DE3235923C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein therapeutisches Mittel gegen
Erkrankungen der Atemwege.
Auf Auftreten eines
Lungenemphysem, welches gekennzeichnet ist durch die
abnormale Ausdehnung der terminalen Bronchiolen, wird
häufig bei Erkrankungen der Atemwege, wie Pneumonie,
Bronchialasthma, Bronchitis, chronische Bronchialstenose
und Bronchiektasi beobachtet. Klinisch wird Lungenemphysem
von subjektiven Symptomen begleitet, wie Husten,
Auswurf und Kurzatmigkeit (Dyspnoe) und es ist nicht
selten, daß Komplikationen, die von Infektionen, etc.,
herrühren, das Lungenemphysem bis zur Atmungsinsuffizienz
oder Cor pulmonale verschlechtern.
Basierend auf der Tatsache, daß Lungenemphysem von
einem Serum-α₁-Antitrypsinmangel (Eriksson et al,
j. Clin. Lab. Invest., 15, 132 (1963)) begleitet ist,
hat Eriksson eine Autolysetheorie für die Induktion von
Lungenemphysem aufgestellt, wonach er annimmt, daß die
Autolyse des Lungengewebes von einer Abnahme an α₁-
Antitrypsin (α₁AT), einem Proteaseinhibitor, der im
Lokalgewebe oder im Blutstrom vorkommt, herrührt, und
seinen Ursprung in Leukocyten,
Alveolar-Macrophagen oder Mikroorganismen hat (Acta Medica
Scandinavica, 177, 1 (1965)). Martorana et al berichten
jedoch, daß bei einem experimentellen Lungenempysem
bei Hamstern, welches durch Inhalation von
Papain induziert wurde, die intravenöse Injektion von
α₁-AT eine signifikante Zunahme der Aktivität von
Serum-Antitrypsin ergab, jedoch das Lungenemphysem nicht
verhindern konnte (Am. Respir. Dis., 118, 607 (1967)).
Es gibt auch zahlreiche Berichte dahingehend, daß
hinsichlich der Beziehung zwischen Serum-α₁AT und
Lungenemphysem noch vieles aufzuklären ist, da das
Serum-α₁ AT von Lungenemphysem-Patienten nicht immer
einen niederen Wert aufweist, und Progesteron das Lungenemphysem
verhindert, ohne eine Zunahme an α₁-AT-Aktivität
zu verursachen (z. B. Susumu Harada et al., Internal
Medicine, 32 845 (1973)).
Es ist bekannt, daß menschlicher Harn-Trypsin-Inhibitor
(im folgenden abgekürzt als UTI) nicht nur Trypsin
inhibiert, sondern auch eine Reihe von gewebeschädigenden
Enzymen, und daß dessen Ausscheidung im
Harn von Patienten mit chronischen Entzündungserkrankungen,
wie Infektion oder Krebs, zunimmt.
Die Erfinder sind davon ausgegangen, daß, wenn Lungenemphysem
- wie von Eriksson behauptet - auf eine Autolyse
zurückzuführen ist, welche von gewebeschädigenden
Enzymen, die an der entzündeten Stelle aktiviert werden,
bewirkt wird, UTI bei der Pathogenese und/oder
dem Fortschreiten von Lungenemphysem involviert
und bei der Prophylaxe und Behandlung von Lungenemphysem
wirksam sein kann.
Demzufolge wurde erwartet, daß UTI nützlich ist bei der
Behandlung verschiedener Erkrankungen der Atemwege
da es nicht nur wirksam ist bei der direkten Behandlung
von Lungenemphysem, sondern auch bei der Behandlung
bakterieller und vireller Infektionen der Atmungsorgane,
die zu Lungenemphysem führen können.
Die Erfinder haben Untersuchungen über die Wirkung von UTI
auf verschiedene Erkrankungen der Atemwege durchgeführt
und gefunden - wie dies in den folgenden experimentellen
Beispielen wiedergegeben wird - daß UTI eine ausgezeichnete
Wirkung gegen Lungenemphysem, Pneumonie und Lungenfibrose
besitzt.
Gemäß der Erfindung wird ein therapeutisches Mittel gegen
Erkrankungen der Atemwege zur Verfügung gestellt, das gekennzeichnet
ist durch einen menschlichen Harn-Trypsin-Inhibitor,
der ein saures Glykoprotein mit einem Molekulargewicht
von 17 000 bis 70 000 darstellt, einen isoelektrischen
Punkt von 2 bis 3 besitzt und 5 bis 12% Kohlenhydrate
aufweist, oder ein Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt
eines Säuger-Harn-Trypsin-Inhibitors, der ein Molekulargewicht
von 6000 bis 9000 aufweist, einen isoelektrischen
Punkt von pH 8 bis 10 besitzt, ein Absorptionsmaximum bei
278 nm ergibt, einen Stickstoffgehalt von 15 bis 17% aufweist,
einen positiven Ninhydrintest ergibt und in Wasser
leicht löslich, in Ether, Chloroform und Ethanol unlöslich
ist, oder ein Gemisch derselben als aktiven Bestandteil.
UTI, welches von Tieren (nicht vom Menschen) stammt, kann
praktisch nicht an Menschen verabreicht werden, da es eine
antigene Wirkung auf Menschen besitzt. Andererseits konnte
von den Erfindern festgestellt werden, daß das Zersetzungs-
bzw. Abbauprodukt von UTI mit Hilfe einer Protease
ein Peptid ergibt, welches keine antigene Wirkung auf den
Menschen ausübt. Es wurde gefunden, daß das Zersetzungs-
bzw. Abbauprodukt von UTI einen äquivalenten oder
sogar größeren Effekt von UTI gegen Pneumonie, Lungenemphysem
und Lungenfibrose besitzt.
UTI, welches als Wirkstoff in dem pharmazeutischen Mittel
gemäß der Erfindung verwendet wird, ist eine Substanz,
die im Urin von Säugern weit verbreitet ist; es ist bekannt,
daß deren Eigenschaft je nach der Tierart, von der
UTI stammt, verschieden sind (Carlsson et al, Enzyme, 18
176 [1974]).
Menschliches UTI, das eine trypsin-inhibierende Wirkung
besitzt (Broksh, J, Lab. Clin. Med., 79, 4981 [1972]),
kann erhalten werden nach der Methode von Sumi et al (J.
Biochem., 83, 141 [1978]).
Hierzu wird menschlicher Urin konzentriert und durch
eine Säule mit Arginin-Sepharose geschickt. Die Säule
wird dann mit 2%igem Ammoniak, der 0,2 M Natriumchlorid
enthält, eluiert. Daraufhin wird das Eluat einer
Gelchromatografie unter Anwendung üblicher Methoden,
auf einer Sephadex (TM) G-200 Säule unterworfen, wobei
eine Fraktion des Trypsininhibitors erhalten wird. Der
auf diese Weise gereinigte Harn-Trypsin-Inhibitor stellt
ein saures Glykoprotein mit einem
Molekulargewicht von ca. 67 000 dar und weist einen
isoelektrischen Punkt von pH 2 bis 3 auf und enthält
5 bis 12% Kohlenhydrate.
Das Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt von UTI kann erhalten
werden durch Zersetzung bzw. Abbau von UTI mit Protease;
dann wird das Produkt durch geeignete, konventionelle
Reinigungsverfahren, wie sie in der Biochemie verwendet
werden, wie Ionenaustauschchromatografie und Gelfiltration,
gereinigt.
Jedes von einem Säuger stammende UTI kann als Rohsubstanz
für das UTI-Zersetzungsprodukt verwendet werden, aber
UTI menschlichen Ursprungs ist besonders bevorzugt.
Die Zersetzung bzw. der Abbau von UTI mit Protease wird
gewöhnlich mit Hilfe allgemein bekannter Verfahren zum
Abbau von von Proteinen durchgeführt. Zum Beispiel
wird eine Lösung von Protease, wie Papain, zu UTI, das in
einem geeigneten Puffer aufgelöst ist, zugegeben und
10 bis 60 Minuten lang bei ca. 37°C reagieren gelassen.
Das Produkt wird dann durch Gelfiltration, Ionenaustauschchromatografie,
etc., gereinigt, um eine Fraktion
mit einem Molekulargewicht von 6000 bis 9000
zu erhalten. Vorzugsweise wird vor dieser Reinigung
das Reaktionsgemisch durch Lyophilisierung etc. konzentriert,
um eine verbesserte Effizienz der Reinigung
zu erzielen. Das erhaltene UTI-Abbauprodukt kann im
weiteren mit einer anderen Protease, wie Pepsin, behandelt
werden, um eine Fraktion mit einer größeren Aktivität
zu erhalten.
Verschiedene Proteasen, wie Papain, Pepsin, Trypsin
und a-Chymotrypsin, können als Protease zum Abbau von
UTI verwendet werden. Papain und Pepsin sind besonders
bevorzugt. Diese Enzyme können nicht nur in Form einer
Lösung, sondern auch als sogenannte insolubilisierte
Enzyme verwendet werden.
Die Wirksamkeit und Toxizität von UTI und/oder UTI-
Abbauprodukt, welche gemäß der Erfindung verwendet werden,
sollen in den nachfolgenden Wirkungsnachweisen
näher erläutert werden.
In Übereinstimmung mit dem Verfahren von Martorana et
al (Can. J. Physiol. Pharmacol., 51, 635 (1973)) wurden
UTI (12 mg/kg), das Abbauprodukt von UTI (1,2 mg/kg)
und α₁AT (300 mg/kg) intravenös an männliche Goldhamster
mit einem Gewicht von ca. 70 g in Gruppen von
jeweils 10 Tieren verabreicht. Dann wurden 70 ml einer
3%igen Papainlösung 3 Stunden lang auf die Tiere zur
Inhalation zerstäubt und das Lungenemphysem induziert.
Nach 1 Woche wurden die Lungen von den Tieren exstipiert
und deren spezifische statische Nachgiebigkeit (compliance)
(abgekürzt zu SSC), das spezifische Lungenvolumen
bei voller Inflation (abgekürzt zu SVI), die
gesamte Deflationszeit (abgekürzt mit TDT) und die
Fragilität gemessen. SSC wird ausgedrückt als
wobei Δ V die Veränderung des Lungenvolumens ist, die
eintritt, wenn der Druck von 5 cm H₂O auf 0 cm H₂O verringert
wird, nachdem die Luft in die Lungen durch
die Trachea eingeführt worden ist. W ist das
Naßgewicht der Lungen. SVI wird ausgedrückt als
wobei P das Lungenvolumen nach Einführung von Luft in
dieselbe von der Trachea bei einem Druck von 20 cm H₂O
darstellt, und W das Naßgewicht der Lungen ist. TDT
stellt die Zeit (in Sekunden) dar, die für die Lungen
erforderlich ist, die bei einem Druck von 20 cm H₂O
inflatiert wurden, um bei Druckentfernung vollständig
zu schrumpfen. Die Fragilität stellt das Verhältnis
von Lungenschäden dar, wenn sie bei einem Druck
von 20 cm H₂O inflatiert werden. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 1 aufgeführt.
UTI und das Abbauprodukt von UTI zeigten eine signifikante
suppressive Wirkung auf Lungenemphysem im Vergleich
zu α₁AT, welches keine derartige Aktivität
zeigte.
Männliche Goldhamster mit einem Gewicht von ca. 70 g
wurde in Gruppen von jeweils 10 Tieren eingesetzt.
Die Tiere wurden mit Natriumpentobarbital anästhesiert
und 1 mg Papain pro 100 g Körpergewicht wurde in die
Trachea der Tiere injiziert. Nachdem dieselben von der
Anästhesie erwachten, wurden 10 ml einer UTI-Präparation
in einer Konzentration von 20 mg/ml oder das Abbauprodukt
von UTI in einer Konzentration von 2 mg/ml 40 Minuten
lang auf die Tiere zerstäubt, um die Inhalation
zu ermöglichen. Die Lungen wurden nach einer Woche
exstirpiert und deren SSC, SVI, TDT und Fragilität auf
die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
UTI und das Abbauprodukt von UTI zeigten eine signifikante
suppressive Wirkung auf Lungenemphysem.
In die Trachea von weißen japanischen männlichen
Kaninchen, mit einem Gewicht von 2,6 ± 0,2 kg in Gruppen
von jeweils 7 Tieren, wurden ein Schlauch eingeführt
und 0,1 N Salzsäure 3 Tage lang in die Trachea durch
den Schlauch mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/kg/Tag
eingeführt, um eine Schluckpneumonie zu induzieren.
UTI (12 mg/kg), das Zersetzungsprodukt von UTI (1,2 mg/kg)
oder ein Gemisch, bestehend aus UTI und dem UTI-Abbauprodukt
in einem Verhältnis von 10:1 (6,6 mg/kg) wurde
den Tieren mit Schluckpneumonie für insgesamt 5 Tage
verabreicht (die Verabreichung erfolgte vor Einführung
von HCl während der ersten drei Tage, als die Einführung
von HCl fortgeführt wurde). Die Zahl der Tiere, die
innerhalb von 10 Tagen nach Beginn des Experimentes
in jeder Gruppe starben, wurde mit der der Kontrollgruppe
verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Die Sterblichkeit bei Schluckpneumonie nahm bei Verabreichung
von UTI oder dem UTI-Abbauprodukt ab. Die
Verabreichung eines Gemisches derselben ergab eine
Abnahme der Mortalität bei Schluckpneumonie.
Anzahl der toten Tiere
Kontrollgruppe6/7
Gruppe, der UTI verabreicht wurde1/7*)
Gruppe, der UTI-Abbauprodukt verabreicht wurde2/7*)
Gruppe, der das Gemisch verabreicht wurde0/7**)
*) P< 0,05
**) P< 0,01
**) P< 0,01
Ohne Anästhesie wurde durch einen Nelaton-Katheter in
die Trachea von weißen japanischen männlichen Kaninchen,
die 2,6 ± 0,2 kg wogen, in Gruppen von jeweils 7 Tieren,
1 ml/kg/Tag 0,1 N Salzsäure eingeführt. Vom nächsten Tag
an wurden die Tiere veranlaßt, 0,1 N Salzsäure über
einen Gesamtzeitraum von 3 Tagen, zweimal täglich für
jeweils 10 Minuten, unter Verwendung eines Zerstäubers
einzuatmen. Auf diese Weise wurde Schluckpneumonie erzeugt.
UTI (12 mg/kg) oder dessen Abbauprodukt (1,2 mg/
kg) wurde der Trachea der Tiere mit Schluckpneumonie
während 4 Tagen, während HCl gegeben wurde, verabreicht.
Die Verabreichung erfolgte vor Einführung der HCl. Am
fünften Tag nach Beginn des Experimentes wurde die Halsschlagader
der Tiere durchgeschnitten und dieselben ausgeblutet.
Es wurde der Brustkasten eines jeden Tieres
geöffnet und große Mengen an physiologischer Kochsalzlösung
unter konstantem Druck durch die Lungenaterie
perfundiert, um das Blut aus den Lungen zu entfernen.
Daraufhin wurden die Lungen exstirpiert und unter Zugabe
von 9 ml, pro g Lunge, physiologischer Kochsalzlösung
homogenisiert. Die Phospholipide des erhaltenen
Homogenats wurden quantitativ bestimmt. Das Lungenhomogenat
wurde bei 3000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde mit physiologischer
Kochsalzlösung verdünnt. Zu 1 ml der verdünnten Lösung
wurde 1 ml 95%iges Ethanol zugegeben und das Gemisch
15 Sekunden lang gerührt. 15 Minuten später wurde ein
bleibender geringer stabiler Schaum an der Gas-Flüssigkeitsgrenze
beobachtet, als ein Anzeichen
für die Existenz einer oberflächenaktiven Substanz in
der Lunge. Wenn der Schaum einen Ring entlang der Wandung
des Reagenzglases bildete, wurden die Ergebnisse
als "positiv" bewertet, und der Gehalt an oberflächenaktiver
Substanz wurde ausgedrückt als Maximum-Verdünnungsverhältnis,
bei welchem das "positive" Ergebnis
erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
UTI und das Abbauprodukt von UTI zeigten eine signifikante
suppressive Aktivität auf Schluckpneumonie.
In Übereinstimmung mit der Methode von Imano (Lung and
Heart, 21, 31 (1974)) wurde Bleomycin in einer Dosis
von 10 mg/kg intraperitoneal 10 Tage lang an männliche
Mäuse von dd-Stamm, mit einem Gewicht von 20 g, in
Gruppen von jeweils 10 Tieren, verabreicht. UTI (12 mg/kg)
oder das Abbauprodukt von UTI (1,2 mg/kg) wurden einmal
täglich, 4 Wochen lang, intravenös injiziert. Am
Ende dieser Periode wurde gemäß der Methode von
Hayashi ("Kosankinbyo Kenkyu Zasshi", 24, 253 (1972))
die Menge an Kollagen bestimmt, wobei als Parameter die
Aufnahme von ¹⁴C-Hydroxyprolin in Kollagen in die Lungen
verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
UTI und das Abbauprodukt von UTI verminderten die Menge
an Kollagen.
Menge von Kollagen in den
Lungen (¹⁴C-Hydroxyprolin
d. p. m.)
Kontrollgruppe3800 ± 430
Gruppe, der UTI verabreicht wurde2200 ± 3,0
Gruppe, der UTI-Abbauprodukt
verabreicht wurde2450 ± 450
UTI, das Abbauprodukt von UTI und ein 10:1-Gemisch
von UTI und UTI-Abbauprodukt wurden in physiologischer
Kochsalzlösung aufgelöst und intravenös oder intraperitoneal
in einer Dosis von 2 g/kg Mäusen von ddy-
Stamm, mit einem Gewicht von 20 g, in Gruppen von
jeweils 10 Tieren, injiziert. Der Zustand der Tiere
wurde über einen Zeitraum von 1 Woche beobachtet. Es
wurde festgestellt, daß Veränderungen im Körpergewicht
während dieser Zeitdauer gleich denen sind, wie sie
bei der Gruppe, der lediglich physiologische Kochsalzlösung
verabreicht wurde, auftraten; es wurde kein Tod eines
Tieres festgestellt. Die nach 1 Woche durchgeführte
Autopsie zeigte keine Abnormalitäten in den Tieren.
Aus den vorstehend durchgeführten Ergebnissen geht
hervor, daß UTI und das Abbauprodukt von UTI deutlich
das Lungenemphysem, die Pneumonie und Lungenfibrose
unterdrücken, und daß die Dosen, bei welchen diese
Aktivitäten auftreten, im Hinblick auf die Ergebnisse
des Testes zur akuten Toxizität ausreichend sicher
sind. Demzufolge sind UTI, das Abbauprodukt von UTI und
ein Gemisch derselben sehr nützliche Arzneimittel zur
Prophylaxe und Behandlung verschiedener Erkrankungen der Atemwege
einschließlich Lungenemphysem, Pneumonie
und Lungenfibrose.
Die therapeutische wirksame Menge an UTI und/oder UTI-
Abbauprodukt gemäß der Erfindung ist 1 bis 1000 mg,
vorzugsweise 50 bis 500 mg, pro Tag, kann jedoch nach
Wunsch erhöht oder vermindert werden, je nach dem Zustand
des Patienten und der Verabreichungsweise.
Gewöhnlich werden UTI und UTI-Abbauprodukt gemäß der
Erfindung in Form einer Injektion oder eines Inhalierungsmittels
verabreicht. Sie können auch in Form einer
oralen Präparation oder einer intrarektalen Präparation
verabreicht werden. Geeigneterweise stellen die
Injektion und das Inhalierungsmittel lyophilisierte
Präparationen dar, die man nach Auflösung in einem
geeigneten Lösungsmittel verwendet. Geeignete orale
Präparationen sind Kapseln, Tabletten, Granalien,
Pulver und orale flüssige Präparationen. Bei der Formulierung
von UTI oder UTI-Abbauprodukten in orale
Präparationen ist es vorteilhaft, diese Verbindungen
in Liposomen zu versiegeln, um die Absorption nach
der oralen Verabreichung zu verbessern. Als intrarektale
Präparation ist ein intrarektales Suppositorium
geeignet. Bei der Formulierung aller dieser Präparationen
können übliche Verfahren angewandt werden, zusammen
mit üblichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern,
Exzipienten, etc..
Das Verfahren, nach dem UTI isoliert und gereinigt
wird, wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Gemäß der Methode von Proksh (J. Lab. Clin. Med., 79,
491 (1972)) wurden 650 l Urin von gesunden menschlichen
Individuen konzentriert und über Nacht gegen
deionisiertes Wasser dialysiert. Der dialysierte Urin
wurde durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung auf
pH 7,8 eingestellt. Daraufhin wurde der Urin durch
eine DEAE-Zellulose-Säule (20 × 80 cm), equilibriert
mit 0,05 M tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,8), geschickt,
um auf der Säule UTI zu adsorbieren. Die Säule wurde
dann mit 40 l derselben Pufferlösung gewaschen und
mit der gleichen Pufferlösung, die 0,3 M Natriumchlorid
enthielt, eluiert. Das Eluat wurde daraufhin 20 Minuten
lang auf 60°C erhitzt, um die Proteasen zu inaktivieren,
die als Verunreinigung vorliegen und den Abbau
von UTI verhindern könnten; es wurden 16 g rohes
UTI erhalten. Rohes UTI, 16 g, wurde in 0,02 M Glycin-
HCl-Pufferlösung (pH 3,4) aufgelöst und über Nacht
gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf eine
DEAE-Zellulose-Säule (8,0 × 60 cm), equilibriert mit der
gleichen Pufferlösung, aufgebracht. Dann wurde die
Säule mit 10 l der gleichen Pufferlösung und dann mit 10 l der gleichen
Pufferlösung welche 0,2 M Natriumchlorid
enthielt, gewaschen und mit 8 l der gleichen
Pufferlösung, welche 0,4 M Natriumchlorid enthielt,
eluiert. Eine aktive Fraktion wurde durch Ultrafiltration
konzentriert und das konzentrierte Eluat auf eine
Sephadex G-100 (Pharmacia)-Gelfiltrationssäule (10 ×
95 cm) aufgebracht, die so vorbereitet wurde, daß sie
frei an Pyrogenen war, wobei physiologische Kochsalzlösung
als ein Entwickler verwendet wurde. Auf diese
Weise gereinigtes UTI besaß eine Reinheit von 95% und
eine spezifische Aktivität von 2500 TIU/mg.
Die spezifische Aktivität des UTI wurde nach der
Methode von Kassell (Methods in Enzymology, 19, 844
(1970)) bestimmt, wobei die UTI-Menge, die 1 Mikrogramm
Rindertrypsin (3000 NFU/mg) zu
100% inhibierte, als 1 TIU angenommen wurde.
Die Formulierung des pharmazeutischen Mittels gemäß
der Erfindung wird nachstehend durch Beispiele erläutert,
ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele begrenzt
sein soll.
4 g humanes UTI wurden in 200 ml physiologischer Kochsalzlösung
aufgelöst und die Lösung durch ein Membranfilter
zur Sterilisation filtriert. 10 ml des Filtrates
wurden jeweils in eine Anzahl von sterilisierten Glasbehältern
gefüllt und lyophilisiert. Die Behälter wurden
versiegelt, unter Erhalt von lyophilisierten Injektionen.
7 g Papain wurden zu 2 g humanem UTI, aufgelöst in 150 ml
0,015 M Phosphatpuffer (pH 7,2), zugegeben. Das Gemisch
wurde 30 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen und dann
lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde in
52 ml 0,154 M Natriumchloridlösung aufgelöst. Die Lösung
wurde einer Gelfiltration durch eine Säule
(10 × 83 cm) Sephadex G-100, welche mit der gleichen
Natriumchloridlösung wie vorstehend equilibriert war,
unterworfen und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 7000 bis 9000 gesammelt. Die Proteinmenge
der erhaltenen Fraktionen wurde nach der Methode von
Lory (J. Biol.Chem., 139, 265 (1951)) unter Verwendung
von Rinderserumalbumin als Standardprotein quantitativ
bestimmt. Physiologische Kochsalzlösung wurde bis zu
einer Konzentration von 10 mg/ml zu den Fraktionen zugegeben.
Die Lösung wurde zur Sterilisation durch ein
Membranfilter filtriert und 10 ml des Filtrates wurden
jeweils in eine Anzahl von Glasbehältern gefüllt und
lyophilisiert. Dann wurden die Glasbehälter zur Bildung
lyophilisierter Inhalationsmittel versiegelt.
Pepsin (20 mg) wurde zu 1 g der Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 7000 bis 9000, wie sie nach dem Verfahren
von Beispiel 3 erhalten wurde, zugegeben. Das Gemisch
wurde 10 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen
und nach Einstellung auf pH 8 mit 4 N Natriumhydroxidlösung
lyophilisiert. Das lyophiliserte Pulver wurde in
50 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde durch eine
Säule (5 × 50 cm) Sephadex G-25, equilibriert mit
0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) geschickt, um den
Puffer zu ersetzen und dann auf einer Säule (2,6 ×
15 cm) CM-Sepharose, equilibriert mit demselben Puffer
wie vorstehend, adsorbiert. Daraufhin wurde die Säule
eluiert mit einer linearen Konzentrationsgradientenmethode
unter Verwendung des gleichen Puffers wie
vorstehend, welcher 0,2 M Natriumchlorid enthielt, und
eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von 6000-7000
wurde gesammelt. Die Proteinmenge dieser Fraktion
wurde nach der gleichen Methode wie in Beispiel 3 bestimmt,
und dann die Proteinkonzentration der Lösung
durch physiologische Kochsalzlösung auf 10 mg/ml eingestellt.
Die Lösung wurde zur Sterilisation durch ein Membranfilter
filtriert.
5 ml des Filtrates wurden jeweils in eine
Anzahl von Glasbehältern gefüllt und die Behälter zum
Erhalt von flüssigen Injektionen versiegelt.
1 g des Zersetzungs- bzw. Abbauproduktes von UTI mit
einem Molekulargewicht von 6000 bis 7000, erhalten
nach der Methode von Beispiel 4, und 10 g humanes UTI
wurden in 1100 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst.
Die Lösung wurde zur Sterilisation durch ein
Membranfilter gefiltert. 5 ml der Lösung wurden jeweils
in eine Anzahl von Glasbehältern gefüllt. Die Behälter
wurden zum Erhalt von flüssigen Injektionen versiegelt.
Tabletten:
Humanes UTI4 g
Laktose3,2 g
Kartoffelstärke1,5 g
Polyvinylalkohol0,15 g
Magnesiumstearat0,15 g
Jeder der vorstehenden Bestandteile wurde ausgewogen.
Humanes UTI; Laktose und Kartoffelstärke wurden gleichmäßig
vermischt. Eine wäßrige Lösung aus Polyvinylalkohol
wurde zu dem Gemisch zugegeben und Granalien
nach der Naß-Granulationsmethode hergestellt. Die
Granalien wurden getrocknet und mit Magnesiumstearat
vermischt. Das Gemisch wurde komprimiert und Tabletten
von jeweils 100 mg hergestellt.
5 g Schweine-UTI (Carlsson et al, Enzyme, 18, 176 (1974))
wurden in 400 ml 0,015 M Phosphatpuffer (pH 7,2) aufgelöst
und 15 g Papain zu dieser Lösung zugegeben. Das
Gemisch wurde 30 Minuten lang bei 37°C stehen gelassen
und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde
in 250 ml 0,154 M Natriumchloridlösung aufgelöst. Die
Lösung wurde einer Gelfiltration durch eine Säule
(14 × 90 cm) von Sephadex G-100, welche mit der gleichen
NaCl-Lösung wie vorstehend equilibriert war,
unterworfen und eine Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 7000-9000 wurde gesammelt. Die Proteinmenge
in der resultierenden Fraktion wurde nach der vorstehenden
Methode von Lory et al gemessen und die Konzentration
der Fraktion auf 100 mg/ml eingestellt. Nach Filtration
der Lösung durch ein Membranfilter zur Sterilisation
wurde einfacher Sirup zugegeben, um orale
flüssige Präparationen zu erhalten.
Eigelb-Lecithin, Cholesterol und Diacetylphosphat wurden
in einem molaren Verhältnis von 7:2:1 vermischt
und 100 mg des Gemisches in 12,5 ml Chloroform aufgelöst.
Die Chloroformlösung wurde auf die Innenwand
eines Glaskolbens zur Bildung eines dünnen Films aufgetragen.
Dieser Film und 25 ml Phosphatpuffer, welcher
100 mg humanes UTI enthielt, wurden vermischt und eine
Suspension hergestellt. Die Suspension wurde beschallt
und dann bei 110.000 g zentrifugiert. Der Niederschlag
wurde in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert
und sterilisiert. Auf diese Weise wurde eine
Liposomen-versiegelte UTI-Präparation erhalten.
Claims (2)
1. Therapeutisches Mittel zur Behandlung von Erkrankungen
der Atemwege, gekennzeichnet durch
einen menschlichen Harn-Trypsin-Inhibitor, der ein
saures Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von
17 000 bis 70 000 darstellt, einen isoelektrischen
Punkt von 2 bis 3 besitzt und 5 bis 12% Kohlenhydrate
aufweist, oder ein Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt
eines Säuger-Harn-Trypsin-Inhibitors, der ein
Molekulargewicht von 6000 bis 9000 aufweist, einen
isoelektrischen Punkt von pH 8 bis 10 besitzt, ein
Absorptionsmaximun bei 278 nm ergibt, einen
Stickstoffgehalt von 15 bis 17% aufweist, einen
positiven Ninhydrintest ergibt und in Wasser leicht
löslich, in Ehter, Chloroform und Ethanol unlöslich
ist, oder ein Gemisch derselben als aktiven
Bestandteil.
2. Therapeutisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das
Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt des
Harn-Trypsin-Inhibitors menschlichen Ursprungs ist.
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