DE3228047A1

DE3228047A1 - Verfahren zum zuechten von zellgewebe

Info

Publication number: DE3228047A1
Application number: DE19823228047
Authority: DE
Inventors: Philip William Thompson; Roger Stanley Horsham West Sussex White
Original assignee: APV Corp Ltd
Current assignee: SPX Flow Technology Crawley Ltd
Priority date: 1981-07-27
Filing date: 1982-07-27
Publication date: 1983-02-03
Also published as: IT8222589A0; CH653702A5; SE8204437L; FR2510137A1; IT1157311B; DK335182A; IT8222589A1; SE8204437D0

Description

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DR.-ING. R. DÖRING - 5 - DIPL.-PHYS. DR. J. FRICKE

BRAUNSCHWEIG MÜNCHEN

The A.P.V. Company Limited Manor Royal, Crawley, Sussex, England

"Verfahren zum Züchten von Zellgewebe"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Zellgeweben.

Bei der Herstellung von Zellgeweben werden die Zellen traditionell in Roux-Zylindern oder Rollflaschen gezüchtet. Um große Mengen an Gewebe zu gewinnen, sind große Anzahlen von solchen Flaschen notwendig. Dies Verfahren ist mit hoher Arbeitseinheit belastet. Viele unterschiedliche Systeme sind vorgeschlagen worden, um Zellkulturen, die eine Verankerung der Zellen erforderlich machen, wie tierische, pflanzliche oder Pilzzellen einschichtig auf einer Haftoberfläche zu züchten, von Laboratoriumsverhältnissen auf große Produktionsmaßstäbe umzusetzen. Viele Zellkulturen zeigen als Erfordernis für ein Wachstum eine Verankerungsabhängigkeit auf einer entsprechenden Oberfläche. Da der Kontakt von Zelle zu Zelle weiteres Wachstum verhindert wird so eine einlagige Zellschichtkultur geschaffen, die die zur Verfügung stehende Fläche bedeckt. Für hohe Herstellungsgeschwindigkeiten von biochemischen Substanzen, beispielsweise "von Impfstoffen, z.B. für Mumps, für Röteln, Masern, Grippe, Paragrippe, Mareksche Erkrankung oder Infektionen der Atmungs-

w * * · er te 9 w f _v V t ··

- 6 wege von Zell-Linien Fibroblast von Kückenembryos, Virenzellen

von Ochsen, Grünaffenzellen, menschliche diploide Lungen- oder ! Haut-Fibroblaste, ist eine große Oberfläche erforderlich.

Die Erzeugung vieler virualer Impfstoffe und Biochemika z.B. j Interferon, meschliche Wachstumshormone, Somatastatin, Alpha- i thymasin-1 sowie menschliches Insulin hängen von der erfolg- I

reichen Züchtung von tierischen Zellen in Form einer an einer · Oberfläche haftenden Monoschicht ab. ähnliche Produkte können j von Pflanzenzellen und von fungalen Zellengewebekulturen gewonnen werden. ;

Nachdem die Technik der Molekularbiologoe viele neue Zellenreihen produziert haben, sind vergrößerte Produktionsausmaße
angestrebt und Verfahrensvorrichtungen angeboten worden, welch
größere Oberflächen aufweisen.

Insbesondere ist eine Prozeßeinheit erhältlich, welche eine
Reihe von Metallscheiben aufweist, die zusammen mit einer
Welle rotierend montiert sind. Diese Scheiben sind in einem
Kessel montiert, der Speise- und Abführungsleitungen für
flüssige und gasförmige Median aufweist. Im Betrieb wird das !
Gefäß mit einem Serum gefüllt und so gehalten, daß sich die j
Scheiben in·horizontalen Ebenen befinden, so daß sich die
Zellen auf den Platten absetzen können. Der Kessel wird gekippt, so daß sich die Scheiben in einer senkrechten Ebene
befinden, wobei der Kessel teilweise entleert wird, um einen
Kopfraum für die Belüftung zu erhalten. Die Scheiben werden

• β *

dann langsam rotiert, so daß die Zellen für die weitere Behandlung weitergeführt werden können. Bei einer anderen Ausführungsform des Apparates werden die Zellen auf einer Reihe , von Rohren gezüchtet und behandelt.

Einrichtungen dieser Art sind teuer in der Herstellung und können nicht den Produktionserfordernissen leicht angepaßt werden. Auch ist eine genaue Kontrolle des Prozesses nicht leicht möglich, da die Kultur im wesentlichen chargenweise : erfolgt, wobei die Temperatur und die anderen Variablen nicht ; leicht von der Außenseite her gesteuert werden können.

' Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren der eingangs näher

bezeichneten Art so weiterzubilden, daß die aufgezeigten Nach- ; teile und Schwierigkeiten vermieden werden.

; j

■ Zum Ausführen des Verfahrens sieht die Erfindung vor, daß

; man die Zellen auf Platten eines Plattenwärmetauschers sich

[ absetzen läßt und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren läßt.

Vorteilhafterweise wird ein Virus oder ein anderer Zusatz dem zirkulierenden Wachstumsmedium während der Zirkulation zuge-' führt.

' Durch Impfen des Wachstumsmediums mit einem Virus kann eine

. i

Infektion an Ort und Stelle der Zellen erreicht werden, was j

zur Produktion von Impfstoffen führt. Der Virus kann auch dazu verwendet werden, um die Zelltypen zu transformieren. Alternaitv kann der Kultur auch ein Trasposon oder ein Plasmid zugefügt werden. Unter bestimmten Umständen können andere Zusatzstoffe erforderlich sein, z.B. Antibiotika oder ein Zusatz wie Natriumbutyrat für die Stimmulation einer Interferonproduktion.

Vorzugsweise wird Luft oder Sauerstoff in das zirkulierende Wachstumsmedium bei Eintritt in den Wärmetauscher gelöst.

Insbesondere sind Mittel vorgesehen, um Luftsauerstoff oder Kohlendioxyd aus dem Wachstumsmedium nach Verlassen des Wärmetauschers zu entfernen.

Bei einer AusfUhrungsform werden nur alternierende Strömungsräume für die Züchtung verwendet, während die dazwischen-, liegenden Strömungsräume für die Zirkulation von Wasser oder einem anderen Medium bei kontrollierter Temperatur ausgenutzt werden.

Bei einer Ausführungsform ist eine selektierte Variation der wirksamen Fläche, auf der die tierischen Zellgewebe gezüchtet werden dadurch erhalten, daß man Impfstoff- und Wachstumsmedien durch selektierte Strömungsräume des Wärmetauschers umlenkt.

Durch Trennung des Wärmetauschers in zwei oder mehr getrennte Wachstumsbereiche können die anfänglichen Impfstoffe im kleineren Maßstabe gezüchtet werden, bevor eine aseptische Übertragung auf den gesamten Wärmetauscher stattfindet.

Ein Vorteil einer solchen Methode besteht darin, daß eine Subkultur, die bei geringerem Flächenausmaß gezüchtet werden kann, zunächst auf Veränderungen der Morphologie, Karyologie und Lebensdauer getestet werden kann, bevor Kulturen größeren Ausmaßes angelegt werden. Sollte die Subkultur mutiert sein oder verunreinigt sein, kann sie aufgegeben werden. j

Die Selektion kann mit Hilfe eines .Verbindungsnetzes erfolgen.

In einer Ausführungsform bleibt die Geschwindigkeit des Impfstoffes und des Wachstumsmediums im wesentlichen in allen Porozeßströmungsräumen konstant.

Unter Geschwindigkeit wird hier sowohl die Richtung als auch die Bewegungsgeschwindigkeit der Strömung verstanden. Es wurde festgestellt, daß bestimmte Zellreihen besser wachsen, wenn das Wachstumsmedium über eine Zeilmonoschicht, die an einer senkrechten Fläche haftet in Aufwärtsrichtung strömt während alle anderen Zell-Linien einen Vorzug für nach unten fließende Median besitzen.

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Indem man sicherstellt, daß die Strömungsgeschwindigkeit im wesentlichen konstant ist, kann die bevorzugte Strömung für eine spezielle Zellwachstümslinie über die ganze Plattenfläche aufrecht erhalten werden.

In einer Ausführungsform wird die effektive Fläche, auf der die Zellgewebe gezüchtet werden, mit Hilfe eines Einsatzes vergrößert, der in irgend einen oder mehrere Prozeßströmungsräume des Wärmetauschers eingesetzt wird.

Durch Vergrößerung der Oberfläche mit Hilfe von Einsätzen kann die Gesamtzahl von Zellen, die in dem Wärmetauscher gezüchtet werden kann, vergrößert werden.

Der Einsatz kann ein Gitter aus Polypropylen, aus einem Drahtnetzt aus rostfreiem Stahl oder eine perforierte Metallplatte sein.

Durch Einsetzen irgend eines der oben erwähnten Einsätze zwischen die Platten des Prozeßströmungsraumes kann die Gesamtfläche, die für die Züchtung zur Verfügung steht, bis zu 65% bei gleichem Innenvolumen des Wärmetauschers vergrößert werden. Das Gitter aus Polypropylen ist weniger teuer als ein Metallgitter aus rostfreiem Stahl oder Platten. Ein solches Polypropylengitter ist jedoch weniger geeignet für die Verwendung im Zusammenhang mit Medien, welche Feststoffanteile ; oder andere störende Komponenten aufweisen, da es wesentlich schwieriger ist, die Maschenöffnungen sauber zu halten und zu sterilisieren. .

Der Einsatz kann eine Platte eines Plattenwärmetauschers sein,!

Der Effekt des Hinzufügens einer eingesetzten Platte zu dem Stapel besteht darin, den Oberflächenbereich der Prozeßströmungsräume um 100% oder mehr zu steigern, indem man eine Zahl von Prozeßströmungsräumen zwischen jedem Paar von Strömungsräumen für eine Hilfsflüssigkeit aufweist.

In einer Ausführungsforra wird die Haftung der Zellgewebe an ; den Oberflächen der Strömungsräume durch eine Vorbehandlung ' dieser Flächen verstärkt. Die Vorbehandlung kann durch Sand- ' strahlen oder Glasstrahlen der Oberflächen der Strömungsräume ! erfolgen. Die sich ergebende, mit Narben bedeckte Oberfläche j liefert eine geeignete Umgebung sowohl für das anfängliche | Einfangen als auch für gute langdauernde Haftung dieser Zellen', die sonst nicht leicht an glatten Zellen haften.

Die Vorbehandlung kann alternativ dazu die Anwendung eines Oberflächenüberzuges auf die Oberfläche des Strömungsraumes umfassen.

Durch überziehen der Flächen der Strömungsräume mit beispielsweise Polylysin, Histonen, Protaminen, Collagen, Gelantine, Glas oder Polystyrol-Kunststoff mit Protonen, die von, den oberflächlichen aromatischen Gruppen entladen worden sind, kann die Affinität der Zellen für die Oberfläche vergrößert werden.

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Um die Zellen von der Oberfläche freizusetzen , kann ein proteolytisches Mittel, z.B. Trypsin oder Pronase angewendet werden. Der Vorteil eines Plattenwärmetauscher als Züchtungskessel besteht darin, daß die Temperatur leicht auf Werte unter 15° herabgesenkt werden kann, bevor die Behandlung mit dem proteolytischen Mittel erfolgt. Bei einer Temperatur unter 15⁰C wird der Zugang von Trypsin und Pronase zu kritischen Zellkomponenten stark herabgesetzt. Außerdem vermindert die niedrige Temperatur das Ausmaß der Haftung an der Oberfläche an den seitlichen Ecken der Zellen und verstärkt die Frei- !

legung der verbleibenden Haftungsbereiche. Diese Wirkungen j

I kummulieren die Verminderung sowohl der erforderlichen Trypsin^ oder Pronase-Aktivierungseinheiten wie auch die Einwirkungszeit für das Freisetzen der Zellen.

In einer Ausführungsform wird die Haftung der Zellgewebe an den Oberflächen der Strömungsräume durch eine Vorbehandlung dieser Oberflächen vermindert.

Die Vorbehandlung umfaßt die Anwendung eines dünnen Filmüberzuges aus Polytetrafluoräthylen auf die Oberfläche der Strömungsräume.

Diese Fläche ist geeignet für Zellen, die nur eine relativ leichte Haftung an der Oberfläche erfordern und die auf leichte Weise entfernt werden müssen.

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In einer Ausführungsform wird eine Duplex-Dichtungsanordnung
angewendet.

Wenn die Zellen oder Produkte von den Zellen von besonders
gewährlicher Natur sind, kann der Plattenwärmetauscher in
einer solchen Form konstruiert werden, daß er ein Auslecken
jeglichen gefährlichen Materials zur Atmosphäre hin oder
des Temperatursteuermediums durch die Abdichtungsmittel zu
verhindern. Eine solche unfallsichere Abdichtung zur Verhinderung jeglichen Entweichens von gewährlichen Fluiden
zur Atmosphäre hin oder in die Hilfsflüssigkeit ist in der
britischen Patentanmeldung 206 28 33A beschrieben. Ein Überwachungssystem ist dort ebenfalls beschrieben, um eine frühzeitige Warnung von jedem Auslecken durch die erste Dichtung
zu geben. Dies kann besonders wichtig sein, wenn es sich
bei den Kulturen um hoch pathogene Organismen handelt.

Bei einer Ausführungsform kann man die Zerlegung der an den j

i Oberflächen haftenden Zellen an Ort und Stelle ausführen. j

Durch Zerlegen der an der Oberfläche haftenden Zellen an j

Ort und Stelle kann der Gehalt der Zellen wiedergewonnen ι

\ werden. Die Zerlegung kann auf eine Vielzahl von Arten er- j

folgen, z.B. durch viruale Infektion, durch Temperatur- |

änderung oder durch einen osmotischen Schick. ι

In Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der Erfindung j ist eine Vorrichtung vorgesehen, um tierische Zellgewebe zu j

züchten. Diese Vorrichtung umfaßt einen Plattenwärmetauscher, Mittel zum Zirkulieren eines die Temperatur steuernden Mediums durch einen Satz von Strömungsräumen des Wärmetauschers, Mittel zum Zirkulieren eines Wachstumsmediums durch die anderen Sätze der Strömungsräume, Mittel zum Entfernen von Gasen aus dem zirkulierenden Wachstumsraedium nachdem dieses den Wärmetauscher verlassen hat, Mittel zum Injezieren von Luft oder

• Sauerstoff in das zirkulierende Medium, Mittel zum Injezieren eines Impfmediums in das zirkulierende Medium sowie ein Intumentarium zum Messen der Arbeitsparameter, um so den Prozeß zu steueren.

; Unter bestimmten Umständen, z.B. bei Wachstum einer pathogenen

\ Zellen-Linie, bei Zell-Linien, die mit einem Pathogen geimpft ! sind, oder bei einem Zell-Linienwachstum in Gegenwart eines

; Giftes oder eines Karziogen, kann es wünschenswert sein, einen

j Wärmetauscher anzuwenden, bei dem nebeneinanderliegende Platten, welche einen Strömungsraum für das Prozeßmedium begrenzen, paarweise dem Umfang nach und um den Umfang der durchgehenden

öffnungen, welche die Kanäle zur Weiterleitung der Hilfsmedien begrenzen, verschweißt ,,sind., während die Strömungsräume für die Hilfsmedien durch flexible Dichtungen abgedichtet werden.

• Auf diese Weise wird Gebrauch gemacht von relativ großen Flächenbereichen, wie sie in einem Plattenwärmetauscher zur

; Verfügung stehen. Es ist ersichtlich, daß durch Zufügen oder Entfernen von Platten die zur Verfügung stehende Fläche leicht

- 15 - j

an den gewünschten Zweck angepaßt werden kann. Außerdem kann \

' durch Zirkulieren von gesteuerten Temperaturheiz- oder j

' KUhlungsmedien in den Zwischenräumen die Züchtungstemperatur j

genau eingestellt werden. Wenn eine gewellte Oberfläche ver- J

; wendet wird, können die ursprünglich eingeführten Zellen ohne j

'^: die Notwendigkeit einer Reorientierung der Flächen, auf denen j

die Zellen gezüchtet werden sollen, sich absetzen. Da nur ein

kleiner Teil des gesamten Wachstumsmediums in Kontakt mit
den Zellen zu jeder gegebenen Zeit steht, kann eine Kontrolle
j des Prozesses durch Behandlung des Mediums außerhalb des

j Wärmetauschers erhalten werden, indem man z.B. den pH-Wert, j

! i

; den Nährstoffgehalt, den gelösten Sauerstoffgehalt und dgl. ·

überwacht und regelt. ;

Die -!Erfindung wird nachfolgend anhand schematischer Zeichnungen an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Es zeigen:

Figur 1 ein schematisches Diagramm einer Einrichtung für die
Züchtung von Zellen zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Figur 2 eine schematische Ansicht einer abgewandelten Einrichtung zum Züchten von Zellkulturen,

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- 16 -

Figur 3 eine auseinandergezogene Darstellung eines Plattenwärmetauschers und

Figur 4 in scheraatischem Diagramm zwei mögliche Einsätze, durch die die Oberfläche, die für das Zellwachstum zur Verfügung steht, vergrößert werden kann.

In Fig. 1 ist eine Ausführungsform einer Einsichtung gezeigt, um eine einschichtige Gewebekultur zu erhalten, und zwar unter Verwendung eines Plattenwärmetauschers 1A und 1B als biologischer Reaktor mit großem Flächenbereich. Wie es bei einem Plattenwärmetauscher 1Aund TB normal ist, enthält dieser einen Stapel von z.B. gewellten Platten (nicht dargestellt), welche in vorbestimmter Flächenabstandsbeziehung stehen. Um eine Verankerung der Zellen zu gewährleisten, besitzen die Platten Kontaktpunkte zwischen benachbarten Platten. Diese können entweder durch sich kreuzende und aneinanderliegende Wellungen in den Platten gebildet werden, oder indem man örtlich Vorsprünge auf den Wellungen oder dgl. vorsieht, welche normalerweise die gegenseitige Plattenabstützung gewährleisten. Diese Kontaktpunkte liefern eine sichere Verankerung, von welcher die Zellen sich über die Plattenfläche bei ihrem fortschreitenden Wachstum ausbreiten können.

Ein Vorratstank 2 für ein ernährendes Wachstumsmedium mit einem Auslaß 3 ist an eine Pumpe A angeschlossen, die das Medium vom Tank 2 über einen Satz von Strömungsräumen ( bei 43 gezeigt) des Wärmetauschers 1 leitet. Von dem Wärme-

tauscher 1 kann das Medium zurück über eine Entgasungsvorrichtung 6 und eine Rückführungsleitung 27 zum Tank 2 geführt werden.

Zwischen der Pumpe 4 und dem Wärmetauscher 1A und 1B ist eine Injektionsleitung 8 vorgesehen, die verwendet werden kann, um Luft oder Sauerstoff in den Kreis einzuführen. Eine Abzugsleitung 28 ist stromab der Pumpe 4 vorgesehen. Ein Vorratstank 5 liegt parallel zum Tank 2, um ein zweites Medium durch die Pumpe 4 durch den Wärmetauscher 1A und 1B zirkulieren zu lassen. Das Medium wird dem Tank 5 über die Leitung 42 zugeführt.

Dampfeinlasse 9 bis 16 sind dazu vorgesehen, um an Ort und Stelle eine Dampfsterilisation des Systems vornehmen zu können. Dazu gehören die Kondensatleitungen 17 bis 26. Die Entgasungsvorrichtung 6 kann beispielsweise in Form eines Vakuurakessels ausgebildet sein. Sie dient dazu, Luft und/oder Kohlendioxyd und/oder andere Gase aus dem zirkulierenden Medium zu entfernen, um so eine aerobische bakterielle Verunreinigung zu vermeiden. Gleichzeitig können dadurch auch Abfallprodukte des Zellenwachstums innerhalb der Wärmetauscher 1A und 1B entfernt werden. Die Luft oder das abgezogene Kohlendioxydgas können durch einen Sterilisierungsfilter 7 entfernt werden, so daß verhindert wird, daß pathogenische ι Organismen in die Umgebung gelangen.

Wenn keine Entgasungsvorrichtung erforderlich ist, kann die überschüssige Luft vom Injektionspunkt 9 einfach durch Ent-

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, lüften des Tankes 2 über einen Filter 29 abgeleitet werden.

Die Instrumentation für die Steuerung des Prozesses umfaßt ein pH-Meßgerät 30, ein Druckmeßgerät 31 und ein Temperaturmeß-, gerät 32. Das pH-Meßgerät 30 steuert die Injektion von zur Korrektur dienenden Säuren oder Alkalistoffen über eine Leitung 33. Das Druckmeßgerät 31 steuert ein Druckventil 34.

Die Strömungsräume, die zwischen jenen verbleiben, die durch j das zirkulierende Medium besetzt sind, sind an einen WäWiß- : oder Kühlwasserkreis angeschlossen, dem eine Pumpe 35 angej hört. Das Wasser kann beispielsweise durch einen Wärmetauscher ! 36 geleitet werden, wo es durch Dampf erhitzt wird. Dieser .' wird über eine Leitung 37 und ein Ventil 38 zugeleitet, welche j durch das Temperaturmeßgerät 32 gesteuert wird. Wenn eine ' Kühlung gewünscht wird, kann frisches oder selbst gekühltes Wasser über eine Leitung 39 zur Verfügung gestellt werden, welches durch den Wärmetauscher gepumpt und dann durch ein Ablaufventil 40 abgeleitet wird.

Vor Betriebsbeginn muß die dargestellte Einrichtung sterilisiert werden, Dies kann entweder durch chemische Sterilisation! mittel oder vorzugsweise durch Dampf bei einer Temperatur von 121⁰C und für die Dauer von 30 Min. erfolgen. Hierzu dienen die Dampfeinlässe 9 bis 16.

Ein steriles Wachstumsmedium, das die geeigneten Impfstoffe für die betreffende Zeil-Linie enthält, kann dann auf

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aseptische Weise in den Tank 2 eingeführt werden. Dieses Impfmittel kann in genügender Menge in den Plattenwärmetauscher : abschnitt 1A eingeleitet werden, um den Raum des Platten- ; Wärmetauschers 1A auszufüllen und die Plattenoberflächenbe- j

; j

: reiche zu überfluten. Alternativ kann auch ein steriles ' Wachstumsmedium von Tank 2 eingeführt werden, wobei die

; Impfung mit der entsprechenden Zeil-Linie dadurch erfolgt, daß das Impfmaterial an der Injektionsöffnung 44 eingeleitet

wird. Sterile Luft oder Sauerstoff können durch den Impfstoff

I vom Injektor 8 in Blasen hindurchgeleitet werden, falls dies

j erforderlich ist. Alternativ dazu kann das Impfstoffmaterial

j auch in beide Abschnitte des Wärmetauschers TA und 1B einge-

i bracht werden. Aufgrund der gewellten Natur der Platten

! setzen sich die Zellen des Impfstoffes in natürlicher Weise

! auf den horizontalen Komponenten der Plattenoberfläche ab.·

! Damit ist keine Reorientierung oder Zellenanbringungsmechanis-

I mus notwendig, wie dies bei flachen Platten oder Scheiben notj wendig sein kann. Die vielen Kontakte zwischen den Platten J- oder den Vorsprüngen liefern eine sichere Verankerung, von I denen aus die Zellen sich über die Plattenoberflächen aus-

ί breiten können. In jeder Ausführungsform, die einen Einsatz j in einem oder in mehreren Strömungsräumen umfaßt, werden sich j die Zellen ebenso an den Flächen der Einsätze festlegen. j

Nachdem die Zellenhaftung erreicht ist,- kann das Impfmedium

; abgezogen werden. Das System wird dann erneut mit frischem

j Medium beladen, welches dann durch die Abschnitte 1A oder ^! die Abschnitte 1A+1B rezirkuliert wird, so daß die anhaftenden

- β · 1

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Zellen bis zu der erforderlichen Dichte wachsen können. Luft oder Sauerstoff kann durch die Öffnung 8 bei Bedarf injesiert werden. Die Vorrichtung 6 zum Entfernen von Luft, oder CO₂ kann aktiviert werden, um eine aerobe bakterielle Verunreinigung zu verhindern und die Abfallprodukte des Zellenwachstums abzuführen. Das Medium wird dann zu.dem Tank 2 zurückgelegtet.

Während der Zellenwachstumsphase müssen die Bedingungen der Kulturen auf optimalem Niveau gehalten werden. Die sterile Luft, die über Injektor 8 eingeleitet wird, muß genau, kontrolliert werden, ebenso wie der pH-Wert des Mediums. Die Luft oder der Sauerstoff werden in das zirkulierende Medium gelöst. Eine sehr genaue Temperaturkontrolle kann durch Zirkulieren von warmen oder kaltem Wasser auf der Serviceseite 41 der Platten unter Verwendung einer Pumpe 35 erhalten werden.

Wenn nur der Abschnitt 1A als Impfabschnitt des Plattenwärmetauschers verwendet wird, kann man die Zellen dann, wenn das Zellenwachstum beendet ist, durch Abziehen des Wachstumsmediums und Füllen des Systems mit Trypsin-Lösung entfernen, durch die die Zellen von den Plattenoberflächen gelöst werden. Dabei kann man die Strömungsgeschwindigkeit vergrößern, um Turbulenz zwischen den Strömungsplatten des Abschnittes 1A zu erhalten, um so das Lösen der Zellen von den Plattenflächen zu unterstützen, Die Zellensuspension kann dann in beide Abschnitte 1A und1B des Plattenwärmetauschers eingeleitet werden um so die Zellen durch Einfließenlassen auf den gesamten zur

Verfügung stehenden Flächen der Platten einzuleiten. Nachdem die Zellen wieder an den Platten haften kann die Trypsin- ; lösung abgezogen -werden. Das System kann dann erneut mit einem j Wachstumsmedium gefüllt werden. Die Prozedur wird dann wider-

¹ holt, bis das Zellenwachstum vollständig ist. Es ist dann raögi lieh, irgend ein weiteres auslösendes Mittel einzuleiten, z.B.

■ i

¹ einen Virus oder einen Zusatzstoff wie Natriumbutyrat, um die |

Interferon-Produktion zu stimmulieren. !

j I

¹ Das Entfernen der extrazellularen Produkte wird durch vollständiges Abziehen des Mediums vom System erreicht.

^: Wenn die Zellen selbst geerntet werden sollen, wird die selbe · I

: i

Prozedur wie zuvor beschrieben ausgeführt und schließlich die '

■ Zellensuspension endgültig über Leitung 28 abgeleitet.

i Eine Alternative zur Injektion von Luft oder Sauerstoff zur ; Belüftungszwecken besteht darin, das Medium mit Sauerstoff zu

! übersättigen, wie die in der GB-Patentanmeldung 203 47 5OA

■ beschrieben ist.

In Fig. 2 ist eine weitere Ausführungsform der Einrichtung zum ¹ Züchten von Zellen unter Verwendung eines Plattenwärme-, tauschers 50 gezeigt.

Ein Vorratsbehälter 51 für ein Wachstumsmedium ist mit einer Rühreinrichtung 52, einem Temperaturfühler 53 und einem Fühler 54 für den pH-Wert ausgerüstet und kann mit Hilfe von Dampf-

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injektion durch die öffnung 56 sterilisiert werden. Das Wachstumsmedium kann dem Behälter durch die öffnung 55 zugeleitet werden. Korrekturen des pH-Wertes und der anderen Größe kann über eine Zusatzöffnung 74 erfolgen,

Ein Dreiwegeventil 57 verbindet den Vorratsbehälter 51 mit einer Einlaßöffnung 58_;einer Erntelösung und einer Pumpe Diese Pumpe zirkuliert das Wachstumsmedium vom Vorratsbehälter an der Einlaß- und der Auslaßöffnung 60 vorbei in die Prozeßströmungsräume 61 des Wärmetauschers. Das Wachstumsmedium wird dem Vorratsbehälter über einen Strömungsraeßteil zurückgeführt.

Der Kopfraum des Behälters 51 kann durch eine Leitung 63 über eine«,- Strömungsmeßeinrichtung 64 in zugemessener Weise begast werden. Ein Sterilisationsfilter 65 kann in die Begasungsleitung 63 eingefügt sein. Proben können an einer Probeentnahmeöffnung 70 abgezogen werden.

Die Prozeßströmungsräume des Wärmetauschers werden durch Dampf sterilisiert, der durch eine öffnung 68 zugeführt und als Kondensat durch eine öffnung 69 abgeführt wird.

Ein Impfstoff wird normalerweise in das System durch eine öffnung 60 eingeführt, um die Prozeßströmungsräume 61 des Wärmetauschers 50 zu füllen. Die Temperatur des Prozesses und der Hilfsflüssigkeiten kann durch Fühler 66 und 67 Über· wacht werden, überschüssige Gase in dem System können durch

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den Sterilisationsfilter 71 abgelassen werden. Die Hilfsflüssigkeit zirkuliert in den Strömungsräumen 72 und kann j

gekühlt oder erhitzt werden, und zwar durch eine Einheit 73. j

Die Vorteile beider dieser Systeme umfassen:

1. Eine ausgedehntere Oberfläche für das Zellwachstum bei

2 kleinem Volumen, bis auf maximal 1500 m .

2. Gewellte Oberflächen liefern eine gute Zellenhaftung.

3. Die Flächengröße kann leicht durch Wegnehmen und Zufügen von Platten verändert werden.

A. Eine gute Verfahrenssteuerung ist möglich aufgrund des geringen Füllvolumens für das Medium und die Rezirkulierungsströmung.

5. Eine rasche Ausgleichung der Temperatur gestattet eine Optimierung der Produktbildung und eine Minimierung der Zellverluste während.der überführung zwischen Anzucht und Produktionsstadium.

6. Es werden aseptisches Wachstum und Produktgewinnung gewährleistet.

Es wird nun Bezug genommen auf Figur 3. Diese zeigt in auseinandergezogener Darstellung einen Plattenwärmetauscher. Bei diesem sind die Platten 80 und 84 zwischen einem Kopf und einem Nachfolgestück 82 zusammengedrückt. Ein Anschlußstück 83 kann dazu verwendet werden, die Strömung der Prozeßflüssigkeit und der Hilfsflüssigkeit über die Platten 80 und 84 zu.trennen, wodurch effektiv zwei Wärmetauscher innerhalb des gleichen Rahmens zu liegen kommen.

Durch Anwendung einer im wesentlichen ähnlichen Anordnung kann die Strömung von Nährstoff durch den Abschnitt 80 (A1 in Fig. 1), wie sie gestrichelt in Fig. 3 angedeutet ist, von der Strömung des Nährstoffes durch den Abschnitt 84(IB in Fig. 1), wie er mit ausgezogener Linie in Fig. 1 angedeutet ist, getrennt werden, während die Hilfsflüssigkeit, die in strichpunktierten Linien gezeigt ist, durch beide Abschnitte 80 und 84 fließt.

Figur 4 zeigt einige mögliche Einsätze, die zwischen den Platten der Prozeßströmungsräume eingesetzt werden können, um die für das Zellenwachstum erforderliche Fläche vergrößern zu können.

Die perforierte Metallplatte 90 weist öffnungen 91 auf, in welche die Kontaktpunkfee der benachbarten Platten, welche die Strömungsräume umgrenzen, eingreifen können. Die Platte selbst kann beispielsweise aus rostfreiem Stahl, Titan oder anderem geeigneten Metall bestehen.

Das Gitter 92 kann aus einem Drahtgitter aus rostfreiem Stahl-j

draht oder aus Polypropylen bestehen. Zum Säubern werden die Zellen von den Platten und/oder Einsätzen in der Weise entfernt, wie dies zuvor beschrieben wurde, und aus dem System ausgewaschen. Danach folgt eine Säuberung und Sterilisation .durch Dampf. Ein Anbrennen ist so vermieden.

Um das Verständnis der Erfindung noch zu verbessern sind folgende Beispiele angegeben.

Beispiel 1

Die zuvor beschriebene Vorrichtung weist eine zur Verfügung

2 stehende Fläche für die Zellkulturen von 2 m_ auf, die durch 24 Platten aus rostfreiem Stahl gebildet wird. Diese Anordnung wurde verwendet, zum Züchten von menschlichen Fibroblasten und zwar wie folgt:

Der Wärmetauscher und die Teile des zugehörigen Rohrwerkes, welche den Wärmetauscher mit dem Vorratsbehälter für das Wachstumsmedium verbindet, wurden durch direkte Injezierung

2 von Dampf bei einem Druck von 1,05 kg/cm für die Dauer von 60 Min. sterilisiert. Der Behälterkessel, bestehend aus einem j FermentatiQnskessel aus Glas und rostfreiem Stahl mit einer j Kapazität von 3 Itr., der zusammen mit den übrigen Rohren und j der Pumpe zum Zirkulieren des Wachstumsmediums verwendet wird, wurde durch einen Autoklavenprozeß für die Dauer von 140 Min.

ρ
bei einem Druck von 1,05 kg/cm sterilisiert.

Der Wärmetauscher wurde durch Passieren von kaltem Wasser durclji die Mantelseite ahgekühlt. Danach wurde die Temperatur im

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Bereich von 36-37 C durch Zirkulieren von Wasser von kontrolierter Temperatur durch die Mantelseite stabilisiert. Das Reservoir, das restliche Rohrwerk und die Pumpe wurden dann mit dem Wärmetauscher aseptisch verbunden.

Ein Impfmittel von 1,8x10 MRC aus menschlichen Fibroblastzellen, die in 2,7 ltr. Wachstumsmedium suspendiert waren, wurde dann aufwärts in die Zellenkulturkammer des Wärmetauschers eingeführt, bis die Kammer vollständig gefüllt war. Das verwendete Wachstumsmedium war Eagle's-Medium, welches Earle's-Salze enthält und wurde mit 8% Ochsenserum, nicht wesentlichen Aminosäuren und Penicillin/Streptomycin ergänzt. Das Medium wurde mit 2,2g Natriumbikarbonat pro Liter gepuffert, mit 5% Kohlendioxyd in Luft überlagert und enthielt als pH-Indikator Phenorot.

Zusätzliche 3,1 ltr. Wachstumsmedium wurden in den Vorratsbehälter auf aseptische Weise eingeleitet. Der Inhalt wurde umgerührt, der Kopfraum des Behälters mit 5% Kohlendioxyd j in Luft begast und der Inhalt auf 37⁰C erhitzt und auf dieser ;' Temperatur gehalten.

Man ließ dann das System ungestört bei 3°C für die Dauer von j

! 24 Std. ruhen, so daß die Zellen sich an der Oberfläche der !

Wärmetauscherplatten ansetzen konnten. \

Am Ende der Haftungsperiode wurde das Wärmewachstumsmittel in i

dem Kreis zirkuliert, der den Vorratsbehälter, die Pumpe, die :

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Kulturseite des Wärmetauschers enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 100-130 ml pro Min. für die Dauer von 7 Tagen, derart, daß die Strömung nach oben durch den Wärmetauscher erfolgt
während gleichzeitig Wasser durch die Mantelseite geleitet

; wurde. Das Wachstumsmedium wurde dann vollständig aus der
Vorrichtung abgezogen und 5,8 ltr. frisches Wachstumsmedium
aseptisch eingeführt. Das frische Wachstumsmedium wurde mit
einer Geschwindigkeit von 130-280 ml pro Min. für die Dauer ■;

, von weiteren drei Tagen zirkuliert.

ι :

j Danach wurde die Zirkulation des Wachstumsmediums gestoppt.

,

Mit Phosphat gepufferte Salzlösung (31tr.) wurde eingeleitet, ;

' um das Wachstumsmedium nach unten durch den Wärmetauscher zu _; ■ verdrängen. Die phosphatgepufferte Salzlösung wurde dann · . wiederum durch 0,25%iges Trypsin in phosphatgepufferter Salz- _; lösung (1ltr.) ersetzt. Die Zellkulturkammer wurde vollständig ' entleert und bei einer Temperatur von 36-37°C gehalten, und ' \ zwar indem man Wasser durch die Mantelseite leitete. Dies ge-, schah für die Dauer von 1 Std. Drei aliquote Teile (21tr.)
von serumfreiem Wachstumsmedium wurden dann in der Folge aufwärts in die Zellkulturkammer geleitet, wobei eine Mischung : aus 5% Kohlendioxyd in Luft durch jedes Aliquot pulsiert
wurde, bevor d,ie Füllung aus der Kammer abgezogen und die
nächste aliquote Menge zugeführt wurde.

i Die Zahl der Zellen, die geimpft und geerntet wurde, wurde _:

bestimmt durch einen Coulter-Zähler und mit einem Haemozyto- ; meter überprüft. . i

« » ν * ■ · «Γ 'ν W β *■«"·#

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Gesamtheit der geimpften Zellen 1,8x10

geerntete Zellen

1) im abgezogenen Wachstumsmedium 2,2x10

2) in der gepufferten Waschsalzlösung und der Trypsin-Lösung 8.7x10

3) pulsiertes serumfreies Medium 29,1x10

insgesamt 29,2x10

Beispiel 2

Unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 wurden mensch-,

I liehe Fibroblaste wie folgt gezüchtet: ι

Ein Wärmetauscher mit 24 Plattenhaus rostfreiem Stahl und
einer für die Zellenkultur zur Verfügung stehenden Fläche von
2 m· wurde mit 1,35x10 MRC 5 menschlichen Fibroblastzellen
geimpft. Die Zellen wurden als Suspension in dem Wachstumsmedium eingeführt, welches das notwendige Minimum an Medium
(Eagle) mit Earle's-Salzen umfaßt und mit 8% Ochsenserum,
nicht essentiellen Aminosäuren, Penicillin/Streptomycin und ■ 2,2g/ltr. Natriumbikarbonat ergänzt worden war. ί

ι Der geimpfte Behälter wurde bei 35°C für die Dauer von I

17,5 Std. so gehalten. Das Volumen des Wachstumsmediums wurde !

vergrößert auf 5,8 ltr. und das Wachstumsmedium wurde dann !

durch die Zellenkulturkammer mit einer Geschwindigkeit von ; 100-200 ml pro Min. für die Dauer von 5 Tagen zirkuliert. Die ·

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Strömung erfolgte durch den Wärmetauscher von unten nach oben, und im Gegenstrom zu der Strömung des Wassers durch die Mantelseite. Das Wachstumsmedium wurde abgezogen und ersetzt durch 5,8 ltr. frischem Wachstumsmedium, das weitere 5 Tage zirkuliert wurde. Das zirkulierende Medium wurde bei einer Temperatur von 34-36⁰C gehalten und durch Passieren von 5% ι Kohlendioxyd in Luft durch den Kopfraum des Vorratsbehälters mit Sauerstoff beladen} pH des Wachstumsmedium wurde durch Zugabe von Natriumbikarbonat auf dem gewünschten Wert gehalten. ;

Das Wachstumsmedium, das von den Zellkulturkammern entnommen wurde, wurde mit durch Phosphat gepufferter Salzlösung ergänzt und die Zellen für die Entnahme von den Wachstumsflächen durch Waschen mit 0,25% Trypsin, gelöst in mit Phosphat} gepufferter Salzlösung vorbereitet. Nachdem alle Lösungen von der Zellenwachstumskammer abgezogen worden war, wurden die Zellen bei 35-37°C für 1,5 Std.in Gegenwart von restlicher Trypsinlösung gehalten. Die Zellen wurden von der Einrichtung mit drei aliquoten Mengen eines serumfreien

Wachtumsmediums entfernt, welches durch Injezierung von 5% Kohlendioxyd enthaltende Luft aufgerührt wurde, während die aliquote Menge jeweils in der Zellenkulturkammer gehalten wurde.

Gesamte geimpfte Zellenzahl 1,35x10

geerntete Zellen

1) im abgezogenen Wachstumsmedium 1,2x10°

2) in der gepufferten Wäschzalslosung

und in der Trypsin-Lösung 1,5x10

3) in dem pulsierten serumfreien

Medium 16,1x10°

insgesamt 16,2x10

Weitere Überprüfungsvorrichtungen, wie Analysierungsgeräte für Glukose, gelösten Sauerstoff und Kohlendioxyd können verwendet werden.

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Claims

57-72

PATENTANWÄLTE \

DR.-ING. R. DÖRING DIPL.-PHYS. DR. J. FRICKE

BRAUNSCHWEIG MÜNCHEN

Ansprüche

1. Verfahren zum Züchten von Zellgewebe, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man die Zellen auf Platten eines Plattenwärmetauschers sich absetzen läßt und ein Wachstumsmedium in kontinuierlicher Zirkulation durch die zwischen den Platten definierten Strömungsräume passieren läßt.

2. Verfahren nacji Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Virus oder ein anderer Zusatz dem zirkulierenden Wachstummedium während der Zirkulation zugefügt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Luft oder Sauerstoff in das zirkulierende Wachstumsmedium-bei einem Eintritt in den Wärmetauscher gelöst wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch g e k e η η ■ zeichnet, daß Schritte vorgesehen sind, um Luftsauerstoff oder Kohlendioxyd von dem Wachstumsmedium nach dem Verlassen des Wärmetauschers zu entfernen.

L J

5. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß lediglich ab-

ι wechselnde Strömungsräume für die Züchtung und die da-' zwischenliegenden Strömungsräume für die Zirkulation von

Wasser oder einem anderen Medium bei konstrollierter ; Temperatur ausgenutzt werden.

6. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine ausge- j wählte Variation in der wirksamen Fläche, auf der i

tierische Zellgewebe gezüchtet werden, dadurch erhalten !

ι werden, daß man die Impfkultur und das Wachstumsmedium ! durch ausgewählte Strömungsräume des Wärmetauschers um- i leitet.

7t Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit der Impfkultur und des WachstunBmedium im wesentlichen | in allen Strömungsräumen konstant gehalten wird.

8. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Fläche, auf der die Zellgewebe gezüchtet werden, durch Einfügen eines Einsatzes in irgend einen oder mehreren Prozeß-Strömungsräumen des Wärmetauschers vergrößert wird.

9. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Haften der Zellgewebe an den Flächen der Prozeß-Strömungsräume durch eine Vorbehandlung dieser Flächen verstärkt.

10. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Haftung der Zeil- ; gewebe an den Flächen des Prozeß-Strömungsraumes durch eine Vorbehandlung dieser Flächen vermindert.

11. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Doppeldichtung einsetzt.

12. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, ^:

dadurch gekennzeichnet, daß man die Zerlegung: der an der Oberfläche haftenden Zelle an Ort und Stelle ausführt.

13. Verfahren nach irgend einem der voranstehenden Ansprüche, : dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung des Impfmedium und des Wachstumsmediums, die Temperaturen des Verfahrens und des Service-Fluids und die Strömungsgeschwindigkeit mit Hilfe elektronischer Steuermittel überwacht und kontrolliert.

14. Vorrichtung zum Züchten von Zellgewebe, insb zum Ausführen des Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Plattenwärmetauscher, Mittel zum Zirkulieren eines Temperatursteuermediums durch einen Satz von Strömungsräumen des Wärmetauschers, Mittel zum Zirkulieren eines Wachstumsfflediuras durch den anderen Satz von Strömungsräumen, Mittel zum Entfernen von Gasen aus dem zirkulierenden Wachstumsmedium, nachdem dieses den Wärmetauscher verlassen hat, Mittel zum Injezieren von Luft oder Sauerstoff in das zirkulierende Wachstummedium, sowie durch Mittel zum Injezieren eines Impfmediuras in das zirkulierende Medium und durch eine Instrumenteneinrichtung zum Messen der Arbeitsparameter zur Kontrolle des Verfahrens.