DE3235923C2

DE3235923C2 -

Info

Publication number: DE3235923C2
Application number: DE3235923T
Authority: DE
Inventors: Haruo Ohnishi; Hiroshi Kosuzume; Yasuo Suzuki; Ei Mochida
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-03-02
Filing date: 1982-03-01
Publication date: 1988-05-26
Also published as: DE3235923T1; EP0073251B1; CA1181006A; GB2122486A; JPS6237615B2; EP0073251A1; JPS57144224A; WO1982003011A1; GB2122486B; EP0073251A4

Description

Die Erfindung betrifft ein therapeutisches Mittel gegen Erkrankungen der Atemwege.

Auf Auftreten eines Lungenemphysem, welches gekennzeichnet ist durch die abnormale Ausdehnung der terminalen Bronchiolen, wird häufig bei Erkrankungen der Atemwege, wie Pneumonie, Bronchialasthma, Bronchitis, chronische Bronchialstenose und Bronchiektasi beobachtet. Klinisch wird Lungenemphysem von subjektiven Symptomen begleitet, wie Husten, Auswurf und Kurzatmigkeit (Dyspnoe) und es ist nicht selten, daß Komplikationen, die von Infektionen, etc., herrühren, das Lungenemphysem bis zur Atmungsinsuffizienz oder Cor pulmonale verschlechtern.

Basierend auf der Tatsache, daß Lungenemphysem von einem Serum-α₁-Antitrypsinmangel (Eriksson et al, j. Clin. Lab. Invest., 15, 132 (1963)) begleitet ist, hat Eriksson eine Autolysetheorie für die Induktion von Lungenemphysem aufgestellt, wonach er annimmt, daß die Autolyse des Lungengewebes von einer Abnahme an α₁- Antitrypsin (α₁AT), einem Proteaseinhibitor, der im Lokalgewebe oder im Blutstrom vorkommt, herrührt, und seinen Ursprung in Leukocyten, Alveolar-Macrophagen oder Mikroorganismen hat (Acta Medica Scandinavica, 177, 1 (1965)). Martorana et al berichten jedoch, daß bei einem experimentellen Lungenempysem bei Hamstern, welches durch Inhalation von Papain induziert wurde, die intravenöse Injektion von α₁-AT eine signifikante Zunahme der Aktivität von Serum-Antitrypsin ergab, jedoch das Lungenemphysem nicht verhindern konnte (Am. Respir. Dis., 118, 607 (1967)). Es gibt auch zahlreiche Berichte dahingehend, daß hinsichlich der Beziehung zwischen Serum-α₁AT und Lungenemphysem noch vieles aufzuklären ist, da das Serum-α₁ AT von Lungenemphysem-Patienten nicht immer einen niederen Wert aufweist, und Progesteron das Lungenemphysem verhindert, ohne eine Zunahme an α₁-AT-Aktivität zu verursachen (z. B. Susumu Harada et al., Internal Medicine, 32 845 (1973)).

Es ist bekannt, daß menschlicher Harn-Trypsin-Inhibitor (im folgenden abgekürzt als UTI) nicht nur Trypsin inhibiert, sondern auch eine Reihe von gewebeschädigenden Enzymen, und daß dessen Ausscheidung im Harn von Patienten mit chronischen Entzündungserkrankungen, wie Infektion oder Krebs, zunimmt.

Die Erfinder sind davon ausgegangen, daß, wenn Lungenemphysem - wie von Eriksson behauptet - auf eine Autolyse zurückzuführen ist, welche von gewebeschädigenden Enzymen, die an der entzündeten Stelle aktiviert werden, bewirkt wird, UTI bei der Pathogenese und/oder dem Fortschreiten von Lungenemphysem involviert und bei der Prophylaxe und Behandlung von Lungenemphysem wirksam sein kann.

Demzufolge wurde erwartet, daß UTI nützlich ist bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen der Atemwege da es nicht nur wirksam ist bei der direkten Behandlung von Lungenemphysem, sondern auch bei der Behandlung bakterieller und vireller Infektionen der Atmungsorgane, die zu Lungenemphysem führen können.

Die Erfinder haben Untersuchungen über die Wirkung von UTI auf verschiedene Erkrankungen der Atemwege durchgeführt und gefunden - wie dies in den folgenden experimentellen Beispielen wiedergegeben wird - daß UTI eine ausgezeichnete Wirkung gegen Lungenemphysem, Pneumonie und Lungenfibrose besitzt.

Gemäß der Erfindung wird ein therapeutisches Mittel gegen Erkrankungen der Atemwege zur Verfügung gestellt, das gekennzeichnet ist durch einen menschlichen Harn-Trypsin-Inhibitor, der ein saures Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 17 000 bis 70 000 darstellt, einen isoelektrischen Punkt von 2 bis 3 besitzt und 5 bis 12% Kohlenhydrate aufweist, oder ein Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt eines Säuger-Harn-Trypsin-Inhibitors, der ein Molekulargewicht von 6000 bis 9000 aufweist, einen isoelektrischen Punkt von pH 8 bis 10 besitzt, ein Absorptionsmaximum bei 278 nm ergibt, einen Stickstoffgehalt von 15 bis 17% aufweist, einen positiven Ninhydrintest ergibt und in Wasser leicht löslich, in Ether, Chloroform und Ethanol unlöslich ist, oder ein Gemisch derselben als aktiven Bestandteil.

UTI, welches von Tieren (nicht vom Menschen) stammt, kann praktisch nicht an Menschen verabreicht werden, da es eine antigene Wirkung auf Menschen besitzt. Andererseits konnte von den Erfindern festgestellt werden, daß das Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt von UTI mit Hilfe einer Protease ein Peptid ergibt, welches keine antigene Wirkung auf den Menschen ausübt. Es wurde gefunden, daß das Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt von UTI einen äquivalenten oder sogar größeren Effekt von UTI gegen Pneumonie, Lungenemphysem und Lungenfibrose besitzt.

UTI, welches als Wirkstoff in dem pharmazeutischen Mittel gemäß der Erfindung verwendet wird, ist eine Substanz, die im Urin von Säugern weit verbreitet ist; es ist bekannt, daß deren Eigenschaft je nach der Tierart, von der UTI stammt, verschieden sind (Carlsson et al, Enzyme, 18 176 [1974]).

Menschliches UTI, das eine trypsin-inhibierende Wirkung besitzt (Broksh, J, Lab. Clin. Med., 79, 4981 [1972]), kann erhalten werden nach der Methode von Sumi et al (J. Biochem., 83, 141 [1978]).

Hierzu wird menschlicher Urin konzentriert und durch eine Säule mit Arginin-Sepharose geschickt. Die Säule wird dann mit 2%igem Ammoniak, der 0,2 M Natriumchlorid enthält, eluiert. Daraufhin wird das Eluat einer Gelchromatografie unter Anwendung üblicher Methoden, auf einer Sephadex (TM) G-200 Säule unterworfen, wobei eine Fraktion des Trypsininhibitors erhalten wird. Der auf diese Weise gereinigte Harn-Trypsin-Inhibitor stellt ein saures Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 67 000 dar und weist einen isoelektrischen Punkt von pH 2 bis 3 auf und enthält 5 bis 12% Kohlenhydrate.

Das Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt von UTI kann erhalten werden durch Zersetzung bzw. Abbau von UTI mit Protease; dann wird das Produkt durch geeignete, konventionelle Reinigungsverfahren, wie sie in der Biochemie verwendet werden, wie Ionenaustauschchromatografie und Gelfiltration, gereinigt.

Jedes von einem Säuger stammende UTI kann als Rohsubstanz für das UTI-Zersetzungsprodukt verwendet werden, aber UTI menschlichen Ursprungs ist besonders bevorzugt.

Die Zersetzung bzw. der Abbau von UTI mit Protease wird gewöhnlich mit Hilfe allgemein bekannter Verfahren zum Abbau von von Proteinen durchgeführt. Zum Beispiel wird eine Lösung von Protease, wie Papain, zu UTI, das in einem geeigneten Puffer aufgelöst ist, zugegeben und 10 bis 60 Minuten lang bei ca. 37°C reagieren gelassen. Das Produkt wird dann durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatografie, etc., gereinigt, um eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 9000 zu erhalten. Vorzugsweise wird vor dieser Reinigung das Reaktionsgemisch durch Lyophilisierung etc. konzentriert, um eine verbesserte Effizienz der Reinigung zu erzielen. Das erhaltene UTI-Abbauprodukt kann im weiteren mit einer anderen Protease, wie Pepsin, behandelt werden, um eine Fraktion mit einer größeren Aktivität zu erhalten.

Verschiedene Proteasen, wie Papain, Pepsin, Trypsin und a-Chymotrypsin, können als Protease zum Abbau von UTI verwendet werden. Papain und Pepsin sind besonders bevorzugt. Diese Enzyme können nicht nur in Form einer Lösung, sondern auch als sogenannte insolubilisierte Enzyme verwendet werden.

Die Wirksamkeit und Toxizität von UTI und/oder UTI- Abbauprodukt, welche gemäß der Erfindung verwendet werden, sollen in den nachfolgenden Wirkungsnachweisen näher erläutert werden.

Wirkungsnachweis 1 Suppressive Wirkung auf Lungenemphysem (durch intravenöse Verabreichung)

In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Martorana et al (Can. J. Physiol. Pharmacol., 51, 635 (1973)) wurden UTI (12 mg/kg), das Abbauprodukt von UTI (1,2 mg/kg) und α₁AT (300 mg/kg) intravenös an männliche Goldhamster mit einem Gewicht von ca. 70 g in Gruppen von jeweils 10 Tieren verabreicht. Dann wurden 70 ml einer 3%igen Papainlösung 3 Stunden lang auf die Tiere zur Inhalation zerstäubt und das Lungenemphysem induziert. Nach 1 Woche wurden die Lungen von den Tieren exstipiert und deren spezifische statische Nachgiebigkeit (compliance) (abgekürzt zu SSC), das spezifische Lungenvolumen bei voller Inflation (abgekürzt zu SVI), die gesamte Deflationszeit (abgekürzt mit TDT) und die Fragilität gemessen. SSC wird ausgedrückt als

wobei Δ V die Veränderung des Lungenvolumens ist, die eintritt, wenn der Druck von 5 cm H₂O auf 0 cm H₂O verringert wird, nachdem die Luft in die Lungen durch die Trachea eingeführt worden ist. W ist das Naßgewicht der Lungen. SVI wird ausgedrückt als

wobei P das Lungenvolumen nach Einführung von Luft in dieselbe von der Trachea bei einem Druck von 20 cm H₂O darstellt, und W das Naßgewicht der Lungen ist. TDT stellt die Zeit (in Sekunden) dar, die für die Lungen erforderlich ist, die bei einem Druck von 20 cm H₂O inflatiert wurden, um bei Druckentfernung vollständig zu schrumpfen. Die Fragilität stellt das Verhältnis von Lungenschäden dar, wenn sie bei einem Druck von 20 cm H₂O inflatiert werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

UTI und das Abbauprodukt von UTI zeigten eine signifikante suppressive Wirkung auf Lungenemphysem im Vergleich zu α₁AT, welches keine derartige Aktivität zeigte.

Tabelle 1

Wirkungsnachweis 2 Suppressive Wirkung auf Lungenemphysem (durch Inhalation)

Männliche Goldhamster mit einem Gewicht von ca. 70 g wurde in Gruppen von jeweils 10 Tieren eingesetzt. Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert und 1 mg Papain pro 100 g Körpergewicht wurde in die Trachea der Tiere injiziert. Nachdem dieselben von der Anästhesie erwachten, wurden 10 ml einer UTI-Präparation in einer Konzentration von 20 mg/ml oder das Abbauprodukt von UTI in einer Konzentration von 2 mg/ml 40 Minuten lang auf die Tiere zerstäubt, um die Inhalation zu ermöglichen. Die Lungen wurden nach einer Woche exstirpiert und deren SSC, SVI, TDT und Fragilität auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

UTI und das Abbauprodukt von UTI zeigten eine signifikante suppressive Wirkung auf Lungenemphysem.

Tabelle 2

Wirkungsnachweis 3 Suppressive Wirkung auf Pneumonie (1)

In die Trachea von weißen japanischen männlichen Kaninchen, mit einem Gewicht von 2,6 ± 0,2 kg in Gruppen von jeweils 7 Tieren, wurden ein Schlauch eingeführt und 0,1 N Salzsäure 3 Tage lang in die Trachea durch den Schlauch mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/kg/Tag eingeführt, um eine Schluckpneumonie zu induzieren. UTI (12 mg/kg), das Zersetzungsprodukt von UTI (1,2 mg/kg) oder ein Gemisch, bestehend aus UTI und dem UTI-Abbauprodukt in einem Verhältnis von 10:1 (6,6 mg/kg) wurde den Tieren mit Schluckpneumonie für insgesamt 5 Tage verabreicht (die Verabreichung erfolgte vor Einführung von HCl während der ersten drei Tage, als die Einführung von HCl fortgeführt wurde). Die Zahl der Tiere, die innerhalb von 10 Tagen nach Beginn des Experimentes in jeder Gruppe starben, wurde mit der der Kontrollgruppe verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Die Sterblichkeit bei Schluckpneumonie nahm bei Verabreichung von UTI oder dem UTI-Abbauprodukt ab. Die Verabreichung eines Gemisches derselben ergab eine Abnahme der Mortalität bei Schluckpneumonie.

Tabelle 3

Anzahl der toten Tiere

Kontrollgruppe6/7

Gruppe, der UTI verabreicht wurde1/7*)

Gruppe, der UTI-Abbauprodukt verabreicht wurde2/7*)

Gruppe, der das Gemisch verabreicht wurde0/7**)

*) P< 0,05
**) P< 0,01

Wirkungsnachweis 4 Suppressive Wirkung auf Pneumonie (2)

Ohne Anästhesie wurde durch einen Nelaton-Katheter in die Trachea von weißen japanischen männlichen Kaninchen, die 2,6 ± 0,2 kg wogen, in Gruppen von jeweils 7 Tieren, 1 ml/kg/Tag 0,1 N Salzsäure eingeführt. Vom nächsten Tag an wurden die Tiere veranlaßt, 0,1 N Salzsäure über einen Gesamtzeitraum von 3 Tagen, zweimal täglich für jeweils 10 Minuten, unter Verwendung eines Zerstäubers einzuatmen. Auf diese Weise wurde Schluckpneumonie erzeugt. UTI (12 mg/kg) oder dessen Abbauprodukt (1,2 mg/ kg) wurde der Trachea der Tiere mit Schluckpneumonie während 4 Tagen, während HCl gegeben wurde, verabreicht. Die Verabreichung erfolgte vor Einführung der HCl. Am fünften Tag nach Beginn des Experimentes wurde die Halsschlagader der Tiere durchgeschnitten und dieselben ausgeblutet. Es wurde der Brustkasten eines jeden Tieres geöffnet und große Mengen an physiologischer Kochsalzlösung unter konstantem Druck durch die Lungenaterie perfundiert, um das Blut aus den Lungen zu entfernen. Daraufhin wurden die Lungen exstirpiert und unter Zugabe von 9 ml, pro g Lunge, physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert. Die Phospholipide des erhaltenen Homogenats wurden quantitativ bestimmt. Das Lungenhomogenat wurde bei 3000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Zu 1 ml der verdünnten Lösung wurde 1 ml 95%iges Ethanol zugegeben und das Gemisch 15 Sekunden lang gerührt. 15 Minuten später wurde ein bleibender geringer stabiler Schaum an der Gas-Flüssigkeitsgrenze beobachtet, als ein Anzeichen für die Existenz einer oberflächenaktiven Substanz in der Lunge. Wenn der Schaum einen Ring entlang der Wandung des Reagenzglases bildete, wurden die Ergebnisse als "positiv" bewertet, und der Gehalt an oberflächenaktiver Substanz wurde ausgedrückt als Maximum-Verdünnungsverhältnis, bei welchem das "positive" Ergebnis erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

UTI und das Abbauprodukt von UTI zeigten eine signifikante suppressive Aktivität auf Schluckpneumonie.

Tabelle 4

Wirkungsnachweis 5 Suppressive Wirkung auf Lungenfibrose

In Übereinstimmung mit der Methode von Imano (Lung and Heart, 21, 31 (1974)) wurde Bleomycin in einer Dosis von 10 mg/kg intraperitoneal 10 Tage lang an männliche Mäuse von dd-Stamm, mit einem Gewicht von 20 g, in Gruppen von jeweils 10 Tieren, verabreicht. UTI (12 mg/kg) oder das Abbauprodukt von UTI (1,2 mg/kg) wurden einmal täglich, 4 Wochen lang, intravenös injiziert. Am Ende dieser Periode wurde gemäß der Methode von Hayashi ("Kosankinbyo Kenkyu Zasshi", 24, 253 (1972)) die Menge an Kollagen bestimmt, wobei als Parameter die Aufnahme von ¹⁴C-Hydroxyprolin in Kollagen in die Lungen verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.

UTI und das Abbauprodukt von UTI verminderten die Menge an Kollagen.

Tabelle 5

Menge von Kollagen in den Lungen (¹⁴C-Hydroxyprolin d. p. m.)

Kontrollgruppe3800 ± 430 Gruppe, der UTI verabreicht wurde2200 ± 3,0 Gruppe, der UTI-Abbauprodukt verabreicht wurde2450 ± 450

Wirkungnachweis 6 Akute Toxizität

UTI, das Abbauprodukt von UTI und ein 10:1-Gemisch von UTI und UTI-Abbauprodukt wurden in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und intravenös oder intraperitoneal in einer Dosis von 2 g/kg Mäusen von ddy- Stamm, mit einem Gewicht von 20 g, in Gruppen von jeweils 10 Tieren, injiziert. Der Zustand der Tiere wurde über einen Zeitraum von 1 Woche beobachtet. Es wurde festgestellt, daß Veränderungen im Körpergewicht während dieser Zeitdauer gleich denen sind, wie sie bei der Gruppe, der lediglich physiologische Kochsalzlösung verabreicht wurde, auftraten; es wurde kein Tod eines Tieres festgestellt. Die nach 1 Woche durchgeführte Autopsie zeigte keine Abnormalitäten in den Tieren.

Aus den vorstehend durchgeführten Ergebnissen geht hervor, daß UTI und das Abbauprodukt von UTI deutlich das Lungenemphysem, die Pneumonie und Lungenfibrose unterdrücken, und daß die Dosen, bei welchen diese Aktivitäten auftreten, im Hinblick auf die Ergebnisse des Testes zur akuten Toxizität ausreichend sicher sind. Demzufolge sind UTI, das Abbauprodukt von UTI und ein Gemisch derselben sehr nützliche Arzneimittel zur Prophylaxe und Behandlung verschiedener Erkrankungen der Atemwege einschließlich Lungenemphysem, Pneumonie und Lungenfibrose.

Beste Ausführungsart der Erfindung

Die therapeutische wirksame Menge an UTI und/oder UTI- Abbauprodukt gemäß der Erfindung ist 1 bis 1000 mg, vorzugsweise 50 bis 500 mg, pro Tag, kann jedoch nach Wunsch erhöht oder vermindert werden, je nach dem Zustand des Patienten und der Verabreichungsweise.

Gewöhnlich werden UTI und UTI-Abbauprodukt gemäß der Erfindung in Form einer Injektion oder eines Inhalierungsmittels verabreicht. Sie können auch in Form einer oralen Präparation oder einer intrarektalen Präparation verabreicht werden. Geeigneterweise stellen die Injektion und das Inhalierungsmittel lyophilisierte Präparationen dar, die man nach Auflösung in einem geeigneten Lösungsmittel verwendet. Geeignete orale Präparationen sind Kapseln, Tabletten, Granalien, Pulver und orale flüssige Präparationen. Bei der Formulierung von UTI oder UTI-Abbauprodukten in orale Präparationen ist es vorteilhaft, diese Verbindungen in Liposomen zu versiegeln, um die Absorption nach der oralen Verabreichung zu verbessern. Als intrarektale Präparation ist ein intrarektales Suppositorium geeignet. Bei der Formulierung aller dieser Präparationen können übliche Verfahren angewandt werden, zusammen mit üblichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Exzipienten, etc..

Das Verfahren, nach dem UTI isoliert und gereinigt wird, wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Gemäß der Methode von Proksh (J. Lab. Clin. Med., 79, 491 (1972)) wurden 650 l Urin von gesunden menschlichen Individuen konzentriert und über Nacht gegen deionisiertes Wasser dialysiert. Der dialysierte Urin wurde durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung auf pH 7,8 eingestellt. Daraufhin wurde der Urin durch eine DEAE-Zellulose-Säule (20 × 80 cm), equilibriert mit 0,05 M tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,8), geschickt, um auf der Säule UTI zu adsorbieren. Die Säule wurde dann mit 40 l derselben Pufferlösung gewaschen und mit der gleichen Pufferlösung, die 0,3 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Das Eluat wurde daraufhin 20 Minuten lang auf 60°C erhitzt, um die Proteasen zu inaktivieren, die als Verunreinigung vorliegen und den Abbau von UTI verhindern könnten; es wurden 16 g rohes UTI erhalten. Rohes UTI, 16 g, wurde in 0,02 M Glycin- HCl-Pufferlösung (pH 3,4) aufgelöst und über Nacht gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf eine DEAE-Zellulose-Säule (8,0 × 60 cm), equilibriert mit der gleichen Pufferlösung, aufgebracht. Dann wurde die Säule mit 10 l der gleichen Pufferlösung und dann mit 10 l der gleichen Pufferlösung welche 0,2 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen und mit 8 l der gleichen Pufferlösung, welche 0,4 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Eine aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration konzentriert und das konzentrierte Eluat auf eine Sephadex G-100 (Pharmacia)-Gelfiltrationssäule (10 × 95 cm) aufgebracht, die so vorbereitet wurde, daß sie frei an Pyrogenen war, wobei physiologische Kochsalzlösung als ein Entwickler verwendet wurde. Auf diese Weise gereinigtes UTI besaß eine Reinheit von 95% und eine spezifische Aktivität von 2500 TIU/mg.

Die spezifische Aktivität des UTI wurde nach der Methode von Kassell (Methods in Enzymology, 19, 844 (1970)) bestimmt, wobei die UTI-Menge, die 1 Mikrogramm Rindertrypsin (3000 NFU/mg) zu 100% inhibierte, als 1 TIU angenommen wurde.

Die Formulierung des pharmazeutischen Mittels gemäß der Erfindung wird nachstehend durch Beispiele erläutert, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele begrenzt sein soll.

Beispiel 2 Lyophilisierte Injektion

4 g humanes UTI wurden in 200 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und die Lösung durch ein Membranfilter zur Sterilisation filtriert. 10 ml des Filtrates wurden jeweils in eine Anzahl von sterilisierten Glasbehältern gefüllt und lyophilisiert. Die Behälter wurden versiegelt, unter Erhalt von lyophilisierten Injektionen.

Beispiel 3 Lyophilisiertes Inhalationsmittel

7 g Papain wurden zu 2 g humanem UTI, aufgelöst in 150 ml 0,015 M Phosphatpuffer (pH 7,2), zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 52 ml 0,154 M Natriumchloridlösung aufgelöst. Die Lösung wurde einer Gelfiltration durch eine Säule (10 × 83 cm) Sephadex G-100, welche mit der gleichen Natriumchloridlösung wie vorstehend equilibriert war, unterworfen und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 9000 gesammelt. Die Proteinmenge der erhaltenen Fraktionen wurde nach der Methode von Lory (J. Biol.Chem., 139, 265 (1951)) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standardprotein quantitativ bestimmt. Physiologische Kochsalzlösung wurde bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml zu den Fraktionen zugegeben. Die Lösung wurde zur Sterilisation durch ein Membranfilter filtriert und 10 ml des Filtrates wurden jeweils in eine Anzahl von Glasbehältern gefüllt und lyophilisiert. Dann wurden die Glasbehälter zur Bildung lyophilisierter Inhalationsmittel versiegelt.

Beispiel 4 Flüssige Injektion

Pepsin (20 mg) wurde zu 1 g der Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 9000, wie sie nach dem Verfahren von Beispiel 3 erhalten wurde, zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen und nach Einstellung auf pH 8 mit 4 N Natriumhydroxidlösung lyophilisiert. Das lyophiliserte Pulver wurde in 50 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule (5 × 50 cm) Sephadex G-25, equilibriert mit 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) geschickt, um den Puffer zu ersetzen und dann auf einer Säule (2,6 × 15 cm) CM-Sepharose, equilibriert mit demselben Puffer wie vorstehend, adsorbiert. Daraufhin wurde die Säule eluiert mit einer linearen Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung des gleichen Puffers wie vorstehend, welcher 0,2 M Natriumchlorid enthielt, und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 6000-7000 wurde gesammelt. Die Proteinmenge dieser Fraktion wurde nach der gleichen Methode wie in Beispiel 3 bestimmt, und dann die Proteinkonzentration der Lösung durch physiologische Kochsalzlösung auf 10 mg/ml eingestellt. Die Lösung wurde zur Sterilisation durch ein Membranfilter filtriert. 5 ml des Filtrates wurden jeweils in eine Anzahl von Glasbehältern gefüllt und die Behälter zum Erhalt von flüssigen Injektionen versiegelt.

Beispiel 5 Flüssige Injektion

1 g des Zersetzungs- bzw. Abbauproduktes von UTI mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 7000, erhalten nach der Methode von Beispiel 4, und 10 g humanes UTI wurden in 1100 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst. Die Lösung wurde zur Sterilisation durch ein Membranfilter gefiltert. 5 ml der Lösung wurden jeweils in eine Anzahl von Glasbehältern gefüllt. Die Behälter wurden zum Erhalt von flüssigen Injektionen versiegelt.

Beispiel 6

Tabletten:

Humanes UTI4 g Laktose3,2 g Kartoffelstärke1,5 g Polyvinylalkohol0,15 g Magnesiumstearat0,15 g

Jeder der vorstehenden Bestandteile wurde ausgewogen. Humanes UTI; Laktose und Kartoffelstärke wurden gleichmäßig vermischt. Eine wäßrige Lösung aus Polyvinylalkohol wurde zu dem Gemisch zugegeben und Granalien nach der Naß-Granulationsmethode hergestellt. Die Granalien wurden getrocknet und mit Magnesiumstearat vermischt. Das Gemisch wurde komprimiert und Tabletten von jeweils 100 mg hergestellt.

Beispiel 7 Orale flüssige Präparation

5 g Schweine-UTI (Carlsson et al, Enzyme, 18, 176 (1974)) wurden in 400 ml 0,015 M Phosphatpuffer (pH 7,2) aufgelöst und 15 g Papain zu dieser Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in 250 ml 0,154 M Natriumchloridlösung aufgelöst. Die Lösung wurde einer Gelfiltration durch eine Säule (14 × 90 cm) von Sephadex G-100, welche mit der gleichen NaCl-Lösung wie vorstehend equilibriert war, unterworfen und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 7000-9000 wurde gesammelt. Die Proteinmenge in der resultierenden Fraktion wurde nach der vorstehenden Methode von Lory et al gemessen und die Konzentration der Fraktion auf 100 mg/ml eingestellt. Nach Filtration der Lösung durch ein Membranfilter zur Sterilisation wurde einfacher Sirup zugegeben, um orale flüssige Präparationen zu erhalten.

Beispiel 8 Liposomen-versiegelte Präparation

Eigelb-Lecithin, Cholesterol und Diacetylphosphat wurden in einem molaren Verhältnis von 7:2:1 vermischt und 100 mg des Gemisches in 12,5 ml Chloroform aufgelöst. Die Chloroformlösung wurde auf die Innenwand eines Glaskolbens zur Bildung eines dünnen Films aufgetragen. Dieser Film und 25 ml Phosphatpuffer, welcher 100 mg humanes UTI enthielt, wurden vermischt und eine Suspension hergestellt. Die Suspension wurde beschallt und dann bei 110.000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und sterilisiert. Auf diese Weise wurde eine Liposomen-versiegelte UTI-Präparation erhalten.

Claims

1. Therapeutisches Mittel zur Behandlung von Erkrankungen der Atemwege, gekennzeichnet durch einen menschlichen Harn-Trypsin-Inhibitor, der ein saures Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 17 000 bis 70 000 darstellt, einen isoelektrischen Punkt von 2 bis 3 besitzt und 5 bis 12% Kohlenhydrate aufweist, oder ein Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt eines Säuger-Harn-Trypsin-Inhibitors, der ein Molekulargewicht von 6000 bis 9000 aufweist, einen isoelektrischen Punkt von pH 8 bis 10 besitzt, ein Absorptionsmaximun bei 278 nm ergibt, einen Stickstoffgehalt von 15 bis 17% aufweist, einen positiven Ninhydrintest ergibt und in Wasser leicht löslich, in Ehter, Chloroform und Ethanol unlöslich ist, oder ein Gemisch derselben als aktiven Bestandteil.

2. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt des Harn-Trypsin-Inhibitors menschlichen Ursprungs ist.