DE69118641T2

DE69118641T2 - Acyl-carnitin-Esterase, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Analyse von Acyl-carnitinen

Info

Publication number: DE69118641T2
Application number: DE69118641T
Authority: DE
Inventors: Mamoru Takahashi; Shigeru Ueda
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1991-10-08
Publication date: 1996-12-19
Anticipated expiration: 2011-10-09
Also published as: EP0480676A2; EP0480676A3; ATE136584T1; US5385829A; EP0480676B1; DE69118641D1; JP2684238B2; JPH04148681A

Description

Diese Erfindung betrifft eine Acylcarnitin-esterase, die zur Analyse von Acyl-L-Carnitinen z.B. bei einer Untersuchung in einer biochemischen Klinik oder einer Screening Untersuchung von Lebensmittelprodukten brauchbar ist; ein Verfahren zur Herstellung davon und die Verwendung zur Analyse von Acyl-L-Carnitinen.
L-Carnitin, das auch Vitamin Bγ genannt wird, ist eine für den Transport von Fettsäuren durch Mitochondrienmembrane in Tieren nötige Substanz. In den Zellen von Tieren liegen auf acylierte Derivate von L-Carnitin, nämlich Acyl-L-Carnitine vor. Acyl-L- Carnitine werden von den Tieren ausgeschieden und im Urin gefunden. Daher ist eine quantitative Bestimmung des Gehalts von Acyl-L-Carnitinen z.B. im Blut beispielsweise dafür sehr wichtig, um das Auftreten von einem funktionellen Mitrochondrienleiden zu überwachen, um jegliche Störung bei der intramuskulären Energieübertragung von Tieren zu untersuchen.
Die Analyse von Acyl-L-Carnitinen in Substanzen ist bisher durch Hydrolysieren der Acyl-L-Carnitine mit einem Alkali und quantitative Bestimmung der Menge an freigesetztem, freiem L- Carnitin durchgeführt worden. In verschiedenen Berichten sind Bedingungen für eine derartige Hydrolyse vorgeschlagen worden, z.B. Pearson et al. in "Methods in Enzymology", Band 14, 621 (1969), Bieber et al. in "Methods in Enzymology", Band 72, 276 (1981) und Face et al. in "Clin. Chem.", 24, 32 (1978).
Diese Verfahren des Standes der Technik weisen die erheblichen Nachteile auf, daß für die Analyseverfahren ein erheblicher Zeitraum benötigt wird und daß die Verwendung einer hochkonzentrierten alkalischen Lösung zur Hydrolyse eine Gefahr beim Betrieb mit sich bringt und die Probenlösung verdünnt wird.
Um diese Nachteile zu überwinden kann die Verwendung eines geeigneten Enzyms, d.h. einer Acylcarnitin-esterase erwogen werden. Eine Acylcarnitin-esterase ist bekannt, die aus der Leber von Ratten stammt [S. Mahadevan & F. Sauer; "J. Biol. Chem.", 244, 4448 - 4453 (1969)]. Diese Acylcarnitin-esterase weist jedoch für kurzkettige Acyl-L-Carnitine wie Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin, die in menschlichem Blut vorkommen, keine Aktivität auf. Außerdem weist es höhere Km Werte für langkettige Acyl-L-Carnitine auf, z.B. 3,2 x 10&supmin;³ mol/l für Decanoyl- L-Carnitin und 5 x 10&supmin;³ mol/l für Palmitoyl-L-Carnitin, so daß eine große Menge der Esterase für eine vollständige Hydrolyse von langkettigen Acyl-L-Carnitinen erforderlich ist. Trotz einer großen Nachfrage nach der Esterase können außerdem nur 3,7 Einheiten der Esterase aus 50 g einer Rattenleber (etwa eine ganze Leber einer Ratte) gewonnen werden.
Es ist daher seit längerer Zeit gewünscht worden, eine Acylcarnitin-esterase zu finden, die eine ausreichende enzymatische Aktivität für kurzkettige Acyl-L-Carnitine aufweist, geringere Km Werte für Substrate aufweist und ausreichend stabil ist, und ein verläßliches und hochempfindliches Verfahren zur quantitativen Analyse von Acyl-L-Carnitinen einschließlich der vorstehend erwähnten kurzkettigen Acyl-L-Carnitine zu entwickeln, die in Tieren vorkommen.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder Acylcarnitin-esterasen aus einer großen Anzahl von Kulturprodukten von Bakterien untersucht und gefunden, daß ein Bakterium der Gattung Alcaligenes eine Acyl-L-Carnitin-esterase produzierte, die eine hohe Aktivität für die kurzkettigen Acyl-L-Carnitine aufweist. Dieses Acyl-L-Carnitin kann als ein hydrolisierendes Enzym bei einer hochempfindlichen quantitativen Bestimmung von in einer Probe enthaltenen Acyl-L-Carnitinen verwendet werden.
Durch die vorliegende Erfindung wird eine Acylcarnitin-esterase bereitgestellt, die
(a) für jedes der folgenden Substrate spezifisch ist: Acetyl-L-Carnitin, Propionyl-L-Carnitin und Palmitoyl-L-Carnitin;
(b) die Hydrolyse von einem Mol von einem der genannten Substrate mit einem Mol Wasser unter Bildung eines Mols der korrespondierenden Säure und eines Mols L-Carnitin katalysiert; und
(c) die folgenden physikochemischen Eigenschaften besitzt:
a) ein Molekulargewicht von 63.000 ± 7.000 (durch Gelfiltration bestimmt);
b) einen isoelektrischen Punkt bei pH 5,1 ± 0,5;
c) einen Km Wert für Acetyl-L-Carnitin von 4 x 10&supmin;&sup5; M, für Propionyl-L-Carnitin von 3 x 10&supmin;&sup5; mol/l und für Palmitoyl-L-Carnitin von 2 x 10&supmin;&sup5; M;
d) ein pH-Optimum bei etwa pH 8;
e) eine Stabilität bei einem pH von 7,5 bis 8,5 bei 60ºC für 30 Minuten; und
f) ein Temperaturoptimum bei etwa 70ºC, bei der die Acetylcarnitin-esterase ihr Aktivitätsmaximum in einer 100 mmol/l Tris- HCl-Pufferlösung bei pH 8 zeigt.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer, wie vorstehend definierten, Acyl-carnitinesterase bereitgestellt, das das Kultivieren eines Acylcarnitin-esterase produzierenden Bakteriums von der Gattung Alcaligenes in einem geeigneten Kulturmedium und das Sammeln der dadurch hergestellten Acylcarnitin-esterase aus dem Kulturproduktgemisch umfaßt.
Durch die vorliegende Erfindung wird weiter ein Verfahren zum Testen von Acyl-L-Carnitinen unter Einschluß von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin in einer Probe bereitgestellt, bei dem man die Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer, wie vorstehend definierten, Acyl-carnitin-esterase unterwirft und danach die Menge an Fettsäuren und/oder L-Carnitin bestimmt, die auf diese Weise gebildet worden sind.
Durch die vorliegende Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Testen von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin in einer Probe bereitgestellt, bei der man:
(a) einen Teil der Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer Acylcarnitin-esterase unterwirft, die keine enzymatische Aktivität für Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin besitzt, jedoch Substratspezifität für Acyl-L-Carnitine mit längeren Ketten zeigt und die Hydrolysereaktion von einem Mol Acyl-L-Carnitin mit den längeren Ketten mit einem Mol Wasser unter Bildung von einem Mol der korrespondierenden Fettsäure und einem Mol L-Carnitin katalysiert und danach die Menge an Fettsäuren und/oder L-Carnitin bestimmt, die auf diese Weise gebildet wurden;
(b) einen weiteren Teil der Probe einem Test auf Acyl-L-Carnitine unter Einschluß von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin, wie vorstehend definiert, unterwirft; und
(c) die Differenz der analytischen Werte betimmt, die bei den Stufen (a) und (b) erhalten worden sind.
Durch die vorliegende Erfindung wird noch ein weiteres Verfahren zum Testen von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin in einer Probe bereitgestellt, bei dem man
(a&sub1;) die Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer Acylcarnitin-Esterase unterwirft, die keine enzymatische Aktivität für Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin besitzt, jedoch Substratspezifität für Acyl-L-Carnitine mit längeren Ketten zeigt und die Hydrolysereaktion von einem Mol Acyl-L-Carnitin mit längeren Ketten mit einem Mol Wasser unter Bildung von einem Mol der korrespondierenden Fettsaure und einem Mol L-Carnitin katalysiert, und danach das resultierende Gemisch der Reaktionsprobe der Einwirkung einer L-Carnitin-Dehydrogenase mit einem Coenzym A&sub1; unterwirft (worin A&sub1; eine Verbindung der NAD- Gruppe oder Thio-NAD-Gruppe ist), A&sub1; in seine reduzierte Form A&sub2; überführt und das resultierende Gemisch der Probe behandelt und A&sub2; zersetzt; und
(b&sub1;) das resultierende Gemisch der Probe einem Verfahren zum Testen von Acyl-L-Carnitinen unter Einschluß von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin, wie vorstehend definiert, unterwirft.
Durch die vorstehende Erfindung wird auch Alcaligenes sp. Nr. 981 (FERM BP-2570) oder eine ihrer Mutanten bereitgestellt, die eine, wie vorstehend definierte, Acylcarntitin-esterase herstellen kann.
Durch die vorliegende Erfindung wird zustätzlich eine Kultur von Alcaligenes sp. Nr. 981 (FERM BP-2570) oder eine ihrer Mutanten, die eine, wie vorstehend definierte, Acylcarntitinesterase herstellen kann, in einem Kulturmedium bereitgestellt, das eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff und Mineralsalze umfaßt und das frei von anderen Mikroorganismen ist.
Figur 1 ist eine Darstellung, die den optimalen pH-Wert einer Acylcarnitin-esterase der vorliegenden Erfindung zeigt.
Figur 2 ist eine Darstellung, die den stabilen pH-Bereich einer Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Figur 3 ist eine Darstellung, die die optimale Temperatur einer Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt
Figur 4 ist eine Darstellung, die die Hitzestabilität einer Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
Figur 5 ist eine Darstellung, die die Hydrolyseaktivität einer Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung (die durch eine kreisförmige Markierung bezeichnet wird) mit der von Kaliumhydroxid (das durch eine dreieckige Markierung bezeichnet wird) bezüglich Octanoyl-L-Carnitin vergleicht.
Figur 6 ist eine Darstellung, die die Hitzestabilität einer Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung (die durch eine leere kreisförmige Markierung bezeichnet wird) mit derjenigen einer Acylcarnitin-esterase vergleicht, die aus einer Rattenleber erhalten worden ist (die durch eine ausgefüllte kreisförmige Markierung bezeichnet wird).
Figur 7 ist eine Darstellung, die die Hydrolyseaktivität einer Acylcarnitin-esterase, gemäß der vorliegenden Erfindung (die durch eine leere kreisförmige Markierung bezeichnet wird) mit der einer Acylcarnitin-esterase, die aus einer Rattenleber erhalten wurde (die durch eine ausgefüllte kreisförmige Markierung bezeichnet wird) bezüglich Octanoyl-L-Carnitin vergleicht.
Figur 8 ist eine Darstellung, die die Anwendbarkeit einer Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung auf die quantitative Bestimmung von Acetyl-L-Carnitin zeigt.
Es gibt keine spezielle Beschränkung für das Acylcarnitinesterase produzierende Bakterium, solange es zu der Gattung Alcaligenes gehört und die vorstehend erwähnte Acylcarnitinesterase produzieren kann. Ein spezielles Beispiel davon ist das Bakterium vom Bakterienstamm Nr. 981, das von den Erfindern isoliert worden ist und von dem gezeigt worden ist, daß es in sehr wirksamer Weise zur Realisierung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann (nachstehend wird dieser Bakterienstamm manchmal als der vorliegende Bakterienstamm bezeichnet). Die bakteriologischen Eigenschaften dieses Bakteriums sind:
a) Morphologische Eigenschaften
Die Beobachtung des isolierten Bakteriums nach einer 18 - 24 Stunden dauernden Kultivierung bei 28 - 30ºC ergab die folgenden Ergebnisse:
Es ist ein gerades oder etwas gekrümmtes stabartiges Bakterium mit runden Enden, das in einem isolierten oder doppelt verbundenen Zustand oder selten in einer kurzen Kette vorliegt. Keine Sporenbildung, Bewegung mit peripheren Geißeln, kein Polymorphismus, eine Größe von 0,4 - 0,6 x 1,2 - 2,5 µm.
b) Wachstum auf verschiedenen Medien
Die Beobachtung durch eine 18 - 24 Stunden dauernde Kultivierung bei 28 - 30ºC in verschiedenen Kulturmedien ergab die folgenden Ergebnisse:
1. Schräges Agar-Nährmedium:
Das Wachstum ist besser und erfolgt in Fadenform. Nasses und leuchtendes Aussehen und ockerfarben ohne Erzeugung von löslichem Pigment.
2. Plattenförmiges Agar-Nährmedium:
Eine kreisförmige, konvexe und vollständig eingefaßte Kolonie mit einer glatten, nassen Oberfläche; ocker bis leicht ocker gefärbt. Keine Produktion von löslichem Pigment.
3. Flüssiges Medium (wässriges Pepton)
Das Wachstum ist besser, einheitlich getrübt. Bei einer lang andauernden Kultur (mehr als 40 Stunden) wird die Bildung von einem Häutchen beobachtet.
4. BCP-Milch Medium Wird nach 4 - 5 Tagen alkalisch.
c) Physiologische Eigenschaften Nachstehend bezeichnen die Markierungen: + : positiv, (+) : etwas positiv, - : negativ, Gram Färbung KOH Reaktion Kapselbildung Säurefeste Verfärbung OF-Test (Hugh Leifson) keine Veränderung OF-Test (NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; als N-Quelle) O (Oxidation) Wachstum unter aeroben Bedingungen Wachstum unter anaeroben Bedingungen Wachstum bei Halotoleranz bei Wachstum bei Gelatinehydrolyse Stärkehydrolyse Caseinhydrolyse Esculinhydrolyse Cellulosehydrolyse Tyrosinhydrolyse Produktion von Catalase Produktion von Oxidase LV Reaktion Produktion von Urease (SSR) Produktion von Urease (Chris) Produktion von Indol Produktion von H&sub2;S (mit Bleiacetatpapier bestimmt) Produktion von Acetoin (K&sub2;HPO&sub4;) Produktion von Acetoin (NaCl) MR Test Nitratreduktions tests Nachweis von Gas Nachweis von NO&sub2; Nachweis von NO&sub3; Gebrauch in dem Simmons Medium für Citrat Malat Maleat Malonat Mannit Mannose Melicitose Melibiose Raffinose L(+) -Rhamnose D-Ribose Salicin L- Sorbose Stärke Saccharose Trehalose Xylose Akkumulation von Poly-β-hydroxybutyrat
d) Verwendung von Kohlenstoffquellen
1. Die Untersuchung der Nutzung von verschiedenen Kohlenstoffquellen durch Kultivation in einem flüssigen Kulturmedium (pH 7,0), das 5 g einer Kohlenstoffquelle, 5 g NaCl, 0,2 g MgSO&sub4; x 7H&sub2;O, 1,0 g NH&sub4;H&sub2;PO&sub4; und 1 Liter destilliertes Wasser enthielt, ergab die folgenden Resultate: Glukose L(+)-Arabinose Fructose Mannit Mannose Gluconat Acetat Adipat Pimelat Suberat Tartrat
Zur Identifikation des vorstehend beschriebenen Bakteriums wurden die in "Guide for the Identification of Bacteria in Medicine": "Microbiological method", Band 3, 2te Ausgabe gelehrten Verfahren verwendet. Die Identifizierung wurde durch einen Vergleich der experimentellen Ergebnisse mit den z.B. in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8te Ausgabe, "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Band 1 (1984) und ibid., Band 2 (1986) angegebene Daten durchgeführt.
Die charakteristischen Haupteigenschaften des vorliegenden Bakterienstammes können so ausgedrückt werden, daß es sich um als ein Gram negatives stabförmiges Bakterium handelt, das sich mit seinen peripheren Geißeln bewegt, Catalase und Oxidase produziert und in einem Medium, das Pepton (Hugh-Leifson) enthält, keine Säure aus Glucose produziert, aber eine oxidative Zersetzung von Glucose unter Bildung von Säure bewirkt, das keine Bildung von Sporen aufweist und keine Polymorphie und das unter aeroben Bedingungen wächst.
Gram negative Bakterien, die durch stabförmige Bakterienzellen gekennzeichnet sind und die unter aeroben Bedingungen wachsen und die sich mit peripheren Geißeln bewegen sind diejenigen der Gattungen Alcaligenes, Chromobacterium und Flavobacterium. Bakterien der Gattung Chromobacterium produzieren ein purpur gefärbtes Pigment und diejenigen der Gattung Flavobacterium produzieren ein gelbgefärbtes Pigment. Da der Bakterienstamm gemäß der vorliegenden Erfindung kein Pigment produziert, ist klar, daß er zu der Gattung Alcaligenes gehört.
Um zu unterscheiden, zu welcher Art von Alcaligenes der vorliegende Bakterienstamm gehört, wurden die charakteristischen Eigenschaften des vorliegenden Bakterienstammes mit denjenigen von drei Bakterienspezies verglichen, die in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Band 1 (1984) angegeben sind, nämlich Alcaligenes faecalis (nachstehend wird diese manchmal als "F" dargestellt), Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans (nachstehend wird diese manchmal als "D" dargestellt) und Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans (nachstehend wird diese manchmal als "X" dargestellt). Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben.
In dem folgenden Vergleich bedeutet die Bezeichnung mit dem Kennzeichen "+" eine positive Wahrscheinlichkeit von mehr als 90%, bedeutet das Kennzeichen "-" eine negative Wahrscheinlichkeit von mehr als 90% und bedeutet das Kennzeichen "d", daß die Eigenschaft weder als positiv noch als negativ bewertet wird. Eigenschaften F D X dieser Stamm Herstellung von Oxidase Reduktion von Nitrat Gelatinehydrolyse Herstellung von Säure in einem OF-Medium für Xylose Glukose Produktion von Säure in Kulturmedien ohne Pepton für Xylose Glukose Verwendung einer Kohlenstoffquelle für Glukose L(+)-Arabinose Fructose Mannit Mannose Gluconat Acetat
Bei dem vorstehenden Vergleich wurde beobachtet, daß der vorliegende Bakterienstamm bzgl. vieler Punkte Eigenschaften aufweist, die denen von Alcaligenes subsp. xylosoxodans entsprechen, sich aber bzgl. der Herstellung von Säure in OF Kulturmedien und bzgl. dessen, daß aus Xylose keine Saüre produziert wird, unterscheidet.
Der vorliegende Bakterienstamm wurde daher so beurteilt, daß er sich von diesen bekannten Bakterienspezies unterscheidet und wurde daher im Institute of Microbiological Engineering of the Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Bezeichnung Alcaligenes sp. Nr. 981 mit der Hinterlegungs-Nr. Bikoken Jo-ki 2570 (FERM BP-2570) hinterlegt.
Um die Acylcarnitin-esterase der vorliegenden Erfindung zu erhalten, wird zunächst ein Acylcarnitin-esterase produzierendes Bakterium, das zu der Gattung Alcaligenes gehört, in einem angemessenen Kulturmedium kultiviert.
Ein Beispiel eines die Acylcarnitin-esterase produzierenden Bakteriums ist Alcaligenes sp. Nr. 981. Da die bakteriologischen Eigenschaften eines Bakteriums jedoch im allgemeinen variieren können, kann jeder Bakterienstamm, der zur Gattung Alcaligenes gehört und eine Acylcarnitin-esterase der vorliegenden Erfindung produzieren kann, verwendet werden. Derartige Bakterienstämme können diejenigen sein, die durch eine durch UV-Licht, Bestrahlung, durch die Verwendung eines mutagenen Mittels, wie N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat ausgelöste künstliche Mutation erhalten werden oder können diejenigen sein, die durch natürliche Mutation erhalten werden.
Die Kultur des Bakteriums kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die im allgemeinen für eine Bakterienkultur verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, die Kultur in einem Kulturmedium durchzuführen, das ein Acyl-L-Carnitin enthält. Als das Acyl-L-Carnitin wird z.B. vorzugsweise Octanoyl-L-Carnitin, das billig ist, verwendet (0,1 - 1% bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums). Als das Kulturmedium kann ein Nährstoffkulturmedium verwendet werden, das eine Kohlenstoffquelle, die durch die Bakterien anabolisiert werden kann, eine Stickstoffquelle, die durch die Bakterien verdaut werden kann, und bei Bedarf anorganische Salze enthält.
Beispiele der Kohlenstoffquelle sind Glukose, Fructose, Saccharose, Sucrose, Melassen und Olivenöl, entweder allein oder in Kombination.
Beispiele der Stickstoffquelle sind Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maiseinweichflüssigkeit und Cholinhydrochlorid, entweder allein oder in Kombination.
Zusätzlich können bei Bedarf anorganische Salze, wie Phosphat und Salze von Magnesium, Kalzium, Kalium, Natrium und Schwermetallen wie Eisen und Mangan verwendet werden.
Es ist selbstverständlich möglich, andere Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zu verwenden, die von den Bakterien anabolisiert oder verdaut werden können.
Die Kultur wird unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise unter Schütteln oder Luftumwälzung durchgeführt. Es wird zur industriellen Praxis bevorzugt, eine umgewälzte, untergetauchte belüftete Kultur zu verwenden.
Während die Temperatur für die Kultur innerhalb des Bereiches variiert werden kann, in dem das Acylcarnitin-esterase produzierende Bakterium unter Herstellung der Esterase wachsen kann, wird es üblicherweise bevorzugt, eine Temperatur von 18 - 37 ºC, insbesondere um 28 ºC einzusetzen. Während die Dauer der Kultur für jede spezielle Kulturbedingung unterschiedlich sein kann, kann die Kultur bei einer angemessenen Stufe beendet werden, bei der die maximale Esteraseproduktion erreicht wird, üblicherweise nach 1 bis 3 Tagen.
Die Kulturbedingungen wie die Zusammensetzung und die flüssige Art des Kulturmediums, die Temperatur, die Rührgeschwindigkeit und die Belüftungsgeschwindigkeit kann so eingestellt und ausgewählt werden, daß gemäß jedem verwendeten speziellen Baktenenstamm und den externen Bedingungen bevorzugte Ergebnisse erzielt werden. Wenn in einer Flüssigkultur Schaumbildung auftritt, kann ein Schaumverhütungsmittel, wie ein Silikonöl oder ein Pflanzenöl verwendet werden.
Die produzierte Acylcarnitin-esterase wird hauptsächlich innerhalb der Bakterienzellen zurückgehalten. Die Bakterienzellen werden daher durch ein geeignetes Mittel, wie Filtration oder Zentrifugation aus dem Kulturproduktgemisch gesammelt und die gesammelten Bakterienzellen dann einer Zellaufbruchbehandlung, wie einem mechanischen Aufbrechen durch Ultraschall, einer Behandlung mit einer French-press, einer Glaskugelbehandlung oder Frieren und Tauen oder einer enzymatischen Verdauung unter Verwendung von z.B. Lysozym oder einer geeigneten Kombination dieser mechanischen und enzymatischen Mittel unterzogen, um eine rohe Flüssigkeit zu erhalten, die die Acylcarnitin-esterase enthält.
Aus dem Rohextrakt kann gereinigte Acylcarnitin-esterase durch Verfahren erhalten werden, die zur Isolierung und Reinigung von Proteinen und Enzymen bekannt sind. Das Gewinnen der Esterase kann so z.B. durch das sogen. Aussalzverfahren durch Zugabe von z.B. Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, Kaliumphosphat oder Aluminiumchlorid zu dem Rohextrakt, der die Acylcarnitin-esterase enthält, durchgeführt werden. Der so erhaltene Niederschlag kann bei Bedarf unter Verwendung von verschiedenen Molekularsieben oder durch Chromatographie, Elektrophorese, Ultracentrifugation oder eine Kombination dieser Mittel weiter gereinigt werden. In der Praxis kann die Reinigung dadurch durchgeführt werden, daß die Eigenschaften der zu isolierenden Acylcarnitinesterase verwendet werden. Der, wie vorstehend beschrieben, erhaltene Niederschlag wird z.B. zunächst in Wasser oder in einer Pufferlösung gelöst und die Lösung wird, wenn erforderlich, nach einer Dialyse einer Molekularsiebchromatographie unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes, wie DEAE-Cellulose, DEAE-Sephacel, DEAE-Sepharose oder DEAE-Sephadex A-50 (Produkte der Pharmacia Corp.) oder DEAE-Toyopearl (Toso Corp.) oder unter Verwendung eines Gelfiltrationsmediums, wie Sephadex G-100 und G-75 oder Sephacryl S-200 unterzogen. Es können auch Kombination dieser Reinigungsmittel verwendet werden. Die so erhaltene gereinigte Lösung kann durch Zugabe eines Stabilisators z.B. eines Zuckers, wie Mannit, Saccharose oder Sorbit; einer Aminosäure, wie Glutaminsäure oder Glycin; von Rinderserumalbumin als einem Peptid oder Protein stabilisiert werden, wonach die Lösung z.B. einer Lyophilisierung unterzogen wird, um die gereinigte Acylcarnitin-esterase zu erhalten.
Die charakteristischen Eigenschaften der isolierten Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:

1) Enzymatische Aktivität

Sie katalysiert die Hydrolysereaktion eines Acyl-L-Carnitins mit Wasser unter Bildung von L-Carnitin und der korrespondierenden freigesetzten freien Fettsäure:
Acyl-L-Carnitin + H&sub2;O T Fettsäure + L-Carnitin

2) Molekulargewicht

63.000 ± 7.000
Das Molekulargewicht wurde durch Chromatographie unter Verwendung von TSK Gel G3000 SW (ein Produkt der Toso Corp.) auf einer 0,75 x 60 cm Säule unter Verwendung eines Elutionsmittels, das aus einer 0,1 mol/l Phophatpufferlösung (pH 7,0) bestand, die 0,2 Mol NaCl enthielt, unter Verwendung der von der Oriental Yeast Co. Ltd. gelieferten Standardmolekulargewichtmarker bestimmt: Molekulargewicht Verbindung Cytochrom C Adenylatkinase Enolase Lactatdehydrogenase Glutamatdehydrogenase

3) Isoelektrischer Punkt

pH 5,1 ± 0,5
Der isoelektrische Punkt wurde durch das sogen. isoelektrische Fokussierungsverfahren bestimmt, wobei ein Trägerampholit 40 Stunden lang bei einer konstanten Spannung von 700 V verwendet wurde, worauf die Lösung einer Fraktionierung unterzogen wurde und jede Fraktion auf ihre enzymatische Aktivität untersucht wurde.

4) Km Wert

Lösungen von Acylcarnitinen in 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) wurden so hergestellt, daß die Konzentrationen eines jeden Acylcarnitins 1 x 10&supmin;&sup5; M, 2 x 10&supmin;&sup5; M, 3 x 10&supmin;&sup5; M, 5 x 10&supmin;&sup5; M, 10 x 10&supmin;&sup5; M, 20 x 10&supmin;&sup5; mol/l und 40 x 10&supmin;&sup5; mol/l betrugen. Der Km Wert wurde für jedes spezifische Acylcarnitin bestimmt. Hier wurden als Acylcarnitine entweder diejenigen verwendet, die im Handel erhältlich sind, oder diejenigen, die aus L-Carnitin (ein Produkt von Sigma) gemäß den Verfahren von Bohemer & Bremer hergestellt wurden, die in "Biochim. Biophys. Acta", 152, 559-567 (1968) beschrieben sind. Acylcarnitin Km Wert Acetylcarnitin Propionylcarnitin Hexanoylcarnitin Octanoylcarnitin Decanoylcarnitin Lauroylcarnitin Myristoylcarnitin Palmitoylcarnitin Stearoylcarnitin

5) Substratspezifität

Acylcarnitinlösungen wurden so in einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) hergestellt, daß die Konzentration eines jeden Acylcarnitins auf 0,5 mmol/l eingestellt wurde. Jede der Acylcarnitinlösungen wurde 10 Minuten lang bei 37 ºC der enzymatischen Hydrolysereaktion unterworfen, worauf die Menge des gebildeten L-Carnitins durch die nachstehend beschriebene L- Carnitin Analyse bestimmt wurde, um die enzymatischen Aktivitäten für die Carnitine zu vergleichen. Es wurde gefunden, daß die höchste Aktivität für Octanoyl-L-Carnitin erreicht wurde. Es wurde außerdem ebenfalls gefunden, daß die aus der Leber einer Ratte stammende Acylcarnitin-esterase keine enzymatische Aktivität für Acetyl-L-Carnitin oder Propionyl-L-Carnitin aufwies, wogegen die Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung für diese kurzkettigen Acylcarnitine eine ausreichende Aktivität aufwies. Acylcarnitin Enzymatische Aktivität in relativen % Acetylcarnitin Propionylcarnitin Hexanoylcarnitin Octanoylcarnitin Decanoylcarnitin Lauroylcarnitin Myristoylcarnitin Palmitoylcarnitin Stearoylcarnitin

6) Optimaler pH

Es wurden so Octanoyl-L-Carnitin Lösungen in einer 100 mmol/l Acetatpufferlösung (pH 4,5 - 6,0), in einer 100 mmol/l Phosphatpufferlösung (pH 6,5 - 8,0), in einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0 - 9,0) oder in einer 100 mmol/l Glycin/NaOH Pufferlösung (pH 9,0 - 10,0) hergestellt, daß die Konzentration von Octanoyl-L-Carnitin für jede der Lösungen auf 0,5 mmol/l eingestellt wurde. Jede dieser Lösungen wurde 10 Stunden lang bei 37 ºC einer enzymatischen Hydrolysereaktion unterzogen und die Menge des gebildeten L-Carnitins wurde bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse von L-Carnitin werden in der Zeichnung von Fig. 1 angegeben, die zeigt, daß der optimale pH Wert etwa 8,0 beträgt. Hohe enzymatische Aktivitäten oberhalb von 90% wurden innerhalb eines weiten pH Wert Bereiches von 6,5 - 9,5 erreicht.
In der Darstellung von Fig. 1 entsprechen die Markierungen Δ, 0, und einer Acetatpufferlösung, einer Phosphatpufferlösung, einer Tris-HCl Pufferlösung bzw. einer Glycin/NaOH Pufferlösung.

7) pH Stabilität

Lösungen der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung in einer 100 mmol/l Acetatpufferlösung (pH 4,5 - 6,0), in einer 100 mmol/l Phosphatpufferlösung (pH 6,5 - 8,0), in einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0 - 9,0) oder in einer 100 mmol/l Glycin/NaOH Pufferlösung (pH 9,0 - 10,0) wurden so hergestellt, daß für jede der Lösungen eine Konzentration der Esterase von 0,1 Einheiten/ml erhalten wurde. Jede Lösung wurde 30 Minuten lang bei 60 ºC erhitzt, worauf die Restaktivität bestimmt wurde. Die Ergebnisse werden in Fig. 2 angegeben, die zeigt, daß die Esterase in der Phosphatpufferlösung mit einem pH von 7,5 und in der Tris-HCl Pufferlösung mit einem pH von 8,5 stabil war. Hohe enzymatische Aktivitäten von mehr als 90% wurden innerhalb eines weiten pH Bereichs von 5,5 der Acetatpufferlösung bis 10,5 der Glycin/NaOH Pufferlösung erreicht.
In der Darstellung von Fig. 2 entsprechen die Markierungen Δ, 0, und einer Acetatpufferlösung, einer Phosphatpufferlösung, einer Tris-HCl Pufferlösung bzw. einer Glycin/NaOH Pufferlösung.

8) Optimale Temperatur

Unter Verwendung einer 0,5 mmol/l Octanoyl-L-Carnitin Lösung mit einem pH von 8,0 in einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung wurde die enzymatische Hydrolysereaktion jeweils 10 Minuten lang bei 50, 55, 60, 65, 70 oder 75 ºC durchgeführt, worauf die Menge des gebildeten L-Carnitins bestimmt wurde. Die Ergebnisse der Analyse werden in der Darstellung von Fig. 3 angegeben, die anzeigt, daß die maximale Aktivität bei 70 ºC vorliegt.

9) Hitzestabilität

Ein Satz von Lösungen der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unter Verwendung einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) hergestellt, so daß jede der Lösungen eine Konzentration der Esterase von 0,10 Einheiten/ml aufwies. Jede dieser Lösungen wurde 30 Minuten lang entweder bei 55, 60, 65 oder 70 ºC einer Hitzebehandlung unterzogen, bevor sie auf ihre enzymatische Restaktivität untersucht wurde. Die Ergebnisse werden in der Darstellung von Fig. 4 angegeben, die zeigt, daß die Esterase bis zu 60 ºC stabil ist.

10) Testverfahren für Acylcarnitin-esterase

1. Reaktionsgemisch

Tris-HCl-Puffer
Lösung (pH 8,0): 100 mmol/l
Octanoyl-L-Carnitin: 0,5 mmol/l

2. Verfahren

1 ml der vorstehenden Reaktionslösung wird in ein kleines Reagenzglas eingebracht und 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Es werden 0,05 ml einer Esteraselösung mit einer angemessenen Verdünnung dazugegeben und die entstandene Lösung wird 15 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert, wonach die Reaktion sofort durch überführen des Reagenzglases in ein Bad mit kochendem Wasser beendet wird und die Lösung 15 Minuten lang inkubiert wird um eine zu untersuchende Probenlösung herzustellen. Die Menge des hergestellten L-Carnitins wird gemäß dem nachstehend beschriebenen L-Carnitin Bestimmungsverfahren bestimmt, um die Aktivität der Acylcarnitin-esterase zu bewerten. 3. Gleichung zur Berechnung
(worin Z der Verdünnungsfaktor und die Zahlen 21,7 und 15 dem molekularen Extinktionskoeffizienten in cm²/µMol bzw. der Reaktionsdauer in Minuten entsprechen)

4. Verfahren zur Analyse von L-Carnitin (nachstehend als Analyseverfahren A bezeichnet)

(a) Zusammensetzung der Reaktionslösung

(b) Verfahren

1 ml der vorstehenden Reaktionslösung wird in ein kleines Reagenzglas gebracht und 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. 0,05 ml der zu untersuchenden Esteraselösung wird dann zugegeben und die entstandene Lösung 2 Minuten lang inkubiert, worauf 2 ml 0,1 N wässeriger HCl dazugegeben werden und die Lösung bei A&sub5;&sub5;&sub0; untersucht wird, wodurch die Extinktion A&sub1; erhalten wird. Die Extinktion A&sub0; für eine Vergleichsversuchslösung ohne Zugabe der Esteraselösung wird auf die gleiche Art bestimmt. (c) Gleichung der Berechnung
Wie vorstehend beschrieben, wird die Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur für Acyl-L-Carnitine mittlerer bis langer Kettenlängen als Enzym wirken, sondern auch für kurzkettige Acyl-L-Carnitine, für die die üblichen Acylcarnitin-esterasen unwirksam sind. Deshalb können in einer Probenlösung der zu untersuchenden Substanzen wie menschlichem Serum enthaltene Acyl-L-Carnitine dadurch bestimmt werden, daß die Probenlösung einer enzymatischen Hydrolyse mit der Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung unterworfen wird, die nicht nur für Acyl-L-Carnitine von Acylcarnitinen mit mittleren bis zu längeren Ketten, sondern auch für kurzkettige Acylcarnitine (Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin) eine Substrat-Spezifität aufweist, und daß dann die Menge der so gebildeten Fettsäuren oder des so gebildeten L-Carnitins durch ein an sich bekanntes Analyseverfahren bestimmt wird.
Wenn in der Probenlösung zusätzlich zu den Acyl-L-Carnitinen freies L-Carnitin vorliegt, kann die Analyse der Acyl-carnitine z.B. dadurch realisiert werden, daß die Menge an freiem L-Carnitin zunächst durch das nachstehend beschriebene Analyseverfahren bestimmt wird; das freie L-Carnitin mit einem reduzierenden Coenzym wie mit einem System zersetzt wird, in dem NADH in die oxidierte Form umgewandelt wird, und das Reaktionsgemisch erhitzt wird, worauf die Acyl-L-Carnitine analysiert werden; oder alle Acyl-L-Carnitine unter Verwendung der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung in freies L-Carnitin umgewandelt werden und die Gesamtmenge an L-Carnitin einschließlich des ursprünglich vorliegenden L-Carnitins durch das bekannte Analyseverfahren bestimmt wird.
Für die Bedingungen der Reaktion der Acyl-L-Carnitine in der Probenlösung mit der Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung bestehen keine speziellen Beschränkungen, solange eine ausreichende Hydrolyse der Acyl-L-Carnitine in der Probenlösung erreicht wird. Es wird jedoch empfohlen, die Reaktion durch Inkubieren des mit der Esterase beimpften Probengemisches bei einer Temperatur von z.B. 37 ºC für eine Dauer von z.B. 5 -30 Minuten durchzuführen. Die enzymatische Hydrolysereaktion kann vorzugsweise dadurch beendet werden, daß die Reaktionslösung auf eine Temperatur oberhalb von 80 ºC erhitzt wird.
Durch die wie vorstehend durchgeführte enzymatische Hydrolyse werden die entsprechende Fettsäure und das entsprechende L-Carnitin von dem Acyl-L-Carnitin freigesetzt. Daher kann die Menge des Acyl-L-Carnitins dadurch bestimmt werden, daß entweder die Menge der freien Fettsäure oder diejenige des L-Carnitins quantitativ analysiert wird.
Die quantitative Bestimmung der Fettsäure kann durch ein an sich bekanntes Analyseverfahren durchgeführt werden. Übliche Analyseverfahren umfassen z.B. Flüssigchromatographie und Gaschromatographie. Die bekannten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von L-Carnitin umfassen z.B. ein colorimetrisches Verfahren, bei dem eine Carnitinacetyltransferase (CAT), Acetyl CoA und 5,5'-Dithio-bis-nitrobenzoesäure (DTNB) verwendet werden, das in der Literatur in "J. Biol. Chem.", 238, 2509 (1963) und "J. Lipid Research" 5, 184 - 187 (1964) beschrieben wird; ein Radioisotopenverfahren, bei dem ¹&sup4;C- oder ³H markiertes Acetyl-CoA und CAT verwendet werden, das in der Literatur in "Clin. Chim. Acta", 37, 235 - 243 (1972) und "J. Lipid Research", 17, 277 - 281 (1976) beschrieben wird; ein Carnitindehydrogenaseverfahren, bei dem eine Carnitindehydrogenase NAD&spplus; verwendet wird, wie in "European J. Biochem.", 6, 196 - 201 (1968) berichtet, und ein flourimetrisches Verfahren, bei dem Acetyl-CoA, CAT und N-[p-(2-Benzimidazol-yl)-phenyl]-maleinimid (BIMP) verwendet wird, wie in dem 61sten Jahresforschungsbericht des Institute of Neuropathy of the Ministry of Health and Welfare, Japan, 315 - 318 (1986) berichtet. Von diesen Verfahren wird das Carnitindehydrogenaseverfahren empfohlen. Dieses Verfahren umfaßt das Unterwerfen der Probenlösung unter die Wirkung eines Reagenzes, das eine L-Carnitindehydrogenase und eine Verbindung aus der Nicotinamidadenindinucleotidgruppe (NAD Gruppe) oder der Thionicotinamidadenindinucleotidgruppe (Thio- NAD Gruppe) mit, wenn notwendig, einem nicht ionischen Detergenz, enthält und die Bestimmung der Menge der reduzierten Verbindung aus der NAD Gruppe oder der reduzierten Verbindung aus der Thio-NAD Gruppe, die dadurch gebildet werden. Beispiele von Verbindungen in der NAD Gruppe sind Nicotinamidadenindinucleotid (NAD), Acetylpyridinadenindinucleotid (Acetyl-NAD) und Nicotinamidhypoxanthindinucleotid (Deamino-NAD). Beispiele der Verbindungen in der Thio-NAD Gruppe sind Thionicotinamidadenindinucleotid und Thionicotinamidhypoxanthindinucleotid.
Während die Analyse der reduzierten Verbindung aus der NAD Gruppe oder der reduzierten Verbindung aus der Thio-NAD Gruppe, die durch die Reaktion gebildet wurden, durch eine direkte Bestimmung der Absorption der umgesetzten Probenlösung bewirkt werden kann, wird es bevorzugt, sie durch Umwandlung des Reaktionssystems in ein ein Formazan bildendes System zu bestimmen, wie durch die folgenden Reaktionsschemata dargestellt wird:

(1) L-Carnitindehydrogenase (LCD) Reaktionssystem

LCD
L-Carnitin + NAD&spplus; oder Thio-NAD&spplus; --- T
L-Dehydrocarnitin + NADH oder Thio-NADH + H&spplus;

(2) Umwandlungsreaktionssystem

Tetrazoliumsalz + NADH oder Thio-NADH + H&spplus;
------------- T Formazan + NAD&spplus; oder Thio-NAD&spplus;
Diaphorase oder
ein Phenazinderivat
Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende L-Carnitindehydrogenase ist ein bekanntes Enzym. Es wird empfohlen, eine Dehydrogenase bakteriellen Ursprungs zu verwenden, die durch ein L-Carnitindehydrogenase produzierendes Bakterium hergestellt worden ist. Beispiele derartiger L-Carnitin-dehydrogenase herstellender Bakterien sind diejenigen der Gattung Pseudomonas, wie Pseudomonas aeruginosa IFO 13130, Pseudomonas putida B-0781 (FERM P-5664) und Pseudomonas putida IF 03738 und diejenigen der Gattung Xanthomonas, wie Xanthomonas translucens IFO 13558. Die L-Carnitin-dehydrogenase bakteriellen Ursprungs kann dadurch gemäß den Verfahren erhalten werden, die in der Literatur beschrieben sind, wie in "European J. Biochem.", 6, 196 - 201 (1968), ibid. 10, 56 - 60 (1969), "Agric. Biol. Chem." 52 (1), 249 - 250 (1988), daß die Bakterien kultiviert werden, die Dehydrogenase aus dem Kulturprodukt abgetrennt und gereinigt wird. Sie kann auch dadurch mit einem Genrekombinationsverfahren erhalten werden, daß eine rekombinate Wirtszelle mit dem die L-Carnitin-dehydrogenase produzierenden Gen eines vorstehend erwähnten Bakteriums hergestellt wird, sie kultiviert und die hergestellte Dehydrogenase gesammelt wird [siehe z.B. "Agric. Biol. Chem.", 52 (3), 851 - 852 (1988)]. Durch Beobachtung wurde festgestellt, daß das Bakterium Alcaligenes sp. Nr. 981 ebenfalls eine L-Carnitin-dehydrogenase produziert. Es wird bevorzugt, die Kultur in einem Carnitin enthaltenden Kulturmedium durchzuführen.
Bei den vorstehend vorgeschlagenen Analyseverfahren wird ein Elektronenübertragungsmittel, nämlich ein Mittel verwendet, das ein Tetrazoliumsalz, eine NAD-Gruppe (oder eine Thio-NAD Gruppe) und H&spplus; in Formazan und NAD&spplus; (-Gruppen) (oder Thio-NAD&spplus; (-Gruppen)) umwandeln kann, wie Diaphorase oder ein Phenazinderivat.
Diaphorase ist ein bekanntes Enzym und ist im Handel erhältlich.
Als Phenazinderivate können Phenazinmethosulfat, Meldolablau und Methoxyphenazinmethosulfat aufgezählt werden.
Als das in diesen Analyseverfahren zu verwendende Tetrazohumsalz können 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchlorid], das üblicherweise Nitrotetrazolium (NBT) genannt wird; 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'- biphenylen)-bis [2,5-bis(p-nitrophenyl)-tetrazoliumchlorid]; 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis [2,5-diphenyl-tetrazoliumchlorid]; 2-(p-Nitrophenyl)-3-(p-iodophenyl)-5-phenyl- tetrazoliumchlorid (INT) ; 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5diphenyl-tetrazoliumchlorid (4,5-MTT); 3-(4,5-Dimethyl- 2,triazolyl)-2,4-diphenyl-tetrazoliumchlorid (MTT); 2,2'-5,5'- tetra-(p-Nitrophenyl)-3,3'-(3-dimethoxy-4-diphenylen)-ditetrazoliumchlorid (TNBT); 2, 3, 5-Triphenyl-tetrazoliumchlorid (TT); und Neotetrazoliumchlorid (NT) aufgezählt werden.
In Wasser lösliche nichtionische Detergenzien, die HLB Werte von mehr als 10 und keinen die Reaktion störenden negativen Einfluß aufweisen, werden als die zu dem Reaktionssystem zuzugebenden nichtionischen Detergenzien verwendet. Es wird bevorzugt, nichtionische Detergenzien mit HLB Werten von etwa 11 bis 17 zu verwenden. Beispiele derartiger nichtionischer Detergenzien umfassen Polyoxyethylenalkylether wie Polyoxyethylenoleylether, Polyethylencetylether, Polyoxyethylenstearyletherlauryl, Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyethylenhexadecylether und Polyoxyethylentridecylether; Polyoxyethylenalkylarylether wie Polyoxyethylennonylphenylether und Polyoxyethylenoctylphenylether; Polyoxyethenpolyoxypropylenether wie Polyoxyethylenpolyoxypropylencetylether; Polyoxyethylenalkylester wie Polyoxyethylenmonostearat, Polyoxyethylenmonolaurat und Polyoxyethylenmonooleat; Sorbitanderivate wie Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Sorbitantristearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitansesquioleat und Sorbitantrioleat; Glycerinpropylenglycolfettsäureester wie Glycerinmonostearat, Propylenglykolmonostearat und Glycerinmonooleat; Polyoxyethylensorbitanfettsäureester wie Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyethylensorbitanmonostearat, Polyoxyethylensorbitantristearat, Polyoxyethylensorbitanmonooleat und Polyoxyethylensorbitantrioleat; Polyoxyethylensorbitfettsäureester wie Polyoxyethylensorbitmonolaurat, Polyoxyethylensorbittetraoleat und Polyoxyethylensorbithexastearat; Polyoxyethylenglycerinfettsäureester wie Polyoxyethylenglycerinmonostearat etc.; Polyoxyethylenalkylamine wie Polyoxyethylenstearylamin; Polyoxyethylenamide, wie Polyoxyethylenstearylamid; Fettsäurealkanolamide, wie Laurinsäuredimethanolamid und Kokosnußölfettsäurediethanolamid; Polyoxyethylencastorölderivate wie Polyoxyethylen-hydriertes Castorölderivate; primäre Alkoholethoxylate wie Adekanol (ein Produkt der Asahi Denka Kogyo); sekundäre Alkoholethoxylate, wie Adekatol (ein Produkt der Asahi Denka Kogyo) und Polyoxypropylenpolyoxyethylenether von Ethylendiamid, wie Tetronic (ein Produkt der Asahi Denka Kogyo). Von diesen werden Polyoxyethylenpolyoxypropylenether, wie Pronic F-68 (ein Produkt der Asahi Denka Kogyo); Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, wie Polyoxyethylen (20)sorbitanmonooleat (ein Produkt der Wako Pure Chemical Ind.); Sorbitanfettsäureester und sekundäre Alkoholethoxylate, wie Adekatol (Asahi Denka Kogyo) bevorzugt. Diese nicht ionischen Detergenzien können allein verwendet werden oder es können Kombinationen von zwei oder mehr von ihnen verwendet werden.
Die Konzentrationen des Enzyms und der zu verwendenden Reagenzien bei der Durchführung der quantitativen Bestimmung von L- Carnitin in der Probenlösung konnen im allgemeinen aus den nachstehend angegebenen Bereichen ausgewählt werden: Komponente Konzentration L-Carnitin-dehydrogenase NAD&spplus;s (oder Thio-NAD&spplus;s) Diaphorase Tetrazoliumsalz Nichtionisches Detergenz
Die Enzyme oder andere erforderlichen Reagenzien können als eine wäßrige Lösung in einem separaten System oder in einem kombinierten System, das aus zwei oder mehr Komponenten besteht, oder als Trockenpulver gelagert werden. Es ist vorteilhaft, sie einer Gefriertrocknung zu unterziehen um sie in Form eines trockenen Pulvers zu lagern. Um eine stabile Lagerung der Enzyme und der anderen erforderlichen Reagenzien zu gewährleisten, wird es bevorzugt, jedes von ihnen entweder allein oder in Kombination mit anderen Komponenten zu lagern, die keinen negativen Einfluß auf die Stabilität aufweisen. Es wird z.B. nicht bevorzugt, die L-Dehydrogenase in Kombination mit dem nichtionischen Detergent, die NAD&spplus;s oder Thio-NAD&spplus;s in Kombination mit dem Tetrazoliumsalz, das Elektronentransfermeittel in Kombination mit dem Tetrazoliumsalz und das nicht ionische Detergenz in Kombination mit dem Tetrazoliumsalz in einem einzelnen System über einen langen Zeitraum zu lagern.
Die Reaktion zur quantitativen Analyse der vorstehend erwähnten Acyl-L-Carnitine kann üblicherweise mindestens eine Minute lang bei einer Temperatur von etwa 37 ºC durchgeführt werden. Wenn die Reaktion eine Trübung in dem Reaktionsgemisch bewirkt, kann dem Reaktionssystem ein geeignetes Additiv, wie KCl oder NaCl zugesetzt werden, um eine derartige Trübung zu verhindern.
Die Menge an L-Carnitin in dem Reaktionssystem kann dadurch unter Einsatz von Colorimetrie bestimmt werden, daß Licht mit einer Wellenlänge, die etwa dem spezifischen Absorptionsband des durch die Reaktion gebildeten Formazans entspricht, nämlich mit 500 - 550 nm verwendet wird.
Es ist auch möglich, die Analyse von L-Carnitin mit einem Reagenz durchzuführen, das eine L-Carnitin-dehydrogenase und eine Kombination von entweder (1) einer Verbindung der NAD Gruppe und einer reduzierten Verbindung der Thio-NAD Gruppe oder (2) einer Verbindung Thio-NAD Gruppe und einer reduzierten Verbindung der NAD Gruppe enthält, wodurch die folgende cyclische Reaktion bewirkt wird:
worin A&sub1; eine Verbindung der NAD-Gruppe oder der Thio-NAD- Gruppe ist,
A&sub2; die entsprechende reduzierte Form von A&sub1; ist, B&sub1; eine reduzierte Verbindung der Thio-NAD Gruppe ist, wenn A&sub1; eine Verbindung der NAD-Gruppe ist oder eine reduzierte Verbindung der NAD Gruppe ist, wenn A&sub1; eine Verbindung der Thio-NAD Gruppe ist, und B&sub2; die korrespondierende oxidierte Form von B&sub1; ist; und dann die Menge an B&sub1;, die während der Cyclisierungsreaktion verbraucht wird, oder die Menge an A&sub2; bestimmt wird, die während der Cyclisierungsreaktion gebildet wird. Dieses Reaktionssystem stellt eine sehr hohe Empfindlichkeit bereit und wird besonders bevorzugt.
In diesem Reaktionssystem ist es notwendig, daß zumindest ein Teil der Kombinationen ein Thio-Coenzym ist. Z.B. sollte A&sub1; NAD sein, wenn B&sub1; Thio-NADH ist oder A&sub1; sollte Thio-NAD sein, wenn B&sub1; NADH ist.
Es ist notwendig, daß A&sub1; und B&sub1; im Verhältnis zu L-Carnitin in der Probenlösung im Überschuß vorliegen und dieses sollte im Vergleich mit dem Km Wert der L-Carnitin-dehydrogenase sowohl für A&sub1; als auch für B&sub1; auch im Überschuß vorliegen. Es wird insbesondere bevorzugt, daß die Menge an A&sub1; und B&sub1; etwa das 20 -10.000 fache der Menge an L-Carnitin beträgt.
Es wird bevorzugt, daß die Konzentration an A&sub1; und B&sub1; in dem Analysenreagenz zur Bestimmung der Menge an L-Carnitin in dem vorstehend erwähnten Reaktionssystem von 0,02 - 100 mmol/l, insbesondere 0,05 - 30 mmol/l beträgt. Die Konzentration an L- Carnitin-dehydrogenase beträgt vorzugsweise 5 - 200 Einheiten/ml, insbesondere 10 - 150 Einheiten/ml. Es ist auch eine höhere Konzentration zulässig.
Bezüglich der L-Carnitin-dehydrogenase können bei der Herstellung des Analysenreagenzes zur Bestimmung der Menge an L-Carnitin, diejenigen, die gegenüber dem Substrat, nämlich L-Carnitin reaktiv sind, in Kombination mit einem Coenzym wie NADs (vorzugsweise NAD oder Thio-NAD) verwendet werden. Eine derartige Reaktivität kann unter Verwendung einer Kombination des Coenzyms mit dem Substrat bestätigt werden. Es ist z.B. bestätigt worden, daß, wenn L-Carnitin als das Substrat und Thio-NAD als das Coenzym in einer 100 mmol/l tris-HCl Pufferlösung (pH 9,0) verwendet werden, die von Alcaligenes sp. Nr. 981 (der von Toyo Jozo geliefert wird) hergestellte L-Carnitin-dehydrogenase eine relative enzymatische Aktivität von etwa 15% bezogen auf die Aktivität aufweist, wenn NAD als das Coenzym verwendet wird. Es wurde gefunden, daß der Km Wert für L-Carnitin, NAD und Thio-NAD unter denselben Bedingungen 9,3 mmol/l, 0,14 mmol/l bzw. 0,49 mmol/l betrug.
Was die Zusammensetzung der Reaktionslösung betrifft, wird empfohlen, die Kombination der beiden Coenzyme in geeigneter Weise unter Berücksichtigung von z.B. dem Gleichgewicht der relativen Aktivitäten für jede spezifische verwendete L-Carnitindehydrogenase auszuwählen und den pH-Wert so auszuwählen, daß die relativen Reaktionsgeschwindigkeiten der Hin- /Rückreaktionen unter Berücksichtigung des Einflusses des pH- Werts auf die Hin- und die Rückreaktionsgeschwindigkeiten so nahe wie möglich an 1 liegen.
In den Analyseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine L-Carnitin-dehydrogenase allein oder in Kombination von mindestens zwei verwendet werden.
Die quantitative Bestimmung der Menge an L-Carnitin, das in der Lösung der umgesetzten Proben enthalten ist, wobei für das vorstehend beschriebene Reaktionssystem das Analysenreagenz zur Bestimmung von L-Carnitin verwendet wird, kann z.B. dadurch, daß die Lösung der umgesetzten Probe in einer Menge von 0,01 - 0,5 ml zu dem Reagenz gegeben wird, das die drei vorstehenden Hauptkomponenten enthält, daß die enzymatische Reaktion bei einer Temperatur von etwa 37 ºC durchgeführt und die Menge an gebildetem A&sub2; oder die Menge an während der Reaktion verbrauchtem B1 an zwei Zeitpunkten mit einem vorher festgelegten Zeitabstand bestimmt wird. Es kann z.B. ein Zeitabstand von 1 Minute, z.B. 3 Minuten und 4 Minuten nach dem Start der Reaktion oder ein Zeitabstand von 5 Minuten, z.B. 3 Minuten und 8 Minuten nach dem Start der Reaktion verwendet werden, wobei Spektrophotometrie zur Beobachtung der Veränderung der Extinktion während des Zeitabstandes bei der Wellenlänge eingesetzt wird, die dem spezifischen Absorptionsband für A&sub2; bzw. B&sub1; entspricht. Es ist auch möglich, die Veränderung der Extinktion während der Reaktion durch Abbruch der Reaktion nach einem vorher festgelegten Zeitabstand wie 10 Minuten nach dem Start der Reaktion zu beobachten. Die Menge an gebildetem A&sub2; kann durch Messen der Zunahme der Extinktion bei 400 nm [molarer Extinktionskoeffizient = 11.200 M&supmin;¹cm&supmin;¹ ; vgl. "Methods in Enzymology", Band 55, 261 (1979)] bestimmt werden, wenn A&sub2; Thio-NAD und B&sub1; NADH ist, oder durch Bestimmen der Menge des Verbrauchs an B&sub1; durch Bestimmung der Abnahme der Extinktion bei 340 nm (molarer Extinktionskoeffizient = 6220 M&supmin;¹cm&supmin;¹) und Vergleich des bestimmten Wertes mit den zuvor erhaltenen Werten für bekannte Konzentrationen von L- Carnitin, um einen Echtzeittest der Menge an L-Carnitin in der zu untersuchenden Substanz durchzuführen.
Da bei dem vorstehenden Analyseverfahren die enzymatische Cyclisierungsreaktion von L-Carnitin selbst in der Probenlösung verwendet wird, leidet es kaum unter dem Einfluß von ebenfalls in der Probenlösung vorliegenden Substanzen. Es ist somit zulässig, die Blindwertbestimmung der Probenlösung auszulassen, was zu einer praktischen und einfachen Durchführung des Geschwindigkeitstests führt.
In diesem Reaktionssystem ist es auch möglich, A&sub2; oder B&sub1; durch andere bekannte Verfahren zur Bestimmung von Enzymen anstelle der direkten Messung der Extinktion zu bestimmen.
Die Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren bereitstellen, die Menge an kurzkettigem Acyl-L- Carnitin in der Probenlösung durch eine kombinierte Verwendung von ihr mit der Acylcarnitin-esterase des Standes der Technik zu bestimmen, da die Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine enzymatische Aktivität für kurzkettige Acyl-L-Carnitine, nämlich Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L- Carnitin aufweist.
Somit wird durch die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Testen von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin in einer Probe bereitgestellt, bei dem man
(a) einen Teil der Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer Acylcarnitin-esterase unterwirft, die keine enzymatische Aktivität für Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin besitzt, jedoch Substratspezifität für Acyl-L-Carnitine mit längeren Ketten zeigt und die Hydrolysereaktion von einem Mol Acyl-L-Carnitin mit längeren Ketten mit einem Mol Wasser unter Bildung von einem Mol der korrespondierenden Fettsäure und einem Mol L-Carnitin katalysiert (welche Esterase nachstehend als langkettige Acylcarnitin-esterase bezeichnet wird) und danach die Menge an Fettsäuren und/oder L-Carnitin z.B. durch ein an sich bekanntes Analyseverfahren bestimmt, die so gebildet wurden;
(b) einen weiteren Teil der Probe einem Test auf Acyl-L-Carnitine unter Einschluß von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin, wie vorstehend definiert, unterwirft; und
(c) die Differenz der analytischen Werte bestimmt, die bei den Stufen (a) und (b) erhalten worden sind.
Während es bezüglich der in der Verfahrensstufe (a) des vorstehend erwähnten Analyseverfahrens zu verwendenden langkettigen Acylcarnitin-esterase keine spezielle Beschränkung gibt, wird empfohlen, eine Acylcarnitin-esterase zu verwenden, die von einer Ratte stammt.
Die Verfahren in den vorstehenden Verfahrensstufen (a) und (b) sind im wesentlichen dieselben. Der Unterschied des bestimmten Werts zwischen den Verfahrensstufen (a) und (b) entspricht der Menge der kurzkettigen Acyl-L-Carnitine in der Probenlösung.
Durch die vorliegende Erfindung wird auch ein weiteres Verfahren zum Testen von Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin in einer Probe bereitgestellt, bei dem man
(a&sub1;) die Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer langkettigen Acylcarnitin-esterase unterwirft und danach das resultierende Gemisch der Reaktionsprobe der Einwirkung einer L-Carnitin-dehydrogenase mit einem Coenzym A&sub1; (worin A&sub1; eine Verbindung der NAD-Gruppe oder der Thio-NAD Gruppe ist) unterwirft, um A&sub1; in seine reduzierte Form A&sub2; umzuwandeln, und das resultierende Gemisch der Probe behandelt und A&sub2; zersetzt; und
(b&sub1;) das resultierende Gemisch der Probe einem Verfahren zum Testen von Acyl-L-Carnitinen unter Einschluß von Acetyl-L-Car nitin und Propionyl-L-Carnitin, wie vorstehend definiert, unterwirft.
Die enzymatische Reaktion in der Verfahrenstufe (a&sub1;) kann auf die gleiche Weise realisiert werden, wie diejenige von (a) des vorstehenden Analyseverfahrens. Die Zersetzung von A&sub2; in dem Verfahrensschritt (a&sub1;) dieses Analyseverfahrens wird dadurch realisiert, daß das Gemisch der Reaktionsprobe unter sauren Bedingungen bei einer Temperatur von mindestens 37 ºC erwärmt oder erhitzt wird, wobei das gesamte L-Carnitin, nämlich das, das von den Acyl-L-Carnitinen mit längeren Ketten stammt und dasjenige, das ursprünglich vorlag, durch Zersetzung aus dem Reaktionssystem entfernt wird. Durch die Zersetzung von A&sub2; enthält das Probengemisch somit nur die niederen L-Carnitine, wodurch die Menge der kurzkettigen Acyl-L-Carnitine durch die Verfahrensstufe (b&sub1;) bestimmt werden kann, die der Verfahrensstufe (b) des ersteren Analyseverfahrens im wesentlichen gleich ist.
Die Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung weist das klare Merkmal auf, daß es auch eine Substratspezifität für Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin aufweist, für die die herkömmlichen Acylcarnitin-esterasen keine Substratspezifität aufweisen. Zusätzlich weist die Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung für verschiedene Acyl-L-Carnitine geringere Km Werte und eine überlegene Stabilität auf. Dadurch, daß von diesen überlegenen Merkmalen der Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung Gebrauch gemacht wird, können vorteilhafte und bequeme Tests auf Acylcarnitine vorgeschlagen werden. Durch die vorliegende Erfindung wird dadurch auch ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung einer derartigen Acylcarnitin-esterase vorgeschlagen, daß von der hervorragenden Hitzestabilität der Esterase Gebrauch gemacht wird, was eine leichtere Durchführung der Reinigung bei einer einfachen und ökonomischen Herstellung in großem Maßstab durch aerobe Kultivierung ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den nachfolgenden Beispielen weiter beschrieben.

Beispiel 1

Kultur von Alcaligenes sp. Nr. 981

100 ml eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0), das 0,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,4 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,05 % MgSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,02 % FeSO&sub4; x 7H&sub2;O, 0,02 % MnSO&sub4; x nH&sub2;O und 0,1 % eines Hefeextrakts (ein Produkt der Kyokuto Seiyaku) enthält, wurden jeweils in 5 Erlenmeyer Kolben mit einer Kapazität von 500 ml gegeben und dadurch sterilisiert, daß sie 20 Minuten lang auf 120 ºC erhitzt wurden. 5 ml von vorher sterilisiertem 10%-igem Octanoyl-DL-Carnitin (ein Produkt von Sigma) wurden unter aseptischen Bedingungen in jeden Kolben gegeben, die dann mit einer geringen Menge Alcaligenes sp. Nr. 981 beimpft wurden. Die Gemische wurden 72 Stunden lang bei 28 ºC auf einem Schüttelkultivator mit 120 U/Min. geschüttelt. Es wurde eine Gesamtmenge von 470 ml der Kulturproduktflüssigkeit erhalten.

Beispiel 2

Trennung und Reinigung der Acyclcarnitin-esterase gemäß der Erfindung

470 ml der Kulturproduktflüssigkeit wurden einer Zentrifugation unterzogen, um die Bakterienzellen zu sammeln, die in 50 ml einer 100 mmol/l Tris-Pufferlösung (pH 8,0) suspendiert wurden.
Diese Suspension wurde unter Verwendung eines Ultraschalldesintegrators (hergestellt von Kubota) homogenisiert, wonach es 10 Minuten lang bei 15.000 U/Min. zentrifugiert wurde, wodurch 45 ml einer überstehenden Flüssigkeit (0,3 U/ml) erhalten wurden. Diese hohe Enzymlösung wurde 30 Minuten lang bei 60 ºC hitzebehandelt, worauf sie wiederum bei 15.000 U/Min. zentrifugiert wurde, wodurch 44 ml einer überstehenden Flüssigkeit (0,3 U/ml) erhalten wurden. Die entstandene Enzymlösung wurde durch eine Gelfiltrationssäule geführt, die mit 20 ml einer DEAE-Sepharose CL-68 (hergestellt von Pharmacia beladen war), die mit einer 50 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) gepuffert worden war, worauf 100 ml einer 5 mmol/l Tris-Pufferlösung (pH 8,0) die 0,1 mol/l KCl enthielt, durch die so beladene Säule geführt wurden, bevor die Säule mit einer 50 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) die 0,25 mol/l KCl enthielt, eluiert wurde. Durch diese Elution wurden 25 ml einer Enzymlösung (0,47 U/ml) erhalten. Diese Enzymlösung wurde über Nacht bei 5 ºC gegen mehrere Liter einer 50 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) dialysiert, wodurch 28 ml einer Enzymlösung (0,41 U/ml, Ausbeute = 85%) erhalten wurden. 20 ml dieser Enzymlösung wurden gefriergetrocknet, wodurch 80 mg eines pulverförmigen Produkts (0,1 U/mg) erhalten wurden.

Referenzbeispiel 1

Kultur von Alcaligenes sp. Nr. 981 zur Herstellung von L-Carnitin-dehydrogenase

100 ml eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0), das 3% DL-Carnitinchlorid (ein Produkt von Sigma), 0,2% KH&sub2;PO&sub4;, 0,4% K&sub2;HPO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,002% FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,001% MnSO&sub4; x nH&sub2;O enthielt, wurden in einen 500 ml Erlenmeyer Kolben gegeben und durch 20 Minuten dauerndes Erhitzen bei 120 ºC sterilisiert.
Dieses Kulturmedium wurde mit einer geringen Menge Alcaligenes sp. Nr. 981 beimpft und das Gemisch auf einem Schüttelkultivator 40 Stunden lang bei einer Rührgeschwindigkeit von 120 U/Min. bei 28 ºC kultiviert, wodurch 95 ml einer Kulturstammflüssigkeit (enzymatische Aktivität = 1,2 U/ml) erhalten wurden.
Andererseits wurden 20 Liter eines flüssigen Kulturmediums (pH 7,0), das 3% DL-Carnitinchlorid (ein Produkt von Sigma), 0,1% eines Hefeextrakts (ein Produkt von Kyokuto Seiyaku), 0,054% KH&sub2;PO&sub4;, 0,746% K&sub2;HPO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,002% CaCl&sub2; x 2 H&sub2;O, 0,002% FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,002% MnSO&sub4; x nH&sub2;O und 1 ml/l Disfoam CB442 (ein Produkt von Nippon Oils und Fats) enthielt, in einen 30 l Flaschenfermenter (jar fermenter) gegeben und durch Erhitzen sterilisiert. Dieses flüssige Kulturmedium wurde mit 90 ml der vorstehend erhaltenen Kulturstammflüssigkeit beimpft und das Gemisch unter Bedingungen einer Kulturtemperatur von 28 ºC, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 20 L/Min., einem Fermenter Innendruck von 0,4 kg/cm², einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/Min. und einer Kulturdauer von 27 Stunden einer Belüftungskultivierung unterzogen, wodurch 19 l eines Kulturprodukts (enzymatische Aktivität = 3,0 U/ml) erhalten wurden.

Referenzbeispiel 2

Trennung und Reinigung von L-Carnitin-dehydrogenase

90 Liter des in Referenzbeispiel 1 erhaltenen Kulturprodukts wurden zum Sammeln der Bakterienzellen einer Zentrifugation unterzogen. Die gesammelten Bakterienzellen wurden dadurch 1 Stunde lang einer Solubilisierungsbehandlung bei 37 ºC unterzogen, daß 4 l einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) die 0,1% Lysozym und 15 mmol/l Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz (EDTA x 2Na) enthielt, zugegeben wurden. Das behandelte Gemisch wurde einer Zentrifugation unterzogen, wodurch 4500 ml einer überstehenden Flüssigkeit (mit einer spezifischen enzymatischen Aktivität von 10,3 U/ml) erhalten wurden. In dieser überstehenden Flüssigkeit wurden 1100 g Ammoniumsulfat gelöst und der dadurch gebildete Niederschlag durch Zentrifugation entfernt, worauf wiederum 700 g Ammoniumsulfat in der entstandenen überstehenden Flüssigkeit gelöst wurden. Die behandelte überstehende Flüssigkeit wurde dann einer Zentrifugation unterzogen, wodurch ein Niederschlag erhalten wurde, der in 500 ml einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) gelöst wurde und diese Lösung (die eine spezifische enzymatische Aktivität von 84,1 U/ml aufwies) wurde gegen 10 l einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) dialysiert. Die dialysierte Enzymlösung wurde durch eine Gelfiltrationssäule geführt, die mit 200 ml DEAE-Sepharose CL-6B (ein Produkt von Pharmacia) gepackt war, die mit einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) gepuffert worden war, gefolgt von einer Verdrängung aus dem Filterbett durch Hindurchführen von 1 l einer 40 mmol/l Tris-HCl Lösung (pH 8,0), die 0,1 mol/l KCl enthielt, worauf die Säule unter Verwendung einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0), die 0,3 mol/1 KCl enthielt, eluiert wurde, wodurch 300 ml einer Enzymlösung (mit einer spezifischen enzymatischen Aktivität von 12,5 U/ml) erhalten wurde. Diese Enzymlösung wurde gegen 10 l einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) dialysiert. Die dialysierte Enzymlösung wurde durch eine Säule geführt, die mit 100 ml Hydroxylapate (ein Produkt von KOKEN) gepackt war, das mit einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung gepuffert worden war, gefolgt von einem Verdrängungsverfahren durch Hindurchführen von 200 ml einer 40 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0), worauf die Säule mit 800 ml einer 2 mmol/l Phosphatpufferlösung (pH 7,0) eluiert wurde, wodurch 100 ml einer Enzymlösung (spezifische enzymatische Aktivität = 331 U/ml) erhalten wurden. Diese Enzymlösung wurde gegen 5 l einer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) dialysiert, wodurch 95 ml einer dialysierten Enzymlösung erhalten wurden (spezifische enzymatische Aktivität = 331 U/ml; Wiedergewinnungsausbeute = 67,8%).
Es wurde gefunden, daß die NADH-Oxidaseaktivität in dieser gereinigten L-Carnitindehydrogenase nicht mehr als 0,0001 U/ml betrug.
Die Eigenschaften der vorstehend erhaltenen L-Carnitin-dehydrogenase waren wie folgt:

(1) Enzymatische Aktivität

Sie katalysiert zumindest die Reaktion von L-Carnitin mit NAD wodurch 3-Dehydrocarnitin und NADH gebildet werden, wie in dem folgenden Reaktionsschema dargestellt: L-Carnitin (2) Substratspezifität Substrat Relative Spezifität % L-Carnitin Cholin Glycinbetain Glucose Lysin

(3) Molekulargewicht

51.000 ± 6.000
Das Molekulargewicht wurde durch Molekularsiebchromatographie unter Verwendung von TSK Gel G3000 SW (ein Produkt von Toso) auf einer Säule von 7,5 x 60 cm und unter Verwendung eines Eluiermittels bestimmt, das aus einer 0,1 mol/l Phosphatpufferlösung (pH 7,0) bestand, die 0,2 mol/l NaCl enthielt, wobei die folgenden von Oriental Kobo gelieferten Standardmolekulargewichtmarker verwendet wurden: Molekulargewicht Verbindung Cytochrom C Adel inatkinase Enolase Lactatdehydrogenase Glutamatdehydrogenase

(4) Isoelektrischer Punkt

pH 5,3 ± 0,6
Der isoelektrische Punkt wurde durch isoelektrische Fokusierung bestimmt, wobei ein Trägerampholit 40 Stunden lang unter einer konstanten Spannung von 700 V verwendet wurde, worauf die Lösung einer Fraktionierung unterzogen wurde und die enzymatische Aktivität einer jeden Fraktion untersucht wurde.

(5) Km Wert

Der Km Wert für NAD&spplus; wurde durch Variation der Konzentration von NAD&spplus; in einer Reaktionslösung bestimmt, die eine 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 9,0), 5 Einheiten Diaphorase (ein Produkt von Toyo Jozo), 0,025 % NBT (ein Produkt der Wako Pure Chemical Ind.), 1 % Tween 80 (ein Produkt der Wako Pure Chemical Ind.) und 50 mmol/l L-Carnitin enthielt, wodurch ein Wert von 0,141 mmol/l erhalten wurde.
Andererseits wurde der Km Wert für L-Carnitin dadurch bestimmt, daß die Konzentration von L-Carnitin in der vorstehenden Reaktionslösung variiert wurde, in der 50 mmol/l L-Carnitin durch 1 mmol/l NAD&spplus; ersetzt wurden, wodurch ein Wert von 9,3 mmol/l erhalten wurde.

(6) Hitzestabilität

Unter Verwendung einer 20 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) wurde eine Lösung dieser Esterase (1,00 U/ml) hergestellt. Diese Lösung wurde 1 Stunde lang hitzebehandelt, worauf die enzymatische Restaktivität gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität bestimmt wurde, wodurch gezeigt wurde, daß die enzymatische Aktivität zumindest bis zu einer Temperatur von 45 ºC stabil war.

(7) Optimale Temperatur

Bei Verwendung einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 9,0) wurde eine Lagerstabilität bei 5 ºC von 2 Wochen beobachtet. Die L-Carnitin-dehydrogenasen, die aus den drei Stämmen der vorstehend genannten, bekannten L-Carnitin-dehydrogenase herstellenden Bakterien erhalten wurden, wiesen nach einer Woche eine enzymatische Restaktivität von etwa 53 - 40 % auf, die nach zwei Wochen auf unter 45 % abnahm. Insbesondere das aus Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 hergestellte Enzym war das instabilste und wies eine Restaktivität von nur 41 % auf. Im Gegensatz dazu wies die aus dem Bakterium gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene L-Carnitin-dehydrogenase nach einer Woche eine enzymatische Restaktivität von 96 % und nach zwei Wochen von 82 % auf, was zeigt, daß sie im Vergleich zu den üblichen Enzymen, die von bekannten L-Carnitin-dehydrogenase herstellenden Bakterien stammen, eine erheblich höhere Stabilität aufweist. Wenn man 0,05 mmol/l NAD&spplus; in diesem Lagerstabilitätstest coexistieren ließ, wurde gefunden, daß die enzymatische Restaktivität nach einer Woche 99,7 % und nach zwei Wochen 95,1 % betrug, was noch höher ist als die vorstehende Aktivität, wodurch eine stabilisierende Wirkung von NAD&spplus; dargelegt wird.

(8) Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der L- Carnitin-dehydrogenase

1. Zusammensetzung der Reaktionslösung

Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) 50 mmol/l
NAD&spplus; 1 mmol/l
Diaphorase (von Toyo Jozo) 5 Einheiten
NBT (von der Wako Pure Chemical Ind.) 0,025 %
KCl 100 mmol/l
Polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat (von der Wako Pure Chemical Ind.) 0,5 %
L-Carnitin (von Sigma) 100 mmol/l

2. Bestimmung der enzymatischen Aktivität

1 ml der Reaktionslösung wurde in ein kleines Reagenzglas gebracht und 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert und dann wurden 0,02 ml der zu untersuchenden Esteraselösung zugegeben, um die Reaktion unter Rühren zu starten. Nach exakt 10 Minuten werden 2 ml 0,1 N wässeriger HCl dazugegeben, um die Reaktion abzubrechen, und es wird die A&sub5;&sub5;&sub0; nm der Lösung gemessen, wodurch die Extinktion A&sub1; erhalten wird.
Dieselben Verfahren werden für die Reaktionslösung wiederholt, aus der L-Carnitin entfernt worden war, wodurch die Extinktion A&sub0; erhalten wurde. 3. Gleichung zur Berechnung
(worin Z das Verdünnungs-Verstärkungsverhältnis bezeichnet und der Wert 21,7 dem molekularen Extinktionscoeffizienten in cm²/µmol entspricht)

Beispiel 3

Vergleich der Hydrolyseleistung für Octanoyl-L-Carnitin durch die Acylcarnitin-esterase der Erfindung mit derjenigen von wässerigem Kaliumhydroxid
Probenlösungen von Octanoyl-L-Carnitin wurden unter Verwendung einer 50 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) so hergestellt, daß die Octanoyl-L-Carnitin Konzentrationen 0,1 mmol/l, 0,2 mmol/l, 0,3 mmol/l, 0,4 mmol/l bzw. 0,5 mmol/l betrugen. Es wurde jeweils 1 ml dieser Lösungen in ein kleines Reagenzglas gebracht, das 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert wurde, 0,1 ml der Enzymlösung (0,41 U/ml), die in Beispiel 2 hergestellt worden war, wurde dazugegeben und die entstandene Lösung 15 Minuten lang weiter inkubiert. Je 0,05 ml dieser Lösung, zu der die Enzymlösung gegeben worden war, wurden dann zu jeweils 1 ml der getrennt hergestellten Reaktionslösungen von L-Carnitin aus dem Analyseverfahren A gegeben, die vorher jeweils bei 37 ºC in einem kleinen Reagenzglas beimpft worden waren. Jede der behandelten Lösungen wurden 2 Minuten lang inkubiert und dann wurden 2 ml 0,1 N wässeriger HCl dazugegeben und die entstandene Lösung auf ihren A&sub5;&sub5;&sub0; nm untersucht. Parallel dazu wurden auf ähnliche Weise Probenlösungen hergestellt, wobei aber eine KOH Lösung als Hydrolisierungsmittel verwendet wurde. So wurde 1 ml einer 10 n KOH Lösung zu 1 ml Octanoyl-L-Carnitin gegeben und die entstandene Lösung 3 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert, worauf die Lösung durch Zugabe von 1 ml 10 n wässeriger HCl neutralisiert wurde. 0,15 ml dieser neutralisierten Lösung wurden zu 1 ml der Reaktionslösung aus dem Analyseverfahren A gegeben (vgl. 4. von Paragr. 10 Verfahren zur Abschätzung der Aktivität von Acylcarnitin-esterase), worauf die entstandene Lösung in der gleichen Weise auf ihren A&sub5;&sub5;&sub0; nm untersucht wurde. Die Ergebnisse werden in der Zeichnung von Fig. 5 angegeben, die zeigt, daß das Octanoyl-L-Carnitin durch das Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung vollständig hydrolysiert worden ist. In Fig. 5 stehen die Markierungen Δ, 0 und und für die Werte, die durch die Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, und die, die durch KOH erhalten worden sind bzw. diejenigen, die theoretisch berechnet wurden.

Beispiel 4

Bestimmung von Acyl-L-Carnitin in menschlichem Serum

Die Menge an freiem L-Carnitin in dem Serum eines Mannes wurde durch das Analyseverfahren A für 5 normale gesunde männliche Spender bestimmt. 1 ml 10 n wässeriges Kaliumhydroxid wurde zu 1 ml des Serums gegeben und das Gemisch 2 Stunden lang bei 37 ºC inkubiert, worauf dieses mit Alkali behandelte Serum dadurch neutralisiert wurde, daß 1 ml 10 n wässeriger HCl dazugegeben wurde. Das behandelte Serum wurde durch das Analyseverfahren A auf seinen gesamten Carnitingehalt untersucht. Andererseits wurde 1 mg (0,1 U/mg) der Acylcarnitin-esterase gemäß der vorliegenden Erfindung zu 1 ml frischem Serum gegeben und dieses mit Esterase beimpfte Serum wurde 15 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Dieses mit Esterase behandelte Serum wurde ebenfalls durch das Analyseverfahren A auf seinen Gesamtgehalt an Carnitin untersucht. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 zeigt, daß die Acyl-L-Carnitine durch die Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung als auch durch das Alkali hydrolysiert worden sind. Tabelle 1 Serumprobe (Donoralter) Conc. an beob. freiem L-Carnitin (in µmol/l) Gesamtmenge der beob. L-Carnitin Konz. (in µmol/l) Hydrolisiert durch Esterase KOH

Referenzbeispiel 3

Reinigung von Acylcarnitin-esterase, die aus der Leber einer Ratte stammt
Zum Vergleich der Leistung der Esterase mit derjenigen der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung wurde Acylcarnitinesterase aus der Leber einer Ratte gesammelt und gemäß dem Verfahren gereinigt, das von S. Mahadevan und F. Sauer in "J. Biol. Chem.", 244, Nr. 16, 4448 - 4453 (1969) beschrieben wurde. Aus dem Homogenisat aus 50 g der Rattenleber wurde Acylcarnitin-esterase extrahiert und unter Verwendung von DEAE- Cellulose (Whatman DE-52) und Sephadex G-200 (geliefert von Pharmacia) gereinigt, wodurch 101,6 mg (0,0364 U/ml) eines gefriergetrockneten Produkts erhalten wurden.

Referenzbeispiel 4

Unter Verwendung der in Referenzbeispiel 3 hergestellten Esterase wurden die enzymatische Aktivität und die Km Werte von Acetyl-L-carnitin, Propionyl-L-Carnitin, Octanoyl-L-Carnitin, Decanoyl-L-Carnitin und Palrnitoyl-L-Carnitin bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 angegeben. Die Esterase weist keine enzymatische Aktivität für Acyl-L-Carnitin mit kurzen Ketten, d.h. Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin auf, während es eine enzymatische Aktivität für andere Acyl-L-Carnitine mit mittleren bis langen Ketten aufweist. Es wurde gefunden, daß die Km Werte dieser Acyl-L-Carnitine beträchtlich hoch sind, d.h. in der Größenordnung von 10&supmin;³ mol/l liegen, wie in der Literatur berichtet. Tabelle 2 Acyl-L-Carnitin Enzymatische Aktivität (rel. %) Km Wert (x 10&supmin;³) Acetyl-L-Carnitin Propionyl-L-Carnitin Octanoyl-L-Carnitin Decanoyl-L-Carnitin Palmitoyl-L-Carnitin

Beispiel 5

Die in Referenzbeispiel 3 hergestellte Esterase wurde auf ihre Hitzestabilität untersucht.
Es wurden Probenlösungen unter Verwendung einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) so hergestellt, daß sie alle eine Enzymkonzentration von 0,1 U/ml aufwiesen. Unter Verwendung dieser Probenlösungen wurde die enzymatische Restaktivität bestimmt, die nach einer 30 minutigen Hitzebehandlung bei 45 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC oder 70 ºC übrig blieb. Die Ergebnisse werden in der Zeichnung von Fig. 6 angegeben, woraus hervorgeht, daß die enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 50 ºC auf 61% abnahm. In der Zeichnung entsprechen die aufgetragenen Markierungen, und 0 den Daten für eine Esterase, die von einer Ratte stammt, bzw. denjenigen, für die Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 6

1 ml der L-Carnitin Probenlösung, die aus einer 100 mmol/l Tris-HCl Lösung (pH 8,0) hergestellt worden war, die 0,02 mmol/l Octanoyl-L-Carnitin variierenden Mengen der in Referenzbeispiel 3 hergestellten Esterase, die aus der Leber einer Ratte stammt, und variierenden Mengen der in Beispiel 2 hergestellten Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung enthielt, wurde einer 50 minütigen enzymatischen Hydrolyse bei 37 ºC unterzogen und es wurde die Menge des gebildeten L-Carnitins bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Zeichnung von Fig. 7 angegeben, die zeigt, daß die enzymatische Hydrolyse für die Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung bei einem Esterasegehalt von 0,01 U/ml nahezu vollständig abgelaufen war, während die enzymatische Reaktion für die Esterase, die aus der Leber einer Ratte stammte, selbst bei einem Esterasegehalt von 0,6 U/ml nicht vollständig abgelaufen war.

Beispiel 7

Unter Verwendung der gereinigten Esterase, die aus der Leber einer Ratte stammte, und derjenigen gemäß der Erfindung wurde eine Analyse von Acyl-L-Carnitin durchgeführt. Zu 1 ml einer jeden der Lösungen, die aus einer 100 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) hergestellt worden waren und die jeweils 1 mmol/l Acetyl-L-Carnitin, Propionyl-L-Carnitin, Hexanoyl-L-Carnitin, Octanoyl-L-Carnitin, Decanoyl-L-Carnitin, Lauroyl-L-Carnitin, Myristoyl-L-Carnitin, Palrnitoyl-L-Carnitin und Stearoyl-L-Carnitin enthielten , wurden 0,1 U (1 mg) der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben. Die entstandene Lösung wurde 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Andererseits wurde 1 Einheit (27,5 mg) einer gereinigten Esterase, die aus der Leber einer Ratte stammte zu 1 ml derselben Acyl-L-Carnitin Pufferlösung gegeben und die Lösung ebenfalls 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Zu 1 ml der Reaktionslösung des Analyseverfahrens A zur Bestimmung von L-Carnitin, die zuvor 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert worden war, wurden 0,01 ml von einer jeden der umgesetzten Esteraselösungen gegeben, die wie vorstehend beschrieben, hergestellt worden waren, und das resultierende Gemisch wurde zwei Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Dann wurden 2 ml einer 0,1 N wässerigen HCl dazugegeben und dann der A&sub5;&sub5;&sub0; nm gemessen, um die Menge des hergestellten L-Carnitins zu bestimmen. Andererseits wurde eine Reaktionslösung, zu der 0,01 ml der aus der Ratte stammenden Esteraselösung gegeben worden war und die inkubiert worden war, weiter durch Zugabe von 0,1 Einheiten der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt und weiter 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert, worauf der A&sub5;&sub5;&sub0; nm dieser zusätzlich behandelten Lösung untersucht wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß in den Probenlösungen, die mit der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt worden waren, das gesamte Acyl-L-Carnitin vollständig hydrolysiert worden war, wogegen in den Probenlösungen, die mit der aus der Leber einer Ratte stammenden Esterase behandelt worden waren nur andere Acyl-L-Carnitine als die Acyl-L-Carnitine mit kurzen Ketten, nämlich Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin hydrolysiert worden waren. Durch zusätzliche Weiterbehandlung mit der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Acyl-L-Carnitine mit kurzen Ketten hydrolysiert. Tabelle 3 Behandelt mit Beobachteter A&sub5;&sub5;&sub0; nm Bestimmte Acyl-L-Carnitine Theoretisch Erfindungsgem. Esterase v. Ratten stammende Esterase v. Ratten stammende Esterase + erfindungsgem. Esterase

Beispiel 8

Zu 1 ml Serum eines normalen gesunden männlichen Spenders (Serumprobe 1 in Tabelle 1 von Beispiel 4) wurde 1 Einheit (27,5 mg) einer gereinigten Esterase gegeben, die aus der Leber einer Ratte stammte, und das Gemisch 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert, wodurch die enzymatisch hydrolysierte Reaktionsflüssigkeit 1 erhalten wurde. 0,1 ml der Reaktionsflüssigkeit 1 wurden zu 1 ml der Reaktionslösung aus dem Analyseverfahren A zur Bestimmung von L-Carnitin gegeben, die zuvor 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert worden war, und die entstandene Lösung wurde 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Der A&sub5;&sub5;&sub0; nm dieser inkubierten Lösung wurde dann untersucht, wodurch ein A&sub5;&sub5;&sub0; nm Wert von 0,121 erhalten wurde. Andererseits wurde eine Reaktionsflüssigkeit 2 durch Zugabe von 0,9 ml der Reaktionsflüssigkeit 1 zu 0,09 Einheiten (0,9 mg) der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben und das entstandenen Gemisch 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Der A&sub5;&sub5;&sub0; nm der Reaktionsflüssigkeit 2 wurde ebenfalls auf die gleiche Weise untersucht wie der der Reaktionsflüssigkeit 1, wodurch ein A&sub5;&sub5;&sub0; nm Wert von 0,142 erhalten wurde.
Es wird aus den vorstehenden experimentellen Ergebnissen geschätzt, daß das Carnitinprofil in dem Serum des männlichen Spenders 1 so vorliegt, wie in der nachfolgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Carnitine Konzentration Freies L-Carnitin Gesamtcarnitin Acyl-L-Carnitin Acyl -L-Carnitine mit mittlerer bis langer Kette Acetyl- und Propionyl-L-Carnitin

Beispiel 9

Zusammensetzung der Reaktionslösung
(Ia) 20 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0)
0,2 % Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat (Wako Pure Chem. Ind.)
(Ib) 20 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0)
0,2 % Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat (Wako Pure Chem. Ind.)
0,2 U/ml Acyl-L-Carnitin-esterase
(von Alcaligenes sp. Nr. 981, geliefert von Toyo Jozo)
(Ic) 20 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0)
0,2 % Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat (Wako Pure Chem. Ind)
1 U/ml Acyl-L-Carnitin-esterase (aus der Leber einer Ratte stammend)
(II) 200 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 9,5)
8 mg Thio-NAD (geliefert von Sigma)
0,2 mmol/l NADH (geliefert von Oriental Kobo)
370 U/ml L-Carnitin-dehydrogenase
(von Alcaligenes sp. Nr. 981, geliefert von Toyo Jozo)
Zu 25 ml Serum eines männlichen Spenders 1 wurden 0,5 ml der vorstehenden Lösung (Ia) und 0,5 ml der vorstehenden Lösung (II) gegeben, die beide zuvor bei 37 ºC inkubiert worden waren, und das Gemisch wurde auf 37 ºC erhitzt. Der Unterschied zwischen den Extinktionsdaten bei 400 nm, die 3 Minuten und 5 Minuten nach der Zugabe der Lösung bestimmt wurden, wurden berechnet [A (mAbs)]. Dasselbe Verfahren wurde auch auf die Lösung (Ib) angewendet, um den Unterschied der Extinktionsdaten (B) zu berechnen. Weiter wurde dasselbe Verfahren auch auf destilliertes Wasser, auf die Standard 50 µmol/l L-Carnitin Lösung bzw. auf die Lösung (Ia) allein angewendet, ohne Serum zu verwenden, wodurch RB und S erhalten wurden.
Aus diesen Ergebnissen wird der Gehalt an freiem L-Carnitin und der Gesamtcarnitingehalt durch die folgenden Gleichungen berechnet:
(1) Freies L-Carnitin (µmol/l) =
(2) Gesamtcarnitin (µmol/l) =
Getrennt davon wurden 25 ml des vorstehend erwähnten Serums zu 0,5 ml der vorstehend erwähnten Lösung (Ic) gegeben, die aus der Leber einer Ratte stammende Acyl-L-Carnitin-esterase enthielt, und das entstandene Gemisch wurde 30 Minuten lang auf 37 ºC erhitzt, um die Hydrolyse aller anderen Acyl-L-Carnitine als Acetyl-L-Carnitin und Propionyl-L-Carnitin zu bewirken. Zu dem behandelten Gemisch wurden 0,5 ml der vorstehenden Lösung (II) gegeben und das entstandene Gemisch wurde auf 37 ºC erwärmt, worauf die Extinktion bei 400 nm 3 Minuten und 5 Minuten nach der Zugabe der Lösung (II) bestimmt wurde, um den Unterschied zwischen ihnen durch Berechnung zu bestimmen. Der Gesamtgehalt an Carnitin außer Acetyl- und Propionyl-L-Carnitin wird durch die folgende Gleichung berechnet:
(3) Gesamtcarnitin ohne Acetyl- und Propionyl- L-Carnitin (µmol/l) =
Der Gehalt an Acetyl-L-Carnitin plus Propionyl-L-Carnitin wird durch die folgende Gleichung berechnet:
(4) Acetyl- + Propionyl- = (2) - (3) L-Carnitin (µmol/l)
Diese Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Wie daraus hervorgeht, stimmt das Serum Carnitin Profil von Probe 1 nahezu mit den in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnissen überein. Unterschied der Extinktionen bei 400 nm zu Zeitpunkten 3 und 5 Minuten nach dem Start

Arbeitsweise und Ergebnisse

1 ml der vorstehenden Reaktionslösung wurde in ein kleines Reagenzglas gebracht und 5 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Dazu wurde 1 Einheit (27,5 mg) der gereinigten Acylcarnitin-esterase gegeben, die aus der Leber einer Ratte stammt, und die entstandene Lösung wiederum 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Dadurch wurde ein A&sub3;&sub4;&sub0; nm Wert von 0,561 erhalten. Zu dieser Lösung wurden 0,025 ml einer 0,5 n wässerigen HCl gegeben und die entstandene angesäuerte Lösung wurde 15 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert, worauf die Lösung durch Zugabe von 0,025 ml von 5 n wässeriger KOH neutralisiert wurde. Die neutralisierte Lösung ergab einen A&sub2;&sub4;&sub0; nm Wert von 0,08. Zu der behandelten Reaktionslösung wurden weiter 0,01 ml von 500 mmol/l NAD&spplus;, 0,01 ml von L-Carnitin-dehydrogenase und 0,1 Einheit (1 mg) der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung zugegeben und das entstandene Gemisch wieder 30 Minuten lang bei 37 ºC inkubiert. Die entstandene Lösung ergab einen A&sub3;&sub4;&sub0; nm Wert von 0,594.
Wie vorstehend beschrieben konnten alle Acetyl-L-Carnitine in der Probenlösung dadurch bestimmt werden, daß die Probenlösungen zunächst einer enzymatischen Hydrolyse mit der Esterase unterzogen wurden, die aus der Leber einer Ratte stammte, um Octanoyl-L-Carnitin zu hydrolysieren, und dann das dadurch gebildete L-Carnitin mit der L-Carnitin-dehydrogenase und NAD&spplus; zu behandeln, um das L-Carnitin in Dehydrocarnitin unter Umsetzung von NAD zu NAD&spplus; umzuwandeln, und daß danach die gebildete NADH durch Zugabe von Salzsäure durch Säurezersetzung entfernt wurde und daß das entstandene Reaktionsgemisch schließlich durch erneute Zugabe der L-Carnitin-dehydrogenase zusammen mit NAD&spplus; und der Esterase gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt wurde.

Beispiel 11

Reaktionsgemisch
50 mmol/l Glycin-NaOH (pH 10,0)
5 mmol/l Thio-NAD (geliefert von Sigma)
30 U/ml L-Carnitin-dehydrogenase (aus Alcaligenes sp. Nr. 981, geliefert von Toyo Jozo)
0,5 % Polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat (Wako Pure Chem. Ind.)
0,1 M Natriumchlorid
Eine gemischte Lösung, die aus 250 µmol/l L-Carnitin und 250 µmol/l Acetyl-L-Carnitin bestand, wurde unter Verwendung einer 50 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) hergestellt. Diese gemischte Lösung wurde unter Verwendung derselben 50 mmol/l Tris- HCl Pufferlösung (pH 8,0) durch 5 verschiedene, schrittweise Verdünnungsverhältnisse verdünnt, wodurch 5 Probenlösungen erhalten wurden, die jeweils stufenweise unterschiedliche Konzentrationen aufwiesen. Jede dieser 5 Proben wurden jeweils in einer Menge von 0,5 ml in zwei Reagenzgläser gebracht und die Reagenzgläser zunächst auf 37 ºC erhitzt. In ein Reagenzglas wurden 0,05 ml der Acylcarnitin-esteraselösung (0,41 U/ml) von Beispiel 2 gegeben (um als mit einem Enzym behandelte Probe zu dienen) und in das andere Reagenzglas wurden 0,05 ml destilliertes Wasser gegeben (um als eine Probe ohne Enzymbehandlung zu dienen), worauf beide 15 Minuten lang auf 37 ºC erhitzt wurden. Zu 1 ml der vorstehenden Reaktionslösung, die zuvor auf 37 ºC erwärmt worden war, wurden jeweils 0,1 ml von entweder der vorstehenden mit einem Enzym behandelten Probenlösung (die in der Zeichnung von Figur 8 durch die Markierung 0 bezeichnet wird) oder der vorstehenden Probenlösung ohne Enzymbehandlung (die in der Zeichnung von Figur 8 durch die Markierung bezeichnet wird) gegeben, worauf die entstandene Lösung 10 Minuten lang auf 37 ºC erwärmt wurde. Die behandelten Lösungen wurden dann zur Messung der Extinktion bei 400 nm beobachtet.
Als Blindversuch wurde eine 15 mmol/l Tris-HCl Pufferlösung (pH 8,0) anstelle der Probenlösung verwendet. In der Zeichnung in Figur 8 sind Werte aufgetragen, bei denen die Werte des Blindversuchs bereits von den beobachteten Werten abgezogen worden sind.

Claims

1. Acylcarnitin-esterase, die

(a) für jedes der folgenden Substrate spezifisch ist: Acetyl-Lcarnitin, Propionyl-L-carnitin und Palmitoyl-L-carnitin;

(b) die Hydrolyse von einem Mol der genannten Substrate mit einem Mol Wasser unter Bildung eines Mols der korrespondierenden Säure und einem Mol L-Carnitin katalysiert; und

(c) die folgenden physikochemischen Eigenschaften besitzt:

a) ein Molekulargewicht von 63.000 ± 7.000 (bestimmt durch Gelfiltration);

b) einen isoelektrischen Punkt beim pH 5,1 ± 0,5;

c) einen Km-Wert für Acetyl-L-Carnitin von 4 x 10&supmin;&sup5; M, für Propionyl-L-Carnitin von 3 x 10&supmin;&sup5; M und für Palmitoyl-L- Carnitin von 2 x 10&supmin;&sup5; M;

d) ein pH-Optimum bei etwa pH 8;

e) eine Stabilität bei einem pH von 7,5 bis 8,5 bei 60 ºC für 30 min.; und

f) ein Temperaturoptimum bei etwa 70 ºC, bei der die Acylcarnitin-esterase ihr Aktiviätsmaximum in einer 100 mM Tris-HCl- Pufferlösung beim pH 8 zeigt.

2. Acylcarnitin-esterase nach Anspruch 1, die aus Alcaligenes sp. Nummer 981 (FERM BP-2570) oder einer ihrer Mutanten erhältlich ist, die Acylcarnitin-esterase bilden kann.

3. Verfahren zur Herstellung eine Acylcarnitin-esterase gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem man ein Acylcarnitin-esterase bildendes Bakterium der Gattung Alcaligenes in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert und die dabei gebildete Acylcarnitin-esterase vom Gemisch der Kulturprodukte sammelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem als Acylcarnitin-esterase bildendes Bakterium der Gattung Alcaligenes Alcaligenes sp. Nr. 981 (FERM BP-2750) oder eine seiner Mutanten verwendet, die Acylcarnitin-esterase bilden kann.

5. Verfahren zum Testen von Acyl-L-carnitinen unter Einschluß von Acetyl-L-carnitin und Propionyl-L-carnitin in einer Probe, bei dem man die Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer Acylcarnitin-esterase gemäß Anspruch 1 oder 2 unterwirft und danach die Menge an Fettsäuren und/oder L-Carnitin bestimmt, die auf diese Weise gebildet worden sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man die Bestimmung der Mengen an resultierenden Fettsäuren durch Flussigchromatographie oder Gaschromatograhie durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem man die Bestimmung der Menge an L-Carnitin dadurch durchführt, daß man das Produkt der enzymatischen Hydrolysereaktion der Einwirkung eines Reagens, das eine L-Carnitindehydrogenase und eine Verbindung der Nikotinamidadenindinucleotid-Gruppe (NAD-Gruppe) oder eine Verbindung der Thionikotinamidadenindinucleotid-Gruppe (Thio-NAD- Gruppe) umfaßt, mit gegebenenfalls Zugabe eines nicht-ionischen oberfächenaktiven Mittels unterwirft und danach die Menge der resultierenden reduzierten Verbindungen der NAD-Gruppe oder Thio-NAD-Gruppe bestimmt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, bei dem man die enzymatische Hydrolyse mit der L-Carnitindehydrogenase und einer Kombination von entweder

(1) einer Verbindung der NAD-Gruppe und einer reduzierten Verbindung der Thio-NAD-Gruppe oder

(2) eine Verbindung der Thio-NAD-Gruppe und einer reduzierten Verbindung der NAD-Gruppe durchführt und die zyklische Reaktion erreicht:

worin:

A&sub1; eine Verbindung der NAD-Gruppe oder der Thio-NAD-Gruppe ist,

A&sub2; die korrespondierende reduzierte Form von A&sub1; ist,

B&sub1; eine reduzierte Verbindung der Thio-NAD-Gruppe ist, sofern A&sub1; eine Verbindung der NAD-Gruppe ist, oder eine reduzierte Verbindung der NAD-Gruppe ist, sofern A&sub1; eine Verbindung der Thio-NAD- Gruppe ist, und

B&sub2; die korrespondierende oxidierte Form von B&sub1; ist; und

die Menge an B&sub1;, die während der Zyklisierungsreaktion verbraucht wird, und/oder die Menge an A&sub2; bestimmt, die während der Zyklisierungsreaktion gebildet wird.

9. Verfahren zum Testen von Acetyl-L-carnitin und Propionyl-Lcarnitin in einer Probe, bei dem man

(a) einen Teil der Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer Acylcarnitin-esterase unterwirft, die keine enzymatische Aktivität für Acetyl-L-carnitin und Propionyl-L-carnitin besitzt, jedoch Substratspezifität für Acyl-L-carnitine mit längeren Ketten zeigt und die Hydrolysereaktion von einem Mol Acyl-L-carnitin mit den längeren Ketten mit einem Mol Wasser unter Bildung von einem Mol der korrespondierenden Fettsäure und einem Mol L-Carnitin katalysiert und danach die Menge an Fettsäuren und/oder an L-Carnitin bestimmt, die auf diese Weise gebildet wurden;

(b) einen weiteren Teil der Probe einem Test auf Acyl-L-carnitine unter Einschluß von Acetyl-L-carnitin und Propionyl-Lcarnitin gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 unterwirft; und

(c) die Differenz der analytischen Werte bestimmt, die bei den Stufen (a) und (b) erhalten worden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem man eine Acylcarnitinesterase verwendet, die keine enzymatische Aktivität für Acetyl- L-carnitin und Propionyl-L-carnitin besitzt, jedoch Substratspezifität für Acyl-L-carnitine mit längeren Ketten zeigt und aus Ratten erhalten worden ist.

11. Verfahren zum Testen von Acetyl-L-carnitin und Propionyl-Lcarnitin in einer Probe, bei dem man

(a&sub1;) die Probe einer enzymatischen Hydrolyse mit einer Acylcarnitin-esterase unterwirft, die keine enzymatische Aktivität für Acetyl-L-carnitin und Propionyl-L-carnitin besitzt, jedoch Substratspezifität für Acyl-L-carnitine mit längeren Ketten zeigt und die Hydrolysereaktion von einem Mol Acyl- L-carnitin mit längeren Ketten mit einem Mol Wasser unter Bildung von einem Mol der korrespondierenden Fettsäure und einem Mol L-Carnitin katalysiert und danach das resultierende Gemisch der Reaktionsprobe der Einwirkung einer L- Carnitin-dehydrogenase mit einem Coenzym A&sub1; unterwirft (worin A&sub1; eine Verbindung der NAD-Gruppe oder Thio-NAD- Gruppe ist), A&sub1; in seine reduzierte Form A&sub2; überführt und das resultierende Gemisch der Probe behandelt und A&sub2; zersetzt; und

(b&sub1;) das resultierende Gemisch der Probe einem Verfahren zum Testen von Acyl-L-carnitinen unter Einschluß von Acetyl-Lcarnitin und Propionyl-L-carnitin gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 unterwirft.

12. Alcaligenes sp. Nr. 981 (FERM BP-2570) oder einer seiner Mutanten, die eine Acylcarnitin-esterase gemäß Anspruch 1 bilden kann.

13. Kultur von Alcaligenes sp. Nr. 981 (FERM BP-2570) oder einer seiner Mutanten, die Acylcarnitin-esterase gemäß Anspruch 1 in einem Kulturmedium bilden kann, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze umfaßt und frei von anderen Mikroorganismen ist.