DE68924738T2

DE68924738T2 - Hitzestabile Lipoproteinlipase, Verfahren zu deren Herstellung sowie ein Reagenz zur Bestimmung von Triglyceriden, welches diese Lipase enthält.

Info

Publication number: DE68924738T2
Application number: DE68924738T
Authority: DE
Inventors: Masao C O Unitika Ltd Kageyama; Tomoko C O Unitika Ltd Kamei; Kenzo C O Unitika Ltd Motosugi; Akira C O Unitika Ltd Takeda
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1988-08-09
Filing date: 1989-08-09
Publication date: 1996-05-02
Anticipated expiration: 2009-08-10
Also published as: DE68924738D1; US5173417A; US5244798A; EP0354551B1; JP2693786B2; JPH0249581A; EP0354551A3; EP0354551A2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lipoproteinlipase mit hervorragender Thermostabilität und hoher Glycerinbildungsaktivität, ein Verfahren zur Herstellung der Lipase und ein Reagenz, das die Lipase enthält und sich für die quantitative Bestimmung von Triglyceriden eignet.

Hintergrund der Erfindung

Die Existenz einer Lipoproteinlipase (nachstehend als "LPL" bezeichnet) als ein Klärungsfaktor wurde 1943 von P. F. Hahn durch seine Studien über die Menge an roten Blutzellen im Kreislauf festgestellt. P. F. Hahn stellte fest, daß die Injektion von Heparin in ernährungsbedingt lipämische Hunde zur Klärung des milchigen Plasmas führt. Später wurde aufgeklärt, daß der Klärungsmechanisinus auf der Hydrolyse von Lipoprotein durch LPL beruht. LPL wurde in den Geweben verschiedener Tiere nachgewiesen. LPL spielt also eine wichtige Rolle beim Lipidmetabolismus bei Tieren.
Arima et al., Agr. Biol. Chein., Bd. 30 (1966), S. 515 berichteten, daß ein Enzym, das ähnlich zu LPL tierischen Ursprungs ist, in Mikroorganismen existiert, und dieses Enzym wurde als mikrobielle LPL bezeichnet. Da mikrobielle LPL in großen Mengen hergestellt werden kann, wurden Studien über die Nutzung inikrobieller LPL gefördert. Insbesondere wurden Anwendungen entwickelt, die die quantitative Bestimmung von Triglyceriden in Blut betreffen.
Mikroorganismen, die zur Bildung von LPL imstande sind, umfassen verschiedene Gattungen, wie Pseudomonas, Mucor, Streptomyces, Serratia, Aeromonnas, Bacillus (vgl. Agr. Biol. Chem., Bd. 31 (1967), S. 924, JP-B-41-7836 und JP-B-58-37835 (der Ausdruck "JP-B" bedeutet hier "geprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung") und Rhizopus (vgl. Agr. Biol. Chem., Bd. 43 (1979), S. 2125 und JP-B-58-37834). Da jedoch alle diese Mikroorganismen mesophil sind, zeigt daraus hergestellte LPL eine schlechte Stabilität.
Mit der in jüngster Zeit zunehmenden Verwendung von Enzymassays bei klinischen Untersuchungen hat die Instabilität von Enzymen zu großen Problemen geführt. Techniken, um thermostabile Enzyme aus thermophilen Mikroorganismen zu erhalten, sind entwickelt worden, um die Enzymstabilität zu verbessern.
Eine thermostabile LPL ist bis jetzt noch nicht entwickelt worden, und daher besteht daran ein großer Bedarf.
Ferner muß in Fällen, in denen LPL bei der quantitativen Bestimmung von Triglyceriden in Blut verwendet wird, LPL eine hohe Aktivität bei der Bildung von Glycerin zeigen, so daß die erforderliche Menge an verwendetem Reagenz verringert und die erforderliche Reaktionszeit verkürzt wird. Die Verwendung irgendwelcher bekannter LPL ist also nicht zufriedenstellend.
Es ist bekannt, daß Lipasen unter Einschluß von LPL eine Spezifität für die drei Esterverknüpfungen eines Triglyceridsubstrats zeigen. Bei der quantitativen Bestimmung von Blut-Triglyceriden unter Verwendung von LPL wird Glycerin, das durch Hydrolyse gebildet wird, in das Nachweissystem vorzugsweise durch ein Kupplungsenzym eingeführt. Um Glycerin in einer Menge zu bilden, die proportional zur Menge an Triglyceriden ist, ist es bevorzugt, eine LPL zu verwenden, die zur Hydrolyse der drei Esterverknüpfungen imstande ist, ohne eine Selektivität zu zeigen. Die Positionsspezifität der bekannten LPL gegenüber Esterverknüpfungen, die als Prozentsatz der Glycerinbildungsaktivität relativ zur Fettsäurebildungsaktivität ausgedrückt wird, ist im allgemeinen gering. Der höchste bisher berichtete Wert beträgt 1,97 % für LPL, die aus einem Mikroorganismus stammt, der zur Gattung Pseudomonas gehört, wie es in JP-A-59-187780 (der Ausdruck "JP-A" bedeutet hier "ungeprüfte veröffentlichte japanische Patentanmeldung") beschrieben wird.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine LPL mit hervorragender Thermostabilität und hoher Glycerinbildungsaktivität bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen LPL bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Reagenz zur Triglyceridbestimmung, das eine derartige LPL enthält, bereitzustellen.
Die Erfinder haben intensiv nach Mikroorganismen gesucht, die zur Bildung der vorstehend beschriebenen LPL imstande sind. Als Ergebnis wurde nun festgestellt, daß ein thermophiler Actinomycetes (Streptomyces 7825 (FERM P-9983, FERM BP- 2489)), der aus dem Erdboden von Izu Atagawa, Shizuoka, Japan isoliert wurde, zur Bildung einer LPL mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften imstande ist.
Die vorliegende Erfindung stellt also eine thermostabile Lipoproteinlipase bereit, die zur Hydrolyse von Triglyceriden in Lipoproteinen zu Glycerin und Fettsäuren imstande ist, wobei die Hydrolyseaktivität zu etwa 100 % nach einer Behandlung in einem Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 7 bei 60ºC für 15 Minuten erhalten bleibt, wobei die thermostabile Lipoproteinlipase eine Glycerinbildungsaktivität und eine Fettsäurebildungsaktivität aufweist, so daß die Glycerinbildungsaktivität mindestens etwa 15 % der Fettsäurebildungsaktivität beträgt, und
die thermostabile Lipoproteinlipase aus Streptomyces 7825 (FERM P-9983, FERM BP-2489) erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen thermostabilen Lipoproteinlipase, das folgende Stufen umfaßt:
(A) Kultivieren von Streptomyces 7825 (FERM P-9983), FERM BP- 2489) in einem Medium; und
(B) Gewinnung der thermostabilen Lipoproteinlipase aus der erhaltenen Kultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Reagenz zur quantitativen Bestimmung von Triglyceriden in Körperflüssigkeiten, das die vorstehende thermostabile Lipoproteinlipase umfaßt.
Die erfindungsgemäße LPL ist herkömmlichen bekannten LPLs hinsichtlich der Thermostabilität und hinsichtlich des Verhältnisses der Glycerinbildungsaktivität zur Fettsäurebildungsaktivität überlegen. Bei Verwendung als Testreagenz ermöglicht es die LPL daher, die Haltbarkeit des Reagenzes erheblich zu verlängern, während die Zeit, die für die Bestimmung pro Probe erforderlich ist, verringert wird, was wesentlich zur gewerblichen Anwendbarkeit beiträgt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 ist ein Graph, der den optimalen pH-Wert der LPL der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 2 ist ein Graph, der die pH-Stabilität der LPL der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 3 ist ein Graph, der die optimale Temperatur der LPL der vorliegenden Erfindung zeigt.
Fig. 4 ist ein Graph, der die Wärmestabilität der LPL der vorliegenden Erfindung zeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Hydrolyseaktivität der vorliegenden LPL bleibt zu etwa 100 % erhalten, wenn sie in einem Puffer bei etwa 60ºC für etwa 15 Minuten behandelt wird. Die Konzentration und der pH- Wert des Puffers, auf den hier Bezug genommen wird, sind nicht besonders beschränkt, üblicherweise liegt die Konzentration jedoch im Bereich von etwa 5 bis 500 millimolar, vorzugsweise etwa 10 bis 250 millimolar und insbesondere etwa 20 bis 100 millimolar, und der pH-Wert liegt im Bereich von etwa 4 bis 7, vorzugsweise etwa 4,5 bis 6 und insbesondere bei etwa 5. Es wird besonders bevorzugt, einen Essigsäurepuffer (pH-Wert = 5,0) zu verwenden.
Die erfindungsgemäße LPL, die von Streptomyces 7825 (FERM P- 9983, FERM BP-2489) gebildet wird, weist die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:
(a) Wirkung:
Sie wirkt auf Triglyceride von Lipoproteinen unter deren Hydrolyse in Glycerin und Fettsäuren. Die Lipoproteine umfassen nicht nur künstliche Lipoproteine, sondern auch humane Blutproteine.
(b) Substratspezifität:
Sie zeigt eine Aktivität gegenüber Lipoproteinen, die aus verschiedenen Triglyceriden bestehen, wie sie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt ist. In Tabelle 1 wird die Aktivität relativ zu Olivenöl als Standard (100 %) ausgedrückt.

Tabelle 1

Substratspezifität

Triglycerid Relative Aktivität (%)
Triacetin 28
Tributyrin 22
Tricaproin 46
Tricaprylin 148
Tricaprin 153
Trilaurin 234
Tripalmitin 99
Tristearin 29
Triolein 75
Olivenöl 100
(c) Optimaler pH-Wert: 8,0 bis 9,0, wie es in Fig. 1 gezeigt ist.
pH-Stabilitätsbereich: 4,0 bis 7,0 (bei Behandlung bei 60ºC, 30 Minuten), wie es in Fig. 2 gezeigt ist.
(d) Temperatur der optimalen Aktivität: 50 bis 60ºC, wie es in Fig. 3 gezeigt ist.
(e) Wärmestabilität:
Etwa 100 % der Aktivität bleibt nach einer Behandlung in 50 millimolar Acetatpuffer (pH-Wert: 5,0) bei etwa 60ºC für etwa 15 Minuten erhalten, wie es in Fig. 4 gezeigt ist.
(f) Hemmung:
Sie wird zu 30 bis 40 % durch Zn²&spplus;, Fe³&spplus; und Mg²&spplus; bei einer Konzentration von jeweils 1 millimolar gehemmt, zu etwa 40 % durch 3 m NaCl gehemmt, zu etwa 40 % durch 10 millimolar Desoxycholsäure gehemmt und zu etwa 30 % durch 400 ug/ml Protaminsulfat gehemmt.
(g) Molekulargewicht: 30 000 bis 50 000 (Gelfiltration)
(h) Titer:
Die Titerbestimmung basiert im Prinzip auf der quantitativen Bestimmung des Glycerins, das durch die Einwirkung von LPL auf ein künstliches Lipoprotein gebildet wird, das aus Olivenöl hergestellt wird, wie es in Clin. Chim. Acta., Bd. 22 (1968), S. 393 beschrieben wird.

Reagenz

Ein Gemisch aus 5 g Olivenöl und 5 ml einer 5 %igen (Vol./Vol.) Triton X-100-Lösung wird einer Ultraschallbehandlung für 10 Minuten unterworfen, um eine Substratemulsion herzustellen.
12 ml 25 millimolar Metaperiodsäure und 20 ml Isopropanol werden gemischt. 1 n Essigsäure wird zugegeben, so daß man 100 ml erhält.
2,4-Pentandion (0,75 ml) und 2,5 ml Isopropanol werden gemischt, und 2 m Ammoniumacetat wird zugegeben, so daß man 100 ml erhält.

Verfahren

70 ul der vorstehend genannten Substratlösung, 20 ul eines 0,5 m Glycinpuffers (pH-Wert: 8,5), 50 ul 10 % (Gew./Vol.) BSA und 55 ul Wasser werden in einem Teströhrchen gemischt, und das System wird auf 37ºC vorgewärmt. 5 ul einer Enzymlösung mit einer Enzymkonzentration, die auf etwa 10 U/ml eingestellt wurde, werden zu dem System gegeben. Man läßt das System dann 10 Minuten bei 37ºC reagieren. Nach Abschluß der Reaktion wird das Teströhrchen in kochendes Wasser getaucht, um die Reaktion abzubrechen. Nachdem das Teströhrchen abgekühlt ist, werden 400 ul Isopropanol zu dem Reaktionssystem gegeben, und anschließend wird gerührt. Das Gemisch wird dann zentrifugiert. 2 ml Isopropanol werden zu 100 ul der Überstandsflüssigkeit gegeben. Die Lösung wird mit 1 ml der vorstehend hergestellten Metaperiodsäurelösung und 0,5 ml der vorstehend hergestellten Acetylacetonlösung gemischt, und für 30 Minuten wird eine Reaktion bei 50ºC durchgeführt. Die Extinktion des Systems bei 405 nm wird gemessen. Eine Leerwertbestimmung (Kontrolle) wird für ein System durchgeführt, das keine Enzymlösung enthält.
Aus den gemessenen Werten wird eine Eichkurve unter Verwendung einer Glycerinlösung mit einer bekannten Konzentration aufgestellt. Der Glyceringehalt des Reaktionsgemisches wird also unter Verwendung der aufgestellten Eichkurve bestimmt.
Die Enzymaktivität wird ausgedrückt, indem die Menge an Enzym, die 1 uMol Glycerin pro Minute bildet, als 1 U festgelegt wird.
(i) Verhältnis der Glycerinbildungsaktivität:
Die Glycerinbildungsaktivität der LPL beträgt mindestens etwa 15 % der Fettsäurebildungsaktivität. Während die Aktivität im allgemeinen als Glycerinbildungsaktivität ausgedrückt wird, wie es vorstehend angegeben wurde, ist es erforderlich, die Fettsäurebildungsaktivität zu erhalten, bevor das Verhältnis von Glycerinbildungsaktivität zu Fettsäurebildungsaktivität erhalten werden kann. Die Fettsäurebildungsaktivität kann bestimmt werden, indem ein Isopropanolextrakt, der auf die gleiche Weise, wie es vorstehend beschrieben wurde, erhalten wird, auf den Gehalt an gebildeter Fettsäure unter Verwendung eines handelsüblichen Reagenzsatzes zur Bestimmung freier Fettsäuren (z. B. NEFAC-Test, hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) untersucht wird, wobei die Menge an Enzym, die zur Bildung von 1 Mikroäquivalent Fettsäuren pro Minute imstande ist, als 1 U festgelegt wird.
Dementsprechend kann das Verhältnis der Glycerinbildungsaktivität zur Fettsäurebildungsaktivität aus folgender Formel berechnet werden:
Glycerinbildungsaktivität (U)/Fettsäurebildungsaktivität (U) x 100
(j) Reinigungsverfahren: Wie nachstehend beschrieben.
(k) Kristallstruktur und Elementaranalyse: Nicht bestimmt.
Die erfindungsgemäße LPL kann durch Kultivieren eines thermophilen Actinomycetes und Gewinnung der gebildeten und angereicherten LPL aus der Kultur hergestellt werden.
Der thermophile Actinomycetes für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht beschränkt, solange er zur Bildung der erfindungsgemäßen LPL imstande ist. Ein Beispiel für einen derartigen Mikroorganismus ist Streptomyces 7825, der aus dem Erdboden isoliert wurde. Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stamms werden nachstehend beschrieben.
Die Experimente zur Bestimmung der mikrobiologischen Eigenschaften wurden gemäß den Verfahren durchgeführt, die in Nippon Hosenkin Kenkyukai (Hrsg.), Hosenkin no Dotei Jikkenho (Identifikationstestverfahren für Actinomycetes) (1975) und Kazuo Komagata (Hrsg.), Biseibutsu no Kagaku Bunrui Jikkenho (chemischer Klassifizierungstest für Mikroorganismen) (1982) beschrieben wurden.
(a) Morphologie:
Die Kultur nach Kultivieren durch Objektträger-Zellkultur in einem Agarnährmedium bei 50ºC für 4 Tage wurde unter einem Mikroskop und einem Rasterelektronenmikroskop beobachtet.
Verzweigung sporolierender Hypha: Einfache Verzweigung Form der sporulierenden Hypha: Gebogen und spiralförmig Anzahl der Sporen: 10 oder mehr
Oberflächenstruktur und Größe der Sporen: Glatt, 0,5 bis 1,0 um x 1,0 bis 1,5 um im Durchmesser
Flagellosporen: Keine
Sporangium: Keines
Wachstumsposition der Sporephoren: Auf aerialen Hyphae.
Sclerotium-Bildung: Keine
(b) Wachstumsverhalten in verschiedenen Medien (bei Kultivieren bei 50ºC für 6 Tage):
(1) Saccharose-Nitrat-Agarmedium:
Sich ausbreitende und flache milchige Kolonien mit dünnen pulverartigen braunen aerialen Hyphae.
(2) Glucose-Asparagin-Agarmedium:
Sich ausbreitende und flache milchige Kolonien ohne aeriale Hyphae.
(3) Glycerin-Asparagin-Agarmedium:
Sich ausbreitende und flache milchige Kolonien ohne aeriale Hyphae.
(4) Stärke-Agar-Medium:
Sich ausbreitende und flache milchige Kolonien mit häufigen pulverartigen braunen aerialen Hyphae.
(5) Tyrosin-Agarmedium:
Sich ausbreitende und geschwollene milchige Kolonien mit dünnen pulverförmigen weißen aerialen Hyphae, braunes Pigment wird im umgebenden Agar gebildet.
(6) Agar-Nährmedium:
Sich ausbreitende und geschwollene milchige Kolonien mit häufigen pulverförmigen grauen aerialen Hyphae.
(7) Hefe-Malz-Agarmedium:
Sich ausbreitende und verschrumpelte milchige Kolonien mit häufigen pulverförmigen grauen aerialen Hyphae.
(8) Hafermehl-Agarmedium:
Sich ausbreitende und flache milchige Kolonien ohne aeriale Hyphae.
(c) Physiologische Eigenschaften:
(1) Wachstumstemperaturbereich: 2 bis 55ºC
(2) Verflüssigung von Gelatine: +
(3) Hydrolyse von Stärke: +
(4) Gerinnung und Peptonisation von Magermilch: -
(5) Bildung von Melanin-ähnlichem Pigment: +
(d) Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen:
(1) L-Arabinose ±
(2) D-Xylose: ++
(3) D-Glucose: ++
(4) D-Fructose: ++
(5) Saccharose: -/+
(6) Inosit: ++
(7) L-Rhamnose: -/+
(8) Raffinose: -/+
(9) D-Mannit: ++
++: Gut assimilierbar. Gleiche oder höhere Assimilierbarkeit als bei Glucose.
±: Zweifelhaft. Geringfügig besser als die Kontrolle, jedoch wesentlich geringer als die Assimilierbarkeit von Glucose.
-/+: Nicht assimilierbar. Gleicht der Kontrolle und wesentlich geringer als die Assimilierbarkeit von Glucose.
(e) Chemische Zusammensetzung der Zellwand: Zellwandtyp I Als Ergebnis der Untersuchung der vorstehend genannten mikrobiologischen Eigenschaften gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., wurde dieser Stamm als zur Gattung Streptomyces gehörend identifiziert. Als Ergebnis weiterer Untersuchungen wurde festgestellt, daß der Stamm nahezu mit Streptomyces galbus im Hinblick auf Sporenfarbe, Form der Sporephoren, Oberflächenstruktur der Sporen, Bildung von melaninartigem Pigment und Assimilierbarkeit von Kohlenstoffquellen übereinstimmte, mit der Ausnahme von Unterschieden hinsichtlich der Assimilierbarkeit von L- Arabinose und der Farbe der Hyphae. Es wurde also festgestellt, daß der Stamm ähnlich, jedoch nicht identisch mit Streptomyces galbus war. Der Stamm wurde als Streptomyces 7825 bezeichnet und bei der Agency of Fermentation Research Institute, Japan hinterlegt (FERM P-9983, FERM BP-2489).
Dieser Stamm ist zur Bildung der vorliegenden LPL durch Kultivieren in einem geeigneten flüssigen Nährmedium, das einen Induktor enthält, imstande. Nach Abschluß der Kultivierung wird das Kulturfiltrat gesammelt und nach verschiedenen bekannten Methoden gereinigt, wie sie z. B. in Methods in Enzymology, Bd. 22, herausgegeben von W. B. Jakoby, Academic Press (1971) beschrieben werden, wobei man die erfindungsgemäße LPL erhält.
Ausführlicher gesagt ist, da die LPL-Synthese durch den Stamm induziert wird, die Zugabe eines Induktors zu dem Medium wünschenswert. Geeignete Tnduktoren umfassen Fette und Öle und Fettsäuren. Die Fette und Öle umfassen tierische Öle, z. B. Schmalz, Butter, Fischöl und Walöl; sowie pflanzliche Öle, z. B. Olivenöl, Sojabohnenöl, Reisöl, Baumwollsamenöl und Sesamöl. Die Fettsäuren umfassen Ölsäure, Palmitinsäure und Linolensäure. Die Menge an Induktor, die zugegeben wird, ist nicht besonders beschränkt, liegt vorzugsweise jedoch im Bereich von etwa 0,1 bis 3 % (Gew./Vol.). Das Medium umfaßt ferner Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze, die allgemein für die Kultivierung von Actinomycetes eingesetzt werden. Geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Glucose, Glycerin und lösliche Stärke. Geeignete Stickstoffquellen umfassen Pepton, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Maiseinweichflüssigkeit, entfettetes Sojabohnenmehl, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Geeignete anorganische Salze umfassen Monokaliumhydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat und Magnesiumsulfat. Um die Absonderung von LPL in das Medium zu beschleunigen, ist die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels wirksam. Insbesondere wird es bevorzugt, etwa 0,05 bis 0,5 % (Gew./Vol.) eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, z. B. Tween 40, Tween 60 oder Tween 80, zuzugeben. Das Medium wird auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,0 bis 7,5 in der Nähe der Neutralität eingestellt. Aerobe Bedingungen, wie Rühren unter Belüftung, führen zu zufriedenstellenden Ergebnissen. Die Temperatur der Kultivierung liegt üblicherweise im Bereich von etwa 30ºC bis etwa 50ºC und vorzugsweise bei etwa 50ºC, um die Zeit für das Kultivieren zu verringern. Das Kultivieren für etwa 1 bis 6 Tage und vorzugsweise etwa 3 bis 5 Tage unter diesen Bedingungen führt zur Anreicherung einer erheblichen Menge an LPL im Medium.
Nach Abschluß der Kultivierung werden die Mycelium-Pellets aus der Kultur entfernt, z. B. durch Zentrifugation oder Filtration, um die Flüssigkeit aufzufangen. Die Reinigung des Enzyms kann nach bekannten Reinigungsverfahren durchgeführt werden, wie Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Alkoholen und dergl., wobei man ein rohes Enzym erhält. Das Rohprodukt kann weiter zu einem höheren Grad durch verschiedene bekannte chromatographische Techniken, wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und hydrophobe Chromatographie, gereinigt werden. Da die erfindungsgemäße LPL stark hydrophob ist, wird eine hydrophobe Chromatographie vorzugsweise angewandt, um ein hochgradig gereinigtes Enzym zu erhalten.
Da die erfindungsgemäße LPL sehr wärmestabil ist, kann sie für eine verlängerte Zeitspanne im Vergleich mit herkömmlicherweise verfügbaren LPL-Zubereitungen aufbewahrt werden. Die Verwendung der vorliegenden LPL ist also von großem Vorteil.
Es ist z. B. bekannt, daß LPL sich für ein Reagenz für einen enzymatischen Assay von Blut-Triglyceriden eignet. Der Assay basiert auf dem Prinzip, daß Triglyceride im Blut durch LPL hydrolysiert und das gebildete Glycerin quantitativ durch den enzymatischen Assay bestimmt wird. Die quantitative Bestimmung von Glycerin kann nach Methoden, bei denen Glycerinkinase, Glycerindehydrogenase und Glycerinoxidase verwendet werden, durchgeführt werden. Die Methode, bei der Glycerinkinase verwendet wird, wird allgemein angewandt. Gemäß dem Verfahren unter Verwendung von Glycerinkinase werden 3 Arten von Enzymen, nämlich Glycerinkinase, Glycerin-3-Phosphat-Oxidase und Peroxidase, eingesetzt. Jedes dieser Enzyme wird, ohne Beschränkung auf Hersteller oder Ursprung, in Konzentrationen von etwa 1,0 bis 2,5 U/ml in einem Bestimmungsreagenz verwendet. Der zu verwendende Puffer ist nicht besonders beschränkt, ein schwach saurer Puffer, wie Citrat, ß,ß'-Dimethylglutarat, Acetat, Succinat, Fumarat, Phosphat oder MES-Puffer, wird jedoch vorzugsweise verwendet. Ein geeigneter pH-Bereich des Puffers ist etwa 5 bis 7, und eine geeignete Konzentration des Puffers ist etwa 10 bis 100 millimolar. Das Reagenz enthält ferner ATP-Na&sub2;.3H&sub2;O und Mgcl&sub2;.6H&sub2;O, die für die Glycerinkinasereaktion erforderlich sind, und zwar in einer Menge von 20 bis 30 mg bzw. von 3 bis 50 mg pro 200 ml Reagenz. Das Reagenz enthält ferner 4- Aminoantipyrin und einen Farbbildner im Bereich von etwa 1 bis 20 mg bzw. von etwa 5 bis 100 mg pro 200 ml Reagenz. Der Farbbildner kann willkürlich unter Phenolderivaten, Anilinderivaten und Toluidinderivaten, wie p-Hydroxydiphenyl, Hydrochinon, Hydrochinonmonomethylether, Catechin, Resorcin, Pyrogallol, o-Phenylendiamin, m-Phenylendiamin, Anilin, Diethylanilin, p-Aminobenzoesäure, Reducton und Dimethyltoluidin ausgewählt werden. Um die Löslichkeit des gebildeten Farbstoffs zu erhöhen, wird vorzugsweise ein oberflächenaktives Mittel, z. B. Triton X-100, Span 20, Natriumcholat, Natriumdodecylsulfat oder Dimethylbenzylalkylammoniumchlorid, zugegeben. Diese oberflächenaktiven Mittel können in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 % (Gew./Vol.) und einer Menge von etwa 2 bis 10 ml und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 2 bis 6 % (Gew./Vol.) und einer Menge von etwa 3 bis 6 ml pro 200 ml Reagenz verwendet werden.
Zu 1 ml des auf diese Weise hergestellten Bestimmungsreagenzes werden mehrere u1, vorzugsweise etwa 1 bis 30 ul, insbesondere 2 bis 20 u1 und ganz besonders 5 bis 15 ul unverdünntes Serum gegeben, und anschließend werden mehrere ul der erfindungsgemäßen LPL (5 bis 10 U/ml) zugegeben. Das System wird in einer Küvette inkubiert, wobei der Farbbildner eine Farbe entwickelt, und zwar proportional zur Menge an Triglyceriden im Serum. Die Farbbildung wird als Extinktion bestimmt, um quantitativ die Menge an Triglycerid in der Probe zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher durch die nachstehenden Beispiele erläutert, die jedoch nicht dahingehend verstanden werden dürfen, daß die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Ein Medium (100 ml), das 0,5 % Pepton, 0,1 % KH&sub2;PO&sub4;, 0,1 % Na&sub2;HPO&sub4;.12H&sub2;O, 0,05 % MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,03 % Hefeextrakt, 0,2 % Olivenöl und 0,5 % Tween 40 (pH-Wert: 7,0) umfaßte, wurde in einen 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben gegeben und 15 Minuten bei 121ºC autoklaviert.
Getrennt davon wurde Streptomyces 7825 (FERM P-9983, FERM BP- 2489) in einem Teströhrchen kultiviert, das 5 ml eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie vorstehend beschrieben wurde, enthielt.
Die Kulturflüssigkeit wurde in das vorstehend hergestellte Medium überimpft und durch Rotations-Schüttelkultur bei 50ºC für 3 Tage kultiviert, wobei man eine Vorkultur für die Fermentation in einem Behälter erhielt. 2 l des gleichen Mediums wurden in einen 3 l fassenden Fermenter gegeben und 15 Minuten bei 121ºC autoklaviert. 100 ml der Vorkultur wurden dann darein überimpft, und anschließend wurde bei 50ºC unter Belüftung mit 1 VVM und Rühren bei 400 U/min kultiviert.
Nach 3 Tagen wurde die Kulturflüssigkeit auf Enzymaktivität untersucht, und es wurde festgestellt, daß sie 0,2 U/ml LPL enthielt. Die Kultur wurde zu diesem Zeitpunkt beendet, und die Mycelium-Pellets wurden durch Filtration entfernt, um das Kulturfiltrat zu gewinnen.
Das Kulturfiltrat wurde durch eine Säule (4,4 cm Durchmesser, 10 cm Höhe), die mit Phenyl-Sepharose gepackt und mit 25 millimolar Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,0) voräquilibriert worden war, geleitet. Nachdem die Säule gründlich mit dem gleichen Puffer gewaschen worden war, wurde der Puffer gegen 25 millimolar Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 1 % Triton X-100 ausgetauscht, und anschließend wurde LPL eluiert, wobei sich ein scharfer Elutionspeak zeigte. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, eingeengt und durch eine Säule (2,2 cm Durchmesser, 90 cm Höhe), die mit Sephadex G-75 gepackt und mit einem Puffer mit einem Gehalt an 0,1 % Triton X-100 voräquilibriert worden war, geleitet. Der Proteinpeak und der Aktivitätspeak stimmten miteinander überein. Die SDS- Polyacrylamidgel-Elektrophorese der aktiven Fraktionen ergab eine einzelne Bande.
Die erhaltene Enzymprobe wies eine spezifische Aktivität von 1,2 U/mg auf.
Die Menge an Protein wurde quantitativ nach dem Wang-Smith- Verfahren (Anal. Biochem., Bd. 63 (1975), S. 414) bestimmt.
Bei Untersuchung des erhaltenen gereinigten Enzyms wurden die vorstehend angegebenen physikochemischen Merkmale bestätigt. Insbesondere wurde bewiesen, daß die vorliegende LPL hinsichtlich der Thermostabilität anderen, handelsüblichen LPLS mit Mikroorganismus-Ursprung überlegen ist. Genauer gesagt betrug, wenn LPLS mit Pseudomonas-Ursprung (Produkt von Toyobo Ltd.) oder LPLS mit Alcaligenes-Ursprung (Produkt von Meito Sangyo Co., Ltd.) bei 60ºC für 15 Minuten bei einem pH-Wert, an dem die entsprechenden LPLs am stabilsten sind, d. h. 7,0 bzw. 8,0, behandelt wurden, die Aufrechterhaltung der Aktivität etwa 70 % bzw. etwa 0 %. Die erhaltene erfindungsgemäße LPL zeigte eine Aufrechterhaltung der Aktivität von ungefähr 100 %, wenn sie auf ähnliche Weise bei einem pH-Wert von 5,0 behandelt wurde. Die erfindungsgemäße LPL ist am stabilsten bei einem pH-Wert von 5,0.
Es wurde festgestellt, daß das Verhältnis der Glycerinbildungsaktivität zur Fettsäurebildungsaktivität der erfindungsgemäßen LPL 16 % beträgt, was wesentlich höher ist als 1,97 %, was mit der LPL mit Pseudomonas-Ursprung (Produkt von Toyobo Ltd.) erzielt wird.

Beispiel 2

Blut-Triglycerid wurde unter Verwendung des Reagenzes bestimmt, das aus der LPL hergestellt wurde, die in Beispiel 1 hergestellt wurde. Die Bestimmung wurde durchgeführt, indem Blut-Triglyceride mit der LPL hydrolysiert wurden und das gebildete Glycerin mit einem Kupplungsenzymsystem, das Glycerinkinase, Glycerin-3-phosphatoxidase und Peroxidase umfaßte, untersucht wurde.

Glycerin-Farbbildungslösung:

5 % Triton X-100 4 ml
N,N-Diethyl-m-toluidin 40 ul
4-Aminoantipyrin 4 mg
ATP-Na&sub2; 3H&sub2;O 25 mg
MgCl&sub2; 6H&sub2;O 40 mg
Glycerinkinase 200 U
Glycerin-3-phosphatoxidase 500 U
Peroxidase 300
Purpurogallin-U
Die vorstehend beschriebene Glycerin-Farbbildungslösung wurde in 50 millimolar MES-Puffer (pH-Wert: 6,5) gelöst, so daß man 200 ml erhielt. 10 ul Serum wurden zu 1 ml der erhaltenen Lösung gegeben, und anschließend wurde 3 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Die Extinktion bei 545 nm wurde abgelesen. Anschließend wurden 5 ul der in Beispiel 1 erhaltenen LPL (eingestellt auf eine Konzentration von 5 bis 10 U/ml) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC. Die Extinktion bei 545 nm wurde gemessen.
10 Minuten später, als die Extinktion einen konstanten Wert erreicht hatte, wurde ein Anstieg der Extinktion (Delta A545) erhalten, und der Triglyceridgehalt wurde daraus gemäß der nachstehenden Gleichung berechnet: Triglyceridgehalt (mg-Triolein/dl) Delta
worin Delta A545 ein Anstieg der Extinktion bei 545 nm ist; 28,2 der molare Extinktionskoeffizient des Farbstoffs (l/mMol/cm) ist; 0,5 ein Faktor ist, der sich daraus ergibt, daß 1 Molekül H&sub2;O&sub2; ein 1/2 Molekül des Farbstoffs bildet; 1 ist die Länge des Lichtwegs (cm); und 885,45 ist das Molekulargewicht von Triolein.
Als Referenz wurden Triglyceridbestimmungen mit dem vorstehend beschriebenen Reagenz für 2 Arten von handelsüblichen, kontrollierten Serumpräparaten durchgeführt, die von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hergestellt werden und deren Triglyceridgehalte mit 104 mg/dl bzw. 280 mg/dl angegeben werden. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß der Triglyceridgehalt dieser Zubereitungen 104 mg/dl bzw. 280 mg/dl betrug.
Andererseits wurde der Triglyceridgehalt der gleichen kontrollierten Serumzubereitungen nach dem Verfahren der Verseifung mit Kaliumhydroxid bestimmt, wie es in Clin. Chim. Acta, Bd. 22 (1968), S. 393 beschrieben wird. Die gemessenen Werte waren 103 mg/dl bzw. 279 mg/dl, was konsistent mit den Werten ist, die mit dem Reagenz, das die erfindungsgemäße LPL enthält, erhalten wurden.
Bei der Triglyceridbestimmung unter Verwendung des vorliegenden Reagenzes, das unter Verwendung der erfindungsgemäßen LPL hergestellt wurde, betrug die erforderliche Zeit, damit die Extinktion einen konstanten Wert erreichte, etwa 8 Minuten, während sie 23 Minuten unter Verwendung eines Reagenzes, das unter Verwendung der LPL mit Pseudomonas-Ursprung (hergestellt von Toyobo Ltd.) hergestellt wurde, betrug. Die Verwendung der erf indungsgemäßen LPL verringert also erheblich die Zeit, die für die Bestimmung der Triglyceride erforderlich ist.
Ferner ließ man ein Reagenz, das die vorstehend beschriebene Glycerin-Farbbildungslösung und 5 ul der in Beispiel 1 erhaltenen LPL (8 U/ml) umfaßte, und ein herkömmliches Reagenz, das die gleiche Glycerin-Farbbildungslösung und 5 ul der LPL mit Pseudomonas-Ursprung (Produkt von Toyobo Ltd.) (8 U/ml) enthielt, 4 Tage bei 25ºC stehen. Anschließend wurde der Triglyceridgehalt der vorstehend beschriebenen Kontrollserumzubereitungen mit jedem der auf diese Weise gelagerten Reagenzien bestimmt. Als Ergebnis wurden 100 % der Triglyceride unter Verwendung des vorliegenden Reagenzes innerhalb von 8 Minuten vom Start der Bestimmung nachgewiesen, während nur 80 % der Triglyceride unter Verwendung des herkömmlichen Reagenzes in 8 Minuten nachgewiesen werden konnten.

Claims

1. Thermostabile Lipoproteinlipase, die zur Hydrolyse von Triglyceriden in Lipoproteinen zu Glycerin und Fettsäuren imstande ist, wobei die Hydrolyseaktivität zu etwa 100 % nach einer Behandlung in einem Puffer mit einem pH-Wert von 4 bis 7 bei 60ºC für 15 Minuten erhalten bleibt,

wobei die thermostabile Lipoproteinlipase eine Glycerinbildungsaktivität und eine Fettsäurebildungsaktivität aufweist, so daß die Glycerinbildungsaktivität mindestens etwa 15 % der Fettsäurebildungsaktivität beträgt, und

die thermostabile Lipoproteinlipase aus Streptomyces 7825 (FERM P-9983, FERM BP-2489) erhältlich ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Lipoproteinlipase nach Anspruch 1, das folgende Stufen umfaßt:

(A) Kultivieren von Streptomyces 7825 (FERM P-9983, FERM BP- 2489) in einem Medium; und

(B) Gewinnung der thermostabilen Lipoproteinlipase aus der erhaltenen Kultur.

3. Reagenz zur quantitativen Bestimmung von Triglyceriden in Körperflüssigkeiten, umfassend die thermostabile Lipoproteinlipase nach Anspruch 1.

4. Reagenz nach Anspruch 3, das ferner einen Farbbildner umfaßt.