DE2624047A1 - Verfahren zur massenzuechtung von zellen und kammer-system zu seiner durchfuehrung - Google Patents

Verfahren zur massenzuechtung von zellen und kammer-system zu seiner durchfuehrung

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DE2624047A1 DE19762624047 DE2624047A DE2624047A1 DE 2624047 A1 DE2624047 A1 DE 2624047A1 DE 19762624047 DE19762624047 DE 19762624047 DE 2624047 A DE2624047 A DE 2624047A DE 2624047 A1 DE2624047 A1 DE 2624047A1
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Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR * g ο / Q / η
PATENTANWÄLTE
8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 86 0245
Anwaltsakte 26 89Ο ^ 8. MAI 1976
Meditest j Institut für medizinisch-pharmazeutische Untersuchungen, GmbH & Co. KG
Verfahren zur Massenzüchtung von Zellen und Kammer-System zu seiner Durchführung
Normale diploide Zellen sind für viele Zwecke erforderlich, beispielsweise für die Produktion von Vakzinen und Zellprodukten, für den menschlichen Gebrauch und für Forschungszwecke. Heteroploide Zellen sind für solche Zwecke nicht verwendbar, da sie kanzerös sind, obwohl ihre Züchtung wesentlich einfacher wäre.
Normale diploide Zellen wachsen nur an zellfreundlichen Oberflächen, an denen sie fest haften und einen geschlossenen dichten Zellrasen (Monolayer) bilden. Dies ermöglicht einer-
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t (089) 988272 8 München 80, Mauerkircherstraße 45 Banken: Bayerische Vereinsbank München 453100
9g 7043 Telegramme: BERGSTAPFPATENT München Hypo-Bank München 3892623
98 3310 TELEX: 05 24 560 BERG d Postscheck München 653 43 - 808
seits einen schnellen Wechsel des Mediums ohne Abzentrifugieren der Zellen, andererseite wird jedoch nur eine bestimmte, von der Größe der Oberfläche abhängige Menge von Zellen produziert. Zur Vermehrung werden die Zellen mit Hilfe von proteolytischen Enzymen wie z.B. Trypsin bzw. in Kombination mit EDTA, von der Oberfläche gelöst. Angesetzt in einem Kulturgefäß haften die Zellen innerhalb von 3 Stunden und erreichen die für sie jeweils typische Form in etwa 8 Stunden. Je nach Dichte des Ansatzes und der Geschwindigkeit des Wachstums (Zellteilung) bildet sich nach einem bis mehreren Tagen der dichte ZeIl-
rasen. Sobald die Zellen eine bestimmte Dichte pro cm erreicht haben, abhängig vom jeweiligen Zellstamm, hören sie auf sich zu vermehren. Das Prinzip der Züchtung von Zellen an der Oberfläche einer Substanz setzt deshalb der Produktion in einer Einheit eine natürliche Grenze.
Obwohl theoretisch eine plane Oberfläche bis 100 χ 100 cm (Im ) betragen könnte, erscheint eine praktische Lösung in dieser Weise unmöglich, da Sterilität und häufig auch eine geschlossene Atmosphäre gewährleistet sein müssen, weshalb nur flache Flaschen, sogenannte Roux-Schalen praktisch in Betracht kommen; ihre Vergrößerung zu sogenannten Penicillin-Schalen brachte jedoch nur eine 2- bis 3-fache Fläche
(Roux-Schalen aus Glas bzw. aus Plastik: 100 - 200 cm ; Penicillin-Schalen: 600 cm2).
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Die Roux-Schalen wurden für die Kultur von Zellen aus der Bakteriologie übernommen, wo sie vor 100 Jahren eingeführt wurden und bisher durch nichts Besseres ersetzt werden konnten.
Seit mehreren Jahren bemühte man sich um eine praktische Lösung des Problems der Vergrößerung der inneren Oberfläche eines Gefäßes und es wurden hierfür mehrere Möglichkeiten vorges chlagen:
a) Wölbung der Oberfläche zu einem Rohr, das ständig gedreht wird, so daß die Zellen zwar an der ganzen Innenfläche wachsen, jedoch nur in dem unteren 1/5 - 1/3 mit Nährmedium bedeckt sind. Es sind mehrere Systeme dieser sogenannten Roller-Rohre bekannt, bei denen die Fläche
2
eines Gefäßes auf 500 - 13OO cm vergrößert wurde. Durch Anordnung von bis zu hunderten Rohren in Etagen übereinander sind Produktionseinheiten bis 7200 Roller-Flaschen entstanden. Der Nachteil solcher Systeme besteht darin, daß jedes Rohr eine Einheit ist, die getrennt bearbeitet werden muß, was technisch sehr aufwendig ist. Eine Automatisierung ist bisher in der Praxis gescheitert.
b) Es wurde vorgeschlagen, die Oberfläche eines Rohres durch Einlegen einer Schnecke (Spirale) aus zellfreund-
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lichem Plastikmaterial zu vergrößern (W. House, Bulk Culture of Cell Monolayers. S. 338-31J1O was zur Entwicklung eines 2 - 20-1-Kolbens mit 8.000 bis 80.000 cm2 führte. Nach diesem System sollen 5 bis 10 Zellvermehrungen erreicht werden, was sich jedoch in der Praxis nicht bestätigt hat, da die Zellen an den inneren Windungen der Spirale sehr spärlich anwachsen. Auch hier ist ein Nachteil darin zu sehen, daß jedes Rohr eine Einheit darstellt, die getrennt bearbeitet werden muß, was technisch sehr aufwendig ist. Neben einem verhältnismäßig hohen Preis pro Gefäß stellen sich auch bei diesem System der Automatisierung in der Praxis große Schwierigkeiten entgegen.
c) Ein weiterer Vorschlag ging dahin, die Oberfläche in einem Gefäß durch Einlegen von vielschichtigen Stapeln von Platten aus Glas, Metall oder Kunststoff zu vergrößern. Ein von Weiß und Schleicher (1968) vorgeschlagenes System besteht aus vielen Platten aus Fensterglas, 6 mm voneinander entfernt, die in 1- bis 200-1-Tanks eingelegt werden. Ähnliche Modelle aus Titan wurden in 2 Größen (18.000 und 72.000 cm2) von der Firma New Brunswick Scientifics (NBS) auf den Markt gebracht.
In der Kopfplatte dieser vorstehend erwähnten Modelle befinden sich Stutzen zum Begasen, Mediumwechsel usw. Das
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Zellwachstum findet in horizontaler oder vertikaler Position der Platten, mit oder ohne Rollen des ganzen Gefäßes statt.
Ein Nachteil dieser Systeme besteht darain, daß eine große Menge Medium im Verhältnis zur Oberfläche erforderlich ist.
d) Es wurde ferner vorgeschlagen, die Oberfläche in einem Gefäß durch Einlegen von Glasperlen (Gey, 1933, Robineaux, 1970; Rüdiger, 1975) oder Sephadex-Kügelchen (van Wezel, Growth of Cell-Strains and Primary Cells in Microcarriers in homogenous culture, 1967 j S. 216; Horug et al., 1974) in das Medium im Gefäß zu vergrößern. Es gibt Gefäße von 1 bis 3 1» die im ersten Fall als ruhende Monolayer-Kultur ,im zweiten Fall als Suspensions-Kultur betrieben werden. In beiden Fällen sind Möglichkeiten für die Messung und Anpassung der Umweltbedingungen, z.B. CO?, O2, Temperatur, pH, Glukose usw. eingebaut.
Der Nachteil dieser Systeme besteht in der Notwendigkeit großer Mengen an Medium im Verhältnis zu den Zellen und der Schwierigkeit der Zellgewinnung.
e) Einen völlig neuen Zugang zu der Massenzüchtung von Zellen bedeutet das sogenannte "Hollow Fiber Cartridge System", das ein Bündel von Kapillaren aus zellfreund-
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Hchem Kunststoffmaterial, das sich in einer Röhrchen-Kammer befindet, darstellt. Die Zellen wachsen an der Außenfläche der Kapillaren, die mit Wachstumsmedium fortlaufend perfundiert werden. Die gegenwärtig existie-
2 renden Modelle haben eine Oberfläche von etwa 100 cm , was für die Massenproduktion von Zellen nicht ausreichend ist.
Es kann gesagt werden, daß keines der bisherigen Systeme der Massenzüchtung von Zellen das Stadium der operationellen und routinemäßigen Produktion von Zellen, bzw. von Zellprodukten für parenterale Applikation beim Menschen erreicht hat. In praktischer Hinsicht wurde mit keinem System eine wirkliche Massenzüchtung von Zellen erreicht und in theoretischer Hinsicht sind alle Systeme mit schwerwiegenden Nachteilen behaftet, beispielsweis der Möglichkeit der mikrobiellen und zellulären Kontamination, der Schwierigkeit der Rationalisierung und Automatisierung.
Ein den praktischen Bedürfnissen gerecht werdendes System der Massenzüchtung von Zellen sollte folgende Kriterien erfüllen:
Das System sollte eine langdauernde Kultivierung von diploiden Zellen bis zum Zeitpunkt ihrer möglichen, d.h. theoretisch aufgrund der Mutationsrate 1 : 10 bis 1 :
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errechenbaren Transformation bzw. bis zu ihrem Absterben ermöglichen, wobei ihre spezielle Punktion, z.B. die Produktion von Interferon, erhalten bleiben müssen. In dem System sollten die Zellen minimal den "Biohazards" ausgesetzt sein, d.h. den Einwirkungen von fremden Substanzen und der Außenwelt,besonders in der Zeit der Ernte und Aussaat. Auch die Herstellungs- und Produktionskosten sollten unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten realistisch sein.
Es wurde nunmehr gefunden, daß es möglich ist, die Nutzfläche für die Zellzüchtung erheblich zu vergrößern und die für die Züchtung erforderlichen Arbeitsgänge für mehrere Nutzflächen gleichzeitig und gemeinsam vorzunehmen, was eine weitgehende Rationalisierung und Automatisierung der Züchtung erlaubt. Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
a) das Nährmedium, die Zellsuspension, die Trypsinlösung bzw. alle anderen flüssigen Bestandteile über eine als Versorgungskanal dienende zentrale Zuleitung 1 in den unteren Teil eines durch Stapelung ä-eichgerichteter flacher Wannen gebildetes System kommunizierender Kammern 2 mit im wesentlichen vertikal angeordneten Wannenböden 3 (Position A) einleitet und nach dem Prinzip kommunizierender Rohre sich verteilen läßt, wobei gleich-
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- ο —
zeitig über einen im oberen Teil des Kammer-Systems befindlichen zentralen Be- und Entlüftungskanal '4 der Luftdruckausgleich stattfindet.
b) nach Schließen der aie Zufuhr des Nährmediums der Zellsuspension, der Trypsinlösung bzw. aller anderen flüssigen bestandteile und der Luft regelnden Ventile 5 und 6 durch Schwenken des Kammer-Systems in die horizontale Lage (Position B) das Nährmedium usw. auf die Nutzfläche der im wesentlichen horizontal gelagerten Wannen verteilt,
c) in der horizontalen Position die Parameter der über aem Medium herrschenden Atmosphäre mißt, korrigiert und die Züchtung der Zellen auf den Nutzflächen der einzelnen, jetzt übereinander angeordneten Kammern durchführt, wobei gegebenenfalls durch vorübergehende Rückstellung des Kammer-Systems in die vertikale Lage (Position A) die Parameter des Nährmediums kontrolliert und korrigiert werden können,
d) nach Beendigung des Zellwachstums bzw. der Virus- oder Interferonproduktion und Rückstellung des Kammer-Systems in die vertikale Position die abtrypsinierten Zellen bzw. die Virus- oder Interferonernte über den zentralen Versorgungskanal 1 abfließen läßt und daß man
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e) die Zellen bzw. die Zellprodukte auf übliche Weise aufarbeitet.
Zur Durchführung des erfindungsbemäioeri Verfahrens dient vorzugsweise eine Vorrichtung, die im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben werden soll:
Das Kammer-System besteht aus einzelnen flachen Wannen, deren Nutzfläche verschiedene Größen aufweisen kann, die sich weitgehend nach der technischen Möglichkeit ihrer Herstellung richten. Die einzelnen Wannen haben eine als Wachstums- oder Nutzfläche dienende innere Bodenfläche 3 und sina mit Seitenwänden 9 versehen, deren Höhe vorzugsweise 5 bis 20 mm betragen kann. Selbstverständlich können Wannenboden und -wand auch getrennt hergestellt und zum erfindungsgemäßen Kammer-System gestapelt werden. In zwei Ecken der kurzen Seitenwand sind Überläufe 10 vorgesehen, welche die Form eines Röhrchens oder Vierecks aufweisen können, dessen Höhe gleich ist mit der kurzen Seitenwand (Wanne 7) und in dessen oberen Teil sich eine (oder mehrere) öffnung(en) 11 befindet, die zur Versorgung bzw. Be- oder Entlüftung der betreffenden Kammer dient. Die vorgesehenen Überläufe können auch kürzer als die Seitenwände sein (Wanne 7:a), wodurch die Notwendigkeit spezieller Öffnungen entfällt. Die Höhe solcher kürzeren Überläufe wird dadurch bestimmt, daß aus ihnen in im wesentlichen horizontaler Lage (Position B) keine Plüssig-
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- ίο -
keit über den zentralen Versorgungs- oder Belüftungskanal abfließen darf.
Beispielsweise mit Hilfe von Dichtungsringen oder geklebte aufeinander gestapelte und mit Hilfe von Schrauben zusammengehaltene Wannen bilden einen Stapel, der aus mehreren, z.B. aus lü bis 20 Kammern bestehen kann. Die Überläufe der einzelnen Wannen werden im Stapel zu zwei Kanälen, die als Versorgungs- 1 und Be- bzw. Entlüftungskanal 4 dienen. In der vertikalen Position der Stapel befindet sich unten der Versorgungs- und oben der Lüftungskanal. Der Versorgungskanal hat am vorderen Eingang zweckmäßig ein Mehr-Weg-Ventil, der Lüftungskanal zweckmäßig ein Zwei-Weg-Ventil mit Milliporefilter. Beide Leitungen enden hinten blind.
Die Wannen können aus allen für die Zellzüchtung geeigneten Materialien wie Glas, Kunststoff usw. bestehen. Vorzugsweise bestehen die Wannen aus Polystyrol 3 dessen Oberfläche zellfreundlich behandelt ist.
Die Versorgung des Kammer-Systems erfolgt in vertikaler Position auf dem Prinzip der kommunizierenden Rohre. Der Versorgungskanal ist mit Hilfe von Schläuchen an ein zentrales Versorgungs- uid Entleerungssystem angeschlossen. Der Luftdruckausgleich beim Füllen bzw. Entleeren geschieht durch den Lüftung3kanal.
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- ii -
Das gefüllte Kammer-System wird in Position B gestellt, in der sich beide Kanäle oben befinden. In dieser horizontalen Inkubationslage verteilt sich das Medium gleichmäßig auf die Nutzfläche der einzelnen Kammern. Beide Kanäle kommen auf diese Weise in eine vertikale Lage; die öffnungen für die einzelnen Kammern befinden sich dann in horizontaler Lage dicht oben, unter dem Boden der nächsten Kammer, wodurch der Zusammenhalt der Flüssigkeit unterbrochen und das Ausfließen nach unten verhindert wird. In dieser Position ist die Aeration z.B. mit CO2 möglich.
Zum Entleeren wird das Kammer-System in der beschriebenen Weise, jedoch in umgekehrter Richtung in die vertikale Lage gebracht. Zur Zugabe von weiteren Substanzen wird das Nährmedium in das Entleerungsgefäß überführt, die gewünschte!Substanzen werden dort hinzugeführt und die Flüssigkeit in das Kammer-System zurückgeführt.
Bei einer besonders zweckmäßigen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Bebrütung des Kammer-Systems auf einer Kippvorrichtung, um die Menge des Nährmediums zu vermindern und das Wachstum der Zellen zu verbessern.
Es können auch mehrere Kammer-Systeme mit gemeinsamer zentraler Versorgung auf einer gemeinsamen Kippvorrichtung zu einer größeren Einheit verbunden und als solche bearbeitet
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werden. Das Ganze kann in einen brutschrank eingebaut werden.
Beispiel der .berechnun^; der Zellproduktion
1 cm"
10-
1 Wanne 20 Wannen 1 Batterie
20 χ 30 cm 1 Stapel 20 Stapel
12.000 cm 2^0.000 cm
Jellen
600 cm = 6 χ 10' Zellen
= 1,2 χ 109 Zellen
= 2,k χ 10
-IQ
Zellen
Mediumverbrauch
1 mm - Höhe für 1 Wanne 1 1 Stapel 1 Batterie ml
bei 2 mm - Höhe 60 ml 2 .200 2H .000 ml
bei 3 mm - Höhe 120 ml 3 .400 48 .000 ml
bei IbO ml .600 72 .000
Die technischen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens und des zu seiner Durchführung dienenden Kammer-Sy st ems sind im besonderen folgende:
1. Durch die Vergrößerung der für das Zellwachstum zur Verfügung stehenden Oberfläche und Einheitlichkeit der Bedienungsvorgänge werden gleichmäßige Bedingungen für das Zellwachstum im ganzen System eines Stapels bzw. einer Batterie
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sichergestellt, wodurch die theoretische Wahrscheinlichkeit der Zelltransformation durch Mutation an Stellen abweichender Bedingungen vermindert wird.
2.Die einfache zentrale Versorgung und Aeration vermindert das Risiko sog. Biohazards besonders zur Zeit der Aussaat, Vermehrung der Zellen durch mikrobielle oder zelluläre Kontamination usw. auf ein Mindestmaß.
3. Umweltfaktoren wie CO , Q^3 U3 pH, Währstoffe usw. sind leicht meß- und regulierbar.
4. Es wird eine erhöhte Sterilität bei allen Arbeitsvorgängen ermöglicht, wodurch ein Zusatz von Antibiotika vermieden werden kann.
5. Es ist eine sehr gute Ausnutzung des Raumes, d.h. ein gutes Verhältnis zwischen Anzuchtfläche und Raumbedarf möglich.
6. Verwendung von zellfreundlichem Kunststoffmaterial, zwecke mäßig Polystyrol, in dem die Zellen am besten wachsen.
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Claims (7)

  1. Patentansprüche :
    Verfahren zur Massenzüchtung von diploiden Zellen, d a aurch gekennzeichnet, daß man
    a) die Zellsuspension, das Nährmedium oder sonstige Lösungen über einen zentralen Versorgungskanal (1) in den unteren Teil eines durch Stapelung gleichgerichteter flacher
    Wannen gebildetes System kommunizierender Kammern (2) mit im wesentlichen vertikal angeordneten Wannenböden einleitet und nach dem Prinzip kommunizierender Rohre sich verteilen läßt j wobei gleichzeitig über einen im oberen Teil des Kammer-Systems befindlichen zentralen Be- und Entlüftungskanal (4) der Luftdruckausgleich stattfindet,
    b) nach Schließen der die Versorgung und die Be- oder Entlüftung regelnden Ventile (5) und (6) durch Schwenken des Kammer-Systems in die horizontale Position das Medium, die Zellsuspension, das Nährmedium oder sonstige Lösungen auf die Nutzfläche (3) der im wesentlichen horizontalen Wannen verteilt und die Züchtung der Zellen durchführt und
    c) nach Beendigung des Wachstums und Rückstellung des Kammer-Systems in die vertikale Position die Zellsuspension oder die Zellprodukte gewinnt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-
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    ΟΗΘ1ΗΜ·
    zeichnet , daß man in vertikaler Position des Kammer-Systems die Parameter des Mediums und in horizontaler Position des Kammer-Systems die Parameter der über dem Medium herrschenden Atmosphäre mißt und gegebenenfalls korrigiert.
  3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet , daß man während der Züchtung der Zellen das im wesentlichen horizontal gelagerte Kammer-System mittels einer Kippvorrichtung in Bewegung hält.
  4. 4. Vorrichtung zur Massenzüchtung von Zellen, im besonderen zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere flache Wannen (7) einen Stapel bildend mit ihren freien Außenrändern luft- und flüssigkeitsdicht aufeinandersetzen, daß in zwei Ecken jeder Wanne zwei im Abstand über dem Wannenboden (3) vorgesehene, zur zunächst darunter befindlichen Wanne offene Überläufe (10) vorgesehen sind, daß die Überläufe der verschiedenen Wannen wenigstens angenähert in einer Flucht sind, daß die Überläufe der obersten und untersten Wanne verschließbar und daß die einzelnen Wannen miteinander verbunden sind.
  5. 5- Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Überläufe die gleiche Höhe wie die
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    Außenwände aufweisen und in ihrem oberen Teil eine oder mehrere Öffnungen besitzen.
  6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet , daß die Wannen aus Polystyrol bestehen, dessen Nutzfläche zellfreundlich behandelt ist.
  7. 7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Versorgungskanal mit Hilfe von Schläuchen an zentrale Versorgungs- und Entleerungsgefäße angeschlossen ist.
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