DE3601705A1

DE3601705A1 - Gasblasenerzeuger und vorrichtung und verfahren zum zuechten von zellen

Info

Publication number: DE3601705A1
Application number: DE19863601705
Authority: DE
Inventors: Henry W. Scarborough Me. Founds; Michael W. Kennebunkport Me. Young; Peter Harvard Mass. Zuk jun.
Original assignee: Vxr Inc
Current assignee: Vxr Inc
Priority date: 1985-02-06
Filing date: 1986-01-22
Publication date: 1986-08-07
Also published as: GB2173118A; JPS61227835A; US4668632A; GB2173118B; GB8602975D0; CA1275272C

Description

PRINZ, LEISER, 3UNKE & PARTNER

Patentanwälte · European Pateni Attorneys ^RDI 7 Π R

Ernsbergerstraße 19 · 8000 München 60

22. Januar 1986

VXR, INC.

217 Read Street

Portland, Maine 04103 / USA

Unser Zeichen: V 808

Gasblasenerzeuger und Vorrichtung und Verfahren zum Züchten von Zellen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Einführen von Gas in eine in einem Behälter enthaltene Flüssigkeit, nachfolgend auch als Gasblasenerzeuger (Sparger) bezeichnet, und insbesondere einen Gasblasenerzeuger zur Verwendung in Verfahren und Vorrichtungen zur Kultivierung lebender Zellen, insbesondere eukaryotischer Zellen und von Hybridomas-Zellen.

ι_Λ/ Perforierte Platten aus nichtporösen Materialien wie Keramik oder nichtrostendem Stahl umfassende Gasblasenerzeuger wurden zur Einführung von Gas in Form von

Bj/Ma

Bläschen in eine Flüssigkeit zwecks Versetzen der Flüssigkeit mit Sauerstoff, Kohlendioxid oder irgendwelcher anderer Gase oder Gasgemische verwendet. Solche Gasblasen erzeuger weisen einen bestimmten Bereich von Porengrößen und folglich Gasblasengrößen auf und sind verhältnismäßig teuer herzustellen. Andere bekannte Gasblasenerzeuger sind aus Stoffen wie gesinterten offenporigen Kunststoffen, Kunststoffmatrizen, die kugelförmige Teilchen von im wesentlichen gleichförmiger Größe enthalten, sowie gesinterten pulverförmigen Metallen hergestellt. Wegen der speziellen Art von Stoffen, aus denen diese Gasblasen erzeuger bestehen, ist es schwierig, eine gleichmäßige Blasenbildung zu erreichen und die Blasengröße zu steuern Dieser Mangel an Steuerungsmöglichkexten kann nachteilige Auswirkungen auf die belüftete Flüssigkeit oder auf das darin enthaltene biologische Material haben. Beispielsweise besitzen größere Blasen größere Scherkräfte und können zerbrechliche Zellen in der Flüssigkeit beschädigen oder, falls es sich bei der Flüssigkeit um Blut handelt, Gerinnung verursachen. Gasblasenerzeuger aus Metall können mit dem flüssigen Medium reagieren oder können für die darin enthaltenen Zellen toxisch sein.

Der erfindungsgemäße Gasblasenerzeuger stellt eine Verbesserung des Standes der Technik dar, da er frei von den vorgenannten Nachteilen und billig in der Herstellung ist. Das Material, durch welches das Gas unter Bildung von Blasen hindurchtritt, führt zu einer gleichmäßigen Blasenbildung und die Porengröße des Materials kann innerhalb eines großen Bereiches ausgewählt werden, um Blasen der gewünschten Größe zu erzeugen. Die Erfindung stellt eine weitere Verbesserung insoweit dar, als die Blasen derart in das Medium abgegeben werden, daß das Zusammenwachsen der Blasen minimiert wird.

Obwohl der erfindungsgemäße Gasblasenerzeuger bei jedem Verfahren verwendet werden kann, bei dem Gas in eine Flüssigkeit einströmt, findet er doch eine besondere Anwendung auf dem Gebiet der Biotechnologie bei der Kultur lebender Zellen, z.B. bei der Gärung und insbesondere bei der Züchtung eukaryotischer Zellen wie Hybridomas-Zellen.

Alle lebenden Zellen müssen mit einer geeigneten Umwelt bzw. Atmosphäre versehen werden, worin sie wachsen und eine angemessene Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen für das Wachstum finden. Ein flüssiges Wachstumsmedium sorgt für die ernährungsphysiologischen Bedürfnisse lebender Zellen. Um die Nährstoffe und Sauerstoff für die Zellen verfügbar zu machen, muß das Medium sorgfältig vermischt werden.

■ Eine Vielzahl von Methoden und Vorrichtungen ist bereits für die Züchtung von Zellen entwickelt worden. Die einfachste Vorrichtung besteht aus zylindrischen Flaschen, die Zellen und ein Medium enthalten. Die Zellen haften an der inneren Oberfläche der zylindrischen Flasche, und die Flasche wird rotiert, um die Zellen immer abwechselnd, aber konstant in das flüssige Medium einzutauchen und der Luft auszusetzen. Die Arbeitsweise komplizierterer Vorrichtungen umfaßt das Einführen von Gas in das System, um den für das aerobe Wachstum benötigten Sauerstoff zur Verfügung zu stellen und um das Medium durch innere oder äußere mechanische Mittel umzuwälzen, um die Nährstoffe in dem Medium und das eingeführte Gas für die Zellen verfügbar zu machen. Die Geschwindigkeit, mit der das flüssige Medium zirkuliert, wirkt sich auf das Zellwachstum aus. Eine hohe Zirkulationsgeschwindigkeit beansprucht die Zellen physisch und kann zur Beschädigung oder Zerstörung bestimmter Zellarten führen. Zellen höherer Eukaryoten sind für Beschädigungen dieser Art sehr empfindlich.

Die Umwälzung des Mediums kann in bestimmten Zellkulturgeräten durch Einführen von Gas in ein Kulturgefäß derart erfolgen, daß eine Umwälzung des darin enthaltenen flüssigen Mediums bewirkt wird. Ein Gefäß, in welchem die Umwälzung des Mediums in dieser Weise erhalten wird, ist in der Regel mit einer oder mehreren Prallplatten ausgerüstet, die das Gefäß in zwei oder mehrere Zonen unterteilen, durch welche das Medium zirkulieren kann. Die Umwälzung des Mediums wird erreicht durch Einführen eines Gases in Form von Blasen, um die Dichte der Flüssigkeit zu verändern, d.h. um die Dichte zu verringern, so daß die Flüssigkeit in der Zone aufsteigt, in die das Gas eintritt, und in einem anderen Bereich absteigt, nachdem sie einen Teil des eingeführten Gases verloren hat. Vgl.

z.B. die US-PS 3 963 581, 4 183 787, 3 790 141 und 3 880 716. Verschieden ausgebildete Gasblasenerzeuger haben sich als nützlich erwiesen, um Gas in eine Flüssigkeit einzuführen, um der Flüssigkeit eine zirkulierende Bewegung zu verleihen. Die meisten dieser Gasblasenerzeuger sind jedoch nicht verwendbar bei der Kultur hochempfindlichen biologischen Materials, insbesondere eukaryotischer Zellen. Eine Vorrichtung, die für die Züchtung von Säugetierzellen bestimmt und dafür eingerichtet ist, dem Medium eine zirkulatorische Bewegung zu verleihen, verwendet perforierte Platten (vgl. US-PS 4 173 516).

Um eine Verunreinigung zu vermeiden oder zu minimieren, wird bei den meisten Zellkulturvorrichtungen unter sterilen Bedingungen gearbeitet. Das Medium und das Kulturgefäß werden sterilisiert und es wird eine Reinkultur aus einer bestimmten lebenden Zelle eingeführt. Um eine nachfolgende Verunreinigung zu vermeiden, werden alle Stoffe und Materialien, die in das System eingeführt werden, einschließlich der für die aerobe Zellkultur erforderlichen großen Sauerstoffmenge, sterilisiert. Die Vorrichtung muß so gebaut sein, daß jede Kontaminierung während des Arbeitens vermieden wird.

Vorrichtungen für das Züchten von Zellen können für absatzweises Arbeiten oder für das Arbeiten unter einem stationären Zustand bei konstantem Stömen gebaut sein.

Bei absatzweisem Arbeiten wird die Kulturvorrichtung mit dem Medium und den zu züchtenden Zellen gefüllt, und das Wachstum findet während eines bestimmten Zeitraumes statt. Während dieses Zeitraums werden Nährstoffe und Sauerstoff der Vorrichtung zugeführt, und von den wachsenden Zellen erzeugte Gase werden abgeführt. Die Zellen und die von Ihnen erzeugten Stoffe werden jedoch nicht entfernt, bis der Züchtungsvorgang beendet ist.

In kontinuierlich strömenden, in einem stationären Zustand befindlichen Systemen wird Medium kontinuierlich dem Reaktionsgefäß zugeführt, und verbrauchtes Medium und erzeugte Stoffe werden aus dem Reaktionsgefäß kontinuierlich und in volumetrisch gleichen Verhältnissen abgeführt. Solche Systeme stehen den Wachstumsbedingungen von Säugetierzellen näher, d.h. Säugetierzellen sind ständig von einem umlaufenden System umgeben, das Nährstoffe zuführt und Abfallstoffe entfernt. Einige Vorteile des kontinuierlich strömenden, in einem stationären Zustand befindlichen Systems sind größere Ausbeuten an Erzeugnissen der Zellen sowie die Mühelosigkeit der Produktion.

Das schnell wachsende Gebiet der Biotechnologie schuf Mittel für die Erzeugung neuer und verbesserter Produkte durch gentechnologisch behandelte Mikroorganismen und miteinander verschmolzene Zellen, die als "Hybridomas" bekannt sind. Der wirtschaftliche Erfolg gewerblicher Anwendungen von Rekombinations-DNA-Technologie und ZeIlfusionstechniken, insbesondere auf pharmazeutischem Gebiet, wird von der erfolgreichen Kultur eukaryotischer Zellen und von Hybridomas-Zellen in großem Maßstab abhängen. Die Züchtung solcher Zellen und von Hybridomas

ist jedoch nicht einfach und ist mit einer Vielzahl ganz spezieller Probleme verbunden.

Die Organismen, die in ganz überwiegendem Maße bei der Zellkultur verwendet wurden, waren Prokaryonten, z.B. Bakterien, oder einfache Eukaryonten, z.B. Hefe. Diese zähen Organismen, die von einer zähen Zellwand umschlossen sind, sind verhältnismäßig leicht zu züchten, verglichen mit höhereukaryotischen Zellen, die größer als die meisten Mikroorganismen sind und in einer empfindlichen Plasmamembran eingeschlossen sind. Die für die Züchtung von Mikroorganismen entwickelten Methoden sind auf die Züchtung eukaryotischer Zellen nur beschränkt anwendbar, weil die vorgenannten Methoden diese größeren, zerbrechlicheren Zellen schädigen.

Die mit Pflanzenzellkulturen verbundenen Probleme sind den mit Säugetierzellen verbundenen Problemen durchaus ähnlich. Die Sorte von Pflanzenzellen, die sich am besten züchten läßt, sind einzelne Pflanzenzellen, die sich in Suspension vermehren, beispielsweise Algenzellen. Weitere Erfordernisse für die Züchtung von Pflanzenzellen sind ein angemessenes Medium für die Versorgung der Pflanzenzellen mit Nährstoffen und eine Lichtquelle für die Fotosynthese.

Einige Säugetierzellen wachsen in Suspension wie mikrobische Zellen, und die meisten Tumor- und andere transformierte Zellen können dem Wachstum in Suspension angepaßt werden. Die meisten höheren Zellen müssen jedoch an einer festen Oberfläche befestigt werden.

Obschon eine Vielzahl von Verfahren für die Züchtung von Säugetierzellen entwickelt worden ist, und zwar sowohl in Suspension als auch an einer festen Oberfläche befestigt, konnte doch keines das oben beschriebene Problem der Schädigung lösen. Die einfachste dieser

Techniken ist das oben beschriebene Verfahren mit zylindrischen Flaschen. Es gibt verschiedene Imitiobilis ie rungs techniken, bei denen von einer Verankerung nichtabhängige Zellen ("non-ADC") wie Hybridomas an einer porösen Keramik oder an Oberflächen eines Hohlfaser-Ultrafilters fixiert werden. Medium wird dann mit Sauerstoff beladen oder belüftet und über die immobilisierten Zellen gepumpt. Hybridomas und andere Zellen wurden in verschiedene Arten von Gelatine oder membranartige Kapseln zwecks Erhöhung der Zelldichte und damit auch der Ausbeute an Endprodukt eingekapselt. Hybridomas und andere Nicht-ADC-Zellen werden oft in Schleuderkulturgefäßen gezüchtet. Dieses Gefäß ist ein einfacher Behälter mit verschiedenartigen Schaufeln, der mit Hilfe magnetischer Mittel in Drehung versetzt wird. Alle vorstehend genannten Verfahren leiden an dem Nachteil, daß die Mittel zum Zirkulieren des Mediums, die somit die Nährstoffe und den Sauerstoff für die Zellen verfügbar machen und im Falle von Zellen, die in Suspension gezüchtet werden, die Zellen in Suspension halten, zu wenig schonend und mit unzureichender Sanftheit arbeiten, so daß stets die Gefahr der Schädigung der Zellen besteht.

Neben den oben beschriebenen in vitro-Systemen ist es am gebräuchlichsten, Hybridomas in vivo zu züchten, und zwar als Ascites-Tumor in Mäusen. Die Flüssigkeit aus dem Tumor, gewonnen aus dem Mäuseperitoneum, enthält das von dem Hybridoma erzeugte Produkt, d.h. monoklonale Antikörper, sowie viele andere von den Zellen der Maus produzierte Stoffe als normales Nebenprodukt des Zellularstoffwechsels. Die Ascites-Flüssigkeit muß zur Entfernung dieser anderen Produkte gereinigt werden. Ihre Verwendung als Humantherapeutikum ist sowohl wegen der Reinigungsprobleme als auch wegen des ProduktionsmaßStabes begrenzt.

Die gegenwärtig verfügbaren Verfahren zur Züchtung von Säugetierzellen wie Hybridomas sind unzureichend. Empfindliche Zellen werden durch die z.Zt. zur Verfügung stehenden Verfahren geschädigt und diese Verfahren führen nicht zu Zellen in ausreichender Anzahl oder zu Zellprodukten in ausreichender Menge. Andere Verfahren sind wegen der Reinheit der damit hergestellten Produkte und wegen des Erfordernisses einer sehr umfangreichen, häufig schwierigen Reinigung nur von begrenztem Wert. Deshalb werden alternative Verfahren für die Züchtung eukaryotischer Zellen und Hybridomas gesucht.

Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung für die Einführung von Gas in eine Flüssigkeit geschaffen, wobei die Vorrichtung einen Gaseinlaß, mindestens ein dem Gaseinlaß benachbartes gasdurchlässiges Teil sowie einen dem gasdurchlässigen Teil benachbarten Gasverteiler umfaßt, wobei der Gaseinlaß, das gasdurchlässige Teil und der Gasverteiler abdichtbar miteinander verbunden sind.

Mit der Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Einführen von Gas in eine in einem Gefäß enthaltene Flüssigkeit geschaffen, das das Einführen von Gas in einen Gaseinlaß , das Hindurchleiten von Gas von dem Gaseinlaß durch mindestens ein gasdurchlässiges Teil sowie das Verteilen des von dem gasdurchlässigen Teil durch einen Gasverteiler in ein flüssiges Medium hindurchtretenden Gases umfaßt.

Mit der Erfindung wird ferner eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Züchten von Zellen, insbesondere Säugetierzellen, geschaffen. Die Vorrichtung umfaßt einen Behälter für das flüssige Medium, mindestens eine im Inneren des Gefäßes angebrachte und im Abstand von dessen Oberteil und Boden befindliche Pralleinrichtunq, wobei die Pralleinrichtung vorzugsweise mindestens zwei Bereiche definiert, eine Anordnung für das Einführen von Gas in eine in einem

'Ά-

Gefäß enthaltene Flüssigkeit, die so ausgebildet ist, daß das Gas durch sie hindurch eingeführt wird, und einen Gaseinlaß, mindestens ein neben dem Gaseinlaß befindliches gasdurchlässiges Teil sowie einen dem gasdurchlässigen Teil benachbarten Gasverteiler, wobei der Gaseinlaß, das gasdurchlässige Teil und der Gasverteiler abdichtbar miteinander verbunden sind. Das Verfahren umfaßt das Einführen von Gas in einen Gaseinlaß, das Hindurchleiten von Gas vom Gaseinlaß durch mindestens ein gasdurchlässiges Teil, das Verteilen des von dem gasdurchlässigen Teil durch einen Gasverteiler in einen Bereich des Gefäßes hindurchtretenden Gases, wobei der Bereich durch eine Pralleinrjchtungderart definiert ist, daß das Gas in den Bereich aufsteigt, in den es eingeführt wird, und in einem anderen Bereich niedersinkt, der ebenfalls durch die Pralleinrichtung definiert ist, sowie das hierdurch fortlaufende Zirkulieren des Mediums. Mit der Erfindung wird außerdem eine Vorrichtung für die Behandlung von Zellen bei einem stationären Zustand unter konstantem Strömen geschaffen. Bei dieser Ausführungsform enthält das Kulturgefäß einen Einlaß und einen Auslaß für das Medium.

Damit eine wirksame Kultur stattfindet, wird das Gas so eingeführt, daß es ein Umlaufen des Mediums über und um die Zellen herum verursacht, falls die Zellen auf einer Oberfläche gezüchtet werden, und zwar mit einer Geschwindigkeit, die ausreicht, um den Sauerstoff und die in dem Medium enthaltenen Nährstoffe für die Zellen verfügbar zu machen, und zwar so behutsam, daß sie nicht geschädigt werden. In Fällen, in denen Zellen in Suspension gezüchtet werden, muß das Medium ebenfalls mit einer Geschwindigkeit umlaufen, die ausreicht, um die Zellen in Suspension zu halten. Mittels des erfindungsgemäßen Gasblasenerzeugers wird Gas in ein flüssiges Medium in Form kleiner Blasen einer kontrolliert-

gesteuerten Größe eingeführt, um eine behutsame Zirkulation des Mediums zu schaffen und um gegebenenfalls die Zellen ohne Schädigung in Suspension zu halten.

Die meisten fermenterartigen Zellkulturvorrichtungen sind kompliziert aufgebaut und teuer in der Herstellung. Mit der Erfindung wird ein einfaches und billiges Gerät für die Züchtung von Zellen, insbesondere von eukaryotischen Zellen, bereitgestellt. Für einige Anwendungen wird das erfindungsgemäße Zellkulturgefäß aus Kunststoff hergestellt und dem Anwender als sterilisierte Einweg-Einheit, komplett mit dem Gasblasenerzeuger, zur Verfügung gestellt.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher 'K erläutert.

Fig. 1 ist eine Vorderansicht (mit entfernten Teilen)

einer bevorzugten Ausführungsform eines Gasblasenerzeugers und einer Zellkulturvorrichtung

gemäß der Erfindung.

Fig. 2 ist eine Seitenansicht der Vorrichtung gemäß

Fig. 1.
25

Fig. 3 ist ein Schnitt nach Linie 3-3 in Fig. 1 und

zeigt den Gasverteiler der Vorrichtung gemäß

Fig. 1.

Fig. 4 ist eine Draufsicht auf zwei gasdurchlässige Teile gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 5 ist ein Schnitt nach Linie 5-5 in Fig. 4.

Fig. 6 ist eine Draufsicht auf eine Ausführungsform eines Gaseinlasses gemäß der Erfindung.

Fig. 7 ist ein Schnitt nach Linie 7-7 in Fig. 6.

Fig. 8 ist eine Vorderansicht (mit entfernten Teilen) einer zweiten Ausführungsform eines Gasblasenerzeugers und einer Zellkulturvorrichtung

gemäß der Erfindung.

Fig. 9 ist eine Seitenansicht der Vorrichtung gemäß

Fig. 8.
10

Fig. 10 ist eine Draufsicht auf eine zweite Ausführungsform des Gasverteilers.

Fig. 11 ist ein Schnitt nach Linie 11-11 in Fig. 10. 15

Fig. 12 ist eine Draufsicht auf eine dritte Ausführungsform des Gasverteilers.

Fig. 13 ist eine Teil-Vorderansicht einer dritten Ausführungsform eines Gasblasenerzeugers und

einer Zellkulturvorrichtung gemäß der Erfindung.

Fig. 14 ist ein Schnitt nach Linie 14-14 in Fig. 13.

Fig. 15 zeigt eine dritte Ausführungsform einer Pralleinrichtung gemäß der Erfindung.

Die Figuren 1 und 2 zeigen eine Vorrichtung für die Züchtung von Zellen mit einem zylindrischen Rohr 2 mit Wänden 10, das ein flüssiges Medium 15 enthält und mit einem Einlaß 11 und einem Auslaß 13 für das flüssige Medium versehen ist, sowie mit einem Gasblasenerzeuger, der eine Gaseinlaßvorrichtung 4 umfaßt, mit einem ersten gasdurchlässigen Teil 6, das im wesentlichen wasserundurchlässig ist, d.h. unter normalen Arbeitsbedingungen kein flüssiges Wasser hindurchtreten läßt, und vorzugsweise aus einem hydrophoben Material hergestellt ist, mit

einem zweiten gasdurchlässigen Teil 7, einem Gasverteiler 8, einem ringförmigen Tragelement 9 für das Rohr 2, einem Prallelement 14, Tragelementen 12 für das Prallelement 14, mit einem Deckel 16 zum Verschließen des Rohrs, der eine Probenöffnung 20, Entlüftungslöcher 18, einen Gaseinlaß 17 und ein Gasverteilungselement 21 aufweist. Die Figuren 8 und 9 zeigen eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Gleiche Teile sind mit gleichen Bezugszahlen, jedoch mit einem Strich versehen, bezeichnet.

Gas tritt in die Vorrichtung durch den Gaseinlaß 3 ein, strömt in die Gaskammer 5, durch das erste und zweite gasdurchlässige Teil 6 und 7 hindurch, tritt durch den Gasverteiler 8 hindurch und tritt schließlich in das in dem Rohr 2 enthaltene flüssige Medium 15 ein. Das Gas strömt in das Rohr 2 in Form von Blasen ein, die beim Durchgang des Gases durch die Poren der gasdurchlässigen Teile 6 und 7 sowie die öffnungen 1 in dem Gasverteiler 8 gebildet werden. Das erste im wesentlichen wasserundurchlässige Teil 6 verhindert, daß das flüssige Medium 15 in die darunter liegende Gaskammer 5 abfließen kann.

Ein Gasdruck von bis zu 689,5-10 Pa wird unter normalen Arbeitsbedingungen verwendet. Der gewählte Druck hängt von einer Anzahl von Variablen ab, einschließlich der Art der zu kultivierenden Zellen, der gewünschten Umwälzgeschwindigkeit, der Größe und Form der Zellkulturvorrichtung, dem Volumen und Inhalt des flüssigen Mediums, von den Filterkenngrößen und dem Aufbau des Gasblasenerzeugers .

Die Bildung von Blasen wird durch die Art des Materials bewirkt, aus dem die gasdurchlässigen Teile 6 und 7 bestehen, sowie durch die Struktur und die Anordnung der öffnungen 1 im Gasverteiler 8. Die Gestaltung der Gaseinlaßvorrichtung 4 hängt teilweise von der Lage des

Gasblasenerzeugers in bezug auf das Kulturgefäß ab. Bei einigen Ausführungsformen umfaßt die Gaseinlaßvorrichtung 4 auch den Boden des Rohrs 2. Der Boden des Rohrs 2 ist flach oder bei bevorzugten Ausführungsformen konkav gekrümmt. Bei Ausführungsformen, bei denen die Gaseinlaßvorrichtung 4 den Boden des Rohrs mit umfaßt, muß diese ausreichend dick sein, um sowohl das Rohr 2 zu tragen als auch die Anordnung eines Durchgangs 3 für die Lieferung von Gas in die Gaskammer 5 zu gestatten.

Bei einigen Ausführungsformen ist der Gasverteiler 8 in den Boden des Rohrs eingebaut, d.h. eine Konstruktion, die dann möglich ist, wenn die Zellkulturvorrichtung und der Gasblasenerzeuger aus Kunststoff hergestellt sind, z.B. durch Spritzgießen, wie nachstehend erläutert. Bei anderen Ausführungsformen ist der Gasblasenerzeuger innerhalb des Gefäßes angeordnet, z.B. im unteren Bereich, wie aus Fig. 13 ersichtlich.

Bei bevorzugten Ausführungsformen stellt die Gaseinlaßvorrichtung 4 einen Träger für die beiden gasdurchlässigen Teile 6 und 7 sowie für den Gasverteiler 8 dar. Bei der Ausführungsform gemäß den Figuren 1 und 6 bildet die Gaseinlaßvorrichtung 4 den Boden für das Rohr 2 sowie einen Träger für die gasdurchlässigen Teile 6 und 7. Wie aus den Figuren 13 und 14 ersichtlich, bildet die Gaseinlaßvörrichtung 4A keinen Boden für das Rohr 2, stellt aber einen Träger für die beiden gasdurchlässigen Teile 6A und 7A dar.

Die Gaseinlaßvorrichtung 4 (vgl. Fig. 1) umfaßt ein nichtporöses Teil, das mit einem Durchlaß 3, der in eine Gaskammer 5 mündet, versehen ist, um Gas in die Gaskammer 5 zu leiten. Der obere Teil der Gaskammer 5 öffnet sich neben dem gasdurchlässigen Teil 6 und gestattet so einen Durchgang des Gases von der Kammer 5 durch die gasdurchlässigen Teile 6 und 7 und den Gasverteiler 8. Die Gaskammer 5 ist mit Tragelementen für

die gasdurchlässigen Teile 6 und 7 versehen, die aus im Abstand voneinander angeordneten parallelen Platten 31 bestehen, welche sich vom Boden der Gaskammer 5 bis zu deren Decke, neben dem ersten gasdurchlässigen Teil 6, erstrecken.

Die Abmessungen, die äußere Form, die Anzahl und die räumliche Anordnung der Öffnungen 1 im Gasverteiler 8 hängen teilweise von der Gestalt des verwendeten ZeIlkulturgefäßes und von der gewünschten Blasengröße und Umlaufgeschwindigkeit der Flüssigkeit ab. Die gewünschte Blasengröße und Umlaufgeschwindigkeit wird von der Art und Form der gezüchteten Zellen bestimmt; in Suspension gezüchtete Zellen erfordern beispielsweise eine behutsaniere Umlaufgeschwindigkeit als Zellen, die verkapselt oder auf einem Mikroträger gezüchtet werden. Die Öffnungen sind in einer Weise angeordnet, daß sich eine gleichmäßige Blasenbildung sowie eine optimale Umwälzung des flüssigen Mediums mit Hilfe der aufsteigenden Blasen bildet. Die Öffnungen können aus einer Vielzahl äußerer Formen ausgewählt werden, einschließlich Schlitzen und Kreisen. Alternative Ausführungsformen des Gasverteilers 8 sind in den Figuren 3, 10 und 12 dargestellt. Die aus Fig. 3 ersichtlichen Öffnungen 1 des Gasverteilers 8 sind so konstruiert, daß sie eine optimale Blasenbildung dort gestatten, wo die Öffnungen das zweite gasdurchlässige Teil 7 berühren. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungs form, die in den Figuren 10 und 11 dargestellt ist, sind die Seiten 25 der Öffnungen 1A abgeschrägt oder V-förmig, um zu verhindern, daß sich Blasen aneinander anlagern und entlang der Seiten 25 ineinander aufgehen, sobald sie vom Boden der V-förmigen Öffnung, neben dem zweiten gasdurchlässigen Teil 7, freigesetzt werden und in die Flüssigkeit eintreten und dort aufsteigen.

Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind zwei gasdurchlässige Teile vorhanden. Das erste gasdurchlässige Teil 6 ist im wesentlichen wasserundurchlässig in Richtung auf die Gaskammer 5 und verhindert den Durchfluß von Flüssigkeit in die Gaskammer 5 unter normalen Arbeitsbedingungen. Geeignete Materialien für das erste gasdurchlässige Teil 6 schließen Filter aus Teflon, Polypropylen oder Polyethylen ein. Unter "Filter" werden Membrane, Filtersiebe und Membranfilter verstanden. Ein besonders bevorzugtes Material ist hydrophobes Teflon. Geeignete Materialien für das zweite gasdurchlässige Teil schließen Filter aus Polyester, Nitrozellulose, Zelluloseacetat und Nylon ein. Besonders bevorzugte Materialien sind hydrophile Polyester. Die Porengröße der Filter wird so gewählt, daß im Zusammenwirken mit den Öffnungen 1 in dem Gasverteiler 8 Gasblasen gebildet werden. Die Porengröße des ersten gasdurchlässigen Teils 6 beträgt 0,02 bis 1,0 μΐη, vorzugsweise 0,02 bis 0,2 μπι. Bei einigen Ausführungsformen kann die Porengröße des ersten gasdurchlässigen Teils 6 so gewählt werden, daß das in das System eintretende Gas sterilisiert wird. Wenn man das in den Gasblasenerzeuger eintretende Gas sterilisieren will, wird das erste gasdruchlässige Teil 6 so gewählt, daß es eine Porengröße im Bereich von 0,02 bis 0,22 μΐη besitzt. Die Porengröße des zweiten gasdurchlässigen Teils 7 beträgt 0,22 bis 100,0 μΐη, vorzugsweise 0,5 bis 5 μΐη.

Bei Ausführungsformen, bei denen nur ein gasdurchlässiges Teil vorhanden ist, ist dieses Teil vorzugsweise im wesentlichen wasserundurchlässig in Richtung auf die Gaskammer. Geeignete Materialien schließen Filter aus Teflon, Polypropylen oder Polyethylen ein. Wenn das gasdurchlässige Teil aus Materialien wie Polyester-, Nitro-Zellulose-, Zelluloseacetat- oder Nylon-Filter ausgewählt wird, wird Gas durch den Gasdurchlaß in die Gaskammer unter einem Druck eingeführt, der ausreicht, um einen

Flüssigkeitsrückstrom in die Gaskammer während des Betriebs der Zellkulturvorrichtung zu verhindern.

Das Kulturgefäß kann jede beliebige Form aufweisen, die sich auf eine oder mehrere Pralleinrichtungen 14 abstimmen läßt, welche die von dem Gas verursachte Umwälzung des Mediums steuern. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel (vgl. Figuren 1 und 2) besteht das Gefäß aus einem senkrechten zylindrischen Rohr 2 mit einem Oberteil 16 und einem Bodenteil, das die Gaseinlaßvorrichtung 4 umfaßt, aus einem ersten gasdurchlässigen Teil 6 und einem zweiten gasdurchlässigen Teil 7, einem Gasverteiler 8, welche bei dieser Ausführungsform alle lösbar mittels Schrauben 19 und 22 (vgl. Fig. 3) mit dem Rohr verbunden sind. Die Figuren 1 und 2 zeigen eine Ausführungsform für ein kontinuierliches Kulturverfahren, bei der das Rohr 2 mit einem Einlaß 11 und einem Auslaß 13 für das Medium versehen ist. Das Oberteil 16 ist mit einem oder mehreren Entlüftungslöchern 18 und einer oder mehreren Probenöffnungen 20 versehen. Bei der Ausführungsform gemäß den Figuren 1 und 2 weist das Oberteil außerdem einen Schlauchstutzen 17 für den Anschluß an eine Gasleitung und ein mit dem Oberteil 16 unmittelbar unterhalb des Schlauchstutzens 17 verbundenes Rohr 21 auf, welches sich bis zum Boden des Kulturgefäßes erstreckt, so daß Gas am Boden ausströmen kann. Das auf diese Weise zugeführte Gas wird zur Resuspendierung von Material verwendet, das sich aus dem flüssigen Medium absetzt. Bei einer anderen Ausführungsform (Fig. 13) wird der Boden des Rohrs von einem festen Körper 40 gebildet, der mit einer Gaseinlaßvorrichtung 4A versehen ist.

Wie aus der Zeichnung ersichtlich, befindet sich eine Prallplatte 14 in dem Kulturgefäß, wodurch zwei Bereiche definiert werden, von denen der eine größer ist als der andere. Die Prallplatte 14 ist in dem Gefäß in bezug

auf den Gasblasenerzeuger so angeordnet, daß die von dem durch den Gasblasenerzeuger eingeführten Gas verursachte Umwälzung des Mediums gesteuert wird. Bei dem in Fig. 1 wiedergegebenen bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Prallplatte 14 eine rechtwinklige Platte, die sich in dem Gefäß in axialer Richtung von einem unteren zu einem oberen Bereich erstreckt und die sich seitlich so weit erstreckt, daß sie die innere Wand 10 des Gefäßes in einem Abstand vom oberen Ende und vom Boden des Gefäßes berührt, und die durch Tragelemente 12 gehalten wird, deren eines Ende an der inneren Wand 10 des Rohrs 2 und deren anderes Ende an der Prallplatte 14 befestigt ist. Bei einer anderen Ausführungsform (vgl. Figuren 8 und 9) ist das Prallelement 14' in einem Abstand von der inneren Wand des Rohrs 2¹ angeordnet. Wiederum bei einer anderen Ausführungsform (Fig. 15) ist das Prallelement ein offenes zylindrisches Rohr, das sich in dem Gefäß von einem unteren Bereich nach oben erstreckt und sich in einem Abstand sowohl von der inneren Wand als auch vom oberen Ende und vom Bodenteil des Gefäßes befindet.

Das Rohr 2 und sein Deckel- und Bodenteil können aus verschiedenen Materialien, die nichttoxisch und sterilisierbar sind, ausgewählt sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Material aus einem Kunststoff, der aus der Gruppe der Polystyrole, Polycarbonate und Polysulfone ausgewählt ist. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht das Material der Wahl aus einem Kunststoff wie Polystyrol, der durch Spritzgießen verarbeitet werden kann.

Mit der Erfindung wird schließlich ein Verfahren geschaffen, bei dem der hier beschriebene Gasblasenerzeuger und die beschriebene Zellkulturvorrichtung verwendet werden und bei dem Zellen in einem flüssigen Medium mit Hilfe der folgenden Verfahrensstufen gezüchtet werden:

Es wird Gas in eine Gaseinlaßvorrichtung eingeführt; das Gas wird von der Gaseinlaßvorrichtung durch ein erstes gasdurchlässiges Teil und durch ein zweites gasdurchlässiges Teil hindurchgeführt; das durch das zweite gasdurchlässige Teil hindurchtretende Gas wird mittels eines Gasverteilers in einem durch eine Pralleinrichtung definierten Bereich des Gefäßes verteilt, so daß das Gas in dem Bereich aufsteigt, in den es eingeführt wird, und in einem anderen durch die Pralleinrichtung definierten Bereich absteigt; und das Medium wird hierdurch kontinuierlich umgewälzt.

Das ausgewählte flüssige Medium hängt von den Umwelt- und Ernährungsbedingungen der gezüchteten Zellen ab. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die gezüchteten Zellen Hybridoma-Zellen und das ausgewählte Medium ist ein definiertes serumfreies Medium.

Obwohl der Gasblasenerzeuger und die erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen im Zusammenhang mit der Kultur von Zellen beschrieben wurden, sei darauf hingewiesen, daß dieselben auch bei jedem anderen Verfahren Anwendung finden können, bei dem Gas in eine Flüssigkeit eingeführt wird.
25

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele weiter erläutert, auf die die Erfindung jedoch keineswegs beschränkt ist.

Beispiele

Die nachstehend angegebenen Bedingungen wurden bei den Beispielen 1 bis 4 eingehalten. Die Versuche wurden unter sterilen Bedingungen bei 37⁰C durchgeführt. HB-12-Zellen, eine bei Ventrex entwickelte Linie von Hybridoma-Zellen, wurden in einer Konzentration von etwa 1-10 Zellen/ml in HL-1 Medium mit 2 % Rinderfötenserum (FBS) und einem

^ Antischaummittel "B" der Firma Dow Corning in einer Verdünnung von 1:15000 eingeimpft. HL-1 ist ein definiertes serumfreies Medium, das von der Firma Ventrex im Handel erhältlich ist und speziell für die Züchtung von ^ Hybridomas bestimmt ist. HL-1 wurde in diesen Beispielen verwendet, wegen seines geringen Proteingehalts und seiner hohen Pufferkapazität. DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium F12 (Harn)) kann bei diesen Versuchen jedoch ebenfalls verwendet werden. Glutamin (Gibco)

¹^ wurde in einer Menge zugegeben, daß sich eine Endkonzentration von 2 mMol ergibt, und Gentamycin (Gibco) wurde bis zu einer Endkonzentration von 50 mcg/ml zugegeben. In eine T75-Flasche wurden 20 ml Zellkultur gegeben, und die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung (nachfolgend

¹^ auch als "CELLIFT"®, ein Warenzeichen der Firma Ventrex, bezeichnet) wurde mit 500 ml gefüllt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung der Standard-Trypanblau-Ausschlußmethode bestimmt. Bei den Beispielen 1, 2 und 3 wurde das absatzweise Zellkulturverfahren verwendet. Bei dem Beispiel 4 wurde ein kontinuierliches Verfahren mit einem stationären Zustand bei konstanter Strömung verwendet.

Beispiel 1; Hybridoma-Lebensfähigkeit 25

Die Kultur der Zellen wurde in einer erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung mit dem in den Figuren 8 und 9 wiedergegebenen Aufbau und mit einem Gasverteiler gemäß den Figuren 8, 9 und 12 durchgeführt und mit der in einer Standard-T75-Flasche durchgeführten Kultur verglichen. Das verwendete erste gasdurchlässige Teil war eine 0,02 μΐη-TefIon-Membran (Millipore) , die auch dazu diente, das in das System eintretende Gas zu sterilisieren. Das zweite gasdurchlässige Teil war ein 1 μΐη-Poly- esterfiltersieb (Tetko).

Tabelle I

Lebensfähigkeit (%) Hybridoma HBI2 Tag CELLIFT* T75-Flasche +

1 91 80

4 91 80

5 59 66 7 42 28

* 500 ml HL-1 + 2 % FBS + 20 ml HL-1 + 2 % FBS

Gleiche Zellkonzentrationen in beiden Gefäßen zu Beginn des Versuchs.

Beispiel 2: Antikörpererzeugung

Es wurde unter denselben Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, gearbeitet, wobei jedoch die gesamte Antikörpersynthese unter Verwendung eines Standard-ELISA-Verfahrens gemessen wurde. HB12 sondert Immunglobulin G (IgG) ab.

Tabelle II

Antikörpererzeugung mit Hybridoma HB12 Tag CELLIFT* T75-Flasche +

1 5,9 mg 0,9 mg

4 62,9 mg 4,8 mg

5 81,6 mg 13,52 mg 7 108,0 mg 12,50 mg

* Wie in Tabelle I
+ Wie in Tabelle I

Beispiel 3: Antikörper-Gesamttiter, gemessen mittels

eines Standard-ELISA-Verfahrens

Die Bedingungen entsprachen denjenigen des Beispiels 1, mit Ausnahme, daß die Antikörpererzeugung in bezug auf die Zellanzahl normalisiert wurde, was ein Maß für die Ausbeute an Antikörpern je Einheit der Zellmasse darstellt. Aus der Tabelle ergibt sich, daß bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine höhere Ausbeute erzielt wird als bei Verwendung der T75-Flasche.

Tabelle III

5 Antxkörperkonzentration ^g) je 10 Zellen je ml (HB12) bei absatzweiser Kultur

Tag	in Tabelle	CELLIFT*	I	T75-Flasche*
1	in Tabelle	107,3	I	66,4
4		229,1		116,1
5	171 ,2	191 ,8
7	360,0	241,3
* Wie
+ Wie
Beispiel 4

Die mittels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dem in den Figuren 1 und 2 gezeigten Aufbau (mit der Ausnahme, daß ein Schlauchstutzen 17 und ein Gaseinlaß 21 nicht vorhanden waren) und mit dem Gasverteiler gemäß Fig. 3 durchgeführte Kultur von Zellen wurde mit einer Kultur verglichen, die in einer T75-Flasche durchgeführt wurde. Im übrigen entsprachen die Bedingungen denjenigen des Beispiels 1, mit Ausnahme, daß eine kontinuierliche Einspeisung von Kultur in die Zellkulturvorrichtung am

Tag 7 mit einer Infusion von etwa 3,6 1 bis zum Tag begonnen wurde. Der Antikörpergesamtgehalt wurde für die vereinten Flüssigkeitsmengen bestimmt.

Tabelle IV

Antikörperausbeute (mg) im Vergleich zwischen kontinuierlicher und stationärer Kultur, letztere in einer T75-Flasche durchgeführt, unter Verwendung von Hybridoma HB12

Tag CELLIFT* T75-Flasche+

8 175 mg 11,7 mg

14 325 mg 11,2 mg

* HL-1 Medium + 2 % FBS mit einer Austauschrate von etwa 0,35 ml/min, beginnend am Tag 7. Etwa 3,6 1 Medium wurden bei dieser Untersuchung ausgetauscht.

+ HL-1 Medium + 2 % FBS ohne Austausch an Medium.

1. pH-Verschiebungen im Zellift wurden unter Verwendung eines gut gepufferten Mediums (HL-1, Ventrex) wirksam unter Kontrolle gehalten.

2. Das Schäumen ist in 2 % FBS enthaltendem Medium

minimal; es wurde unter Verwendung von HL-1 und eines AntischäummitteIs (Antifoam B, Dow Corning) weiter verringert.

- Leerseite -

Claims

PRINZ, LEISEH, BUNKE & PARTNER

Patentanwälte · European Patent Attorneys ^ R Π 1 7 Π S

Ernsbergerstraße 19 · 8000 München 60

22. Januar 1986

VXR, INC.

217 Read Street

Portland, Maine 04103 / USA

Unser Zeichen: V 808

Patentansprüche

1. Vorrichtung zum Einführen von Gas in eine in einem für die Durchleitung von Gas eingerichteten Gefäß enthaltene Flüssigkeit, gekennzeichnet durch eine Gaseinlaß-Vorrichtung, mindestens ein gasdurchlässiges Teil, das neben der Gaseinlaßvorrichtung angeordnet ist, sowie einen Gasverteiler, der neben dem gasdurchlässigen Teil angeordnet ist, wobei die Gaseinlaßvorrichtung, das gasdurchlässige Teil und der Gasverteiler abdichtbar miteinander verbunden sind.
10

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gasverteiler ein nichtporöses Teil umfaßt, das mit mindestens einer Öffnung versehen ist, welche

so angeordnet ist, daß das Gas in das Gefäß gelenkt wird. 15

Bi/Ma

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung verlängert ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Querschnitt der verlängerten Öffnung V-förmig ist, wobei sich der engere Teil neben dem gasdurchlässigen Teil befindet.

5. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung konkav gebogen ist, wobei der Boden der Öffnung, der sich neben dem gasdurchlässigen Teil befindet, mit einer zentralen Öffnung versehen ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung sphärisch-konkav ausgebildet ist, wobei der Boden der Öffnung, der sich neben dem gasdurchlässigen Teil befindet, mit einer zentralen Öffnung versehen ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gaseinlaßvorrichtung ein nichtporöses Teil umfaßt, das mit einer Durchströmöffnung in eine Gaskammer versehen ist, um Gas in die Gaskammer zu führen, wobei die Gaskammer mit einer Öffnung neben dem gasdurchlässigen Teil versehen ist, welches so angeordnet ist, daß das Gas von der Gaskammer durch das gasdurchlässige Teil hindurchtreten kann.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung konkav ausgebildet ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung ein Tragelement für das gasdurchlässige Teil umfaßt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gaskammer mit einem Tragelement zum Tragen des gasdurchlässigen Teils versehen ist, wobei das Trag-

element im Abstand voneinander parallel angeordnete Stäbe umfaßt, die sich über die Länge und Höhe der öffnung erstrecken und mit den diese begrenzenden Seitenwänden verbunden sind.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gasdurchlässige Teil ein Filter ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Filter im wesentlichen wasserundurchlässig ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserundurchlässige Filter im wesentlichen aus Teflon, Polypropylen oder Polyethylen besteht.

14. Vorrichtung zum Einführen von Gas in eine in einem für das Durchleiten von Gas eingerichteten Gefäß enthaltene Flüssigkeit, gekennzeichnet durch eine Gaseinlaßvorrichtung, ein erstes gasdurchlässiges Teil, das neben der Gaseinlaßvorrichtung angeordnet ist, ein zweites gasdurchlässiges Teil, das neben dem ersten gasdurchlässigen Teil angeordnet ist, und einem neben dem gasdurchlässigen Teil angeordneten Gasverteiler, wobei die Gaseinlaßvorrichtung, das erste und zweite gasdurchlässige Teil und der Gasverteiler abdichtbar miteinander verbunden sind.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite gasdurchlässige Membran hydrophil ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophile Membran aus Polyester, Nitro-Zellulose, Zelluloseacetat oder Nylon besteht.

17. Vorrichtung für die Kultur lebender Zellen in einem flüssigen Medium, gekennzeichnet durch ein Gefäß für das flüssige Medium, mindestens eine Pralleinrichtung, die innerhalb des Gefäßes angeordnet und von dessen Oberteil und Bodenteil im Abstand gehalten ist, wobei die Pralleinrichtung mindestens zwei Bereiche definiert, durch einen Gasblasenerzeuger zum Einführen von Gas in eine in einem Gefäß enthaltene Flüssigkeit, wobei der Gasblasenerzeuger für das Einführen und Hindurchleiten von Gas in einen bestimmten Bereich, der durch die Pralleinrichtung definiert wird, eingerichtet ist und wobei der Gasblasenerzeuger eine Gaseinlaßvorrichtung, mindestens ein neben der Gaseinlaßvorrichtung angeordnetes gasdurchlässiges Teil sowie einen Gasverteiler umfaßt, der neben dem gasdurchlässigen Teil angeordnet ist, wobei die Gaseinlaßvorrichtung, das gasdurchlässige Teil und der Gasverteiler abdichtbar miteinander verbunden sind.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pralleinrichtung eine Prallplatte ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Prallplatte innerhalb des Gefäßes sich in axialer Richtung erstreckt und im Abstand von den Gefäßwänden angeordnet ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Pralleinrichtung ein zylindrisches Rohr ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das zylindrische Rohr sich in dem Gefäß in axialer Richtung erstreckt und im Abstand von den Gefäßwänden angeordnet ist.

22. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß mit Mitteln zum Einführen von Gas in

das Bodenteil des Gefäßes versehen ist, um die Dispergierung von Zellen und anderen Stoffen, die sich aus dem flüssigen Medium absetzen können, zu bewirken.

23. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß einen Einlaß und einen Auslaß für das flüssige Medium aufweist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen eukaryotische Zellen sind.

25. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Säugetierzellen sind.

26. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Hybridomas-Zellen sind.

27. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Pflanzenzellen sind.

28. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige Medium ein definiertes serumfreies Medium ist.

29. Vorrichtung zum Kultivieren lebender Zellen in einem flüssigen Medium, gekennzeichnet durch ein Gefäß für das flüssige Medium, mindestens eine Pralleinrichtung, die innerhalb des Gefäßes und im Abstand von dessen Oberteil und Bodenteil angeordnet ist und mindestens zwei Bereiche definiert, durch einen Gasblasenerzeuger für das Einführen von Gas in eine in einem Gefäß enthaltene Flüssigkeit, wobei der Gasblasenerzeuger für das Einführen und Hindurchleiten von Gas in einen durch die Pralleinrichtung definierten Bereich eingerichtet ist und eine Gaseinlaßvorrichtung, ein erstes gasdurchlässiges Teil, das sich neben der Gaseinlaßvorrichtung befindet, ein zweites gasdurchlässiges Teil, das

—ο-Ι sich neben dem ersten gasdurchlässigen Teil befindet, sowie einen Gasverteiler, der neben dem zweiten gasdurchlässigen Teil angeordnet ist, umfaßt, wobei die Gaseinlaßvorrichtung, die gasdurchlässigen Teile und der Gasverteiler abdichtbar miteinander verbunden sind.

30. Verfahren zum Einführen von Gas in eine Flüssigkeit ohne schädliche Auswirkungen auf darin enthaltene empfindliche biologische Materialien, dadurch gekenn-

IC zeichnet, daß Gas in eine Gaseinlaßvorrichtung eingeführt wird, von der Gaseinlaßvorrichtung durch ein erstes und ein zweites gasdurchlässiges Teil hindurchgeleitet wird und daß das von dem zweiten gasdurchlässigen Teil durch einen Gasverteiler hindurchtretende Gas in ein flüssiges Medium abgegeben und verteilt wird.

31. Verfahren zum Kultivieren von Zellen in einem in einem Gefäß enthaltenen flüssigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß Gas in eine Gaseinlaßvorrichtung eingeführt wird, von der Gaseinlaßvorrichtung durch ein erstes und ein zweites gasdurchlässiges Teil hindurchgeleitet wird und daß das von dem zweiten gasdurchlässigen Teil durch einen Gasverteiler in einen durch eine Pralleinrichtung definierten Bereich des Gefäßes geleitete Gas verteilt wird, derart, daß das Gas in dem Bereich, in den es eingeführt wird, aufsteigt und in einem anderen durch die Pralleinrichtung definierten Bereich absteigt, und daß das Medium hierdurch kontinuierlich umgewälzt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Umwälzen keine schädlichen Auswirkungen auf Zellen hat, um und über die das flüssige Medium umgewälzt wird.

33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Umwälzen keine schädlichen Auswirkungen auf

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Zellen hat, die in dem flüssigen Medium enthalten sind und mit dem Medium umgewälzt werden.

34. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellen Säugetierzellen verwendet werden.

35. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß als Zellen Hybridoma-Zellen verwendet werden.

36. Verfahren zum Kultivieren lebender Zellen mit Hilfe einer Vorrichtung zum Kultivieren lebender Zellen in einem flüssigen Medium, welche folgende Teile umfaßt: ein Gefäß für das flüssige Medium, mindestens eine Pralleinrichtung, die innerhalb des Gefäßes xm Abstand von dessen Oberteil und Bodenteil angeordnet ist und mindestens zwei Bereiche definiert, einen Gasblasenerzeuger zum Einführen von Gas in eine in einem Gefäß enthaltene Flüssigkeit, wobei der Gasblasenerzeuger für das Einführen und Hindurchleiten von Gas in einen durch die Pralleinrichtung definierten Bereich eingerichtet ist und eine Gaseinlaßvorrichtung, ein gasdurchlässiges Teil, das neben der Gaseinlaßvorrichtung angeordnet ist, sowie einen Gasverteiler, der neben dem gasdurchlässigen Teil angeordnet ist, umfaßt, wobei die Gaseinlaßvorrichtung, das gasdurchlässige Teil und der Gasverteiler abcichtbar miteinander verbunden sind,

dadurch gekennzeichnet, daß Gas in die Gaseinlaßvorrichtung eingeführt wird, von der Gaseinlaßvorrichtung durch das gasdurchlässige Teil hindurchgeleitet wird, daß das von dem gasdurchlässigen Teil durch den Gasverteiler in den durch die Pralleinrichtung definierten Bereich des Gefäßes strömende Gas derart verteilt wird, daß das Gas in dem Bereich, in den es eingeführt wird, aufsteigt und in einem anderen durch die Pralleinrichtung definierten Bereich absteigt, wodurch das Medium kontinuierlich umgewälzt wird.