DE68913962T2

DE68913962T2 - Bioreaktor und vorrichtung zur kultivierung von tierischen zellen.

Info

Publication number: DE68913962T2
Application number: DE68913962T
Authority: DE
Inventors: Bernard Besnainou; Marie-Paule Elluard; Pierre Lessart; Alain Philippe
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1989-12-19
Publication date: 1994-09-15
Anticipated expiration: 2009-12-20
Also published as: FI903987A0; EP0403629A1; WO1990006990A1; FR2640638B1; US5064764A; EP0403629B1; FR2640638A1; JPH03502891A; DE68913962D1

Description

Die vorliegende Vorrichtung hat einen Bioreaktor zum Gegenstand und eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Kultivierung von tierischen Zellen. Sie betrifft die Produktion von tierischen Zellen jeder Art und die Produktion von durch die Zellen produzierten Metaboliten, wie z.B. die monoklonen Antikörper. Der Bioreaktor und die Vorrichtung der Erfindung ermöglichen die Kultivierung von tierischen Zellen wie Hybridome unter sterilen Bedingungen.
Man kennt schon verschieden Bioreaktoren, die verwendet werden können für die Kultivierung von freien (losen) Zellen, wie die, die beschrieben werden in den Dokumenten EP-A-0 113 328, EP- A-0 112 155, US-A-4 661 455, EP-A-0 155 237 und EP-A-0 112 154. In allen diesen bekannten Bioreaktoren werden wasserundurchlässige aber gasdurchlässige Membrane verwendet, um den Transfer bzw. Durchgang des Sauerstoffs zu gewähreisten, der nötig ist für die Entwicklung jeder Tierzelle. Bei der größenmäßigen Erweiterung dieser Reaktoren entsteht sehr schnell das Problem der Durchgangsflächen: zum Beispiel wurde berechnet, daß für einen Reaktor des Typs BRAUN, ausgestattet mit einem Tank, umgerührt mit Siliconrohren für den Sauerstofftransfer, 700 m Rohre erforderlich wären für einen Fermenter von 75 l.
Außerdem beziehen sich die vier letzteren Referenzen auf Reaktoren, gebildet durch flache Membrane, die den Nachteil aufweisen, nichthomogene Transfers herzustellen.
Außerdem gibt es keine Einrichtung zur Regulierung und zur Überwachung der Kolmatierung dieser Membrane durch die kultivierten Zellen. Vor allem das erste zitierte Dokument erzwingt den Durchgang der die Zellen enthaltenden Lösung durch Membrane. Das unmittelbare Resultat ist ein Transfer von sehr viel größeren Substanzen, aber ein Sekundäreffekt davon ist eine Erhöhung des Transferdrucks und eine Kompression der Polarisationsschicht, die sich gebildet hat auf den Membranen, was eine Erhöhung der Verstopfungsgefahr dieser Membrane zur Folge hat.
Schließlich besitzen die Apparate, die basieren auf der Einschließung der Zellen zwischen unterschiedlichen Typen von Membranen, wobei die einen dazu dienen, den Zellen gewisse Substrate zuzuführen und die anderen der Extraktion gewisser Stoffe dienen, keine Vorrichtung zur Regulierung und zur Zwischenkontrolle des Druckverlustes, und weisen folglich schlecht genutzte Membranabschnitte auf, wobei in gewissen Zonen die Drücke beiderseits der Memabran ähnlich sind, was einen schwachen Transfer zur Folge hat. Dieser schwache Transfer erlaubt nicht die kontrollierte und intensive Zuführung der erforderlichen Nährsubstrate.
Außerdem hat die fortschreitende Kolmatierung der Membrane eine gleichzeitige Verringerung der Transfers von allen Nährsubstraten zur Folge, jedoch in oft unterschiedlichen Proportionen, was die Überwachung der Konzentrationen im Laufe der Zeit stört und einen Betrieb dieser Reaktoren unter guten Bedingungen über einen langen Zeitraum verhindert.
Die Erfindung hat genau einen Bioreaktor und eine Vorrichtung für die Kultivierung von tierischen Zellen zur Zielsetzung, die ermöglichen, die verschieden oben genannten Nachteile zu beseitigen.
Die Erfindung hat also einen Bioreaktor für die Kultivierung von tierischen Zellen zum Gegenstand, umfassend:
- eine Zellkulturkammer, gebildet durch einen Innenring und den sich gegenüberstehenden Wänden von zwei Räumen, einem Eintrittsraum und einem Austrittsraum, die zugleich die Zellen und den Nährboden umschließen, wobei jeder Raum versehen ist mit einer Innentrennwand, die den genannten Raum aufteilt in eine erste, innere Kammer und eine zweite, äußere Kammer;
- wenigstens ein erstes poröses Mineralrohr, das die Außenkammer des Eintrittsraums mit der Innenkammer des Austrittsraums verbindet und die genannte Zellkulturkammer durchquert, um den Nährboden mit Nährmittel zu versorgen, wobei das genannte erste poröse Mineralrohr an seiner Innenfläche eine erste poröse Filtriermembran enthält, die den Durchgang der Molküle mittlerer molarer Masse des Nährmittels zuläßt, aber die Partikel großer molarer Masse zurückhält, und auf seiner Außenseite eine zweite mikrofiltrierende Membran, welche den Durchgang der Moleküle kleiner molarer Masse zuläßt und die Rolle einer Barriere spielt für die Zellen und die meisten Proteine, die in der Zellkulturkammer vorhanden sind;
- wenigstens ein zweites poröses Mineralrohr, das die Innenkammer des Eintrittsraums mit der Außenkammer des Austrittsraums verbindet, indem es die Zellkulturkammer durchquert und somit ermöglicht, ihr die Metaboliten geringer molarer Masse zu entziehen, wobei das genannte zweite Rohr an seinen Flächen, außen und innen, Filtriermembranen aufweist, identisch mit denen des ersten porösen Rohrs;
- eine Verbindungsleitung zwischen den beiden Innenkammern der Eintritts- und Austrittsräume, deren zusätzlicher Druckverlust einen besseren Stoffluß durch die ersten und zweiten porösen Mineralrohre zur Folge hat und die, mittels Erzeugung einer gleichgerichteten Zirkulation des Nährmittels durch die ersten und zweiten porösen Mineralrohre, eine Verbesserung der Homogeneität des Bioreaktors gewährleistet.
Unter Molekülen mittlerer Molekularmassen muß man Moleküle von Molekularmassen enthalten zwischen 50 000 und 300 000 Dalton verstehen; die Moleküle kleiner Molekularmassen haben folglich Molekularmassen kleiner als 50 000 Dalton und die Moleküle großer Molekularmassen haben Molekularmassen größer als 300 000 Dalton.
Erfindungsgemäß dient die erste Filtriermembran auch als Barriere für Partikel wie Viren, Mikroorganismen, Zellrückstände und Gele.
Die Metaboliten geringer Molekularmasse sind vor allem die Ammoniumionen, das Kohlenstoffdioxid oder das Laktat.
Vorteilhafterweise ist die Verbindungsleitung zwischen den beiden Innenkammern versehen mit einem Regelventil, das ermöglicht, den Druckverlust in der genannten Leitung einzustellen und somit einen im wesentlichen sehr konstanten Transfer über die gesamte Länge der genannten ersten und zweiten porösen iMineralrohre zu erhalten.
Der Bioreaktor kann diskontinuierlich (nicht erneuerter Nährboden) oder kontinuierlich funktionieren. Im ersteren Fall besteht eine Perfektionierung des Bioreaktors darin, wenigsten ein drittes poröses Mineralrohr die Zellkulturkammer durchqueren zu lassen, isoliert bezüglich der beiden Räume und auf der Außenseite überzogen mit einer mikroporösen Filtriermembran, undurchlässig für Zellen aber durchlässig für die in der Zellkulturkammer produzierten Makromoleküle. Diese Makromoleküle können somit entzogen werden während des Betriebs des Bioreaktors über eine Leitung, die angeschlossen ist an das offene Ende des genannten dritten porösen Mineralrohrs.
Die mikroporösen Filtriermembrane sind vorzugsweise Mineralmembrane und vor allem Membrane aus Al&sub2;O&sub3;, TiO&sub2; oder ZrO&sub2;, obschon andere mineralische Materialien, wie etwa pyrolytischer Kohlenstoff, verwendet werden können. Jedoch können auch dampfsterilisierbare organische Membrane verwendet werden, wie die Membrane aus Polyvinylidenfluorid. Die porösen Rohre, die diese Membrane tragen, werden vorzugsweise hergestellt aus porösem Kohlenstoff oder aus Aluminiumoxid, obschon andere Materialien, wie die Metalle oder die gesinterten oder gewobenen Keramiken, verwendet werden können.
Um die Kolmatierung der Membrane zu begrenzen, die auf die Flächen der ersten und zweiten porösen Rohr aufgebracht werden, und somit im wesentlichen konstante Transfercharakteristika während der gesamten Dauer der Kultivierung zu erhalten, werden Einrichtungen vorgesehen, um die Durchflußrichtung des Nährmittels im Inneren der ersten und zweiten porösen Rohre umzukehren. Dabei werden die Transferrichtungen der ersten und der zweiten Rohre umgekehrt, bezogen auf die Zellkulturkammer, und der Eintrittsraum wird der Austrittsraum und umgekehrt.
Die Erhöhung der Transfermenge der ersten Rohre in Richtung Zellkulturkammer und von dieser Zellkulturkammer in Richtung zweite Rohre kann erreicht werden, indem man die Einspeismenge an Nährmittel erhöht und/oder die Einspeismenge pulsieren läßt und/oder die Öffnung des Regelventils und der Verbindungsleitung zwischen den beiden Innenkammern der Eintritts- und Austrittsräume verkleinert, was eine Erhöhung des Drucks der Nährmittels in der Leitung vor dem Ventils zur Folge hat.
Die Homogeneität der Zellkulturkammer kann verbessert werden durch Einrichtungen, die eine Wechseldrehung der Zellkulturkammer um 180º ermoglichen, um eine Langsachse, die parallel ist zu den porösen Rohren.
Die Erfindung hat auch eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Kultivierung von tierischen Zellen zum Gegenstand, die einen Bioreaktor wie den vorhergehend definierten umfaßt, verbunden mit einem Kontroll- und Präparationsreaktor des Nährmittels über elastische Leitungen, vorzugweise aus Silcon, und Einrichtungen, um kontinuierlich oder sequentiell die durch die Zellen produzierten Substanzen zu extrahieren.
Weitere Eigenschaften und Vorzüge der Erfindung gehen besser aus der nachfolgenden, beispielhaften und nicht einschränkenden Beschreibung hervor, mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen:
- die Figur 1 stellt ein Gesamtschema einer erfindungsgemäßen Kultivierungsvorrichtung von tierischen Zellen dar;
- die Figur 2 stellt auf detailliertere Weise und im Längsschnitt den Bioreaktor der Vorrichtung der Figur 1 dar; und
- die Figur 3 stellt einen Teil der Figur 2 vergrößert dar, dabei die verschiedenen Filtriermembrane des Bioreaktors zeigend.
Mit Bezug auf Figur 1 umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Kultivierung von tierischen Zellen einen Tank 2, bestimmt für die Vorkultivierung von tierischen Zellen, ausgestattet mit einer CO&sub2;- und Luftversorgung 4 und einer Nährlösungsversorgung 6, wobei die Gasmischung und die Nährlösung erforderlich sind für die Entwicklung der in dem Nährboden 9 enthaltenen tierischen Zellen. Ein Rührwerk 8 gewährleistet ein langsames Umrühren des Nährbodens 9. Sensoren 10 zur Überwachung dieses Nährbodens und vor allem des pH-Werts, des Sauerstoffdrucks und des Dioxiddrucks sind vorgesehen. Der Tank 2 und seine Ausrüstung werden als Inokulum (inoculum) des Bioreaktors verwendet.
Der Tank 2 ist über eine elastische Leitung 12 verbunden mit einem Bioreaktor 14, in dem die eigentliche ultivierung der tierischen Zellen für die Produktion von Metaboliten durch diese Zellen durchgeführt wird. Der Bioreaktor weist eine Längssymetrieachse 15 auf.
Der Bioreaktor 14 ist ausgestattet mit einer Zuführungsleitung 16 des Nährmittels von geringem Molekulargewicht (kleiner als 50 000 Dalton), das nötig ist für das Leben der tierischen Zellen, die in dem Nährboden 9 enthalten sind. Diese Zuführungsleitung 16 ist eine biegsame Leitung und ist angeschlossen an einen Hilfsreaktor 18, der zur Vorbereitung und zur Kontrolle dieses letzteren bestimmt ist.
Die Regulierung des pH-Werts, des Sauerstoffdrucks, des Kohlenstoffdioxiddrucks, des Glutamins, der Glukose und der Aminosäuren des Nährmittels erfolgt in diesem Hilfsreaktor 18. Das Nährmittel trägt die Referenz 19. Ein System 20 ermöglicht seine Umrührung. Das Nichtvorhandensein von Proteinen und von Zellen in dem Reaktor 18 ermöglicht die Anwendung einer groben Umrührung des Nährmittels 19 (die Zerkleinerungsbeschränkungen sind nicht einengend) und einer großen Sauerstoff- und Kohlendioxidmenge (keine anormale Schaumbildung); die Luft und das CO&sub2; werden in den Reaktor 18 eingeführt über die Zuführungsleitung 22.
Dieser Reaktor 18 ist ebenso wie alle Leitungen und anderen Speicher der Vorrichtung in situ mit Dampf sterilisierbar.
Der Reaktor 18 ist ausgestattet mit einer sterilen Entnahmeeinrichtung 24 von Nährmittel 19, die die kontinuierliche oder sequentielle Entnahme von Proben sicherstellt, die automatisch in Analysatoren eingespeist werden, die mit einem Informatiksystem verbunden sind, das dieses Nährmittel 19 kontrolliert. Dieses System ermöglicht je nach Bedarf die Einspeisung von Glukose, von Glutamin oder Amonosäuren, gelagert in einem Tank 26, verbunden mit dem Reaktor 18 über eine Leitung 28, ausgestattet mit einer Pumpe 30.
Das Sterilisierungssystem des Aufbaus der Vorrichtung sowie die automatische Kontrolle des Nährbodens und des Nährmittels sind dem Fachmann wohlbekannt und werden hier nicht weiter beschrieben.
Der Bioreaktor 14 ist außerdem ausgerüstet mit einer biegsamen Ausgangsleitung 32 des Nährmittels 19, verbunden mit dem Reaktor 18.
Eine Ventilanordnung 34 ermöglicht es, periodisch die Zirkulationsrichtung des Nährmittels in dem Bioreaktor 14 umzukehren, um dessen Verkrustung zu vermeiden.
Eine Pumpe 36, angebracht auf einer steifen Ausgangsleitung 38 des Nährmittels 19 aus dem Reaktor 18 und verbunden mit der Ventileanordnung 34, gewährleistet die Zirkulation des Nährmittels.
Die durch die Zellen in dem Bioreaktor 14 erzeugten Metaboliten werden diesem entzogen über eine biegsame Leitung 40, verbunden mit einem Ultrafiltrierungssystem 42, das die Trennung der Metaboliten von anderen Produkten des flüssigen Mittels sicherstellt. Die Förderung dieser letzteren in das System 42 wird sichergestellt durch eine Zuführungsleitung 44, verbunden mit der Leitung 40 und ausgestattet mit einer Pumpe 46 und einem Pufferspeicher 48. Speicher 50 und 52 sichern das Sammeln der Produkte der Ultrafiltrierung; der Speicher 50 das Sammeln der verbrauchten Mittel und der Speicher 52 das Sammeln der Metaboliten.
Um die Extrahierung der Proteine in 40 zu kompensieren bei der sequentiellen Entnahme der Kultivierungsprodukte ist eine Zuführungsleitung 54 einer proteinhaltigen Lösung in den Reaktor 14 vorgesehen. Diese Leitung ist eine biegsame Leitung 54, ausgestattet mit einer Pumpe 56, und kommt von einem Rezipienten 58, der die proteinhaltige Lösung enthält.
Erfindungskonform sind die Leitungen 12, 16, 32, 40 und 54, die den Bioreaktor 14 mit den anderen Elementen der Kultivierungsvorrichtung verbinden, biegsam, um nicht die Rotationswechselbewegung des Bioreaktors 14 um ungefähr 180º um seine Längsachse 15 zu behindern; diese Rotationsbewegung, in Verbindung mit der Zirkulationsrichtungsumkehrung des Nährmittels in dem Bioreaktor 14, verhindert die Ablagerung der Zellen in diesem letzteren.
Selbstverständlich können die genannten biegsamen Leitungen ersetzt werden durch steife Leitungen, ausgestattet mit drehbaren, dichten und sterilisierbaren Koaxial- oder Semikoaxialanschlüssen.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor 14, im Detail dargestellt in den Figuren 2 und 3, umfaßt zwei zylindrische Umschließungen 60 und 62, in der Längsrichtung angeordnet und angebracht an jedem Ende eines zylindrischen Innenmantels 64, dazu bestimmt den Nährboden 9 zu enthalten. Die ersten und zweiten porösen Mineralrohre 66 und 68, insbesondere aus porösem Kohlenstoff, untergebracht in dem Mantel 64 und ausgerichtet entsprechend der Längsachse des Bioreaktors 14, gewährleisten die Verbindung der Umschließungen 60 und 62.
Die Rohre 66 und 68 dienen der Leitung des vom Reaktor 18 kommenden Nährmittels und befinden sich in Kontakt mit dem Nährboden 9, enthalten in der Kammer 65, begrenzt durch den Innenmantel 64 und die gegenüberstehenden Wände 78 und 80 der beiden Umschließungen 60 und 62.
Erfindungskonform ist jedes Rohr 66 und 68 ausgestattet mit einer porösen Innenfiltiermembran 70 und einer porösen Außenfiltriermembran 72. Diese Membrane 70 und 72 sind mikroporöse Mineralmembrane, vor allem aus Zirkon.
Die Innenfiltriermembrane 70 gewährleisten den Durchlaß der Moleküle geringer Molekularmasse vom Nährmittel 19 zum Nährboden 9, verhindern jedoch den Durchlaß von vorhandenen Viren und Korrosionsprodukten und anderen Partikeln hoher Molekularmasse vom Nährmittel 19 zum Nährboden 9. Sie stellen folglich eine Barriere gegen die Verunreinigung dar. Ihre Durchlaßschwelle wird insbesondere so gewählt, daß sie bei 0,08 um liegt.
Die Außenfiltiermembrane 72 lassen Nährmittelmoleküle kleiner Molekularmasse durch zum Nährboden, aber ihre Durchlaßschwelle ist niedriger als die der Innenmembrane 70. Die Außenbarrieren 72 bilden eine wirksame Barriere für die meisten Proteine und für die Zellen, die in dem Nährboden 9 enthalten sind. Die Durchlaßschwelle dieser Außenmembrane beträgt insbesondere 10 000 Dalton.
Die Tatsache, daß die Durchlaßschwelle der Innenfiltriermembran höher ist als die der entsprechenden Außemembran erlaubt, die Gesamtpermeabiltät des Aufbaus Rohr- Membrane nicht zu sehr zu verringern.
Erfindungskonform ist jede der beiden Umschließungen 60 und 62 unterteilt in zwei Kammern, eine Innenkammer und eine Außenkammer, durch eine Trennwand, senkrecht zu den Rohren 66 und 68. Die Trennwand der Umschließung 60 trägt die Referenz 74 und egrenzt eine Innenkammer 60a und eine Außenkammer 60b, und die Umschließung 62 ist ausgestattet mit einer Trennwand 76, die zwei Kammern begrenzt, eine Innenkammer 62a und eine Außenkammer 62b.
Das Rohr 66, das die gegenüberstehenden Wände 78 und 80 der beiden Umschließungen 60 und 62 durchdringt so wie die Trennwand 74, verbindet die Außenkammer 60b der Umschließung 60 mit der Innenkammer 62a der Umschließung 62. Ebenso, das poröse Rohr 68, das die beiden gegenüberstehenden Wände 78 und 80 der beiden Umschließungen 60 und 62 und die Trennwand 76 durchdringt, stellt die Verbindung der Innenkammer 60a mit der Außenkammer 62b sicher.
Das Nährmittel 19, reich an Elementen die nötig sind für die Kultivierung der Zellen, vom Reaktor 18 kommend, gelangt z.B. in die Kammer 60b, durchquert die poröse Wand des Rohrs 66, ausgestattet mit diesen Innen- und Außenmembranen 70 und 72, versorgt den Nährboden 9 der Zellen mit frischem Nährmittel und mündet dann in die Innenkammer 62a. Der Durchgang des Nährmittels durch die erste poröse Barriere (Rohr 66 + Membrane) ist gewährleistet durch einen Überdruck des Nährinittels bezüglich des Nährbodens.
Zu diesem Zweck ist der Bioreaktor 14 ausgerüstet mit einer Außenleitung 82, die die Verbindung herstellt zwischen der Innenkammer 60a mit der Innenkammer 62a. Diese Leitung 82 ist ausgestattet mit einem Ventil 84, das ermöglicht, den Druckabfall in der genannten Leitung 82 zu modifizieren, um den Druck in den ersten Rohren 66 zu erhöhen. Die Flüssigkeit, indem sie die zweite röhrenförmige Barriere durchströmt, gebildet durch das Rohr 68 und seine Innen- und Außenmembrane 70 und 72, belastet sich mit an Zellennährelementen verarmter Flüssigkeit und kehrt zurück zum Reaktor 18 hinsichtlich einer Neuaufnahme von Nährelementen.
Der Reaktor 14 umfaßt außerdem ein weiteres poröses Mineralrohr 86, vor allem aus porösem Kohlenstoff, isoliert von den beiden Umschließungen 60 und 62 und folglich von den Kammern 60a, 60b, 62a und 62b, bestimmt zur Extrahierung der durch die Zellen des Nährbodens 9 erzeugten Substanzen oder Metaboliten. Das für die Extrahierung von Metaboliten nicht bestimmte Ende des Rohrs ist deswegen ausgestattet mit einem Abdichtungsstopfen 88.
Das poröse Rohr 86 ist ausgestattet mit einer mikroporösen Filtrier-Außenmembran 90, vor allem aus Zirkon, die die Entnahme der von den im Nährboden 9 kultivierten Zellen erzeugten Metaboliten erlaubt, die die verschiedenen Rohre 66, 68, 86 umgeben. Diese Membran 90 weist eine Durchlaßschwelle der gleichen Größenordnung wie die der Innenfiltriermembran 70 auf, nämlich eine Durchlaßschwelle von 0,08 um. Diese mikroporöse Membran 90 ist undurchlässig für Zellen, aber durchlässig für Makromoleküle, die somit entzogen werden können während des Dauerbetriebs des Reaktors.
Die Entnahme des flüssigen, mit Protein und mit Metaboliten angereicherten Mittels kann sequentiell in dem Puffervolumen 48 erfolgen.
Erfindungsgemäß ist der Mantel 64 umgeben von einem zweiten zylindrischen Außenmantel 92, um zwischen den beiden Mänteln einen ringförmigen Raum 94 zu bilden, in dem man eine Flüssigkeit zirkulieren läßt, die die Temperaturregulierung des Nährbodens 9 ermöglicht.
Silcondichtungen 96 sind vorgesehen in den Trennwänden 74, 76 und den Wänden 78 und 80 der Umschließungen 60 bzw. 62. Die Umschließungen 60 und 62 sowie der Innenmantel 64 sind vorzugsweise hergestellt aus nichtoxidierendem Stahl. So sind die tierischen Zellen des Nährbodens nur in Kontakt mit Inox-Stahl, dem Silicon der Dichtungen und dem Material, das die Mineralbarrieren bildet (Rohr + Membrane).
Die Drehung des Bioreaktors 14 um seine Längsachse kann sichergestellt werden durch irgendein hydraulisches, pneumatisches oder mechanisches System und z.B. durch ein Ritzel 98, das auf einen Zahnkranz 100 wirkt, der auf die Umschließung 60 montiert ist. Um die Abstützung des Bioreaktors 14 bei gleichzeitiger Drehung zu gewährleisten, ist dieser ausgerüstet mit einer Stütze 102, versehen mit einem Rollensystem 104.
Der vorhergehend beschriebene Bioreaktor umfaßt nur zwei Rohre 66 und 68 für die Zirkulation des Nährmittels, und nur ein Rohr für das Extrahieren der Metaboliten und insbesondere der monoklonen Antikörper.
Diese Darstellung von nur drei Rohren wurde gewählt hinsichtlich einer Vereinfachung. Praktischerweise verwendet man nämlich in Wirklichkeit einen Aufbau von z.B. 5, 7, 19, 37 ja sogar mehr Rohren, regelmäßig angeordnet im Innern des Bioreaktors. Um die wechselweise Verbindung der Innen- und Außenkammern der Umschließungen 60 und 62 zu gewährleisten, müssen die Anzahl Rohre 66 und die Anzahl Rohre 68 gleich sein.
Die für die Homogeneität günstigste Anordnung dieser Rohre ist eine einem gleichseitigen Dreieck entsprechende Teilung, obgleich andere Anordungen, wie etwa eine quadratische, gleichmäßig fünfeckförmige oder andere Teilung vorgesehen werden kann.
Der erfindungsgemäße Biorekator ist um so leistungfähiger, je größer die Anzahl enthaltener poröser Rohre wie 66 und 68 für die Versorgung mit Nährmittel ist und unter der Bedingung, daß die Anzahl Extrahierrohre sich nicht zu sehr erhöht.
Die Form und die Betriebsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurden gewählt, um eine kontinuierliche Metabolitenproduktion über einen langen Zeitraum zu ermöglichen, sogar mit einem nicht proteinfreien Nährboden. Die Begrenzung der Kolmatierung der porösen Barrieren (Membrane + Rohr) wird erzielt durch die sorgfältige Wahl der mikroporösen Zirkonmembrane, wie oben beschrieben, aber auch durch Begrenzung der Transferdrücke zwischen den verschiedenen Rohren.

Claims

1. Bioreaktor zur Kultivierung von tierischen Zellen, enthaltend

- eine Zellkulturkammer (65), gebildet durch einen Innenring (64) und den sich gegenüberstehenden Wänden (78, 80) von zwei Räumen, einem Eintrittsraum (60) und einem Austrittsraum (62), die zugleich die Zellen und den Nährboden umschließen, wobei jeder Raum ausgestattet ist mit einer Innentrennwand (74, 76), den genannten Raum trennend in eine erste (60a, 62a) und eine zweite (60b, 62b) Innen- beziehungsweise Außenkammer;

- wenigstens ein erstes poröses Mineralrohr (66), das die Außenkammer (60b) des Eintrittsraums (60) mit der Innenkammer (62a) des Austrittsraums (62) verbindet und die genannte Kulturkammer (65) durchquert, um den Nährboden mit Nährmittel zu versorgen, wobei das genannte erste poröse Mineralrohr (66) an seiner Innenfläche eine erste mikroporöse Filtriermembran (70) enthält, die den Durchgang der Moleküle mittlerer molarer Masse des Nährmittels (l9) zuläßt, aber die Partikel großer molarer Masse zurückhält, und auf seiner Außenfläche eine zweite, mikrofiltrierende Membran (72), welche den Durchgang der Molküle kleiner molarer Masse zuläßt und die Rolle einer Barriere spielt für die Zellen und meisten Proteine, die in der Zellkulturkammer vorhanden sind;

- wenigstens ein zweites poröses Mineralrohr (68), das die Innenkammer (60a) des Eintrittsraums (60) mit der Außenkammer (62b) des Austrittsraums (62) verbindet, indem es die Zellkulturkammer durchquert und somit ermöglicht, ihr die Metaboliten geringer molarer Masse zu entziehen, wobei das genannte zweite Rohr (68) an seinen Flächen, außen und innen, Filtriermembranen (70, 72) aufweist, identisch mit denen des ersten porösen Mineralrohrs;

- eine Verbindungsleitung (82) zwischen den beiden Innenkammern (60a, 62a) der Eintritts- und Austrittsräume, deren zusätzlicher Druckverlust einen besseren Stoffluß durch die ersten (66> und zweiten (68) porösen Mineralrohre zur Folge hat und die, mittels Erzeugung einer gleichgerichteten Zirkulation des Nährmittels durch die ersten und zweiten porösen Mineralrohre eine Verbesserung der Homogenität des Bioreaktors gewährleistet.

2. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungsleitung (82) zwischen den beiden Innenkammern (60a, 62a) ausgestattet ist mit einem Regelventil (84), um den Druckverlust in der Leitung (82) anzupassen und zu steuern und somit einen im wesentlichen konstanten Fluß über die gesamte Länge der genannten ersten (66) und zweiten (68) porösen Mineralrohre zu erhalten

3. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens ein drittes poröses Mineralrohr (86) enthält, isoliert bezüglich der beiden Räume (60, 62), das die genannte Kulturkammer (65) durchquert und dessen Außenseite mit einer dritten, mikroporösen Filtriermembran (90) überzogen ist, undurchlässig für die Zellen, aber durchlässig für die in der Zellkulturkammer (65) produzierten Makromoleküle.

4. Bioreaktor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten (70), zweiten (72) und dritten (90) Membranen mineralische Membranen sind.

5. Bioreaktor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten, zweiten und dritten Membranen (70, 72, 90) aus einem Material bestehen, das ausgewählt wird aus Al&sub2;O&sub3;, TiO&sub2; und ZrO&sub2;.

6. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten Filtriermembranen (72) eine Trennschwelle haben, die niedriger ist als die der ersten Filtriermembranen (70).

7. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Rohre (66, 68, 86) aus porösem Karbon sind.

8. Bioreaktor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Filtriermembran (90) eine Trennschwelle hat, die der der ersten Membranen (70) nahekommt.

9. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein den Innenring umgebender Außenring (92) vorgesehen ist, um deinen ringförmigen Raum (94) zu schaffen, bestimmt für den Durchfluß eines Fluids zur Temperaturregelung des Nährbodens.

10. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtungen (34) vorgesehen sind, um periodisch die Flußrichtung des Nährmittels (19) in den ersten Rohren (66,68) umzukehren

11. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er Einrichtungen (98, 100) umfaßt, um ihn wechselweise um ungefähr 180 uin eine Längsachse (15) herum zu drehen.

12. Vorrichtung zur kontinuierlichen Kultivierung von tierischen Zellen, umfassend einen Reaktor (18) zur Kontrolle und Vorbereitung des Nährmittels, angeschlossen an einen Bioreaktor (14) gemäß Anspruch 1, über biegsame Leitungen (16, 32), und Einrichtungen (48, 46, 42, 52), um kontinuierlich oder sequentiell die durch die Zellen produzierten Substanzen zu extrahieren, wobei diese Einrichtungen mit dem Bioreaktor (14) über biegsame Leitungen (40) verbunden sind.