JPS58116691A - Ｌ−スレオニンの取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＤＬ−スＩ／オニンに新規な酵素でろるＤ−ス
レオニンアルドラーゼ全作用させることによってＤ−ス
レオニンを選択的に分解させ、Ｌ−スレオニンを単離す
る方法に関する。

Ｌ−スレオニンは人間および動物の必須アミノ酸のひと
つであり、各種動、植物蛋白質中の含有量が比較的少な
いことから食品および飼料添加物として潜在需要の大き
なものである。このＬ−スレオニンは、従来は天然物よ
りの抽出法とか発酵法で製造されて＠たが、比較的高価
であったために安価な製造法が待望されていた。

一方、ＤＬ−スレオニンは合成法に工って安価かつ大量
生産されている。ＤＬ−スレオニンを光学分割する方法
はａｈ知られているが、いずれも分割操作が非常に煩雑
なうえ収率が低いものであった。捷だ、この光学分割に
よって同量のＤ−スレオニンが得られるが、このＤ−ス
レオニンの需要はほとんどなぐ、また、ラセミ化すると
一般［アロ体を副生することから、ラセミ化も有効な方
法ではない。

本発明者らはＬ−スレオニンの安価な供給源としてＤＬ
−スレオニ７１４着目し、ＤＬ−スレオニンの簡便かつ
効率的な光学分割とそｆｌ−にょって副生するＤ−スレ
オニンの有効利用を図って安価なＬ−スレオニン全市場
に供給するべく種々何発の結果、た−！た１Ｄ−ヌレオ
ーンを慝択的に分解してグリシンとアセトアルデヒドを
生成させる新規な酵素、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを
発見し、この酵素をＤ　Ｌ−スレオニンに作用させれば
Ｌ−スレオニンを容易に単離し副生物もグリシンとアセ
トアルデヒドであるから容易に有効利用しうろこと全見
出し、これに基いて本発明を完成するに至つ友。

すなわち本発明は、ＤＬ−スレオニン［Ｄ−スレオニン
アルドラーゼ全作用させることを特像とす、６ＤＬ−ス
レオニンからＬ−スレオニン會取得する方法に関するも
のである。

Ｄ−スレオニンアルドラーゼ′はＤ−スレオニン及びＤ
−アロスレオニンに作用してグリシンとアルデヒドに分
解する酵素で、例えばアルカリゲネスハエ力リス（Ａｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉａ　）工ＦＯ１２
６６９、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）
ＤＫ−２微工研菌寄第６２００号、およびアリスロバク
タ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）　Ｄ　Ｋ　−１９
微工研菌寄第６２０１号などがこのＤ−スレオニンアル
ドラーゼを産生する能力を有する。

シュードモナスＤＫ−２微工研菌寄第６２００号および
アリスロバクターＤＫ−１９微工研菌寄第６２０１号の
菌学的性質を次に示す。

（ａ）形態 （ｂ）　　各培地における生育状態 （Ｃ）　　生理学的性質 辺上の菌学的性質をもとに１パージニーズ・マニュアル
・オブ・デターミ不イテイプ・バタテリオロジー　第８
版（１９７４）Ｊ葡参照１〜て分類すると、ＤＫ−２菌
はグラム１観性の桿菌で極鞭毛會有し、オキシダーゼ陽
性、脱窒反応１４性であるところから、シュードモナス
属に属するものと同定した。一方、ＤＫ−１９菌はグラ
ム染色性が弱い桿菌で、多形性及び周毛全有し、糖類を
資化できないことからアリスロバクター属に属するもの
と同定した。

Ｄ−スレオニンアルドラーゼは例えばこれらの微生物を
栄養培地に培養すれば生成させることができる。栄養培
地は細菌を培養する通常のものでよく、戻素源としては
グルコース、キシロース、グリセロール、糖蜜等の糖類
、あるいは酢酸、リンゴ酸等の有機酸など、窒素源とし
てハ硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿累なと、
有機栄養源として酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コ
ーンステイープリカー々と、そして無機イオンとしてマ
グネシウム、鉄、マンガン、カリウム、リン酸塩などを
含むものを用いる。

培養方法も細菌を培養する常法に従って行なえはよく、
培地のｐＨを４−１０として菌全接種後２０〜６０°Ｃ
で１〜３日間好気的に培養すればよい。

このようにして得られるＤ−スレオニンアルドラーゼは
主に菌体内に生成蓄積される。そこで、培養液からＤ−
スレオニンアルドラーゼを単離する場合にはまず菌体を
機械的方法、酵素処理する方法、自己溶解法などの公知
の方法の方法によって破壊して粗抽出液金得る。それか
ら、この粗抽出液を硫安沈澱、溶媒沈澱、種々のイオン
交換体や吸着剤を用いたクロマトグラフィーなどを適宜
組合せて精製することＫよって高純度の酵素標品を得る
ことができる。本酵素の活性発現には、補酵素としてピ
リドキサール−５′−リン酸を必要とするため、反応時
には通常１０−３〜１０−５Ｍで存在させる。

次に、酵素製造例１で得られた酵素標品にっいて理化学
的性質を測定した結果を記す。

■作用および基質特異性 本酵素はＤ−スレオニンおよびＤ−アロスレオニンを分
解してグリシンとアセトアルテヒドを生成する。一方、
Ｌ−スレオニンおよびＬ−アロスレオニンにはまったく
作用しない。

■至　適ｐＨ Ｄ−スレオニンを基質として各ｐＨにおいて３０°Ｃで
１０分間反応させ、生成したアルデヒドを定量したとこ
ろ、本酵素の至適ｐＨは７〜９にめった。尚、用いた緩
衝液はｐＨ４〜７．５までは０．１　Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ７〜９までは０．１　Ｍ　）リスー’ｍａｔ緩衝液
及びｐＨ９〜１１までは０．１Ｍ炭酸ソーダ緩衝液であ
る。

■安定ｐＨ範囲 酵累溶液全各ｐＨにおいて３０℃で１時間加温後、溶液
中の残存活性を測定したところ、本酵素の安定ｐＨ範囲
は６〜９にあった。尚、用いた緩衝液はｐＨ４〜７．５
までは０．１ＭＩＪン酸緩衝液、ｐＨ７〜９まではＱ、
Ｉ　Ｍ　トリス−ＨＣ７緩衝液及びｐＨ９〜１１までは
０．１Ｍ炭酸ソーダ緩衝液である。

■力価の測定法 酵素含有液０．１−を１００μｍｏｌｅのＤ−スレオニ
ン結晶有するｐＨ８，０の０．１　Ｍ　）リス−塩酸緩
衝液０．４−に加え、３０°Ｃで１０分間加温して生成
したアセトアルデヒドをＦａｚ法（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　Ｖｏｌ、　１０９
　、　ｐ５４８（１９６５））　　によって定量して求
め友。尚、１分間に１μｍｏｌｅのＤ−スレオニンを分
解する酵素活性を１Ｕとした。

■作用適温の範囲 Ｄ−スレオニンを基質としてｐＨ８，０の０．１Ｍ　）
　ＩＪスス−酸緩衝液を用い、各温度で１０分間反応さ
せ、生成したアセトアルデヒドを測定したところ、本酵
素の至適温度は４０〜５０°ＣＶＣめった。

■熱安定性 ｐＨ８，０の０．１　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液に溶解し
た酵素溶液を各温度で１時間加熱後、溶液中の残存活性
を測定したところ、本酵素の安定温度は４０”Ｃ以下で
めった。

■ｐＨ１温度などによる失活の条件 本酵素はｐＨ５以下、ｐＨ１１Ｊ−１上、および温度７
０°Ｃ以上では１時間に失活する。

■阻害、活性化および安定化 本酵素はメルカプトエタノール、亜硫酸ナトリウム、亜
硫酸水素ナトリウム、ジチオスレイトール、Ｍｎ２＋、
□　ｏ　２　＋、Ｆ１８２＋、Ｍｇｚ＋によって活性化
され安定化される。−万、Ａｇｌ　＋、Ｏｕ”士、Ｈｇ
Ｚモ、ｚｎＺ＋、ｐｄ２＋、ヒドロキシ／シアミン、ｐ
−クロルマーキュリ−安息香酸によって阻害される。

■補酵素 本酵素の補酵素はピリドキサール−５′−リン酸である
。

酵素製造例１で得られた酵素は以上のような理化学的性
質を有しているが、従来知られているスレオニンアルド
ラーゼは丁べてＬ−スレオニンを分解するものでろって
、Ｄ−スレオニンを分解するものは全く知られていない
ところから、この酵素は全く新しい作用全有する１１規
酵素でるる。

ＤＬ−スレオニンに作用せしめる酵素は、要はＤ−スレ
オニンを分解してグリシンとアセトアルデヒドを生成し
うるものであればよい。１だ、このｒ＃累は酵素活性全
発揮しうる形態であればたり、単離された形に限定され
るものではない。

従って、半精製品でもよく、粗抽出液、さらには培養物
、生菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体ろるいはこ
れらの菌体の磨砕物等でろってもよい。さらに、酵素自
体あるいは菌体のま＼公知の手段で固定化して用いても
よい。固定化方法は担体結合法、架橋法、包括法、凝集
法などを広く利用できる。

ＤＬ−スレオニンは公知のいかなる方法で得られたもの
であってもよいが、不発明の方法はＤＴ。

−スレオニンを不斉分解してＬ−スレオニンを得るもの
であり、一方、副産物がグリシンとアセトアルデヒドで
あるから、合成反応はアロ体の副生が少なく、マたグリ
シンとアセトアルデヒド全原料とするものが好都合であ
る。この点で、グリシンに金属塩を作用させてグリシン
金属錯体を形成させ、これにアセトアルデヒド會縮合さ
せてＤＬ−スレオニンを製造する方法（特公昭４８−２
１０９４、特公昭４０−２７７５２など）は本発明にお
いてＤＬ−スレオニン全製造する方法として好適である
。ＤＬ−スレオニンは結晶を水に溶解して用いてもよい
が、合成反応液ろるいはそこからＤＬ−スレオニン結晶
を取得する各種の中間精製工程液であってもＩい。

合成反応液等を使用する場合には、酵素反応１＃１害物
質があれば事前に除去する必要かめることはいう１でも
ない。例えば、合成反応に用いる金属イオンが有害でめ
ればカチオン交換樹脂などで事前に除去しておく。

Ｉ）Ｌ−スレオニンにＤ−スレオニンアルドラーゼを作
用させるには、要は両者を水性媒体中で混合子れば工い
。ＤＬ−スレオニンは酵累活性ｔ著しく阻害しない程度
であればよいが、０．１〜２モル／ｌ程度が好ましい。

反応系の溶媒は原則として水であるが、酵素反応を阻害
しない有機溶媒等が含１れていてもよい。反応時のｐＨ
は使用する酵素によって異なるが、例示した微生物が産
生ずる酵素の場合にはｐＨ７〜１０付近が好ましい。反
応温度も使用する酵素［よるが、例示した微生物が産生
ずる酵素の場合には３０〜４５℃の範囲が好適でおる。

１だ、この微生物の酵素の場合には、補酵素として、１
０−３〜１０６Ｍ程度のピリドキサール　５−リン酸を
共存させると酵素反応を促進させることができる。

その他種々の目的で界面活性剤などを添加してもよい。

反応はバッチ方式で行なっても工く、連続方式で行なっ
てもよい。かぐして、反応は５〜１００時間程度で終了
する。

反応終了後は、必要にエリ遠心分離、−過等で懸濁物を
除去してから、イオン交換樹脂処理、晶析等で精製し、
活性炭等で脱色してこの脱色液全濃縮することに１って
Ｌ−スレオ＝７結晶を純粋な形で取得することができる
。酵素反応によってグリシンとアセトアルデヒドが副生
するが、グリシンは例えばイオン交換樹脂を用いタクロ
マトグラフイーによって容易に分離して回ワすることが
できる。アセトアルデヒドは酵素反応中に同時に副生す
るグリシンと縮合反応し７（す、Ｄ−スレオニンアルド
ラーゼによる逆反応を起こしてグリシンと再結合してＤ
−スレオ＝　ンやＤ−アロスレオニンを生じたりするの
で、アセトアルデヒドはむしろ反応中に蒸溜等で回収し
てしまうのがよい。

本発明の方法を用いれば、工業的に安ＩＩｌ］ｌｔ／Ｃ
大量生産されているＤＬ−スレオニンを簡便な手段で容
易に取得することができ、安価なＬ−スレオニンを市場
に供給できる。また、副生するグリシンとアセトアルデ
ヒドも市場価値の高いものであり、特にグリシン、また
はグリシンとアセトアルデヒドを出発物質とするＤＬ−
スレオニンの合成法と組合わせれば、これらの副産物全
合成原料として再利用できるのでさらに好ましい。

次に、酵素製造例を示す。なお、チは丁べて重量チであ
る。

酵素製造例　１ ポリベグトン０．５％、酵母エキス０．２チ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４０，１％　、　ＭｇＳＯ４０，０５係、Ｌ−グルタ
ミン酸０．１％、およびＤ−スレオニン０．２％カラす
るｐａ　７．５の培地を調製し、５１容の培養槽にその
３１を投入して１２０°Ｃで１５分間加熱殺菌した。こ
の培地にアリスロバクタ−ＤＫ−１９微工研菌寄第６２
０１号を接種し、ｐＨ８ＶＣ保ちながら３０°Ｃで２０
時間通気および攪拌をしつつ培養した。

培養終了後、培養液から菌体を遠心分離し、０．９チ食
塩水で洗浄後この湿菌体を１０ｍＭメルカプトエタノー
ルおよび０．ｌｆｉＭピリドキサール５−リン酸を含む
ｐＨ７，５の０．１Ｍリン酸緩衝液１０〇−中に分散し
た。この菌体分散液を２０　ＫＨ２の超音波にて５分間
５回処理してから遠心し、上清成金分取した。次いで、
上清液ｔこプロタミン硫酸を加えて核酸全除去し、さら
にｍｆ分画してＤ−スレオニンアルドラーゼ活性宮Ｍ画
分を集め′ｆＣ８ この自分金１０７７１Ｍメルカプトエタノールおよび０
．１１７ＬＭピリドキサール５−リンｆｉｔ　’（１ｍ
含むｐＨ７，５の０．０１　Ｍリン酸緩衝液で透析後Ｄ
ｇＡｌ！；−セファデックスＡ−５０１００ｍｊ勿充填
したカラムに通液し、ＫＯｊ塩濃度勾配法にて溶出し、
Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性区分を集めた。この区
分を限外ｐ適法にて濃縮し、スレオニン脱アミン酵素を
含まない精製Ｄ−スレオニンアルドラーゼ溶液１［］ｍ
ｔ’ｉ得た。この溶液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活
性は５Ｕ／ＷＬｔでめった。

酵素製造例　２ シュードモナスＤＫ−２微工研菌寄第６２００号および
アルカリゲネスハエカリスエＦＯ１２６６９を用い、い
ずれも酵素製造例１と同じ培地に同様に培養し、培養液
から同様に分離操作を行なって精製Ｄ−スレオニンアル
ドラーゼ溶液１゜−を取得した。得られた酵素溶液のＤ
−スレオニンアルドラーゼ活性は、シュードモナスＤＫ
−２菌の場合には４．５Ｕ／−２そしてアルカリゲネス
ハエカリス菌の場合には４．２Ｕ／＋＋＋ｔでめった、
以下、実施例を示す。なお、スレオニン、アロスレオニ
ン、およびグリシンは、ｔθｒｔ−ブチルアルコールニ
メチルエチルケトン：　水：　碗アンモニアの比が４：
３：２：＋の混合液を展開溶媒としてペーパークロマト
グラフィーを行ない、ニンヒドリンで発色させてグリシ
ン、スレオニンおよびアロスレオニンのスポラトラ切抜
き、硝酸銅＠　ｏ、ｏ　ｏ　ｓ％含むメタノールで抽出
して比色定量した。また、アセトアルデヒドはＰＥｔＧ
６０００Ｘ６ｍのカラムを用いたガスクロマトグラフィ
ーで定量した。

次に本発明を実施例について説明するが、本発明はこれ
によりなんら限定されるものではなく、又以下の実施例
におけるＤ　Ｌ−スレオニン結晶は次の合成法によった
。

ＤＴ、−スレオニンの合成例 グリシン７５５’を水５１に加熱溶解し塩基性炭酸％Ｊ
１００ｔｋ徐々に加え加熱反応させる。

反応終了後過剰の塩基性炭酸銅を熱溶液から戸別し、こ
の１液を減圧濃縮後冷却すると結晶グリシン銅１１０１
會得る。

次にこのグリシン銅５８ｖ１アニオン交換樹脂Ｓ　Ａ　
２１　Ａ　（ＨＣＯ２型）４０ｆお工びアセトアルデヒ
ド４５−を水１１に加え４０°Ｃで２時間かく拌反応さ
せる。反応完了後、反応液を５°Ｃで２４時間放置すれ
ばビスアセトアルデヒドスレオニン銅の結晶が析出して
くる。これをろ過し、触媒とともに戸別された結晶を３
％アンモニア水０．６１ＶＣ懸濁し、再び濾過する。こ
のｐ成金キレート樹脂ダウエックスＡ−１（ＮＨ４型）
１，２ノを充填したカラムに通過せしめ脱銅し、ニンヒ
ドリン反応陽性の部分を集め、この溶液を減圧にて濃縮
し、メタノールを加えて析出する結晶を含水メタノール
エリ再結晶すればアロスレオニンをまったく含まないＤ
Ｌ−スレオニン４１２が見られた。

実施例　１ ＤＬ−スレオニン結晶２．ｓ８？、ピリドキサール５−
リン酸１０−６モル、メルカプトエタノール１０−４モ
ル、および塩化マンガン１０−３モルを含む３０ゴの水
溶液に酵素製造例１で得られた精製Ｄ−スレオニンアル
ドラーゼ溶液１０ゴを加え、減圧蒸溜して生成したアセ
トアルデヒドを反応液から除去、回収しながら３０゛Ｃ
で２４時間反応させた。反応中は０．Ｉ　ＮＮａＯＨで
反応液のｐＨ全７．５〜８．５に保持した。

反応終了後、反応液を希塩酸で中和してからＨ＋型のＤ
ｏｗｅｘ　５０ＷＸ８１００−を充填したカラムに通液
し、水洗後、０．２Ｎアンモニアで吸着したスレオニン
、グリシン等を溶出し友。溶出液を減圧濃縮して乾固し
、水２０−で再溶解して、希塩酸を加えて酸性水溶液に
して（ｐＨ３）再びＨ十型のＤｏｗｅｘ　５０ＷＸ８　
１００　ｍｌ　ｆ充填したカラムに通液した。水洗後、
こんどは０．０５　Ｎアンモニアを通液してスレオニン
含有区分を溶出させ、溶出液を減圧下で乾固した。この
乾固物に水１０ｔｎｔを加えて溶解し、エタノール１０
ｍ１’ｉ徐々に添加して析出した結晶全分離した。

得られた結晶は乾燥重量で０．９５　ｆであり、ペーパ
ークロマトグラフィーによってスレオニンの純品である
ことを確認した。また、比旋光度も（ｆｆ、１者７＝−
２ａ７（Ｈ２Ｏ）でめり、Ｌ−スＬ／オ＝ンの純品のそ
れと一致した。

０．０５　Ｎアンモニアを更に通撤し、グリシン含有区
分を溶出し、溶出液を減圧下で乾固した。

乾固物に水４−を加えて溶解し、エタノール４−を徐々
に添加して析出した結晶を分離した。

得られた結晶は乾燥重量で０．６１であり、ペーパーク
ロマトグラフィーで分析したところグリシンのみでａつ
７２１．。

一方、反応中に減圧蒸溜で回収されたアセトアルデヒド
は０．５ｆでめった。

実施例　２ 酵素製造例２でシユードモナスＤＫ−２微工研菌寄第６
２００号エリ得られた精製Ｄ−スレオニンアルドラーゼ
溶液１０ｆＩＸｔを用い、実施例１と同様に反応させ、
分離操作を行なったところ、やはりアロスレオニンを全
く含まないスレオニンの結晶０゜９６ｆ１グリシン結晶
０．６２ｒ、およびアセトアルデヒド０．５１　Ｓ’が
得られ′ｆ′ｃｏなお、スレオニン結晶の比旋光度は〔
α］；７＝−２ａ７（Ｈ２Ｏ）で、Ｌ−スレオニンのみ
であった。

実施例　３ 酵素製造例２でアルカリゲネス・ハエ力リスＩＦＯ１２
６／）９より得られた精製Ｄ−スレオニンアルドラーゼ
溶液１０づを用い、実施例１と同様に反応させ、分離操
作を行なったところ、アロスレオニン”を全＜含ｔない
スレオニン（７）　Ｍ　晶Ｑ、９２Ｓ’、グリシン結晶
０．５９ｆ、お裏びアセトアルデヒド０．５Ｏｆが得ら
れた。なお、スレオニン結晶の比旋光度け（ａ〕”Ａ　
＝−２ａ７（Ｈ，、ｏ）−ＣＴＪ−スレオニンのみでめ
った。

実施例　４ 反応中に減圧蒸製操作を行なわなかった点を除いて、実
施例１と同様に反応、分離操作を行なったところ、アロ
スレオニン１０係を含むスレオニン結晶０．８ｒ、グリ
シン結晶０．５ｆ、お工びアセトアルデヒド０．０５１
が得られた。

特許出願人　　電気化学工業株式会社 代理人　中　不　　宏 〃　　　　井　　−ト　　　　　昭 第１頁の続き ０発　明　者　小泉典秋 茨城県新治郡桜村千現２−１１− ８径内ハイッ１０２号 ０発　明　者　山田秀明 京都市左京区松ケ崎本の不可１９ 番地の１ 手　　続　　補　　正　　薔　　（自発補正〕昭和５７
年４月１９日 特許庁長官　島　１）春　樹　殿 １事件の表示 昭和５６年特許卯混２０９９８４号 ２発明の名称 Ｌ−スレオニンの取得方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　　東京都千代田区有楽町１丁目４番１号名　
称　　Ｃ３２９）’！気化学工業株式会社代表者　　篠
　原　　　晃 住　所　　東京都港区西新橋３丁目１５番８号西新橋中
央ビル３０２号邂話（４３７）−５４６７氏　　名　　
　弁理士（７８５０）　　　中　　木　　　安住　　所
　　　同　　　上 ５補正命令の日付　　自発補正 ６．補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ７補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の４−の記載を下記のとおり
補正する。

（イ）明細書第１２頁１７行の次に下記の１．載を加入
する。

［［相］　分子量 セフ７デツクスＧ−２００によるゲル濾過の結果分子量
１００，０００〜１５０，０００と測定された。

■　元素分析値 元素分析値は次の通りである Ｃ　　：　　５　１．　７　　％ Ｈ：　　　７８　％ Ｎ：１５．７％　　　　　　　　　」 （ロ）　同第１５頁１５〜１６行「かくして、・・・終
了する。」を下記の記載に訂正する。

［反応時間は得られるＬ−スレオニンの使用目的に応じ
適宜選択される。たとえば未分解異性体の混在が許され
るよりなＬ−スレオニンを得たい場合には酵素分解反応
が完結する前に反応を停止すればよい。いずれにしても
反応時間は各酵素とも５〜１００時間程度時間分である
。−１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＤＬ−スレオニンにＤ−スレオニンアルドラーゼ全作用
   させることを特徴とするＤＬ−スレオニンからＬ−スレ
   オニンを取得する方法。