DE3220548A1 - Automatisches, kontinuierliches durchflussverfahren zur bestimmung von kreatinin und eine vorrichtung und test-kits zur durchfuehrung desselben - Google Patents

Automatisches, kontinuierliches durchflussverfahren zur bestimmung von kreatinin und eine vorrichtung und test-kits zur durchfuehrung desselben

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DE3220548A1 DE19823220548 DE3220548A DE3220548A1 DE 3220548 A1 DE3220548 A1 DE 3220548A1 DE 19823220548 DE19823220548 DE 19823220548 DE 3220548 A DE3220548 A DE 3220548A DE 3220548 A1 DE3220548 A1 DE 3220548A1
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description

HOFFMANN:; E£e£is 'ÄPiiRTNEE «,
PATENTANWÄLTE 0 Z C V D ^ Q
DR.ING. E. HOFFMANN {1930-197Λ) · Dl PL.-IN G. W. EITLE · OR. RER. NAT. K.H OFFMANN · DI PL.-1N G. W. IEHN
DIPL.-ING. K.FOCHSLE . DR. RER. NAT. B..HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 MO NCHEN 81 . TELEFON (08?) 911087 · TELEX 05-29019 (PATHE)
36 908 m/hl
Farmitalia Carlo Erba S.p.A.,
Mailand / Italien
Automatisches, kontinuierliches Durchflußverfahren zur Bestimmung von Kreatinin und eine Vorrichtung und Test-Kits zur Durchführung desselben
Die Erfindung betrifft ein automatisches, kontinuierliches Durchflußverfahren"zur Bestimmung von Kreatinin und eine Vorrichtung und Test-Kits zur Durchführung desselben.
Kreatinin ist ein Stoffwechselprodukt von Kreatinphosphorsäure, eine der Energiequellen für die Muskelkontraktion.
Unter normalen Bedingungen ist es im Blut in Konzentrationen von 0,5-1,5 mg/100 ml anwesend und wird als Endmetabolit im Urin ausgeschieden.
Es ist bekannt, daß die quantitative Bestimmung von Kreatinin im Blut und Urin einen außerordentlich nützlichen diagnostischen Parameter für die Bestimmung der Nierenfunktion darstell· . . ■
. Die Bestimmung von Kreatinin ist von größerer klinischdiagnostischer Bedeutung in der Diagnose von Nierenerkrankungen als die anderer Metabolite, wie z.B. Harnstoff.
Hypercreatininämie indiziert immer einen Nierenschaden, und da es nahezu unabhängig von der Diät ist, erlaubt es eine Aussage über den Verlauf von Erkrankungen, wie z.B. akuter und chronischer Nephritis, Nephrose, ürethrophraxie, Merkurialismus etc., und zwar auch bei Patienten mit speziellen Diäten.
Die niedere Konzentration von Kreatinin im Blut und das Fehlen von hochspezifischen Nachweismethoden hindern noch die korrekte Bestimmung dieses Metaboliten.
Die meisten der beschriebenen Methoden zur Bestimmung von Kreatinin basieren auf der Reaktion des letzteren mit Picrinsäure im alkalischen Medium, d.h. mit Hilfe des Jaffe-Testes [Z. Physiol. Chem. 10, 391 (1886)].
Es ist bekannt, daß die Jaffe-Methode nicht spezifisch ist, da viele Metabolite, die normalerweise in biologischen Flüssigkeiten vorliegen, den Nachweis stören [Clin. Chem. 21, 286D-288D (1975); Clin. Biochem. V\_, 82 (1978); Ann. Clin.
Biochem. 12, 219 (1975)].
Man kennt heute zahlreiche Modifikationen des Jaffe-Testes, aber obwohl diese die Präzision desselben weitgehend erhöhen, modifizieren sie die Spezifität nur zu einem bestimm-30' ten Grad (J. Clin. Chem. Clin Biochem. 1_8, 385 (1980)).
Die Versuche zur Eliminierung von "Jaffe-positiven Chromogenen" haben, aufgrund operativer Schwierigkeiten, bei Routineanalysen keinen Eingang'gefunden.'
35
Die Jaffe-Reaktion nach der Proteinisierung und Absorption . an Bleicherde (Fuller-Erde) [Z. Klin. Chera. und Klin. Biochem. 8; 587 (1970); Clin. Chem. j27, 179 (1981) ], die man gewöhnlich als Vergleichsmethode nimmt, erweist sich für Routineanalysen ebenfalls als wenig praktikabel.
Um eine größere Spezifität in der Bestimmung von Kreatinin zu erzielen, wurden enzyraatische Verfahren untersucht, die auf der Hydrolyse von Kreatinin zu Kreatin mit Hilfe des Enzymes Kreatinin-Amidohydrolase (E.C. 3.5.2.10) und der darauffolgenden Bestimmung des erhaltenen Kreatins beruhen [Scan. J. Clin. Lab. Invest. 2_9, Suppl. 126, 30.1 (1972); Methods of Enzymatic Analysis, Section 4 H.U. Bergmeyer, Ed. Academic Press, New York, N.Y.., 2nd Ed., 19 74, Seiten 1786-1790; Clin. Chem. 21, 1422 (1975); GB-PS T 359 402],
Obwohl diese Methoden eine gute Spezifität besitzen, ist es schwierig, sie in Routinelaborpraxis, insbesondere in automatischen Vorrichtungen durchzuführen [Clin. Cherti. 25, 1665-1666 (1979); J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 633-638 (1979)] .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren für die automatische, kontinuierliche Bestimmung von Kreatinin in biologischen Flüssigkeiten zur Verfügung zu stellen, mit welchem die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden. Insbesondere soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, wonach eine enzymatische Umwandlung von Kreatinin mit Kreatinindesimidase unter Erhalt von Ammoniak und N-Methylhydantoin erfolgt und anschließend der hydrolysierte Ammoniak quantitativ bestimmt wird.
Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren der vorstehend beschriebenen Art gelöst, wobei die Kreatinindesimidase in immobilisierter Form verwendet wird.
Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym ist Kreatinindesimidase (E.C. 3.5.4.21).
Kreatinindesimidase wurde von J. Szulmajster [J. Bacteriol.
75.' 633 O958) und Biochim. and Biophys. Acta 3U)./ 154 (1958)3 in Mikrobenzellen von Clostridium paraputrificum entdeckt und durch Chromatographie isoliert. Im folgenden wiesen H. Thompson [Anal. Chem. 4£, 2, 246 (1974)] und F. Lim [Clin. Chem. 20, 7, 871 (1974)] auf die Verwendung von Kreatinindesimidase für die quantitative Bestimmung von Kreatinin hin, wobei der in der enzymatischen Reaktion gebildete Ammoniak bestimmt wird.
Patentanmeldungen bzw. Patente auf den Namen Kyowa Hakko Kogyo Co., z.B. GB-PS 15 15 805, offenbarten daraufhin nicht nur ein Verfahren für die Herstellung von Kreatinindesimidase aus spezifischen mikrobiellen Quellen, sondern auch ein Verfahren für die quantitative Bestimmung von Kreatin durch Hydrolyse mit Kreatinindesimidase und anschließende Be-Stimmung von gebildetem Ammoniak oder N-Methylhydantoin.
Das Kyowa-Patent, wie auch frühere Arbeiten, gibt keinen Hinweis auf die Möglichkeit, dieses Verfahren für quantitative kontinuierliche Durchflußbestimmungen anzuwenden. Insbesondere wird keine automatische Durchflußmethode beschrieben, welche die vorherige Eliminierung von endogenem Ammoniak, der in biologischen Flüssigkeiten immer vorliegt, und die darauffolgende Bestimmung des lediglich aus Kreatinin freigesetzten Ammoniaks erlaubt.
Es ist bekannt, daß man auf diagnostischem Gebiet automatische kontinuierliche Durchflußverfahren als Massenroutinepraxis durchführt. Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine automatische kontinuierliche Durchflußmethode für die quanti-.
5 tative Bestimmung von Kreatinin mittels Hydrolyse mit Kreatin! desimidase und spezifischer Bestimmung des gebildeten Ammoniak
Die Entwicklung einer automatischen kontinuierlichen Durchflußtechnik für die Bestimmung von Kreatinin in biologischen Fluiden unter Verwendung von Kreatinindesimidase erfördert die Lösung komplexer Probleme, wie z.B. die Notwendigkeit, die Menge an verwendetem Enzym zu begrenzen, Kreatinindesimidase zu verwenden, die frei von anderen NH-,-abhängigen Enzymen ist, wie z.B. Urease, Störungen aufgrund von endogenem Ammoniak, der stets im Serum und Urin vorliegt, zu - eliminieren, und empfindliche, spezifische Systeme zum alleinigen Nachweis des bei der enzymatischen Umwandlung von Kreatinin gebildeten Ammoniaks einzusetzen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von Kreatinin werden alle diese Probleme gelöst.
Die Notwendigkeit, die Menge des verwendeten Enzyms zu limi-• tieren, ist aus wirtschaftlichen Gründen offensichtlich ein sehr wichtiges Problem, besonders bei einer kontinuierlichen Durchflußmethode mehr als bei einer manuellen Methode.
Die Verwendung von Kreatinindesimidase in Lösung in einem Durchflußsystem bringt nicht nur einen hohen Enzymverbrauch mit sich, sondern auch negative Nebeneffekte, wie z.B. eine Zunahme des Kontrollwertes, lange Inkubationszeiten und den Eingang von Fremdsubstanzen proteinischen Ursprungs (z.B. Enzymproteine) in das System, die nicht immer mit dem zum Nachweis von Ammoniak verwendeten Reagens kompatibel sind.
30- Bei der Durchflußmethode gemäß der Erfindung wird Kreatinindesimidase in einer immobilisierten Form verwendet; dies führt zu einer starken Reduzierung des Verbrauchs mit der Möglichkeit, ausreichend Enzym auch aus schlecht produzierenden mikrobiellen Quellen zu erhalten.
·
Die Verwendung von immobilisiertem Enzym macht es nicht nur möglich, proteinisches Material in den Kreislauf einzubringen (z.B. Enzymproteine), sondern garantiert gleichzeitig eine hohe enzymatisch^ Aktivität, die wiederum kurze Inkubationszeiten mit vollständiger Umwandlung des Substrates ohne Störung der Grundlinie oder des Systems zum Nachweis von Ammoniak, der aus dem Kreatinin stammt, erlaubt. Die Immobilisierung von Kreatinindesimidase wird unter Anwendung bekannter Immobilisierungsmethoden erreicht.
Derartige Methoden werden z.B. für andere Enzyme in Biochem. J. J_4_7, 593-603 (1975); GB-Patentschriften 1 470 955 und 1 485 122 beschrieben. Nach einer besonders geeigneten Methode zur Immobilisierung von Kreatinindesimidase erfolgt das Fixieren des Enzyms an Nylonschläuchen bzw. Nylonröhrchen auf die folgende Weise:
a) Alkylierung eines Nylonschlauches bzw. Nylonröhrchens mit Triethyloxoniumtetrafluoroborat;
b) Einführung einer geraden Kette (Spacer), indem man eine
Lösung von Hexamethylendiamin oder alternativ von Ethylendiamin auf das alkylierte Nylon einwirken läßt;
c) Aktivierung des "Nylon-Spacers" mit einem bifunktionellen Reagens, das z.B. Dimethylsuberimidat oder Glutaraldehyd darstellen kann; und
d) Fixierung des Enzyms an das aktivierte Nylon.
Nach einer alternativen Methode setzt man nach der vorstehend unter Punkt b) beschriebenen Behandlung den Nylon-Spacer mit Maleinsäureanhydrid oder Bernsteinsäureanhydrid um.
Der Nylon-Spacer mit terminaler Carboxylgruppe wird dann mit N-Hydroxysuccinamid in Gegenwart von N-N-Dicyclohexylcarbodiimid behandelt und schließlich wird das Enzym in einem auf neutralem pH-Wert gepufferten Medium, z.B. Phosphatpuffer, an.das so aktivierte carboxylische Nylon gebunden.
. Die vorstehend beschriebenen Immobilisierungstechniken machen es möglich, gleichzeitig eine große Enzymmenge an das Nylon zu binden, eine besonders gereinigte Form des Enzyms zu erhalten, die insbesondere frei ist von Ureasen und/oder anderen NH^-abhängigen Enzymen. Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierte Enzym ist stabil, in wässrigen und physiologischen Proben aktiv und im kontinuierlichen Fluß bzw. Durchfluß funktionsfähig.
Oxe nachfolgenden Tabellen I und II geben die Stabilitätsdaten von Kreatinindesimidase, die nach den vorstehend beschriebenen Methoden immobilisiert wurde, wieder. Tabelle III weist die Daten in bezug auf die Funktionsfähigkeit des immobilisierten Enzyms auf.
Tabelle I
Stabilität bei 40C von Kreatinindesimidase, die an Nylonröhrchen bzw. Nylonschläuchen immobilisiert wurde
Das Enzym Kreatinindesimidase wurde an Nylonschläuchen bzw. Nylonröhrchen von 1 mm Innendurchmesser immobilisiert und die Stabilität derselben bei einer Temperatur von 40C in einer 100 mM Phosphatpufferlösung, pH 7, bestimmt. Die Aktivitätswerte des immobilisierten Enzyms sind ausgedrückt in U/m/min und in den Blindproben als % im Vergleich zur ursprünglichen Aktivität (0 Zeit) Bezug genommen. Immobilisierung A = Nylon, aktiviert mit Dimethylsuberimidat Immobilisierung B = Nylon, aktiviert mit Glutaraldehyd Immobilisierung C = Nylon, aktiviert mit N-Hydroxysuccinimid
' '
Stabilität
i		 0 Immobilisierung A 4°C % Immobilisierung B % Immobilisie %
Monate 1 100 100 rung C 100
2 100 4 0C 96 4 0C 97
4 U/m/min 98 U/m/min 100 U/m/min 101
6 9,9 100 9,7 100 9,2 105
12 9,9 100 9,3 96 8,9 102
18 9,7 100 9,7 97 9,3 103
9*9 97 9,7 92 9,7 93
9,9 9,3 9,4
9,9 9,4 9,5
9,6 8,9 8,6
Tabelle II
Stabilität bei 350C von Kreatinindesimidase, die an Röhrchen immobilisiert wurde.
Das Enzym Kreatinindesimidase wird an Nylonröhrchen mit 1 mm Innendurchmesser immobilisiert und dessen Stabilität bei einer Temperatur von 35°C in 100 mM Phosphatpufferlösung, pH 7, bestimmt. Die Aktivitätswerte des immobilisierten Enzyms werden ausgedrückt in U/m/min und in den Blindproben als % im Vergleich zur ursprünglichen Aktivität (0 Zeit) Be zug g.enommen.
Immobilisierung A = Nylon, aktiviert mit Dimethylsuberimidat Immobilisierung B = Nylon, aktiviert mit Glutaraldehyd Immobilisierung C = Nylon, aktiviert mit N-Hydroxysuccinimid.
Stabilität Immobilisierung A C % Sttnobilisierung B C % Immobilisierung C %
Monate 35° 100 35° 100 350C 100
U/m/min 96 U/m/min 85 U/m/rain 97
0 8,6 83 9,6 82 8,9 92
1 8,3 87 8,2 74 8,7 88
2 7,1 73 7,9 60 8,2 64
4 7,5 7,1 7,9
6 6,3 5,8 5,7
Tabelle III Funktionsfähigkeit von immobilisierter Kreatinindesimidase im kontinuierlichen Durchfluß
Kreatinindesimidase, immobilisiert an Nylonschläuchen bzw. -röhrchen von 1 mm Innendurchmesser und 1 m Länge, wurde für die Routineanalyse von Kreatinin in Serum, Plasma und Urin in einem Durchflußsystem des nachfolgend in Fig. 3 dargestellten Typs verwendet.
Die Restaktivität {residual activity) wird in Intervallen von 5000, 10.000 und 20.000 Analysen kontrolliert und ausgedrückt in % des ursprünglichen Wertes U/m/min.
Immobilisierung A = Nylon, aktiviert mit Dimethylsuberimidat Immobilisierung B = Nylon, aktiviert mit Glutaraldehyd Immobilisierung C = Nylon, aktiviert mit N-Hydroxysuccinimid,
Immobili Anfangsaktivität % Aktivität bei % Aktivität bei % Aktivität bei ; %
sierung 100 5000 Analysen 91 10.000 Analysen 90 20.000 Analysen 74
U/m/min 100 ü/m/min 87 U/m/min 88 U/m/min 71
A 9 100 8,2 89 8,1 84 6,6 75
B 8,6 . 7,5 7,6 • 6,1
C 8,3 7,4 7 6,2
Die zur enzymatischen Spaltung von Kreatinin gemäß der Erfindung verwendete Kreatinindesimidase kann nach bekannten Methoden aus verschiedenen Mikrobenquellen erhalten werden, z.B. kann sie das Enzym darstellen, welches in den vorstehenden Literaturstellen genannt wird: Biochimica et Biophysica Acta 3JD» 154 (1958) und Analytical Chemistry, 46, 2, 246 (1974) .
Das Problem der Eliminierung der Störungen aufgrund von endogenem Ammoniak, der im Serum und Harn stets anwesend ist, ist bei der Analyse von Kreatinin, die auf einer Bestimmung des gebildeten Ammoniaks beim katalytischen Prozeß mit Kreatinindesimidase beruht, von fundamentaler Bedeutung.
Das Problem ist verhältnismäßig einfacher Art, wenn man eine manuelle Methode anwendet; es kann durch eine differentielle Bestimmungsmethode gelöst werden, die man mit der gleichen Probe vor und nach der Inkubation mit Kreatinindesimidase durchführt. Bei einer kontinuierlichen Durchflußmethode ist zwar eine differentielle Bestimmungsmethode möglich, sie stellt jedoch ein sehr viel komplizierteres Problem dar, besonders in den Fällen, in denen der Kontrollwert im Vergleich zur Probe hoch ist, wie im Falle der Bestimmung von Kreatinin.
Außerdem wäre bei einer kontinuierlichen Durchflußmethode mit Dialyse, wie es gemäß der Erfindung vorgeschlagen wird,
. die Beeinflussung von endogenem Ammoniak auf das Gesamtergebnis aufgrund der hohen Dialysefähigkeit des Ammoniumions im Vergleich zu Kreatinin noch größer.
Das Verfahren gemäß der Erfindung erlaubt es, endogenen Ammoniak zu eliminieren und den Katalyseprozeß zwischen immobilisierter Kreatinindesimidase und Kreatinin zum Zwekke der eindeutigen Quantifizierung von nur dem bei der enzyma1 tischen Reaktion produzierten Ammoniak vorzubereiten (predispose).
Gemäß der Erfindung erfolgt die quantitative Bestimmung von Kreatinin im Serum und Urin mit Hilfe einer kontinuierlichen Durchflußmethode in den folgenden Schritten: 15
a) Eliminierung von endogenem Ammoniak in der Probe durch Inkubation mit einem geeigneten Reagens zur Predialyse;
b) kontinuierliche Dialyse;
c) Reaktion von Kreatinin mit immobilisierter Kreatinindesimidase in einer.Akzeptorlinie unter Erhalt von Ammoniak und N-Methylhydantoin; und
d) Bestimmung des gebildeten Ammoniaks unter Verwendung eines geeigneten Nachweissystems.
Das verwendete Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak in der Donorlinie muß spezifisch sein und darf nicht die Bestimmung von Ammoniak, der aus dem Kreatinin in der Akzeptorlinie gebildet wird, stören. Dieses Reagens kann z.B. ein NADH/GLDH-Reagens darstellen, das auf endogenen Ammoniak gemäß folgender Gleichung einwirkt:
NH3 (endogen) + a-Ketoglutarat + NÄDH —^ NAD+ + Glutamat + H3O oder ein Reagens, welches auf Aspartase [E.C. 4.3.1.1] beruht, die mit endogenem Ammoniak nach folgender Gleichung reagiert:
NH3(endogen) + Fumarat Aspartat.
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Die Dialyse erlaubt es, das Protein und korpuskulare Teilchen der Probe zu eliminieren, was eine genaue Analyse von Kreatinin erlaubt, auch im Serum mit hohem Lipid oder Gelbkörperchengehalt.(icteric content).
Das Kreatinin wird in der Dialyse im wesentlichen von endogenem Ammoniak befreit und trifft stromabwärts,nach der Dialyse auf immobilisierte Kreatinindesimidase, die dessen Hydrolyse zu Ammoniak und N-Methylhydantoin katalysiert.
Der Nachweis von freiem Ammoniak erfolgt vorzugsweise mit Hilfe der Reaktion mit einem Berthelot-Reagens, einem chemischen Reagens auf der Basis von Phenol oder Natriumhypochlorit, oder alternativ einem NADH/GLDH/a-Ketoglutarat-Reagens, das qualitativ mit dem vergleichbar ist, das für die Zerstörung von endogenem Ammoniak verwendet wird.
Das Fumarat/Aspartase-System, das zur Eliminierung von endogenem Ammoniak verwendet wird, kann entweder mit dem Nachweissystem vom Typ. Berthelot [Clin. Chem. Band 8, 130-132 (1962)] oder mit einem NADH/GLDH-System gekoppelt werden.
Im Gegensatz dazu stellt die Verwendung von NADH/GLDH/a-Ketoglutarat-Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak eine Störungsquelle mit dem Ammoniaknachweissystem dar, welches stromabwärts der Analyse wirkt, wenn das genannte System aus dem gleichen NADH-abhängigen Reagens besteht.
30. Um die vorstehend genannte Kopplung möglich zu machen, ist es absolut notwendig zu vermeiden, daß das restliche NADH des Reagens, welches in der Donorlinie.verwendet wird und den endogenen Ammoniak eliminiert hat, in die Empfängerlinie (recipient line) übergeht, wobei es in ungewöhnlicher Weise den NADH-Gehalt des Ammoniaknachweissystems verändert.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dies bewerkstelligt werden, indem man den pH-Wert des Mediums auf einen Wert von 2 bringt, so daß das restliche NADH nach der Eliminierung von endogenem Ammoniak und vor dessen Eingang in die' Dialyse, vollständig aufgrund seiner Instabilität in saurem Medium eliminiert wird.
Nach einer bevorzugten Aüsfüh'rungsform wird das Medium mit Phosphorsäure angesäuert und vor Eingang in die Dialyse auf einen pH-Wert von ca. 7,5 gebracht, z.B. durch Zugabe einer Tris-Hydroxymethylaminomethan-Lösung.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das NADH/GLDH-Reagens zur EIiminierung von endogenem Ammoniak gekoppelt mit der·.Verwendung des Berthelot-Reagens zum Nachweis von dem aus Kreatinin • stammenden Ammoniak.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist gemäß der 20
Erfindung die Verwendung von Asparatase/Pumarat-Reagens zur Eliminierung des endogenen Ammoniaks vor' der Dialyse vorgesehen, gekoppelt mit der Verwendung von NADH/GLDH-Reagens zum Nachweis von dem aus dem Kreatinin gebildeten
Ammoniak.
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Die Umwandlung von Kreatinin in Ammoniak und N-Methylhydantoin wird stets mit. Hilfe von immobilisierter Kreatinindesimidase erreicht. Wie bereits ausgeführt, erfolgt die Immobilisierung auf Röhrchen bzw. Schläuchen, insbesondere auf Nylonröhr-.? chen oder Schläuchen nach einem der vorstehend beschriebenen Systeme.
Die verwendeten Nylonröhrchen bzw. Schläuche können einen Innendurchmesser von ca. 0,8 bis 1,6 mm, vorzugsweise von 1 bis 1,2 mm aufweisen. Die Länge des Röhrchen oder des Schlauches variiert etwa von 0,5 bis 1 m, vorzugsweise be-
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trägt sie ca. 1 m. Die Aktivität des gebundenen Enzyms sollte vorzugsweise nicht weniger als 4-6 U/m/min betragen, um eine nahezu I00%ige Umwandlung in einer linearen Reaktion bis zu 15 mg/100 ml Kreatinin zu gewährleisten.
1000 Analysen von Kreatinin in Serum und Urin können mit einem einzigen Röhrchen bzw. Schlauch von immobilisierter Kreatinindesimidase durchgeführt werden. Eine gute Funktionsfähigkeit der immobilisierten Kreatinindesimidase sowie deren gute Stabilität in Abhängigkeit von der Zeit werden ebenfalls durch die Verwendung von Puffern garantiert, die geeignete pH-Werte und eine geeignete Ionenstärke ermöglichen.
Zu diesem Zweck wird der Akzeptorfluß vorzugsweise auf pH 7 bis 8, besonders bevorzugt auf pH 7,5 mit Phosphatpuffer gepuffert, vorzugsweise 50 mM Phosphatpuffer. Außerdem ist es bevorzugt, eine Pufferung bei pH 7,8 mit Trispuffer, z.B. 50 mM Tris/HCl-Puffer, vorzunehmen. Der Donorfluß wird vorzugsweise mit 200 mM Phosphat, pH 7,5, gepuffert oder mit 200 mM Tris-Puffer, pH 7,8. Phosphatpuffer wird in Verbindung mit einem chromogenen System vom Berthelot-Typ verwendet; Tris/HCl-Puffer wird mit einem System vom Typ NADH/GLDH .verwendet.
Das automatische Durchflußverfahren gemäß der Erfindung ist ein Ergebnis detaillierter Untersuchungen verschiedener Durchflußsysteme, wobei als Ziel immer angestrebt wurde, den endogenen Ammoniak vor der Dialyse so weit wie möglich zu eliminieren oder zu reduzieren, eine Umwandlung von Kreatinin nach
3Ό der Dialyse mit immobilisierter Kreatinindesimidase durchzuführen, und den gebildeten Ammoniak mit einem spezifischen Agens, welches mit dem restlichen System kompatibel ist, der.gebildete Ammoniak nachzuweisen. . Es wurde z.B. mit Einkanalsystemen vom Typ, wie er in Fig. 1. illustriert ist, experimentiert, wobei die Probe X mit dem Reagens R, bestehend
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aus NADH/GLDH/a-Glutarat,,..gemischt und in das System, welches ' mit Luftblasen A fraktioniert ist, gepumpt.
Der Fluß gelangt in das Bad B, wo der endogene Ammoniak zusammen mit sämtlichen anderen Substanzen, welche die NADH-Reaktion stören, eliminiert wird.
Nach Inkubation wird der Fluß durch Zugabe von P angesäuert, z.B. durch Zugabe von verdünnter Phosphorsäure, und zwar links auf pH ^ 2 für den gesamten S-Trakt/ und dann auf
pH <** 7 durch Einführen des Systems von T zurückgebracht, z.B. . mit Trihydroxymethylaminomethan.
Nach dieser Behandlung gelangt der Fluß durch die Schlange S- in den Dialysator D. Der nicht-dialysierte Anteil gelangt
in die Abfallableitung O, während der dialysierte Anteil, wel-'eher das Kreatinin enthält, das nun frei von Störungen ist, in den Akzeptorkanal gelangt. Der Fluß des Akzeptorkanals, welcher das Nachweisreagens F für Ammoniak (NADH/GLDH/ α-Ketoglutarat), fraktioniert durch Luftblasen A, enthält, gelangt von der Dia'lyse stromabwärts und wird in den Reaktor (Nylonrohr bzw. Nylonschlauch} mit immobilierter Kreatinin-.desimidase E eingeführt.
Das anwesende Kreatinin gibt Ammoniak ab, welcher mit dem Rea- -gensFin der Entwicklungsschlange Z reagiert, NADH to NAD oxidiert. Eine Ablesung im Kolorimeter C, z.B. bei 340 nm, macht es möglich, die Kreatininkonzentration zu bestimmen und diese auf dem Recorder V aufzuzeichnen. Bei den Einkanal-' systemen, wie z.B. dem in Fig. 1, ist die totale Eliminierung von endogenem Ammoniak und allen anderen Substanzen, die mit dem NADH-System interferieren, mit Hilfe der Dialyse eine notwendige Bedingung, um den Probenwert gegen den Blindwert " bei einer konstanten Grundlinie ablesen zu . können.
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Diese absolut unverzichtbaren Bedingungen erfordern immer die perfekte Effizienz der Reagentien und können die Anwendbarkeit des Verfahrens, insbesondere bei der Krankenhausroutine, limitieren.
Außer den Einkanalsystemen vom Typ, wie z.B. in Fig. 1 angegeben, wurden auch Zweikanalsysteme eingesetzt, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Diese sehen die Eliminierung von endogenem Ammoniak vor, gekoppelt mit einer Ablesung des Ammoniaks, welcher aus dem Kreatinin stammt, in differentieller Phase, wobei der Wert der Blindprobe automatisch von dem der Probe abgezogen wird.
Die Ablesung wird auf diese Weise sicherer und der Zwang der kompletten Eliminierung von endogenem Ammoniak, um eine konstante Blindprobe, welcher der Grundlinie entspricht, zu haben, ist nicht mehr gegeben. Gleichzeitig macht es der Eliminierungsprozeß von endogenem Ammoniak möglich, in jedem Fall niedere Blindproben zu haben oder unter Bedingungen zu arbeiten, die für eine mit Differentialablesung erfolgende Analyse optimal sind.
Fig. 2 stellt ein Zweikanalsystem dar, das zur Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden kann; in dieser Figur wird die Probe X mit dem Reagens R vermischt, wobei das Reagens NADH/GLDH/a-Ketoglutarat oder Aspartase/ Fumarat sein kann, und in das System gepumpt, und mit Luftblasen A fraktioniert. Der Fluß gelangt in das Bad B zur Eliminierung von endogenem Ammoniak.
Die Probe, die frei von endogenem Ammoniak ist, wird mit Hilfe von Recyclisierungsrohren C und C., welche vom Entgaser T {debubbler) wegführen, in den Fluß stromaufwärts von der Dialyse relativ zum Dialysator D des Probenkanals und Dialysator D^ des Blindprobenkanals gepumpt. Die Ströme
stromaufwärts (upstream) von der Dialyse werden dann über die Auslässe S und S^ ausgetragen. Die Ströme stromabwärts (downstream) von der Dialyse T und T., unterbrochen durch Luftblasen A, gelangen in den Reaktor N (Nylonrohr oder Nylonschlauch mit immobilisierter Kreatinindesimidase) und in den Blindwertreaktor N1 (Blindwert-Vergleichsrohr).
Der aus dem Kreatinin in N freigegebene Ammoniak wird mit Hilfe eines Reagens auf der Basis von Phenol F oder Natriumhypochlorit I nachgewiesen.
Gleichzeitig wird der Wert der Blindprobe in der Vergleichssäule aufgezeigt, wobei die gleichen Reagentien durch F- und I- gepumpt werden.
Nach Inkubation auf Z und Z- gelangen die Ströme in das Differential-Ablese-Kolorimeter L und der Wert für Kreatinin wird z.B. bei 650 nm abgelesen und auf dem Recorder V aufgezeichnet.
Nach einer besondes bevorzugten Ausführungsform sieht das kontinuierliche Durchflußsystem für das automatische Analyseverfahren gemäß der Erfindung die Verwendung eines spezifischen Zweikanalsystems vor, welches die Eliminierung von endogenem Ammoniak und die Ausführung der Dialyse auf eindeutige Weise mit Trennung in Probenkanal und Blindwert-. kanal unmittelbar vor dem katalysatischen Prozeß mit immobilisierter Kreatinindesimidase erlaubt.
' Die wesentlichsten Punkte dieses Systems sind:
a) Die größere Einfachheit des Rohrsystems verglichen mit
. . · dem konventionellen Zwei-Dialysator-Zwei-Kanal-Systemen;
b) die Möglichkeit eine ausreichende Empfindlichkeit zu ■ erzielen, auch bei Verwendung eines kleinen Probevolumens, mit guter Genauigkeit und Präzisionswerten;
• ·
- 28 -
σ) die Verwendung eines einzigen Dialysators für die zwei Kanäle;
d) das Recyclisierungssystem mit dem Entgaser (debubbler), welches die Verteilung des Dialysats selbst in sowohl dem Probenkanal und dem Blindwertkanal gleichzeitig und mit gleichem Volumen erlaubt;
e) die Verwendung von immobilisierter Kreatinindesimidase, die, wenn sie geeigneterweise nur im Probenkanal plaziert wird, die Differentialablesung der Blindprobe ermöglicht; und
f) die Leichtigkeit der Phasenbildung (phasing), welche nur den letzten Teil des Systems betrifft.
Zweikanal-Durchflußsysteme mit einem einigen Dialysator, welche die vorstehend beschriebenen Charakteristiken aufweisen, sind z.B. in Fig. 3 und 4 aufgeführt.
Bei dem in Fig. 3 angegebenen System wird die Probe X mit dem Reagens R gemischt und in das System gepumpt, fraktioniert durch Luftblasen A.
Der Fluß kommt in das Bad W zur Eliminierung von endogenem Ammoniak. Nach Inkubation gelangt der Fluß in die Vordialysezone des Dialysators D und wird durch den Auslaß S eliminiert, 25
Die dialysierte Lösung gelangt in den Flußakzeptor F und wird, fraktioniert mit Luftblasen A, durch Rohr d zum Entgaser T geleitet.
30' Ein Teil des Flusses wird in dem System vom Zweiwegentgaser mit Hilfe der Rohre G und G- recyclisiert und gelangt jeweils,, fraktioniert mit Luftblasen A, in die Reaktoren C (Schlauch bzw. Rohr mit immobilisierter Kreatinindesimidase) und B (Blindwert-Vergleichsrohr). Der in C aus dem Kreatinin freigesetzte Ammoniak wird mit einem Reagens auf der Basis von Phenol L und Natriumhypochlorit M nachgewiesen.
- 29 -
■ Der Wert der Blindprobe wird gleichzeitig im Referenzkanal mit den gleichen Reagentien, die von L.. und M1 gepumpt werden, aufgezeigt.
Nach Inkubation in Z und Z^ gelangen die Ströme in das Differential-Ablese-Kolorimeter und der Wert von Kreatinin wird abgelesen, z.B. bei -650 niri/ und auf dem Recorder V aufgezeichnet.
Wenn das Aspartase/Fumarat-Reagens zur Zerstörung von endogenem Ammoniak gekoppelt ist mit der Verwendung von GLDH/ NADH/a-Ketoglutarat-Reagens zum Nachweis von Ammoniak, welcher aus dem Kreatinin freigesetzt wird, so findet das Durchflußsystem gemäß Fig. 4 Anwendung.
. ·
In diesem System wird (der Strom von) Probe X mit dem Reagens R (Aspartase/Fumarat) gemischt und in das System, fraktioniert mit Luftblasen A, gepumpt. Der Strom gelangt in das Bad W zur Eliminierung von endogenem Ammoniak und kommt dann -, nach Inkubation, in den Dialysator D, wo er über den Auslaß S ausgetragen wird.
Das Dialysat gelangt in den Akzeptorfluß/ welcher, fraktioniert mit Luftblasen A, zur Dialyse gelangt. 25
Der Akzeptorfluß F, welcher das NADH/GLDH/a-Ketoglutarat-Reagens enthält, wird über das Rohr bzw. den Schlauch d zum Entgaser T geleitet.
Ein Teil des Stromes wird in das System aus dem Zweiwege-Ent-.gaser mit Hilfe der Leitungen G und G^ recyclisiert und gelangt, fraktioniert durch Luftblasen A, jeweils in die Reaktoren C (Schlauch bzw. Rohr, welcher die immobilisierte Kreatiriindesimidase enthält) und B (Blindproben-Vergleichsrohr). In C wird aus Kreatinin Ammoniak freigesetzt.und reagiert in Z mit NADH. ".
- 30 -
■ Im Vergleichskanal, genauer gesagt in B und Z^, wird die Blindprobe entwickelt und durch Differentialablesung z.B. bei 340 nm im Vergleich zu der jeweiligen Probe unter Verwendung des Kolorimeters U abgelesen und das Ergebnis mit dem Recorder V aufgezeichnet.
Neben der kontinuierlichen enzymatischen Durchflußmethode zur Bestimmung von Kreatinin gemäß der Erfindung, wie dies vorstehend beschrieben wird, umfaßt die Erfindung auch eine Reihe von Materialien und Reagentien zur Durchführung dieses Verfahrens. · ·
Diese Reihe von Materialien und Reagentien umfaßt: a) ein Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak in einem geeigneter Puffer;
_ b) ein Reagens für den Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin; c) immobilisierte Kreatinindesimidase.
Das Reagens zur Eliminierung von Ammoniak kann aus der Gruppe NADH/GLDH-Reagentien und Aspartase/Pumarat-Reagentien, wie sie im vorherigen in der Beschreibung genannt werden, in einem geeigneten neutral-basischen Puffer gewählt werden.
Das Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin kann ein Reagens nach Berthelot oder ein NADH/GLDH-Reagens, wie sie im vorangehenden genannt werden, darstellen.
Die immobilisierte Kreatinindesimidase stellt eine Kreatinindesimidase dar, die an einem Rohr bzw. Schlauch immobilisiert ist, vorzugsweise einem Nylonrohr bzw. -schlauch, wobei die vorstehend beschriebenen Methoden angewandt werden.
Wenn das. Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak in der Reihe der Reagentien gemäß der Erfindung ein NADH/ 5 GLDH-Reagens darstellt, so enthält die Lösung des verwendeten Reagens vorzugsweise:
Phosphatpuffer 200 mM bei pH 7,3-7,8, vorzugsweise 7,5; α-Ketoglutarat 8-1:2 mM, vorzugsweise 10 mM;
NADH . 0,6-1 mM, vorzugsweise 0,8 mM;
GLDH 40-50 U/ml, vorzugsweise 45 U/ml.
, . ■
Wenn das Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak ein Aspartase/Fumarat-Reagens darstellt, so enthält die Lösung des verwendeten Reagens vorzugsweise:
Phosphatpuffer 200 mM bei Ph 7,8-82, vorzugsweise 8; . Aspartase . 18-22 U/ml, vorzugsweise 20 U/ml; Fumarat . 40-60 mM, vorzugsweise 50 mM.
Wenn das Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin ein Reagens gemäß Berthelot darstellt, so enthält die Lösung des verwendeten Reagens vorzugsweise:
Phenol 80-120 mM, .vorzugsweise 100 mM;
Natriumnitroprussid 1,2-1,6 mM, vorzugsweise 1,4 mM; Natriumhypöchlorit 13-17 mM, vorzugsweise 15 mM; Natriumhydroxid 0,15-0,19 mM, vorzugsweise 0,17 mM.
Wenn das Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin ein NADH/GLDH-Reagens darstellt, so enthält die Lösung des verwendeten Reagens vorzugsweise:
Phosphatpuffer 50 mM, bei pH 7,3-7,8, vorzugsweise 7,5
a-Ketoglutarat 6-10 mM, vorzugsweise 8 mM;
NADH 0,05-0,1 mM, vorzugsweise 0,075 mM;
GLDH 10-20 U/ml, vorzugsweise 15 U/ml.
In der Reihe von Reagentien gemäß der Erfindung besitzt die immobilisierte Kreatinindesimidase vorzugsweise eine Aktivität von ca. 6 bis 10 U/m/min, besonders bevorzugt von 8 U/m/min, und wird bevorzugt an Nylonschläuchen bzw. -rohren von 0,5 bis 1 m Länge, vorzugsweise 0,7 bis 0,8 m, und einem Innendurchmesser von ca, 0,8 bis 1,2 mm, vorzugsweise 1 mm immobilisiert, . ·
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reihe von Materialien bzw, das Test-Kit gemäß der Erfindung ein ' NADH/GLDH-Reagens als Reagens für die Eliminierung von endogenem Ammoniak, gekoppelt mit einem Reagens nach Berthelot zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin, oder alternativ ein Aspartase/Fumarat-Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak, gekoppelt mit einem NADH/GLDH-Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin, wobei die verschiedenen Reagentien {NADH/GLDH, Berthelot, Aspartase/ Fumarat) und die immobilisierte Kreatinindesimidase vorzugsweise eine Zusammensetzung und Charakteristiken aufweisen, wie dies als vorteilhaft im vorangehenden angegeben wird.
Die Abkürzungen NADH, NAD und GLDH bedeuten jeweils Nicotinamid-adenindinucleotid in reduzierter Form, Nicotinamidadenindinucleotid in oxidierter Form und Glutamatdehydrogenase; die Bezeichnungen a-Ketoglutarat, Glutamat, Fumarat und Aspartat bedeuten die entsprechenden Salze, vorzugsweise alkalische Salze von Natrium und insbesondere Kalium mit jeweils cc-Ketoglutarsäure, Glutaminsäure, Fumarsäure und Asparaginsäure; die Abkürzungen EDTA und Tris bedeuten jeweils das Dinatriumsalz von Ethylendiamintetraessigsäure .und Trihydroxymethylaminomethan.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese zu beschränken. ' ■ 35
Beispiel 1
Kreatinin wird bestimmt in Seren untei? Verwendung des Durchflußsystems gemäß Fig. 1 mit immobilisierter Kreatinindesimidase und unter Anwendung der Methode von Jaffe (gemäß dem Verfahren, wie dies von H. Bartels et al. in Clin. Chim. Acta 32., 193 (1972)) beschrieben wurde, gleichzeitig mit der Mercotest ® 3385-Methode. .
60 Seren wurden gegen wässrige Standardlösungen von Kreatinin 2 mg/dl unter Verwendung eines Technicon AutoanaIyζers II ® von Technicon Instruments Co., Tarrytown, N.Y. bestimmt:
Die Proben X = 0,23 ml/min werden mit einer Geschwindigkeit von 60 Analysen/h analysiert;
das Reagens R = 0,60 ml/min stellt eine Lösung aus 200 mM Tris/HCl-Puffer von pH 7,8 dar, welcher 0,6 mM NADH, GLDH 40 U/ml, 10 mM Kalium-a-ketoglutarat enthält, und die Luft A = 0,23 ml/min. -
B = 5 ml, stellt das Inkubationsbad bei 37°C dar. P= 0,23 ml/min und T = 0,23 ml/min, es werden jeweils 2,5 % w/v Phosphorsäure und 10 % w/v Tris-hydroxymethylaminoiue than gepumpt, wobei S und S1 = 1,5 ml.
D = 0/601..m{24 inches), stellt den Dialysator dar.
Der Akzeptorfluß F = 1,2 ml/min, stellt eine Lösung aus 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,8 dar, welcher 0,05 mM NADH, GLDH 20 U/ml, 8 mM Kalium-a-ketoglutarat enthält, und die Luft A=O,23 ml/min.
E = Vm, stellt einen Nylonschlauch bzw. ein Nylonrohr mit · Kreatinindesimidase mit 8 U/m/min dar.
Z = 5 ml, bedeutet die Inkubationsschlange bei Raumtemperatur.
C ist das Kolorimeter, welches bei 340 nm mit einer. Zelle von 1,5. cm optischem Lichtweg in einem Linearitätsgebiet .1 bis 12 mg/dl Kreatinin mißt.
Die mit dem erfindungsgem^ßen Verfahren (Y) erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen gemäß der Jaffe-Vergleichsmethode (X) verglichen,
Die erhaltenen Korrelationsdaten sind folgende:
Regression y = 0,946x + 0,065
Korrelationskoeffizient "r = 0,994
Beispiel 2 ' '
60 Seren, 60 Plasmaproben mit EDTA-Antikoagulans, 60 Plasmaproben mit Heparinantikoagulans und 60 Urinproben (verdünnt 1:100 mit Wasser) wurden gegen wässrige Standardlösungen von Kreatinin bei einer Konzentration von 2 mg/dl unter Ver-Wendung eines Technicon Autoanalyzers II ® und dem Durchflußsystem gemäß Fig. 3 einer Bestimmung unterworfen: Die Proben X = 0,23 ml/min, wurden mit einer Geschwindigkeit von 60 Analysen/h analysiert; Reagens R = 0,4 2 ml/min stellt eine Lösung aus 200 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, dar, welche 0,8 mM NADH, GLDH 40 U/ml, 10 mM Kalium-a-ketoglutarat enthält, mit Luft A = "0,23 ml/min.
W = 5 ml, stellt das Inkubationsbad bei 37°C dar. Der Akzeptorfluß F = 1 ml/min, bedeutet eine 50 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,5.
Die Recyclisierungslextungen G und G1 = 0,4 2 ml/min und C = 1 m, stellt einen Nylonschlauch bzw. ein Nylonrohr dar, welches Kreatinindesimidase von 6 U/m/min enthält. Das Reagens Phenol L/L- wird in das System mit einer Geschwindigkeit von 0,42 ml/min eingeführt und das
30' Natriumhypochlorit' M/M1 mit einer Geschwindigkeit von 0,42 ml/min. Nach Inkubation in Z und Z. = 6 ml werden die Lösungen mit einem Zweikanal-Kolorimeter bei 6 50 nm abgelesen. ■ .
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens (Y) erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen der Vergleichsmethode (X) (Jaffe's kinetische Methode, wie sie im Beispiel 1 angewendet wurde) verglichen.
Die erhaltenen Korrelationsdaten sind folgende:
für-die Seren: Regression: y = 1,045x - 0,132;
Korrelationskoeffizient: r - 0,998;
für das Plasma: EDTA: Regression: y = 1,012x - 0,137;
Korrelationskoeffizient: r = 0,998;
für heparinisiertes Plasma:
Regression y = 1,032x - 0,164;
Korrelationskoeffizient: r = 0,995;
für Urin: Regression: y = 0,997x - 0,137
Korrelationskoeffizient: r = 0,996.
Beispiel 3
60 Seren wurden wie im Beispiel 2 analysiert, wobei jedoch als Reagens eine Lösung von Kaliumfumarat 50 mM und Aspartase 20 U/ml in 200 mM Phosphatpuffer, pH 8, verwendet wurde.
Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen nach der Referenzmethode (X) (Jaffe's kinetische Methode gemäß BeispielM) verglichen. Die erhaltenen Korrelationsdaten sind folgende:
Regression: y = 1,032x - 0,159
Korrelationskoeffizient: r = 0,979.
Beispiel 4
Unter Verwendung des Technicon Autoanalyzers II® und des in Fig. 3 aufgezeigten Durchflußsystems wurde eine Serie von Standardseren mit unterschiedlichen Keatininkonzentra-30. tionen analysiert.
Die nachfolgende Tabelle IV zeigt die Handelsnamen der Seren, dessen Chargennummer und die Kreatininwerte auf, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wurden, den Mittelwert, wie er von den Herstellern angegeben wird, und der nach dem Jaffe-Verfahren bestimmt wurde. ' .
Tabelle IV
Serum Charge Kreatinin in mg/dl theoretisch
Pathonorm L 16 gefunden 1,40
Pathonorm H 16 1,26 7,80
Seronorm 142'· .7,60 1,52
Monitrol I 147 1,41 1,40
Precilip 09367 1,36 1,24
Precinorm U 08543 1,33 1,81
Precipath. ü 09510 1,65 3,56
Ortho Norm. 7T025 3,28 1,05
Ortho Abn. 7T113 0,93 9,05
8,70
Beispiel 5 ·
Serienweise Mengen an Kreatininstandard wurden 2u Humanserum'mit einem Kreatiningehalt von 1 mg/dl zugegeben. Die verschiedenen Fraktionen wurden mit einem Technicon Autoanalyzer II® unter Verwendung des Durchflußsystems gemäß Fig. 3 analysiert. Die ermittelten Kreatininwerte sind in Tabelle V aufgeführt und werden in Prozenten des theoretisch berechneten Wertes ausgedrückt.
Tabelle V
Serum: zugegebenes theoretisches gefundenes Prozentsatz der
Kreatinin Kreatinin Kreatinin Kreatinin ermittelten Menge
05 (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl)
1 0 •1- ■■ 1 100
1 1 2 2,03 101
1 2 3 3,07 102
10 1 4 5 5,10 101
1 6 7 7,10 102
1 8 9 9,14 102
Beispiel 6
1 ml Humanserum mit einem Kreatiningehalt von 1,33 mg/dl wurde mit serienweisen Mengen von 0,5 bis 2 ml eines zweiten Humanserums mit einem Kreatiningehalt von 7,86 mg/dl behandelt.
Die verschiedenen Fraktionen wurden mit einem Technicon Autoanalyzer ® unter Verwendung des Durchflußsystems gemäß Fig. analysiert.
Die erhaltenen Kreatininwerte sind in der Tabelle Vl zusammengestellt, ausgedrückt als Prozentsatz der ermittelten Menge in bezug auf den berechneten theoretischen Wert.
- 38 Tabelle VI
Serum
7,86 mg/dl		 Kreatininwerte gefunden
mg/dl		 % ermittelt
(Ausbeute)
Serum
1.33 mg/dl		 + 0,5 ml
+ 1 ml
+ 2 ml		 theoretisch
mg/dl		 3,61
4,77
5,85		 103
104
103
1 ml
1 ml
1 ml		 3,50
4,59
5,68
Beispiel 7
Drei Humanseren mit verschiedenen Kreatininkonzentrationen wurden für 20 ·) Replikationen mit einem Technicon Autoanalyzer II® unter Verwendung des Durchflußsystems gemäß Fig. 3 analysiert.
Die folgende Tabelle VII gibt die Werte als Mittelwerte und den Variationskoeffizienten wieder.
Tabelle VII
Konzentration von
Kreatinin		 Mittelwert
mg/dl		 Variations
koeffizient (CV.)
niedrig
mittel
hoch		 1,3
2,4
7,1		 1 ,98
1,10 ·
0,79
Leerseite

Claims (1)

  1. HOFFMANN · EITLE <& PARTNER
    PAT E N TAN W ALTE
    DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPL.-ING. W. EITLE · D R.RER. NAT. K.HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN
    DIPL.-ING. K. FOCHSLE - OR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 . D-8000 MONCHEN^81 · TELEFON (089) 911087 . TELEX 05-29419 (PATHE)
    36 908 m/hl
    Farmitalia Carlo Erba S.p.A.,
    Mailand / Italien
    Automatisches, kontinuierliches Durchflußverfahren zur Bestimmung von Kreatinin und eine Vorrichtung und Test-Kits zur Durchführung
    desselben
    Patentansprüche
    1. Automatisches, kontinuierliches Durchflußverfahren für die Bestimmung von Kreatinin in biologischen Flüssigkeiten durch enzymatische Umwandlung von Kreatinin mit Kreatinindesimidase unter Erhalt von Ammoniak und N-Methylhydantoin, und quantitative Bestimmung des Hydrolyseammoniaks, dadurch gekennzeichnet, daß die Kreatinindesimidase immobilisiert ist.
    2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der enzymatischen Umwandlung • . von Kreatinin durch immobilisierte Kreatinindesimidase unter Erhalt von Ammoniak und N-Methylhydantoin eine Eliminierung von endogenem Ammoniak, welcher in den biologischen Flüssigkeiten vorliegt, vorausgeht.
    3. Automatische, kontinuierliche Durchflußmethode für die Bestimmung von Kreatinin in biologischen Flüssigkeiten durch enzymatische Umwandlung von Kreatinin mit Kreatinindesimidase unter Erhalt von Ammoniak und N-Methylhydantoin, und darauffolgender Bestimmung des gebildeten Ammoniaks, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
    a) Eliminierung von endogenem Ammoniak, welcher in den biologischen Flüssigkeiten vorliegt, durch Behandlung mit einem geeigneten Reagens in Vordialyse;
    b) kontinuierliche Dialyse;
    c) Reaktion von Kreatinin nach der Dialyse mit immobilisierter Kreatinindesimidase; und
    d) quantitative Bestimmung des gebildeten Ammoniaks mit Hilfe eines geeigneten Nachweissystems.
    4. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung von Kreatinindesimidase auf einem Nylonrohr bzw. Nylonschlauch, welcher in die Fließvorrichtung gebracht ist, bewirkt wird.
    5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung von endogenem Ammoniak automatisch innerhalb des Durchflußsystems bewirkt wird.
    6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung von endogenem Ammoniak durch Behandlung mit einem NADH/GLDH erzielt wird.
    7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das.NADH/GLDH-Reagens in der verwende-
    • ten Lösung enthält:
    ■ ' Phosphatpuffer 200 mM bei pH 7,3-7,8;
    a-Ketoglutarat 8-12mM;
    NADH 0,6-1 mM;
    GLDH 40-50 U/ml. 05
    8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Lösung des NADH/ GLDH-Reagens enthält:
    Phosphatpuffer 200 mM bei pH 7,5
    a-Ketoglutarat 10 mM
    NADH 0,8 mM;
    GLDH 4 5 U/ml.
    9. Verfahren gemäß Ansprüchen 2 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, daß die Eliminierung von endogenem Ammoniak durch eine Behandlung mit einem Aspartase/ Fumarat-Reageris erfolgt.
    10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeich net, daß die als Aspartase/Fumarat-Reagens verwendete Lösung enthält:
    Phosphatpuffer 200 mM bei pH 7,8-8,2; Aspartase 18-22 U/ml;
    Fumarat 40-60 mM.
    11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die als Aspartase/Fumarat-Reagens verwendete Lösung enthält:
    Phosphatpuffer 200 mM bei pH 8;
    Aspartase 20 U/ml;
    Fumarat 50 mM. ' · .
    12. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet / daß die quantitative Bestimmung des Ammoniaks aus dem Kreatinin unter Verwendung eines Reagens auf der Basis von Phenol und Natriumhypochlorit als chromogenes Nachweissystem erfolgt.
    13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens auf der Basis von Phenol und Natriumhypochlorit in der verwendeten Lösung enthält:
    Phenol · 80-120 mM; Natriumnitroprussxd 1,2-1,6 mM; Natriumhypochlorit 13-17 mM; Natriumhydroxid 0,15-0,19 M.
    •14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des Reagens, welches auf Phenol und Natriumhypochlorit basiert, enthält:
    Phenol 100 mM;
    Natriumnitroprussid 1,4 mM;
    Natriumhypochlorit 15 mM;
    Natriumhydroxid 0,17 mM.
    15. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß die quantitative Bestimmung des Ammoniak aus dem Kreatinin unter Verwendung eines
    30_ NADH/GLDH-Reagens als Nachweissystem erfolgte
    16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Lösung des verwendeten NADH/ GLDH-Reagens enthält:
    ·
    " ■"* **' * * ":' 322Ρ548
    Phosphatpuffer ;- 50 mM bei pH 7,3-7,8;
    a-Ketogluturat 6-10 mM;
    NADH 0,05-0,1 mM;
    GLDH . 10-20 U/ml.
    17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die als NADH/GLDH-Reagens verwendete Lösung auch enthält:
    Phosphatpuffer 50 mM bei Ph 7,5;
    a-Ketoglutarat 8 mM;
    NADH 0,075 mM;
    GLDH 15 U/ml.
    18. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß das Durchflußsystem ein Zweikanalsystem mit Differentialablesung darstellt.
    19. -Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Zweikanal-Durchflußsystem mit Differentialablesung einen einzigen Dialysator umfaßt.
    20. Verfahren gemäß den Ansprüchen 3 bis 19, dadurch gekennzeichnet , daß das Durchflußsystem aus einem Rohrsystem besteht, in welchem in der Ordnung der Durchflußroute nacheinander angeordnet sind:
    a) ein Bad für die Eliminierung von endogenem Ammoniak;
    b) ein Dialysator;
    c) ein Recyclisierungssystem mit Entgasung, welches die gleichzeitige Verteilung im Kontrollkanal (blank channel) und dem Probenkanal des einzigen Dialysators erlaubt;
    d) einen Kontrollreaktor (blank reactor), welcher im Kontrollkanal angeordnet ist; .
    e) einen Reaktor, der die immobilisierte Kreatinindesimidase enthält, die im' Probenkanal für die enzymatische Reaktion
    - 6
    mit Kreatinin angeordnet ist; und
    f) zwei Schlangen, die jeweils in der Kontrollinie urid in der Probenlinie angebracht sind und zur Entwicklung der Anunoniumnachweisreaktion dienen.
    21. Vorrichtung zur Durchführung der Methode gemäß Anspruch 20, gekennzeichnet durch:
    a) eine automatische Vorrichtung zur Probennahme;
    b) ein System zum Einlaß der Proben in das Durchflußsystem; c) ein Durchflußsystem; und
    d) ein Nachweis sys tem, wobei das Durchf Iu ß sy stem dem entspricht, wie es in Anspruch 20 beschrieben ist.
    22. Testkit (set) von Materialien und Reagentien zur Durchführung der Methode gemäß Ansprüchen 3 bis 20, gekennzeichnet durch:
    a) ein Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak in einem geeigneten-Puffer;
    b) ein Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin; und
    c) immobilisierte Kreatinindesimidase.
    23. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak aus NADH/GLDH besteht.
    24. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß. das NADH/GLDH-Reagens in der verwendeten Lösung enthält:
    Phosphatpuffer a-Ketoglutarat NADH
    GLDH
    -200 mM bei pH 7,3-7,8; 8-12 mM, 0,6-1 mM; . · 40-50 U/ml.
    25. Testkit von Materialien, und Reagentien gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des Reagens enthält:
    Phosphatpuffer 200 mM bei pH 7,5
    a-Ketoglutarat 10 mM
    NADH 0,8 mM
    GLDH 45 U/ml.
    26. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak aus Aspartase/ Fumarat besteht.
    27. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 26,
    dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des Aspartase/Fumarat-Reagens enthält:
    Phosphatpuffer 200 mM bei pH 7,8-8,2
    Asparatase 18-22 U/ml -
    Fumarat 40-60 mM.
    28. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des Aspartase/Fumarat-Reagens enthält:
    Phosphatpuffer 200 mM bei pH 8
    Aspartase . 20 U/ml Fumarat 50 mM.
    29. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens für den Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin ein Reagens . darstellt, welches auf Phenol und Natriumhypochlorit basiert.
    ■ 30. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet , daß das Reagens auf der Basis von Phenol und Natriumhypochlorit in der verwendeten Lösung enthält:
    Phenol 80-120 mM
    Natriumnitroprussid 1,2-1,6 mM Natriumhypochlorit 13-17 mM
    Natriumhydroxid · 0,15-0,19 mM.
    31. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des Reagens auf der Basis von Phenol und Natriumhypochlorit enthält:
    Phenol 100 mM
    " . Natriumnitroprussid 1,4 raM
    Natriumhypochlorit 15 mM
    Natriumhydroxid 0,17 M.
    32. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 22, dadurch . gekennzeichnet, daß das Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin ein NADH/GLDH-Reagens darstellt.
    33. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des NADH/GLDH-Reagens enthält:
    30· Phosphatpuffer 50 mM bei pH 7,3-7,8
    a-Ketoglutarat 6-1 0 mM
    NADH 0,05-0,1 mM
    . GLDH ' 10-20 U/ml.
    ■ 34. Testkit von Materialien, und Reagentien gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet , daß die verwendete Lösung des NADH/GLDH-Reagens enthält:
    Phosphatpuffer . 50 mM bei pH 7,5
    a-Ketoglutarat 8 mM
    NADH . 0,075 mM
    GLDH 15 U/ml.
    35. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß die immobilisierte Kreatinindesxmidase auf einem Nylonrohr bzw. Nylonschlauch mit einer Länge von 0,2 bis 2 m und einem Innendurchmesser zwischen 0,8 und 1,6 mm immobilisiert ist.
    36. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet , daß das Nylonrohr bzw. der Nylonschlauch eine Länge von 0,8 bis 1,2 m und
    .einen Innendurchmesser von 1 bis 1,2 mm aufweist. 20
    37. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß den Ansprüchen 35 und 36, dadurch gekennzeichnet , daß der Nylonschlauch bzw. das Nylonrohr, welches die immobilisierte Kreatinindesxmidase enthält, nach der folgenden Immobilisierungstechnik erhalten wird:
    a) Alkylierung des Nylons mit Triethyloxonium-tetrafluoroborat;
    b) Einführung einer Linear-Spacerkette auf dem alkylierten Nylon durch Behandlung mit Hexamethylendiamin oder
    30· Ethylendiamin;
    c) Aktivierung des vorstehend genannten "Spacer"-Nylon
    (spaced-nylon) mit einem bifunktionalen Reagens, wie Dimethylsuberimidat und/oder Glutaraldehyd; und ...
    d) Anbringen des Enzyms-auf das aktivierte Nylon.
    38. Testkit von Materialien und Reagentien gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß
    a) das Reagens zur Eliminierung von endogenem Ammoniak das in den Ansprüchen 23 bis 25 beschriebene Reagens darstellt;
    b) das Reagens zum Nachweis von Ammoniak aus Kreatinin das in den Ansprüchen 29 bis 31 beschriebene Reagens darstellt; und
    c) die immobilisierte Kreatinindesimidase gemäß der
    Methode, wie sie in dem Anspruch 37 beschrieben wird, auf einem Nylonschlauch bzw. Nylonrohr, wie in den Ansprüchen 35 bis 36 beschrieben, erhalten wird. -
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