, handelt.

4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das Rekombinant-DNA-Molekül zum Teil einen aus der pKH80, pAH2, pAH49, pAH28, pEVP-1 und Derivate davon umfassenden Gruppe ausgewählten Bazilius-Cloning-Vektor enthält.

ZZ.

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5. Verfahren nach Punkt 3 oder 4, gekennzeichnet dadurch, daß es den Schritt umfaßt: Vereinigen mindestens eines Abschnittes einer DNA—Sequenz, die die Fähigkeit zur Replikation in E^ coil besitzt, mit mindestens einem Abschnitt einer DNA-Sequemz, die die Fähigkeit zur Replikation in Bazillus besitzt, wobei durch den Schritt der Vereinigung der beiden DNA-Sequenzen die Fähigkeit des Rekombinant-DNA-Molekül zur Replikation irr Bazillus nicht zerstört wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß eine DNA-Sequenz vorhanden ist, -von- der zumindest ein Abschnitt für eine eukaryotische oder Virus-Aminosäuresequenz kodiert, wobei die DNA-Sequenz so in das Rekorabinant-DNA-Molekül eingefügt wird, daß die Fähigkeit des Rekombinant-DNA-Moleküls zur Replikation in Bazillus-Wirten nicht zerstört wird und daß sie operativ mit einer Bazillus-Expressions-Kontroll-Sequerrz, verknüpft wird·

7· Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die eukaryotische oder Virus-Aminosäuresequenz eine immunologische oder biologische Aktivität von aus der Leukozyten-Interferon, F ibr ob last-Interferon, andere Interferone, Insulin, Human*- und Tierwachstumshormone, Hepatitis-B-Virus-Kernantigene,· Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigene, FMD-Virus-Antigene und andere Human-, Tier- und Viruspolypeptide umfassenden Gruppe ausgewählten Polypeptiden aufweist.

8. Verfahren nach Punkt 6 und 7> gekennzeichnet dadurch, daß es folgenden Schritt umfaßt: Einfügen einer DNA-Sequenz, vorr der zumindest ein Abschnitt für eine eukaryotische und Virus-Aminosäuresequenz kodiert, in ein Rekombinant-DNA-Molekül nach einem der Punkte 1 bis 4, wobei der Schritt der Einfügung der DFA-Sequenz die Fähigkeit des Rekombinant-DNA-Moleküls zur Replikation in Bazillus nicht zerstört.

Z2>

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9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß das Polypeptid eine immunologische oder biologische Aktivität von aus der Leukozyten-Interferon, Fibroblast-Interferon, andere Interferone, Insulin, Human- und Tierwachstumshormone, Hepatitis-B-Virus-Kernantigene, Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigene, FMD-Virus-Antigene und andere Human-, Tier- und Viruspolypeptide umfassenden Gruppe ausgewählten Polypepetiden aufweist·

Hierzu 3 Blatt Daretellung