DE3209045C2 - Verfahren zum selektiven Aufbrechen permeabler Membranen - Google Patents
Verfahren zum selektiven Aufbrechen permeabler MembranenInfo
- Publication number
- DE3209045C2 DE3209045C2 DE3209045A DE3209045A DE3209045C2 DE 3209045 C2 DE3209045 C2 DE 3209045C2 DE 3209045 A DE3209045 A DE 3209045A DE 3209045 A DE3209045 A DE 3209045A DE 3209045 C2 DE3209045 C2 DE 3209045C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- solution
- polymer
- membranes
- capsules
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
- A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5005—Wall or coating material
- A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
- A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/5073—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals having two or more different coatings optionally including drug-containing subcoatings
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
- B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
- B01J13/20—After-treatment of capsule walls, e.g. hardening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0012—Cell encapsulation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/126—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers
- A61K2035/128—Immunoprotecting barriers, e.g. jackets, diffusion chambers capsules, e.g. microcapsules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
- C12N2533/74—Alginate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mikroverkapselung von Kernmaterialien und anschließenden Freisetzung des Kernmaterials durch selektives Aufbrechen der Mikrokapselmembranen. Bei der Einkapselung werden beispielsweise um ein Tröpfchen herum semipermeable Membranen durch Ausbildung zahlreicher ionischer Salzbrücken zwischen einem polyionischen Polymer im Tröpfchen und einem vernetzenden polyionischen Polymer mit zahlreichen ionischen Gruppen entgegengesetzter Ladung erzeugt. Diese Membranen können dadurch selektiv aufgebrochen werden, daß sie zunächst mit einer Lösung konkurrierender vernetzender mehrwertiger und vorzugsweise zwei- oder dreiwertiger Ionen und anschließend einer Lösung eines konkurrierenden polyionischen Polymers der gleichen Ladung wie beim Polymer im ursprünglichen Tröpfchen zusammengebracht werden. Alternativ kann auch eine Mischlösung aus den beiden Lösungen mit den konkurrierenden Substanzen zusammen eingesetzt werden. Membranen, die aus einem anionischen Alginat bestehen, das an ein kationisches Protein gebunden ist, können beispielsweise dadurch selektiv aufgebrochen werden, daß sie einer Mischlösung einatomiger, mehrwertiger Kationen, z.B. Ca ↑ ↑-Ionen und eines wasserlöslichen Polymers mit zahlreichen anionischen Gruppen, z.B. Heparin, ausgesetzt und anschließend die einatomigen Kationen abgetrennt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich vorteilhaft zur Einkapselung und anschließenden Freisetzung von Zellkulturen ohne Schädigung der .
Description
(A) die Mikrokapseln einer Lösung von mehrwertigen Kationen sowie eines polyanionischen
Trennpolymers, das eine zum Aufbrechen der Salzbrücken ausreichende Ladung aufweist,
ausgesetzt werden,
(B) die Kationen mit dem polykationischen Polymer um die anionischen Gruppen am polyanionischen
Polymer und das polyanionische Trennpolymer mit dem polyanionischen Polymer um die kationischen Gruppen am polykationischen
Polymer konkurrieren gelassen werden, und
(C) die mit dem polyanionischen Polymer nach Schritt (B) assoziierten Kationen abgetrennt
werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (C) durch Einwirkung einer einen
Chelatbildner enthaltenden Lösung auf die Membranen durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner Citrationen und/oder
EDTA-Ionen verwendet werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der
Basis eines Polymers mit zahlreichen Aminogruppen als polykationisches Polymer eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der
Basis eines sauren, wasserlöslichen Gummi* als polyanionisches
Polymer eingesetzt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der Basis eines Alginats
als polyanionisches Polymer eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Trennpolymer Heparin
verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Kationen Ca+ +-Ionen
eingesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln eingesetzt
werden, deren polykationisches Polymer ausgewählt ist unter
(a) Proteinen mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Aminogruppen;
(b) Proteinen mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Iminogruppen;
(c) Polypeptiden mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Aminogruppen;
(d) Polypeptiden mit zahlreichen Aminosäureeinheiten mit freien Iminogruppen;
(e) Polyvinylaminen;
(0 Polyethyleniminen;
(0 Polyethyleniminen;
(g) Polyethylenaminen und
(h) deren Gemischen.
(h) deren Gemischen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, daß ein unter Polysulfonsäuren, Polyphosphorsäuren, ihren Salzen sowie deren
Gemischen ausgewähltes Trennpolymer eingesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß als Trennpolymer ein Polymer mit Polysulfonsäure-Salzgruppen verwendet
wird.
ίο 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß ein polyanionisches Trennpolymer verwendet wird, das eine höhere Ladungsdichte
als das polyanionische Polymer der Mikrokapseln aufweist
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln eingesetzt werden, die lebende Zellen enthalten.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrokapseln auf der Basis eines Proteins
als polykationisches Polymer, Natriumalginat als wasserlöslicher Gummi und Calciumionen als
Kationen eingesetzt und Heparin als Trennpolymer verwendet werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
daß in Schritt (C) als Trennmittel ein Citrat verwendet wird, das in einer mit den Zellen physiologisch
verträglichen Lösung gelöst ist
Die Erfindung betrifft die reversible Einkapselung, d. h. ein Verfahren, mit dem Flüssigkeiten oder Feststoffe
zunächst verkapselt und danach unter Freisetzung des Materials durch selektives Aufbrechen der Kapselmembranen
wieder freigesetzt werden. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Mikroverkapse-Iung
lebender Zellen, die anschließend ohne Beschädigung aus den erzeugten Kapselmembranen wieder freigesetzt
werden können.
In der GB-A 20 46 209 ist ein Mikroverkapselungsverfahren angegeben, das sich zur Einkapselung praktisch
beliebiger Feststoffe oder Flüssigkeiten in Mikrokapseln mit semipermeablen oder im wesentlichen im-
permeablen Kapselmembranen eignet. Ein herausragender Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß bei
der Erzeugung der Kapselmembranen keine toxischen oder denaturierenden Reagentien verwendet oder extreme
Temperaturen oder andere Bedingungen, unter denen lebende Zellen geschädigt werden, angewandt
werden. Diese Verfahrensweise eignet sich entsprechend besonders zur Mikroverkapselung lebender Materialien,
die lebensfähig und im gesunden Zustand bleiben. Da bei diesem Verfahren der Permeabilitätsgrad
der Membranen einstellbar ist, können Zellkulturen von Procaryonten, Eukaryonten oder anderer Herkunft so
mikroverkapselt werden, daß die Zellen der Kultur oder kontaminierenden Bakterien, hochmolekularen Immunglobulinen
und anderen möglicherweise schädlichen Faktoren geschützt sind und innerhalb einer Mikroumgebung
abgegrenzt bleiben, die sich zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit sowie der Stoffwechselfunktionen
günstig eignet. Wenn die Mikrokapseln in einem üblichen Kulturmedium suspendiert werden, das das
Wachstum der betreffenden lebenden Zellen erlaubt, können die mikroverkapselten Zellen die für den Metabolismus
erforderlichen Nahrungssubstanzen, die durch die Membran hindurchdiffundieren, aufnehmen und ihre
Stoffwechselprodukte durch die Kapselmembran hindurch in das umgebende Medium abgeben.
Ein Verfahren, mit dem derartige Mikrokapseln ohne Schädigung ihres Inhalts aufgebrochen werden können,
ist der GB-A 20 46 209 allerdings nicht zu entnehmen.
Der Erfindung Hegt entsprechend die Aufgabe zugrunde,
ein Verfahren zum selektiven Aufbrechen der Membranen von Mikrokapseln des oben definierten
Typs anzugeben, mit dem der Inhalt der Mikrokapseln, d. h. fein verteilte Materialien sowie Flüssigkeiten und
Lösungen, ohne Schädigung freigesetzt werden kann, das sich auch bei Mikrokapseln mit eingekapselten lebenden
Zellen oder lebendem Gewebe anwenden läßt
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteranspräche.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum selektiven Aufbrechen der Membranen von Mikrokapseln, die
nach dem oben erläuterten Mikroverkapselungsverfahren hergestellt wurden, ohne das eingekapselte Material
in irgendeiner nachweisbaren Form zu schädigen. Das erfindungsgemäße Verfahren bezieht sich im einzelnen
auf das selektive Aufbrechen von Mikrokapseln mit Membranen auf der Basis einer wasserunlöslichen Matrix,
die aus mindestens zwei wasserlöslichen Komponenten erzeugt wurde, nämlich einem polykationioschen
Polymer mit zahlreichen kationischen Gruppen, z. B. einem Polyethylenamin, und einem polyanionischen
Polymer mit zahlreichen anionischen Gruppen, z. B. Natriumalginatgummi. Die beiden Komponenten
sind durch Salzbrücken zwischen den anionischen und den kationischen Gruppen unter Matrixbildung miteinander
verbunden.
Die Membranen solcher Mikrokapseln besitzen üblicherweise sphäroidale Form, die einen abgeschlossenen
Innenraum vorgibt, der die eingekapselte Substanz enthält. Das Verfahren kann jedoch auch an Mikrokapseln
dieses Typs durchgeführt werden, die abweichende Form besitzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt folgende Schritte:
Zunächst werden die Mikrokapseln mit Membranen des oben erläuterten Typs einer Lösung von mehrwertigen
Kationen, die einatomig sind oder eine sehr niedere Molekülmasse besitzen, sowie einer Lösung eines polyanionischen
Trennpolymers (Stripping-Polymers) mit zahlreichen anionischen Gruppen ausgesetzt. Diese Lösungen
werden vorzugsweise zusammengemischt. Die anionische Ladung des Polymers muß ausreichen, um
die Salzbrücken aufzubrechen, und sollte vorzugsweise gleich oder größer als die Ladungsdichte des polyanionischen
Polymers der Membran sein. Die Lösung wird mit den Kapseln in Kontakt gebracht, damit die Kationen,
beispielsweise Calcium- oder Aluminiumionen, mit dem polykationischen Polymer in der Kapselmembran
um die anionischen Stellen auf dem polyanionischen Polymer konkurrieren können. Gleichzeitig konkurriert
das Trennpolymer, das zahlreiche anionische Gruppen aufweist, mit dem polyanionischen Polymer
um die kationischen Stellen an den Polymerketten. Dies führt zu einem »Aufweichen« bzw. beginnendem Aufbrechen
der Kapselmembranen. Zur Vervollständigung des Aufbrechens werden die Mikrokapseln gewaschen
und dann zur Abtrennung der am polyanionischen Polymer assoziierten Kationen einem Trennmittel ausgesetzt.
Bevorzugte Trennmittel sind Chelatbildner wie Citrationen oder EDTA-Ionen. Wenn die Kapseln lebensfähige
Zellen enthalten, was einer wichtigen erfindungsgemäßen Ausführungsform entspricht, wird das
Trennmittel vorzugsweise mit einer isotonischen Salzlösung gemischt
Als Kation wird üblicherweise Calcium bevorzugt Beispiele für das polyanionische Trennpolymer mit anionischen
Gruppen, das in der Mischlösung verwendet wird, sind Polysulfonsäuren bzw. vorzugsweise deren
Salze, die natürlich oder synthetisch sein können. Besonders günstige Ergebnisse sind mit Heparin erzielbar,
d. h. einem natürlichen Polymer, das zahlreiche Sulfonatgruppen
enthält Polymere, die Polyphosphorsäure- oder Polyacrylsäuresalzgruppen enthalten, sind ebenfalls
verwendbar.
Als Trennmittel wird üblicherweise bevorzugt Natriumcitrat verwendet
Erfindungsgemäß können entsprechend Kulturen lebender Zellen beliebigen Ursprungs, die in einer sterilen,
stabilisierenden Umgebung in Mikrokapseln des oben angegebenen Typs eingeschlossen sind, in denen
die normalen Stoffwechselvorgänge und sogar die Mitose ablaufen können, ohne Schädigung freigesetzt werden.
Obgleich im wesentlichen beliebige Materialien, die mit wäßrigen Medien verträglich sind und in flüssiger
oder fester Form nach dem oben genannten Verfahren eingekapselt sind, gemäß der Erfindung wieder ohne
Schädigung.freigesetzt werden können, liegt die derzeit
bemerkenswerteste Anwendbarkeit bei der Freisetzung eingekapselter lebender Systeme wie etwa von Zellkulturen.
Die Erläuterung der Erfindung bezieht sich daher im folgenden primär auf die Einkapselung und erfindungsgemäße
Freisetzung von Zellen, wobei das erfindungsgemäße Verfahren vom Fachmann ohne weiteres
auch bei weniger empfindlichen eingekapselten Materialien durchgeführt werden kann.
Die einzukapselnden Gewebe oder Zellen werden in einem wäßrigen Medium suspendiert, das sich zur Aufrechterhaltung
und Unterstützung der Stoffwechselvorgänge der betreffenden Zellen eignet. Hierfür geeignete
Medien sind dem Fachmann auf dem Gebiet geläufig und in zahlreichen Fällen handelsüblich. Der mittlere
Durchmesser der einzukapselnden Zellmassen oder anderer Materialien kann in weitem Bereich zwischen einige
μηι bis zu einigen mm und darüber variieren. Die Langerhans'schen Inseln von Säugetieren und Menschen
besitzen z. B. typischerweise einen Durchmesser von 50 bis 200 μπι. Gewebefragmente und einzelne Zellen
wie etwa Fibroblasten, Leukocyten, Lymphoblastoidzellen, Pancreas-/?, -χ- oder J-Zellen, Langerhans'sche
Inseln, Hepatocyten sowie Zellen anderer Gewebe können gewünschtenfalls eingekapselt werden.
Ferner ist eine Einkapselung von Mikroorganismen einschließlich solcher Mikroorganismen möglich, die durch
DNA-Rekombination oder andere Verfahren kinetisch modifiziert wurden.
Die Erhaltung der Lebensfähigkeit solcher lebender Materialien hängt u. a. von der Verfügbarkeit der erforderlichen
Nährstoffe, dem Sauerstofftransport, der Abwesenheit toxischer Substanzen im Medium so wie dem
pH-Wert des Mediums ab. Solche lebenden Materialien werden bei und nach der Einkapselung in einer physiologisch
verträglichen Umgebung gehalten.
Bei dem gattungsgemäß zugrundeliegenden Einkapselungsverfahren werden bestimmte wasserlösliche
Substanzen, die z. B. mit lebenden Geweben physiologisch verträglich sind und unter Bildung einer formbeständigen,
zusammenhängenden Masse wasserunlöslich gemacht werden können, zur Erzeugung »temporärer
5 6
Kapseln«, & h. von Schutzschichten z. B. um einzelne bige mehrwertige Ionen, die zur Salzbildung mit dem
Zellen, Gruppen von Zellen oder Gewebe herum, her- sauren Gummi in der Lage sind, verwendet werden könangezogen.
Diese Substanzen werden dem Gewebekul- nen, werden vorzugsweise physiologisch verträgliche
turmedium typischerweise in einer Konzentration von Ionen, beispielsweise Calciumionen, angewandt wogrößenordnungsmäßig
1 bis 2 Masse-% zugesetzt Die 5 durch sich Gewebe in lebendem Zustand halten lassen.
Lösung wird anschließend in Tröpfchen umgewandelt Für weniger empfindliche Materialien können auch andie
das Gewebe zusammen mit dem Aufbewahrungs- dere mehrwertige Kationen eingesetzt werden. Magne-
bzw. Kulturmedium enthalten, und dann unmittelbar siumionen sind zur Gelbildung mit Natriumalginat unwasserunlöslich
gemacht und in Gelform übergeführt wirksam.
zumindest in einer Oberflächenschicht Anschließend io Eine typische Lösung ist so zusammengesetzt daß sie
werden die formbeständigen temporären Kapseln mit gleiche Volumina einer Zellsuspension im entsprechen-
einer dauerhafteren Membran versehen, die erfindungs- den Medium sowie einer 1- bis 2°/oigen Lösung des
gemäß anschließend unter Freisetzung des eingekapsel- Gummis in physiologischer Salzlösung enthält Bei Ver-
ten Inhalts ohne Schädigung selektiv aufgebrochen wer- Wendung von Natriumalginat hat sich eine 1,2- bis
den kann. Nach der Erzeugung der permanenten Mem- is l,6°/oige Lösung als günstig erwiesen,
bran kann der Kapselinhalt wenn das zur Erzeugung im nächsten Verfahrensschritt der Einkapselung wird
der temporären Kapseln verwendete Material dies zu- die Gummilösung, die das Gewebe enthält in Tröpfchen
l?|ßt, wieder verflüssigt werden. Dies geschieht durch einer erwünschten Größe umgewandelt die ausrei-
Wiederherstellung der Bedingungen im Medium, unter chend ist um die einzukapselnden Zellen einzuhüllen,
denen das betreffende Material löslich ist 20 Danach werden die Tröpfchen unmittelbar unter Erzeu-
Das zur Erzeugung der temporären Kapseln verwen- gung formbeständiger kugelförmiger oder sphäroidaler
dete Maferial kann ein beliebiges nichttoxisches, was- Massen geliert Die Tropfenbildung kann in herköromli-
serlösliches Material sein, das durch Änderung der ioni- eher Weise erfolgen.
sehen Umgebung bzw. der Ionenkonzentration in eine Ein Rohr, das eine wäßrige Lösung mehrwertiger
formbeständige Masse umgewandelt werden kann. Das 25 Kationen, beispielsweise l,5%ige CaCh-Lösung, ent-Material
enthält ferner zahlreiche leicht ionisierbare an- hält wird mit einem Stopfen versehen, der eine Tropfenionische
Gruppen, beispielsweise Carboxylgruppen, die erzeugungseinrichtung trägt Die Tropfenerzeugungsdurch
Ausbildung von Salzbindungen mit Polymeren einrichtung weist ein Gehäuse mit einer oberen Lufteinreagieren
können, die eine Vielzahl von kationischen laßdüse und einem länglichen Hohlkörper auf, der in
Gruppen aufweisen. Wie im folgenden näher erläutert 30 Gleitpassung im Stopfen vorgesehen ist Oben am Geist erlauben derartige Materialien die Abscheidung ei- häuse wird eine 10-ml-Spritze mit einer Schrittpumpe
ner permanenten Membran wählbarer Permeabilität im montiert die beispielsweise eine mit PTFE beschichtete
Bereich von im wesentlichen nichtporösen Eigenschaf- Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,25 mm auften
bis zu einer Durchlässigkeit entsprechend einer Mo- weist die längs durch das Gehäuse hindurchgeht Das
lekülmasse von einigen Hunderttausend. 35 Innere des Gehäuses ist so konstruiert daß am Ende der
Zu den bevorzugten polyanionischen Polymeren zur Nadel ein konstanter laminarer Luftstrom einwirkt Im
Erzeugung der temporären Kapseln gehören saure, praktischen Einsatz wird die Spritze mit der das einzuwasserlösliche
natürliche oder synthetische Polysaccha- kapselnde Material enthaltenden Lösung gefüllt und die
ridgummi. Zahlreiche derartige Materialien sind han- Schrittpumpe betätigt, die absatzweise Lösungströpfdelsüblich.
Sie werden typischerweise aus Pflanzenma- 40 chen aus der Nadelspitze herausdrückt. Jedes Tröpfterialien
extrahiert und in vielen Fällen als Lebensmit- chen wird durch den Luftstrom abgerissen und fällt ettelzusätze
verwendet Als polyanionisches Polymer wird wa 2,5 cm tief in die CaCb-Lösung, wo es durch Absorpvorzugsweise
Natriumalginat verwendet. Alginate im tion von Calciumionen sofort geliert wird. Der Abstand
Molekülmassenbereich von 150 000+ sind verwend- zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der
bar; aufgrund ihrer molekularen Abmessungen können 45 CaCl2-Lösung ist hierbei groß genug, damit die Natrisie
jedoch üblicherweise die abschließend erzeugten umalginat-Zellsuspension die physikalisch günstigste
Kapselmembranen nicht durchdringen. Form, nämlich die Kugelform, annehmen kann, bei der
Zur Herstellung von Mikrokapseln ohne oingeschlos- maximales Volumen bei zugleich minimaler Oberfläche
senes flüssiges Alginat können Alginate mit niedrigerer vorliegt. Die Luft innerhalb des Rohrs strömt durch eine
Molekülmasse, beispielsweise mit Molekülmassen von 50 öffnung im Stopfen aus. Durch diese Verfahrensweise
40 000 bis 80 000, verwendet werden. Aus den am Ende wird das Gel »vernetzt«, und es bilden sich hochviskose,
erhaltenen Kapseln kann das Alginat dann leichter aus formbeständige temporäre Kapseln, die das suspendier-
dem intrakapsulären Volumen durch Diffusion durch te Gewebe und sein Medium enthalten. Die Kapseln
eine Membran ausreichender Porosität entfernt wer- sammeln sich in der Lösung als separate Phase an und
den. Andere verwendbare polyanionische Gummi sind 55 werden durch Absaugen abgetrennt,
saure Fraktionen von Guargummi, Carageenan, Pectin, In der nächsten Verfahrensstufe wird eine Membran
Tragantgummi und Xanthangummi. auf der Oberfläche der temporären Kapseln durch Ver-
Diese Materialien enthalten glycosidisch gebundene netzung der Oberflächenschichten aufgebracht. Dies
Polysaccharidketten. Ihre freien Säuregruppen liegen in geschieht dadurch, daß die temporären Kapseln, die Po-
vielen Fällen in Form von Alkalimetallsalzen, beispiels- 60 lyanionen, enthalten, einer wäßrigen Lösung eines poly-
weise in der Natriumform, vor. Beim Austausch von kationischen Polymers mit kationischen Gruppen aus-
Alkalimetallionen gegen mehrwertige Ionen wie Calci- gesetzt werden, die mit den anionischen funktionellen
um, Strontium oder Aluminium, werden die Flüssigkeit Gruppen im polyanionischen Polymer reagieren kön-
und die wasserlöslischen Polysaccharidmoleküle unter nen. Polymere, die reaktive kationische Gruppen wie
Bildung eines wasserunlöslichen, formbeständigen Gels 65 etwa freie Aminogruppen oder Aminogruppen in Kom-
»vernetzt«, das durch Abtrennung der Ionen durch Io- bination mit Iminogruppen aufweisen, sind bevorzugt,
nenaustausch oder mit einen» Trennmittel wieder löslich In diesem Stadium wird der Polysaccharidgummi durch
gemacht werden kann. Obgleich im wesentlichen belie- Wechselwirkung (Entstehung von Salzbindungen) zwi-
sehen den Carboxylgruppen und den Amino- oder Iminogruppen
des polykationischen Polymers vernetzt. Die Permeabilität kann vorteilhaft innerhalb bestimmter
Grenzen durch Auswahl der Molekülmasse des eingesetzten vernetzenden Polymers sowie durch Variation
der Einwirkungsdauer und der Konzentration des Polymers in der Lösung eingestellt werden. Lösungen eines
Polymers mit niederer Molekülmasse dringen während einer gegebenen Zeitdauer weiter in die temporären
Kapseln ein als Lösungen von Polymeren mit höherer MolekUlmasse. Der Penetrationsgrad des Vernetzungsmittels läßt sich mit der resultierenden Permeabilität
korrelieren. Allgemein gilt, daß die Porengröße umso höher ist je höher die Molekülmasse und je geringer die
Penetration sind. Längere Einwirkungsdauer und höher konzentrierte Polymerlösungen führen zu einer Verringerung
der resultierenden Obergrenze der Membranpermeabilität. Die mittlere Molekülmasse des Polymers
stellt jedoch die wichtigste Einflußgröße dar.
Allgemein können Polymere mit einer Molekülmasse im Bereich von 10 000 bis 100 000 oder darüber, je nach
der Reaktionsdauer, der Konzentration der Polymerlösung und dem angestrebten Permeabilitätsgrad, eingesetzt
werden.
Günstige Reaktionsbedingungen liegen z. B. vor, wenn Polylysin mit einer mittleren Molekülmasse von
etwa 35 000 verwendet, die Reaktion unter Rühren 3 min lang durchgeführt und eine physiologische Salzlösung
eingesetzt wird, die 0,0167% Polylysin enthält. Unter diesen Bedingungen werden Membranen mit einer
Obergrenze der Permeabilität für Molekülmassen von etwa 100 000 erhalten. Allgemein entstehen aus Materialien
mit höherer Molekülmasse Membranen, die anschließend im Vergleich zur Verwendung von Materialien
mit niedrigerer Molekülmasse schwieriger aufzubrechen sind. Die Ladungsdichte des vernetzenden polykationischen
Polymers beeinflußt ebenfalls die Porengröße und die Leichtigkeit des Aufbrechens entsprechender
Membranen. Allgemein gilt, daß Materialien mit höherer Ladungsdichte weniger poröse Membranen
ergeben, die schwieriger aufzubrechen sind.
Optimale Reaktionsbedingungen, die sich zur Einstellung
der Permeabilität in einem gegebenen System eignen, können aufgrund der oben angegebenen Richtlinien
leicht empirisch ermittelt werden.
Beispiele für geeignete vernetzende Polymere sind etwa Proteine und Polypeptide natürlichen sowie synthetischen
Ursprungs mit freien Aminogruppen oder Amino- und Iminogruppen in Kombination, Polyethylenamine,
Polyethylenimine und Polyvinylamine. Polylysin wurde ebenfalls erfolgreich verwendet, und zwar in der
D- und L-Form. Proteine wie Polyarginin, Polycitrullin
und Polyornithin sind ebenfalls verwendbar. Polymere mit höherer positiver Ladungsdichte, beispielsweise Polyvinylamine,
haften stark an den anionischen Gruppen der polyanionischen Moleküle und sind daher schwieriger
aufzubrechen.
In diesem Stadium der Einkapselung können Kapseln gewonnen werden, die eine »permanente« semipermeable
Membran aufweisen, die eine gelierte Gummilösung, ein mit dem entsprechenden Zelltyp kompatibles
Kulturmedium sowie die Zellen umgibt Wenn lediglich eine einfache Aufbewahrung der Zellen in einer Schutzumgebung
angestrebt ist müssen keine weiteren Schritte durchgeführt werden. Wenn andererseits der Stofftransport
innerhalb der Kapseln und durch die Membranen hindurch gefördert werden soll, ist es bevorzugt,
das Gel wieder zur wasserlöslichen Form zu verflüssigen.
Dies kann durch Wiederherstellung der Bedingungen erfolgen, unter denen der Gummi flüssig ist, beispielsweise
durch Abtrennung des Calciums oder anderer mehrwertiger Kationen aus dem Gel. Das Medium
in der Kapsel kann in einfacher Weise durch Eintauchen der Kapseln in phosphatgepufferte Salzlösung, die Alkalimetallionen
und Wasserstoffionen enthält, resolubilisiert werden. Einwertige Ionen werden beim Eintauchen
der Kapseln in die Lösung unter Rühren gegen
ίο Calcium oder andere mehrwertige Ionen innerhalb des
Gummis ausgetauscht. Zum gleichen Zweck können auch Natriumcitratlösungen verwendet werden, die die
zweiwertigen Ionen abtrennen bzw. maskieren. Die Gummimoleküle mit einem Molekulargewicht unterhalb
der Obergrenze der Permeabilität der Membranen können anschließend durch Diffusion aus dem intrakapsulären
Volumen abgetrennt werden.
Es kann schließlich auch erwünscht sein, die Kapseln so zu behandeln, daß freie Aminogruppen, die sonst zu
einer Verklumpungstendenz der Kapseln führen würden, zu binden. Dies kann beispielsweise durch Eintauchen
der Kapseln in eine verdünnte Lösung von Natriumalginat geschehen.
Aus der obigen Erläuterung geht hervor, daß bei der Membranherstellung weder scharfe Reagentien noch extreme Temperaturen oder andere für Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen schädliche Bedingungen angewandt werden müssen. Daher können auch sehr empfindliche Zellen wie Hepatocyten, Leukocyten, Fibroblasten und Lymphoblasten sowie Zellen verschiedener endocriner Gewebe von Säugetieren und Menschen ohne Schwierigkeiten eingekapselt werden. Zellen mikrobiologischen Ursprungs, wie etwa Hefen, Schimmelpilze und Bakterien, die in ungünstiger Umgebung besser überleben können, sowie inerte Reagentien, Feststoffe oder biologisch aktive Materialien können nach diesem Verfahren natürlich ebenfalls ohne Schädigung eingekapselt werden.
Die eingekapselten Zellen der oben erläuterten Art können in Medien zur Aufbewahrung oder in Kulturmedien suspendiert werden und bleiben frei von bakterieller Infektion. Beim Suspendieren in einem Kulturmedium unterliegen Zellen, bei denen In-vitro-Mitose auftritt der Mitose auch in den Kapseln. Der normale, in vitro stattfindende Metabolismus wird auch in diesem Fall fortgesetzt wenn die für die Stoffwechselprozesse erforderlichen Faktoren ausreichend niedere Molekülmasse besitzen, daß sie die Kapselmembran durchdringen können, oder diese Substanzen zusammen mit den
Aus der obigen Erläuterung geht hervor, daß bei der Membranherstellung weder scharfe Reagentien noch extreme Temperaturen oder andere für Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen schädliche Bedingungen angewandt werden müssen. Daher können auch sehr empfindliche Zellen wie Hepatocyten, Leukocyten, Fibroblasten und Lymphoblasten sowie Zellen verschiedener endocriner Gewebe von Säugetieren und Menschen ohne Schwierigkeiten eingekapselt werden. Zellen mikrobiologischen Ursprungs, wie etwa Hefen, Schimmelpilze und Bakterien, die in ungünstiger Umgebung besser überleben können, sowie inerte Reagentien, Feststoffe oder biologisch aktive Materialien können nach diesem Verfahren natürlich ebenfalls ohne Schädigung eingekapselt werden.
Die eingekapselten Zellen der oben erläuterten Art können in Medien zur Aufbewahrung oder in Kulturmedien suspendiert werden und bleiben frei von bakterieller Infektion. Beim Suspendieren in einem Kulturmedium unterliegen Zellen, bei denen In-vitro-Mitose auftritt der Mitose auch in den Kapseln. Der normale, in vitro stattfindende Metabolismus wird auch in diesem Fall fortgesetzt wenn die für die Stoffwechselprozesse erforderlichen Faktoren ausreichend niedere Molekülmasse besitzen, daß sie die Kapselmembran durchdringen können, oder diese Substanzen zusammen mit den
so Zellen eingekapselt wurden. Die Stoffwechselprodukte
der Zellen durchdringen die Membran, wenn ihre Molekülmasse unterhalb der Obergrenze der Permeabilität
liegt und sammeln sich im Medium an. Die eingekapselten Zellen können nach Wunsch gelagert, versandt oder
kultiviert werden und lassen sich nach der im folgenden erläuterten erfindungsgemäßen Verfahrensweise ohne
Schädigung durch selektives Aufbrechen der Membranen wieder aus ihrer Schutzumhüllung freisetzen.
Das eingekapselte Material kann erfindungsgemäß in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung handelsüblicher Reagentien mit Eigenschaften, die die eingekapselten Zellen nicht nachteilig beeinflussen, freigesetzt werden.
Die Kapseln werden zunächst von dem Medium, in dem sie suspendiert sind, abgetrennt zur Entfernung von Verunreinigungen gründlich gewaschen und anschließend unter Rühren in einer separaten oder vorzugsweise gemischten Lösung vom mehrwertigen Kat-
Das eingekapselte Material kann erfindungsgemäß in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung handelsüblicher Reagentien mit Eigenschaften, die die eingekapselten Zellen nicht nachteilig beeinflussen, freigesetzt werden.
Die Kapseln werden zunächst von dem Medium, in dem sie suspendiert sind, abgetrennt zur Entfernung von Verunreinigungen gründlich gewaschen und anschließend unter Rühren in einer separaten oder vorzugsweise gemischten Lösung vom mehrwertigen Kat-
ionen wie Calciumionen oder anderen einatomigen Ionen,
auch mit niederer Molekülmasse, und einem polyanionischen Trennpolymer (Stripping-Polymer) mit
zahlreichen anionischen Gruppen wie etwa Polysulfonsäuregruppen dispergiert. Polymere mit Polyphosphorsäure-
oder Polyacrylsäure-Gruppen sind ebenfalls verwendbar. Zum Aufbrechen von Membranen, die Zellen
enthalten, ist Heparin, das ein natürliches sulfoniertes Polysaccharid darstellt, bevorzugt.
Die anionische Ladung des eingesetzten Trennpolymers muß ausreichend sein, um die Salzbrücken aufzubrechen.
Die anionische Ladungsdichte kann daher gleich oder vorzugsweise größer sein als die Ladungsdichte
des inneren polyanionischen Polymers (beispielsweise des Gummis), das ursprünglich zur Membranerzeugung
verwendet wurde.
Die Molekülmasse des Trennpolymers sollte mindestens
mit dem des zur Membranerzeugung verwendeten inneren polykationischen Polymers vergleichbar
und vorzugsweise größer sein. Innerhalb der Suspension konkurrieren die Calciumionen mit dem inneren
polykationischen Polymer als Membranbestandteil um die anionischen Stellen am polyanionischen Polymer.
Gleichzeitig konkurriert das in der Lösung gelöste Trennpolymer mit dem polyanionischen Gummi in der
Membran um die kationischen Stellen am polykationischen Polymer. Dies führt zu einem in Wasser dispergierbaren
oder vorzugsweise wasserlöslichen Komplex beispielsweise von Polylysin mit dem polyanionischen
Polymer sowie zur Assoziation der Kationen mit den Gelmolekülen.
Durch diesen Verfahrensschritt wird die Membran für die anschließende Umsetzung mit einem Trennmittel
zugänglich, die das Aufbrechen der Membranen durch Aufnahme zwei- oder dreiwertiger Ionen aus dem Gel
vervollständigt. Typischerweise können Kapselmembranreste, die im Medium verbleiben, soweit sie überhaupt
vorhanden sind, leicht von den Zellen abgetrennt werden.
Eine üblicherweise bevorzugte Lösung für den ersten Schritt des selektiven Aufbrechens der Membranen enthält
1,1% (M/V) Calciumchlorid und 500 bis 1500 Einheiten Heparin/ml Lösung. Diese Lösung wird mit einem
solchen Volumen an Mikrokapseln versetzt, daß sie etwa 20 bis 30% des Gesamtvolumens der Suspension
einnehmen. Calciumchlorid und Heparin sind bevorzugt, wenn Membranen von Zellen enthaltenden Kapseln
aufgebrochen werden sollen, da beide Reagentien mit den meisten Zellen physiologisch verträglich sind
und hierdurch die Möglichkeit von Zellschädigungen auf ein Minimum zurückgedrängt wird. Gemische von
Aluminiumsalzen oder anderen mehrwertigen Kationen (jedoch nicht Mg+ +-Ionen) können ebenfalls zusammen
mit dem Polysulfonsäuresalz oder einem anderen Salz der oben angegebenen Art eingesetzt werden.
Die Konzentration der Ionen und des anionischen Polymers in der in dieser Verfahrensstufe eingesetzten
Lösung kann allgemein in einem weiten Bereich variieren. Optimale Konzentrationen können leicht empirisch
ermittelt werden. Für den jeweiligen Ansatz der eingekapselten Zellen ist dabei die niedrigste noch geeignete
Konzentration bevorzugt
Als Trennmittel zur Durchführung des selektiven Aufbrechens der Membranen wird üblicherweise bevorzugt
Natriumcitrat verwendet, jedoch können auch andere Alkalimetallcitrate und EDTA-Alkalisalze Verwendung
finden. Bei Anwendung von Natriumcitrat beträgt die optimale Konzentration größenordnungsmäßig
55 mM. Wenn die aufzubrechenden Kapselmembranen lebensfähige Gewebe enthalten, wird das Citrat
vorzugsweise in isotonischer Salzlösung gelöst, um die Zellschädigung möglichst weitgehend zurückzudrängen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Kapselerzeugung
Beispiel 1
Einkapselung von Pancreasgewebe
Einkapselung von Pancreasgewebe
Aus Rattenpancreas gewonnene Langerhans'sche Inseln werden zu einer vollständigen Gewebekultur
(CMRL-1969, Connaught Laboratories, Toronto, Canada) in einer Konzentration von etwa 103 Stück/m! zugegeben.
Die Gewebekultur enthält sämtliche zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Langerhans'schen
Inseln erforderlichen Nährstoffe sowie die von den Zellen zur Hormonerzeugung verwendeten
Aminosäuren. 0,4 ml einer Suspension von Langerhans'schen Inseln einer Konzentration von etwa 105
Stück/ml wird anschließend zu 0,5 ml einer l,2%igen Lösung von Natriumalginat in physiologischer Salzlösung
zugegeben.
Anschließend wird eine l,5%ige Calciumchloridlösung angewandt, um die Tröpfchen von größenordnungsmäßig
300—400 μιτι Durchmesser zu gelieren.
Nach Abtrennen der überstehenden Lösung durch Absaugen werden die gelierten Tröpfchen in ein Becherglas
übertragen, das 15 ml einer Lösung enthält, die aus 1 Teil einer 2%igen Pufferlösung von 2-(Cydohexylamino)-ethansulfonsäure
in 0,6%iger NaCl-Lösung (isotonisch, pH = 8,2) und 20 Teilen l%iger Calciumchloridlösung
besteht. Nach 3 min Eintauchen werden die Kapseln zweimal in 1 %iger CaCl2-Lösung gewaschen.
Die Kapseln werden danach in 32 ml einer Lösung eingetragen, die Vso einer l%igen Polylysinlösung (M
35 000) in physiologischer Salzlösung enthält. Nach 3 min wird die Polylysinlösung dekantiert Die Kapseln
werden mit 1% CaCb-Lösung gewaschen und wahlweise 3 min in einer Lösung von Polyethylenimin (M
40 000—60 000) resuspendiert, die durch Verdünnung einer 3,3%igen Stammlösung von Polyethylenimin in
Morpholinopropansulfonsäure-Puffer (0,2 M, pH = 6) mit einer ausreichenden Menge 1 %iger CaCl2-Lösung
zur Erzielung einer resultierenden Polymerkonzentration von 0,12% hergestellt wurde. Die resultierenden
Kapseln mit »permanenten« semipermeablen Membranen werden anschließend zweimal mit l%iger
CaCl2-Lösung und zweimal mit physiologischer Salzlösung
gewaschen und dann mit 10 ml einer 0,12%igen Alginsäurelösung gemischt
Die Kapseln klumpen nicht zusammen; bei vielen Kapseln ist sichtbar, daß sie Langerhans'sche Inseln enthalten.
Das Gel im Inneren der Kapseln wird durch 5 min Eintauchen der Kapseln in ein Gemisch aus Salzlösung
und Citratpuffer (pH = 7,4) wieder verflüssigt Schließlich werden die Kapseln in CMLR- 1969-Medium
suspendiert
Bei der mikroskopischen Untersuchung ergibt sich, daß diese Kapseln eine dünne Membran besitzen, die
eine Insel umgibt innerhalb deren einzelne Zellen sichtbar sind. Moleküle mit einer Molekülmasse bis zu etwa
100 000 können die Membranen durchdringen. Sauerstoff, Aminosäuren, Nährstoffe und Plasmakomponen-
ten, die im Kulturmedium eingesetzt werden, beispielsweise Fetalkälberserum-Komponenten mit niederer
Molekülmasse, können daher zu den Langerhans'schen Inseln gelangen, wobei zugleich eine Ausscheidung des
Insulins möglich ist.
Beispiel 2
Einkapselung von Hepatocyten
Einkapselung von Hepatocyten
Es wird wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle der 0,4 ml Suspension von Langerhans'schen
Inseln nunmehr eine Leberzellensuspension mit 105 Zellen/ml verwendet wird, deren Lebensfähigkeit
nach dem Farbstoff-Ausschlußverfahren (Trypanblau-Ausschluß)
sowie ihre festgestellte Fähigkeit zur kontinuierlichen Harnstoffproduktion nachgewiesen
war.
Es ist bekannt, daß Lebergewebe in vitro Toxine aus der Umgebung aufzunehmen vermag. Toxine, die eine
ausreichend niedere Molekülmasse besitzen, um durch die semipermeablen Membranen hindurchgehen zu
können, werden entsprechend durch die Zellen entgiftet.
Beispiel 3
Einkapselung von Aktivkohle
Einkapselung von Aktivkohle
Es wird wie in Beispiel 1 verfahren mit dem Unterschied, daß anstelle der 0,4 ml der Gewebesuspension
gekörnte Aktivkohle direkt in der Natriumalginatlösung suspendiert und als Vernetzungsmittel Polylysin
mit einer mittleren Molekülmasse von 35 000 verwendet wird. Wenn die Aktivkohlepartikel kleiner sind als der
kleinste Innendurchmesser der zur Tröpfchenerzeugung verwendeten Kapillare, resultiert Aktivkohle mit
großer Oberfläche, die von semipermeablen Membranen umgeben ist. Hierdurch wird in wirksamer Weise
das Auftreten von Aktivkohle-Bruchstücken, Abrieb oder Staub vermieden, wobei das Produkt zur Absorption
von Materialien eines beliebigen, vorgewählten Molekülmassenbereichs aus der durch die Kapseln hindurchgetretenen
Flüssigkeit herangezogen werden kann.
Beispiel 4
Einkapselung von Human-Fibroblasten
Einkapselung von Human-Fibroblasten
Menschliche Fibroblasten, die durch 5 min Behandlung
von Vorhautgewebe mit Trypsin und EDTA bei 37° C in bekannter Weise erhalten sind, werden in einem
vollständigen Kulturmedium (CMLR-1969) unter Zusatz von 40 Volum-gereinigtem Fetal-Kälberserum
0,8% Natriumalginat und 200 mg/ml gereinigtem Collagen aus Kälberhaut suspendiert Die Konzentration der
Zellsuspension beträgt etwa 1,5 · 107 Zellen/mL Die
temporären Alginatkapseln werden wie oben hergestellt Auf den Oberflächenschichten der Kapseln werden
dann durch 3 min langes Suspendieren der Kapsem in einer 0,005%igen (G/V) wäßrigen Lösung von PoIy-L-lysin
(M 43 000) semipermeable Membranen abgeschieden.
Die resultierenden Kapseln werden im Kulturmedium (CMLR-1969) mit einem Zusatz von 10% Fetal-Kälberserum
suspendiert Die obigen Schritte werden sämtlich bei 37° C durchgeführt Nach Inkubation bei
der gleichen Temperatur ergibt sich bei mikroskopischer Untersuchung, daß die Kapseln Fibroblasten enthalten,
die der Mitose unterlagen und innerhalb der Mikrokapseln ihre dreidimensionale Fibroblastenmorphologie
aufweisen.
Selektives Aufbrechen von Membranen gemäß
der Erfindung
der Erfindung
to Beispiel 5
Die Mikrokapseln der Beispiele 1 bis 4 können zum selektiven Aufbrechen der Kapselmembranen ohne
Schädigung des eingekapselten Kernmaterials wie folgt behandelt werden.
10 ml-Portionen der etwa 500 bis 5000 Kapseln/ml enthaltenden Mikrokapselsuspensionen werden absitzen
gelassen; anschließend wird das Suspensionsmedium abgesaugt Die Kapseln werden zweimal mit Salzlösung
gewaschen. Die gewaschenen Kapseln werden anschließend mit einer aliquoten Menge von 3,0 ml Salzlösung
gewaschen, die Heparin in verschiedenen Konzentrationen, die im folgenden angegeben sind, sowie 1,1%
(G/V) CaCk enthält Die Kapseln mit dem darin eingeschlossenen Alginat besitzen nach Abschluß dieses Verfahrensschritts
einen gelförmigen, formbeständigen Innenkern. Die Suspension wird 10 min bei 37° C gerührt;
nach Absitzenlassen der Kapseln wird der Überstand abgesaugt, worauf die Kapseln zweimal mit 3,0 ml
0,15 M NaCl-Lösung gewaschen werden. Nach Absaugen der zweiten Waschlösung werden die Kapseln mit
2,0 ml einer Mischlösung gemischt, die gleiche Volumina einer HOmM Natriumcitratlösung und einer 0,15 M
NaCl-Lösung enthält (pH = 7,4).
Die Kapselmembranen, die mit 1000 Einheiten/ml Heparin behandelt und 1 min in der NaCl-Natriumcitrat-Lösung
verwirbelt worden waren, waren vollständig desintegriert Das gleiche Ergebnis wird mit Kapseln
erzielt die 2 min mit 2000 Einheiten/ml Heparin behandelt und anschließend 15—30 s von Hand verwirbelt
werden. Niedrigere Konzentrationen an Heparin sind bevorzugt, da hierdurch die Möglichkeit von Zellschädigungen
verringert wird.
Nach Auflösung der Membranen können etwa vorliegende Membranreste durch Absaugen und Waschen abgetrennt werden. Nach Resuspendieren im Kulturmedium können die freigesetzten Zellen durch Tryptanblau-Ausschluß getestet werden. Hierbei ergibt sich, daß sie in gesundem, lebensfähigem Zustand sind und relativ wenige Zellen Farbstoff aufnehmen.
Nach Auflösung der Membranen können etwa vorliegende Membranreste durch Absaugen und Waschen abgetrennt werden. Nach Resuspendieren im Kulturmedium können die freigesetzten Zellen durch Tryptanblau-Ausschluß getestet werden. Hierbei ergibt sich, daß sie in gesundem, lebensfähigem Zustand sind und relativ wenige Zellen Farbstoff aufnehmen.
Nach Beispiel 3 hergestellte Kapseln werden nach dem Waschen 6 min unter Rühren mit 3,0 ml einer Lösung
behandelt die 1000 Einheiten/ml Heparin und 1,0% AlCl3 enthält Nach Absaugen des Überstands
wird das Kemmaterial durch 30 bis 90 s Verwirbeln der Kapseln in einer 0,1 M Natriumcitratlösung freigesetzt
Es wird wie in Beispiel 6 verfahren mit dem Unterschied,
daß anstelle von Natriumeitrat 0,10 M EDTA-Na
bei pH 7,0 verwendet wird. Hierdurch wird ein rasches Aufbrechen der Kapselmembranen erzielt
1 I |
IiY
g: |
32 09 045
13 |
14 |
Ί | r | Beispiel 8 | |
ι
t ν t |
U | Nach Beispiel 3 hergestellte Kapseln werden nach dem Waschen mit 3,0 ml einer wäßrigen Lösung behan delt, die 10 mg/ml Polyvinylsulfat (M etwa 50 000) und 5 1% CaCl2 enthält. Die Nachbehandlung mit 0,10 M Na- triumcitratlösung führt zu einer im wesentlichen voll ständigen Auflösung der Kapseln. |
|
t | 10 | ||
1 | 15 | ||
t | |||
ι
I. |
ίο | ||
I | 25 | ||
ι
i |
JO | ||
I | J5 | ||
I | 40 | ||
45 | |||
50 | |||
SS | |||
«0 | |||
C5 |
Claims (1)
1. Verfahren zum selektiven Aufbrechen von Mikrokapseln mit permeablen Membranen auf der Basis
einer Matrix aus einem polykationischen Polymer
und einem polyanionischen Polymer, die über Salzbrücken zwischen den anionischen und kationischen
Gruppen aneinander gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24358481A | 1981-03-13 | 1981-03-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3209045A1 DE3209045A1 (de) | 1982-09-30 |
DE3209045C2 true DE3209045C2 (de) | 1986-06-19 |
Family
ID=22919328
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3209045A Expired DE3209045C2 (de) | 1981-03-13 | 1982-03-12 | Verfahren zum selektiven Aufbrechen permeabler Membranen |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS57197031A (de) |
BE (1) | BE892477A (de) |
CA (1) | CA1184518A (de) |
CH (1) | CH651579A5 (de) |
DE (1) | DE3209045C2 (de) |
DK (1) | DK112382A (de) |
FR (1) | FR2501528A1 (de) |
GB (1) | GB2094750B (de) |
IT (1) | IT1150681B (de) |
NO (1) | NO158284C (de) |
SE (1) | SE454181B (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3209127A1 (de) * | 1981-03-13 | 1982-12-09 | Damon Corp., 02194 Needham Heights, Mass. | Verfahren und system zur herstellung von durch lebende zellen erzeugten substanzen |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DD160393A3 (de) * | 1980-11-14 | 1983-07-27 | Horst Dautzenberg | Mikrokapseln und verfahren zu ihrer herstellung |
NO161446C (no) * | 1981-03-13 | 1989-08-16 | Damon Biotech Inc | Fremgangsmaate for dyrking av celler som er avhengige av forankring. |
US4582799A (en) * | 1983-04-15 | 1986-04-15 | Damon Biotech, Inc. | Process for recovering nonsecreted substances produced by cells |
EP0127989A3 (de) * | 1983-06-01 | 1986-03-26 | Connaught Laboratories Limited | Mikroverkapselung von lebenden Gewebe und Zellen |
CA1196862A (en) * | 1983-06-01 | 1985-11-19 | Anthony M.F. Sun | Microencapsulation of living tissue and cells |
CA1245984A (en) * | 1983-09-01 | 1988-12-06 | Damon Biotech, Inc. | Polyionic microencapsulation |
US4663286A (en) * | 1984-02-13 | 1987-05-05 | Damon Biotech, Inc. | Encapsulation of materials |
EP0152898B1 (de) * | 1984-02-15 | 1990-01-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Verfahren zur Verkapselung und Systeme mit verkapseltem Aktivmaterial |
US4686098A (en) * | 1984-05-14 | 1987-08-11 | Merck & Co., Inc. | Encapsulated mouse cells transformed with avian retrovirus-bovine growth hormone DNA, and a method of administering BGH in vivo |
GB8500121D0 (en) * | 1985-01-03 | 1985-02-13 | Connaught Lab | Microencapsulation of living cells |
EP0213908A3 (de) * | 1985-08-26 | 1989-03-22 | Hana Biologics, Inc. | Transplantierbares Kunstgewebe und Verfahren |
JPS62166891A (ja) * | 1986-01-20 | 1987-07-23 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 細胞培養による有用物質の製造方法 |
US4952506A (en) * | 1986-04-28 | 1990-08-28 | Rohm And Haas Company | Immobilization of nonanchorage-dependent cells |
JPS6348039U (de) * | 1986-09-12 | 1988-04-01 | ||
JPS6379587A (ja) * | 1986-09-22 | 1988-04-09 | Saburo Senoo | 細胞培養用基材 |
US5069831A (en) * | 1988-12-22 | 1991-12-03 | The Mead Corporation | Method for separation of microcapsules and preparation of printing inks |
US5800829A (en) * | 1991-04-25 | 1998-09-01 | Brown University Research Foundation | Methods for coextruding immunoisolatory implantable vehicles with a biocompatible jacket and a biocompatible matrix core |
DK0585368T3 (da) * | 1991-04-25 | 1998-03-16 | Univ Brown Res Found | Implanterbart biokompatibelt immunisolatorisk vehikel til afgivelse af udvalgte terapeutiske produkter |
IL102785A (en) * | 1991-08-20 | 1998-06-15 | Univ Leicester | Method for removing protein from a water- soluble gum and a method of making biocompatible capsules using said gum |
WO2001041809A1 (fr) * | 1999-12-08 | 2001-06-14 | Dmitry Vladimirovich Zybin | Utilisation d'un gel polyacrilamide pour former une capsule dans un tissu d'un mammalien, procede de culture de cellules et procede de traitement des maladies oncologiques et du diabete sucre |
GB201408233D0 (en) | 2014-05-09 | 2014-06-25 | Austrianova Singapore Pte Ltd | Use of polyanionic composition |
WO2020066306A1 (ja) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | 富士フイルム株式会社 | 細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路 |
CN114504561B (zh) * | 2022-03-01 | 2023-08-11 | 陕西科技大学 | 一种用于制备药物渗透泵制剂的水性包衣方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL129921C (de) * | 1958-12-31 | |||
FR1542881A (fr) * | 1966-10-10 | 1968-10-18 | Ncr Co | Procédé de préparation de capsules minuscules à base de polymère |
CH573212A5 (en) * | 1973-06-29 | 1976-03-15 | Feller Marc Rech Tech Et Et Sc | Delayed release agricultural formulations - of herbicide or insecticide absorbed on porous carrier and coed with isolating layer |
US4352883A (en) * | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
-
1982
- 1982-03-11 NO NO820795A patent/NO158284C/no unknown
- 1982-03-12 DE DE3209045A patent/DE3209045C2/de not_active Expired
- 1982-03-12 IT IT20139/82A patent/IT1150681B/it active
- 1982-03-12 SE SE8201557A patent/SE454181B/sv not_active IP Right Cessation
- 1982-03-12 DK DK112382A patent/DK112382A/da not_active Application Discontinuation
- 1982-03-12 CH CH1574/82A patent/CH651579A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-03-12 JP JP57038239A patent/JPS57197031A/ja active Granted
- 1982-03-12 FR FR8204243A patent/FR2501528A1/fr active Granted
- 1982-03-12 CA CA000398210A patent/CA1184518A/en not_active Expired
- 1982-03-12 BE BE0/207557A patent/BE892477A/fr not_active IP Right Cessation
- 1982-03-12 GB GB8207308A patent/GB2094750B/en not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3209127A1 (de) * | 1981-03-13 | 1982-12-09 | Damon Corp., 02194 Needham Heights, Mass. | Verfahren und system zur herstellung von durch lebende zellen erzeugten substanzen |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE8201557L (sv) | 1982-09-14 |
JPS57197031A (en) | 1982-12-03 |
CA1184518A (en) | 1985-03-26 |
CH651579A5 (de) | 1985-09-30 |
DK112382A (da) | 1982-09-14 |
IT8220139A0 (it) | 1982-03-12 |
IT1150681B (it) | 1986-12-17 |
JPS6152737B2 (de) | 1986-11-14 |
BE892477A (fr) | 1982-07-01 |
FR2501528A1 (fr) | 1982-09-17 |
FR2501528B1 (de) | 1984-06-15 |
GB2094750A (en) | 1982-09-22 |
DE3209045A1 (de) | 1982-09-30 |
NO158284C (no) | 1988-08-17 |
NO158284B (no) | 1988-05-09 |
SE454181B (sv) | 1988-04-11 |
NO820795L (no) | 1982-09-14 |
GB2094750B (en) | 1984-08-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3209045C2 (de) | Verfahren zum selektiven Aufbrechen permeabler Membranen | |
DE3209127C2 (de) | ||
DE3012233C2 (de) | ||
DE69531821T2 (de) | Mehrlagige alginatbeschichtungen von biologischen geweben für die transplantation | |
DE69221484T2 (de) | Implantierbare, biokompatible immunisolator-trägersubstanz zum abgeben ausgesuchter, therapeutischer produkte | |
US4407957A (en) | Reversible microencapsulation of a core material | |
DE3504724C2 (de) | Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials | |
DE69829662T2 (de) | Vorrichtung und verfahren zur wundbehandlung | |
DE3209098A1 (de) | Verfahren zur kultivierung verankerungsabhaengiger zellen | |
DE3432143C2 (de) | Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials und so hergestellte Kapseln | |
DE2248475C3 (de) | Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, lagerungsstabilen und infundierbaren Hämoglobinlösungen | |
DE3834634A1 (de) | Antiseptikum-enthaltendes alginat-abdruckmaterial | |
EP1025869A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von stabilem Alginatmaterial | |
CH632789A5 (de) | Enzympraeparat auf der basis traegerfixierter enzyme sowie ihre herstellung. | |
DE2016484C3 (de) | Verfahren zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit von Mikrokapseln | |
DE3414083A1 (de) | Verfahren zur gewinnung von durch lebende zellen produzierten, nicht sekretierten substanzen | |
DE3432923C2 (de) | Biokatalysator und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE10307925A1 (de) | Träger für eine Zellkultur und Verfahren zur Kultivierung von Zellen | |
DE3104815C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Verbundstoffs mit Langzeit-Freigabe | |
DE69425707T2 (de) | Medien für die isolierung und stabilisierung von zellen | |
DE68913890T2 (de) | Verfahren zur züchtung tierischer zellen in grossem massstab und verfahren zur herstellung von trägermaterial dafür. | |
EP0920304B1 (de) | Verfahren zur herstellung eines granulates für die hämodialyse | |
DE69219606T2 (de) | Verfahren zur herstellung von biologische-vertraeglichen kapseln, enthaltend zellen | |
DE60205906T2 (de) | Poröses schwammartiges Cellulosematerial zur Behandlung von Verletzungen | |
EP1718278A1 (de) | Mikrokapsel mit steuerbarer oder verzögerter freisetzung zur immobilisierung von chemischen und/oder biologischen materialien sowie verfahren zu ihrer herstellung |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
8125 | Change of the main classification |
Ipc: C08J 9/38 |
|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: DAMON BIOTECH, INC., NEEDHAM HEIGHTS, MASS., US |
|
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |