DE69425707T2

DE69425707T2 - Medien für die isolierung und stabilisierung von zellen

Info

Publication number: DE69425707T2
Application number: DE69425707T
Authority: DE
Inventors: B. Hu; E. Myers; J. Northup; C. Quijano
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-11
Publication date: 2000-12-28
Anticipated expiration: 2014-01-12
Also published as: EP0636184A1; WO1994016099A1; DE69425707D1; EP0636184B1; JPH07507460A

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung und Stabilisierung tierischer Zellen im allgemeinen. Unter einem der wesentlicheren Gesichtspunkte betrifft diese Erfindung die Verwendung solcher Zellen bei chirurgischen Eingriffen.

Beschreibung des einschlägigen Fachgebietes

Lebende tierische Zellen finden umfangreiche Verwendung bei chirurgischen Eingriffen. Solche Zellen werden zum Beispiel bei Organtransplantationen, bei der Bereitstellung künstlicher Organe und Stoffe und in der Gefäßtransplantationschirurgie verwendet. Eine breite Vielfalt tierischer Zellarten wurde bei verschiedenen chirurgischen Verfahren benützt.
Beispielhaft für die verwendeten Zellarten sind Leberzellen, Langerhans'sche Inseln, Fettzellen, Endothelialzellen und Muskelzellen. Zellen der vorstehenden Art und andere Arten von Zellen wurden typischerweise aus Blutgefäßen, Organen und anderen tierischen Geweben abgetrennt.
Im Falle von Gefäßtransplantationen, insbesondere der Transplantation synthetischer Gefäße, werden lebensfähige Mikroblutgefäß-Endothelialzellen verwendet, um Thrombose zu verhindern. Thrombose bei der Gefäßtransplantation, ein ernstes Problem bei dieser Chirurgie, kann durch Beschichtung eines synthetischen oder natürlichen Transplantats auf der Innenseite mit einer Schicht aus lebensfähigen Blutgefäß-Endothelialzellen vermieden werden.
Mikroblutgefäß-Endothelialzellen sind aus verschiedenen Quellen erhältlich. Eine weithin verwendete Quelle ist Fettgewebe, aus dem Mikroblutgefäß-Endothelialzellen mit verschiedenen Techniken abgetrennt werden können. Die Abtrennung kann mechanisch, chemisch oder enzymatisch erfolgen. Zum Beispiel kann die Aufspaltung oder Aufschließung von Fettgewebe durch die Verwendung proteolytischer Enzyme herbeigeführt werden.
Kollagenase, Dispase, Trypsin, Elastase, Papain, Chymopapain, Pronase, Hyaluronidase und Kombinationen davon sind besonders nützlich, um die komplexen Gemische von Proteinen, Glykoproteinen, Lipiden, Glykolipiden und Mucopolysachariden, welche im Bindegewebe vorgefunden werden, aufzuspalten.
Die in tierischem Gewebe vorliegenden Hauptproteine bilden eine Matrix, um die Zellen zusammenzuhalten. Diese Proteine enthalten Kollagen, Elastin und Fibronectin, welche in ein hydratisiertes Gel eingewoben sind, das durch ein Netzwerk von Glycosaminglycan-Ketten gebildet wird.
Enzymatische Verfahren wurden verbreitet verwendet, um Tiergewebe aufzuschließen, damit die gewünschten Zellen vom Gewebe abgetrennt und verwendet werden können, zum Beispiel für Gefäßtransplantate. Andere, häufig benutzte Verfahren zur Abtrennung von Zellen aus Gewebe beinhalten mechanische Verfahren, wie z. B. das Zerschneiden, Zerhacken, Zerreiben, Sieben oder Abkratzen der anhaftenden Zellen vom Gewebe mit einem Gummischaber, und chemische Mittel, wie den Entzug zweiwertiger Ionen oder die Verwendung von Chelatbildnern.
Kürzlich wurde erkannt, daß es bei Verfahren zur Aufspaltung von Fettgewebe und zur Abtrennung von Blutgefäß-Endothelialzellen, die in solche Fettgewebe eingebettet sind, zweckmäßig ist, verschiedene Enzyme zu verwenden. Diese Verfahren beinhalten ganz allgemein das Mischen von Fettgewebe, welches eingebettete Mikroblutgefäß-Endothelianzellen enthält, wie Liposuktionsfett, mit Kollagenase oder Kombinationen von Kollagenase mit anderen Enzymen unter Bedingungen, welche die Enzyme veranlassen, das Fettgewebe zu zerlegen und aufzuschließen.
Im allgemeinen schädigt der Abbauvorgang die Membranen der Mikroblutgefäß-Endothelialzellen nicht. Bei sorgfältiger Abtrennung der Zellen vom aufgeschlossenen Gewebe können lebensfähige Mikroblutgefäß-Endothelialzellen isoliert werden.
Diese lebensfähigen und intakten Mikroblutgefäß-Endothelialzellen haben besondere Anwendung als Beschichtungen auf dem Inneren von synthetischen Gefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser gefunden, die Menschen und Tieren als Ersatz von Blutgefäßen eingepflanzt wurden, da sie das Thromboserisiko bei Gefäßtransplantationen herabsetzen.
In ähnlicher Weise sind Mikroblutgefäß-Endothelialzellen als Beschichtungen auf den Oberflächen biomedizinischer Implantate ganz allgemein nützlich, wo sie für eine verbesserte biologische Verträglichkeit mit dem Implantat sorgen.
Offensichtlich tragen die Mikroblutgefäß-Endothelialzellen zur Verhinderung unerwünschter Proteinablagerungen und damit zusammenhängender Zellablagerungen auf den Implantaten bei, von denen bekannt ist, daß sie erfolgen, wenn Fremdmaterial mit Blut und Gewebe in Kontakt gebracht werden. Im Falle von Gefäßtransplantationen können diese unerwünschten Ablagerungen das Blutgefäß schnell veranlassen, sich zu okkluidieren, mit dem Ergebnis des funktionellen Versagens der Transplantation.
Zellen, die aus tierischem Gewebe isoliert werden, schwanken qualitativ und besitzen unterschiedliche Grade der Lebensfähigkeit und Wirksamkeit. Sogar dann, wenn lebensfähige Zellen erfolgreich abgetrennt werden, ist die Ausbeute und der Grad der Lebensfähigkeit häufig unvorhersehbar.
Die unvorhersehbare Natur dieser Verfahren ist vielen Faktoren zuzuschreiben. Ein Faktor ist die Reinheit der Enzyme oder anderer Reagenzien, die bei den Abtrennungsverfahren verwendet werden. Ein anderer Faktor, der zur mangelnden Reproduzierbarkeit bei diesen Verfahren beiträgt, ist die Natur des aufzuschließenden Gewebes.
Während Bindegewebe weitgehend von Kollagen gebildet werden, für das die Kollagenase bezüglich ihrer hydrolytischen Aktivität spezifisch ist, werden zusätzlich beträchtliche Anteile an anderen Proteinen und Glykoproteinen in der Bindegewebematrix gefunden. Häufig sind Mischungen von Enzymen nötig, um das Gewebe wirksam zu spalten.
Vielleicht der Schlüsselfaktor zur Verbesserung der Ausbeute an lebensfähigen Mikroblutgefäß-Endothelialzellen, unabhängig davon, welche Abtrennungstechnik benutzt wird, ist jedoch die Wahl des Mediums, in dem sich die Zellen während der Abtrennung und danach befinden.
Zum Beispiel müssen aus tierischem Gewebe entfernte Zellen sofort nach ihrer Entfernung stabilisiert werden, wenn ihre Lebensfähigkeit aufrechterhalten werden soll. Dies ist besonders wichtig, wenn die Zellen bei chirurgischen Eingriffen verwendet werden sollen.
Bisher verfügbare Zellmedien lieferten physiologisch verträgliche Flüssigkeiten vielerlei Art. Zu solchen physiologisch verträglichen Flüssigkeiten gehören phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, wie Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung und ähnliche Elektrolytlösungen mit Osmolaritäten, die mit physiologischem Gewebe verträglich sind, wie dem im Handel erhältlichen Medium 199, das von Gibco und Sigma geliefert wird.
Diese Medien waren jedoch nicht für klinische Zwecke geeignet. Darüber hinaus waren diese Medien zur Isolierung hoher Ausbeuten an lebensfähigen Zellen und zur Stabilisierung der isolierten Zellen für die Zeitspannen, die für die Verwendung solcher Zellen bei operativen Eingriffen erforderlich sind, nicht vollständig zufriedenstellend.
Wegen der kritischen Situation, bei Operationen die Lebensfähigkeit von so vielen Zellen wie möglich während einer längeren Zeitdauer aufrechtzuerhalten, besteht die definitive Notwendigkeit, eine optimale Umgebung für die Isolierung und Stabilisierung der Zellen zur Verfügung zu stellen.
Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zellmedium anzugeben, das die Zahl der während der Operation zur Verfügung stehenden lebensfähigen Zellen maximiert.
Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist es, ein Zellschutz- oder Zellkeimungsmedium anzugeben, in dem die Lebensfähigkeit der Zellen über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten wird.
Andere Zielsetzungen und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Offenbarung und Beschreibung ersichtlich.
Die Veröffentlichung Transfusion, Band 31, Nr. 1, 1991, S. 21-25, G. Rock et al. gibt die Lagerung von Blutplättchen in Plasmalyte®-Elektrolytlösung an. Diese Lösung enthält Natriumchlorid, Natriumgluconat, Natriumacetat, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid mit einer Osmolarität von 294 mOsmol/l und ist im Handel von Baxter Healthcare erhältlich.
Die EP-A-446450 gibt die Aufschließung von Fettgewebe unter Verwendung des Enzyms Kollagenase und die Abtrennung von Endothelialzellen aus dem aufgeschlossenen Fett an.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Medium zur Stabilisierung lebensfähiger Zellen zur Verfügung, das aus einer Mischung einer physiologisch verträglichen, wässerigen Elektrolytlösung mit einem pH-Wert von 6,5 bis 8,0, die im wesentlichen aus Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Chlorid-, Acetat- und Gluconationen besteht und eine Osmolarität von etwa 270 masmol/l bis 310 masmol/l aufweist, und einer Blutkomponente besteht, ausgewählt aus Blutserum und Blutplasma, wobei die Elektrolytlösung und Blutkomponente im Gemisch in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 19 bis 19 : 1 vorliegen. Die Elektrolytlösung kann Plasmalyte® sein.
Das Stabilisierungsmedium ist insbesondere nützlich beim Zellschutz und bei der Zellkeimung bei Gefäßtransplantationen, wo der Erfolg der Gefäßtransplantation die Beschichtung der Innenseite des Transplantats mit einer Schicht lebensfähiger Zellen erfordert. Ein solches Medium ist auch bei anderen Operationen von Nutzen, wo die Verhinderung von Thrombose kritisch ist, wie z. B. bei Gewebetransplantationen oder Operationen unter Beteiligung künstlicher Organe.
Das Fehlen typischer organischer Nährstoffe, wie z. B. von Aminosäuren und Vitaminen, ist ein entscheidender Vorteil von Schutz- und Keimungslösungen zur Gefäßtransplantationschirurgie, weil das durch die eingesetzte Prothese fließende Blut während der Operation seine eigenen Nährstoffe bildet und so die Versorgung mit zusätzlichen Nährstoffen überflüssig macht.
Darüber hinaus kann die Versorgung mit zusätzlichen organischen Nährstoffen die gewünschte enzymatische oder andere physiologische Aktivität hemmen oder verhindern. Zusätzlich stellt die Verwendung einer Elektrolytlösung, die von Fremdstoffen, wie Nährstoffen oder Konservierungsmitteln frei ist, sicher, daß die erforderlichen Zellen in einer für die Lebensfähigkeit optimalen Umgebung vorliegen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Stabilisierung lebensfähiger Zellen, isoliert aus aufgeschlossenem tierischen Gewebe, für einen Zeitraum von bis zu 4 Stunden zur Verfügung, in dem die Zellen im Stabilisierungsmedium suspen diert sind. Das Verhältnis von Elektrolytlösung zu Blutkomponente beträgt vorzugsweise 3 : 1 bis 7 : 1 Gewichtsteile.
Weitere Zielsetzungen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann unter Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Es zeigen:
Fig. 1 ein Diagramm der Größenverteilung der stabilisierten Zellen in verschiedenen Medien;
Fig. 2 ein Diagramm der Größenverteilung der stabilisierten Zellen in verschiedenen Medien, einschließlich des erfindungsgemäßen Stabilisierungsmediums.

Beschreibung beispielhafter Ausführungsformen

Ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung benützt die enzymatische Aufschließung von Fettgewebe zur Spaltung von Fettgewebe und Abtrennung der darin eingebetteten Mikroblutgefäß-Endothelialzellen. Mikroblutgefäß-Endothelialzellen mit hoher Lebensfähigkeit werden mit hohen Ausbeuten isoliert.
Zellzähltechniken liefern Informationen bezüglich Zellgröße und Zellgrößenverteilung der aus einem gegebenen Ansatz abgetrennten Zellen. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch den Grad der Zellwachstumsaktivität nachgewiesen werden, welche die Aktivität eines in den Zellen vorhandenen Enzyms mißt.
Eine hohe Lebensfähigkeit und eine große Zahl brauchbarer Zellen sind besonders wichtig bei Anwendungen, die das Beschichten der inneren Wände synthetischer kleiner Gefäßtransplantate zum Gegenstand haben. Dies beruht darauf, daß die Fähigkeit von Mikroblutgefäß-Endothelialzellen, die Ablagerung von Protein und die anschließende Okklusion im Transplantat zu verhindern, durch die Gesamtzahl und die Lebensfähigkeit dieser Zellen gesteigert wird.
Eine besonders geeignete handelsübliche Elektrolytlösung ist Plasmalyte®-Elektrolytlösung, erhältlich von Baxter Healthcare mit einem gepufferten pH-Wert von 7,4 und einer Osmolarität von 294 mOsmol/l, erhalten mit kontrollierten Konzentrationen an Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Chlorid-, Acetat- und Gluconationen.
Für Anwendungen mit dem Ziel, Fettgewebe aufzuschließen, zum Beispiel Liposuktionsfett, und die Abtrennung der im Fettgewebe eingebetteten Zellen, enthalten beispielhafte Zusammensetzungen, die dafür benützt werden können, in der Elektrolytlösung die Lösung eines Enzyms oder einer Enzymmischung in einer Menge, die ausreicht, die Eiweißbestandteile aufzuschließen.
Zum Beispiel kann Kollagenase oder eine Mischung von Kollagenase und Chymopapain, die im wesentlichen frei von Zellgiften ist, verwendet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Kollagenase in Konzentrationen von etwa 10 nKat/ml bis 100 nKat/ml und Chymopapain von etwa 0,05 nKat/ml bis etwa 0,5 nKat/ml verwendet.
Die nKat/ml-Einheit ist definiert als die Anzahl von Nanomolen Substrat, die pro Sekunde durch 1 ml Enzymlösung unter den verwendeten Versuchsbedingungen hydrolysiert werden. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Enzymzusammensetzung aus einer Lösung von 50 nKat/ml Kollagenase und 0,25 nKat/ml Chymopapain in Plasmalyte®-Elektrolytlösung.
Die Enzymlösung wird zu etwa gleichen Teil mit dem Fettgewebe vereinigt, zum Beispiel im Verhältnis von 1 ml Enzymlösung zu 1 g Fettgewebe und bei etwa 37ºC unter Schütteln bebrütet, bis die Zusammensetzung trübe wird. Hierdurch wird der gewünschte Grad des Gewebeaufschlusses erzielt.
Die weitere Abtrennung lebensfähiger Zellen aus der bebrüteten Zusammensetzung kann durch Zentrifugieren der bebrüteten Zusammensetzung erreicht werden, bis sich die Adipozyten und der Überstand von der Zusammensetzung abtrennen und sich die Mikroblutgefäß-Endothelialzellen als Kügelchen ausbilden. Die Zellkügelchen können von der getrennten Zusammensetzung durch Abpipettieren der Adipozyten und des Überstandes entfernt werden.
Die isolierten Zellen stehen auf diese Weise in Form eines Kügelchens zur Verfügung. Bevorzugte beispielhafte Verfahren beinhalten weiterhin das Spülen des Zellkügelchens mit einer physiologisch verträglichen Flüssigkeit und das anschließende Zentrifugieren des gewaschenen Zellkügelchens vor der Beurteilung und Verwendung der Zellen.
Durch Liposuktion gewonnene Fettgewebe, die aufgeschlossen werden sollen, sollten vorzugsweise stofflich homogen sein und ohne sichtbare große Fettstücke. Demgemäß können inhomogen erscheinende Liposuktions-Fettgemische vor der weiteren Behandlung in einem Fleischwolfzerkleinert werden. Zusätzlich werden die Liposuktions-Fettgemische vorzugsweise mit einer geeigneten, physiologisch verträglichen Waschlösung gewaschen, um sichtbare Verunreinigungen durch Blut, einschließlich geronnenen Blutes, zu entfernen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Spülung des Gemisches besteht darin, das Liposuktions-Fettgemisch in einen inneren Kunststoffkorb oder eine Siebgewebemühlbecher zu überführen und der Mischung unter Rühren eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzuzugeben. Überschüssige Flüssigkeiten und Verunreinigungen durch Blut werden durch das Wasch- und Siebverfahren entfernt. Das homogenisierte und gewaschene Liposuktions- Fettgemisch ist damit fertig für die vorstehend beschriebenen Aufschließungs- und Mikroblutgefäß-Zellisolierungs-Verfahren.
Wie vorstehend allgemein ausgeführt, werden Mikroblutgefäß- Endothelialzellen, die aus Liposuktions-Fettgewebe und anderen Zellarten, die aus verschiedenen tierischen Geweben isoliert wurden, mit höheren Ausbeuten abgetrennt und besitzen eine größere Lebensfähigkeit als Zellen, die mit Verfahren gemäß dem Stand der Technik abgetrennt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Lebensfähigkeit der Zellen durch Suspendierung der isolierten Zellen in einem Gemisch der Elektrolytlösung mit einer Blutkomponente, welche ein Blutserum oder Blutplasma ist, beträchtlich erhöht. Bei Verwendung in der Chirurgie an Menschen sind menschliche Blutkomponenten bevorzugt. Der Einfachheit halber wird das Blutserum oder Plasma des Patienten, der einer Gefäßtrans plantation unterzogen wird, typischerweise verwendet. Zell- Lebensfähigkeiten von bis zu etwa 4 Stunden können verwirklicht werden.
Die überlegenen physischen und funktionellen Eigenschaften der isolierten Zellen werden durch die größere Zahl von Zellen mit bevorzugten Größen nachgewiesen, wie sie mit bekannten Zellzählungsverfahren bestimmt werden. Zu anderen Indikatoren für überlegene Ergebnisse gehören das verbesserte Adhäsionsvermögen und die Zellwachstumsaktivitäten der isolierten Zellen.
Die verbesserte Fähigkeit der Zellen, an Oberflächen zu haften, und das unbehinderte Zellwachstum veranschaulichen ihre verbesserte Lebensfähigkeit. Auf ähnliche Weise ist eine größere Zahl dieser größeren Zellen ein Gradmesser für ein hochwirksames Verfahren, da intakte und lebensfähige Mikroblutgefäßzellen größer als 7,788 um sind.
Das Material mit großem Teilchendurchmesser besteht bekanntlich aus hoch lebensfähigen stoffwechselaktiven Zellen. Im Gegensatz dazu beinhaltet das Material mit kleinem Teilchendurchmesser Zellmaterial und Gewebetrümmer von geringem therapeutischen Nutzen.
Das Stabilisierungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung, das im Suspendieren der abgetrennten Zellen im erfindungsgemäßen Stabilisierungsmedium besteht, das eine Mischung aus Elektrolytlösung mit Serum oder Plasma ist, hat eine Steigerung und Verlängerung der Lebensfähigkeit der isolierten Zellen zum Ergebnis.
Der stabilisierende Einfluß des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Zählverfahren bewiesen, wie z. B. durch Verwendung eines Coulter Multisizers, um die höhere Zahl beobachteter lebensfähiger Zellen bei Verwendung des erfindungsgemäßen Stabilisierungsmediums zu zeigen.
Zusätzlich beweisen Zellhaftungsstudien, durchgeführt durch Bebrüten einer bestimmten Zahl von Zellen auf Zellkulturplatten, welche mit einer Beschichtung aus Zellhaftungsmolekülen ausgerüstet sind, Waschen der Platten zur Entfernung der nicht angegriffenen Zellen und anschließendes Sichtbarmachen der Dichte angegriffener Zellen, die verbesserte Stabilität und Unversehrtheit von gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung stabilisierten Zellen, welche dicht bedeckte Stellen von auf den Zellkulturplatten haftenden Zellen erzeugt. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, ist dies ein Hinweis auf hoch lebensfähige Zellen mit aktiven Oberflächenrezeptoren für Klebstoff- bzw. Adhäsionsmaterialien.
Schließlich beweisen Zellwachstumsstudien an Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung stabilisiert wurden, zusätzlich ihre erhöhte Unversehrtheit. Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung stabilisiert worden sind und die man sich dann vermehren ließ, wiesen eine höhere Enzymaktivität auf, ein Zeichen für das Vorliegen einer höheren Stoffwechselaktivität als bei den mit Verfahren gemäß dem Stand der Technik isolierten.
Diese Ergebnisse beweisen eindeutig, daß Zellen, die gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, eine größere funktionelle Unversehrtheit aufweisen als vergleich bar behandelte Zellen bei Verwendung von Zusammensetzungen und Verfahrenstechniken gemäß dem Stand der Technik.
Die so erhaltenen, überlegenen physischen und funktionellen Eigenschaften der isolierten Zellen machen sie in der Chirurgie besonders nützlich. Mikroblutgefäß-Endothelialzellen sind zum Beispiel brauchbar als Beschichtungen für die Innenwände von künstlichen Blutgefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser.
Diese Transplantate werden typischerweise aus expandiertem Polytetrafluorethylen, Dacron, Polyurethan, Polyurethanharnstoff oder deren Kombinationen gefertigt und Menschen und anderen Säugetieren als künstliche Blutgefäße eingesetzt.
Werden diese künstlichen Implantate auf der inneren Oberfläche gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren beschichtet, dann macht es die erhöhte Population und bessere Lebensfähigkeit der gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten Mikroblutgefäß-Endothelialzellen für die Zellen leichter, an den inneren Wänden des Transplantats bei vollständiger Belegung zu haften und ihre funktionelle Unversehrtheit aufrechtzuerhalten.
Die hohe Lebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit dieser Zellen erzeugen eine Transplantatoberfläche, die für die Ablagerung von Protein und verwandter Zellen weniger anfällig ist. Dementsprechend unterliegen Transplantate, die gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung behandelt werden, weniger Funktionssausfällen, wie z. B. der Okklusion durch unerwünschte Protein- und Zellablagerungen. Darüber hinaus verhindert ihre Verwendung Thrombosen während des Eingriffs.
Die folgenden, die Erfindung nicht einschränkenden Beispiele, veranschaulichen beispielhafte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung. Die Beispiele beweisen auch die verbesserte Stabilität von Zellen bei Lagerung im erfindungsgemäßen Stabilisierungsmedium.

Beispiel 1:

Kaninchenfett wurde in Kollagenase-Lösung unter Verwendung von entweder 4 mg/ml Kollagenase in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder 4 mg/ml Kollagenase in einer Mischung aus Plasmalyte®-Elektrolytlösung und 4 mg/ml menschlichem Albuminserum gespalten.
Für letztere Lösung wurden 0,4 g Kollagenase und 1,6 ml menschliche Albuminserum-Lösung in 100 ml Plasmalyte®- Elektrolytlösung mit einem pH-Wert von 7,4 und einer Osmolarität von 294 mOsmol/l gemischt. Die Plasmalyte®- Elektrolytlösung hat die in Tabelle 1 wiedergegebene Zusammensetzung.

Tabelle 1:

Natriumchlorid 5,26 g/l
Natriumgluconat 5,02 g/l
Natriumacetat-Trihydrat 3,68 g/l
Kaliumchlorid 0,37 g/l
Magnesiumchlorid 0,3 g/l
Der Aufschluß erfolgte in einem 37ºC Wasserbad (Precision Scientific Dubnoff Metabolic Shaker) durch 20 Minuten Bebrüteten bei 100 Zyklen/min. Ein Kügelchen wurde durch Zentrifugieren bei 1800 Upm während 7 Minuten hergestellt. Das Kügel chen wurde dann in 0,1% Rinderalbumin in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, nochmals bei 1800 Upm während 4 min. zentrifugiert und die Zellen unter Verwendung eines Coulter Multisizers II gezählt.
Die Zellausbeute, die aus Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung abgetrennt wurde, betrug 5,98 · 10&sup5; Zellen pro Gramm Fett. Die Zellausbeute, die aus der Plasmalyte®-Elektrolytlösung abgetrennt wurde, betrug 7,38 · 10&sup5;.
Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigen klar, daß Plasmalyte®- Elektrolytlösung ein stärker wirksames Isolierungsmedium ist als Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Stabilität von Zellen, die aus menschlichem Liposuktionsfett in Plasmalyte®- Elektrolytlösung isoliert wurden, im Vergleich mit der Stabilität von Zellen in einem typischen Zellschutzmedium.

Beispiel 2:

Menschliches Liposuktionsfett wurde 45 bis 90 Minuten vor dem Versuch erhalten. Das Fett wurde mit Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und entwässert. Zehn (10) Gramm Fett und 10 g Kollagenase-Lösung wurden in einen Kolben gegeben und in einen Schüttelbrüter bei 37ºC während 20 min. bei 100 Zyklen/min. gebracht.
Die so erhaltene Dispersion wurde gesammelt und in 15 ml fassende, konische Zentrifugengläser gegossen und bei 1800 Upm sieben Minuten lang zentrifugiert.
Die Endothelialzellen und roten Blutzellen setzten sich am Boden ab. Die dunkle Kollagenase-Lösung bildete eine Mittelschicht und das Fett bildete einen Pfropfen an der Oberseite des Zentrifugenglases. Die dunkle Kollagenase-Lösung und das Fett wurden beide verworfen.
Die Endothelialzellen-Kügelchen wurden in 0,1% Rinderalbumin in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, in einem neuen sterilen konischen Zentrifugenglas gesammelt und bei 1800 Upm 4 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das Endothelialzellen- Kügelchen mit 14% menschlichem Serum in Media 199, geliefert von Gibco, resuspendiert. Die Zell-Lösung wurde zu gleichen Teil in zwei Zentrifugengläser aufgeteilt und bei 1800 Upm weitere 4 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Ein Endothelialzellen-Kügelchen wurde mit Plasmalyte®- Elektrolytlösung und das andere Endothelialzellen-Kügelchen mit Medium 199/Serum resuspendiert. Das Volumen betrug jeweils 5 ml. Die 0,5 ml Endothelialzellen-Suspension wurde mit isotonischer Lösung auf 20 ml verdünnt und die Zellausbeute und Zellgröße wurden mit einem Coulter Multisizer II bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Aus den Kurven in Fig. 1 ist ersichtlich, daß Media 199/Serum ein stärker wirksames Stabilisierungsmittel ist als die Plasmalyte®-Elektrolytlösung. Das folgende Beispiel veranschaulicht die Stabilität von aus menschlichen Liposuktionsfett isolierten Zellen in Plasmalyte®-Elektrolytlösung/Serum, verglichen mit der Stabilität von Zellen in Media 199/Serum.

Beispiel 3:

Es wurde nach dem Verfahren in Beispiel 2 verfahren, außer daß Plasmalyte®-Elektrolytlösung/Serum (14% menschliches Serum) an Stelle von Plasmalyte -Elektrolytlösung eingesetzt wurde.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 wiedergegeben.
Aus den Kurven in Fig. 2 ist ersichtlich (beide Kurven überlagern sich im wesentlichen), daß Plasmalyte®-Elektrolytlösung/Serum, das Stabilisierungsmedium der vorliegenden Erfindung, als Stabilisierungsmittel mindestens so wirksam ist wie Media 199/Serum, einem typischen Medium nach dem Stand der Technik.
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Langzeitstabilität von mit Plasmalyte®-Elektrolytlösung/Serum stabilisierten Zellen verglichen mit der Stabilität von mit Media 199/Serum stabilisierten Zellen.

Beispiel 4:

Es wurde nach dem Verfahren im Beispiel 3 vorgegangen. Die Zahl der isolierten Zellen mit einem Durchmesser von > 7,78 Mikrometer pro 500 Mikroliter Lösung wurde nach 2-stündiger Lagerung bei Raumtemperatur unter Verwendung von entweder Plasmalyte®-Elektrolytlösung/Serum oder Media 199/ Serum bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2:

Plasmalyte®-Elektrolytlösung/Serum Media 199/Serum
13969 ± 151 12954 ± 200
Die Ergebnisse zeigen, daß Plasmalyte®-Elektrolytlösung/- Serum bei der Stabilisierung von Zellen nach 2 Stunden Lagerung stärker wirksam ist als Media 199/Serum.

Claims

1. Medium zum Stabilisieren von lebensfähigen Zellen, bestehend aus einer Mischung aus:

- einer physiologisch verträglichen wässerigen Elektrolytlösung mit einem pH-Wert von 6, 5 bis 8,0, die im wesentlichen aus Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Chlorid-, Acetat- und Gluconationen besteht und die eine Osmolarität von ca. 270 mOsmol/l bis 310 mosmol/l aufweist; und

- einer Blutkomponente, ausgewählt aus Blutserum und Blutplasma,

- wobei die Elektrolytlösung und die Blutkomponente in der Mischung in einem Gewichtsanteil von 1 : 19 bis 19 : 1 vorhanden sind.

2. Medium nach Anspruch 1, wobei die Elektrolytlösung und die Blutkomponente in der Mischung in einem, Gewichtsanteil von ca. 3 : 1 bis 7 : 1 vorhanden sind.

3. Medium nach Anspruch 1, wobei die Blutkomponente menschliches Blutserum ist.

4. Verfahren zum Stabilisieren lebensfähiger Zellen, die aus aufgeschlossenem tierischen Gewebe während eines Zeitraums von bis zu 4 Stunden isoliert wurden, welches das Suspendieren der Zellen in dem Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Tiergewebe ein menschliches Gewebe ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, umfassend das Isolieren lebensfähiger Endothelialzellen aus Gewebe, das diese vor der Stabilisierung der Zellen enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

- Bereitstellen einer Elektrolytlösung mit einem pH-Wert von 6, 5 bis 8,0, die im wesentlichen aus Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Chlorid-, Acetät- und Gluconationen besteht und die eine Osmolarität von ca. 270 mosmol/l bis 310 mosmol/l besitzt und die eine Enzymzusammensetzung in einer Menge enthält, um das Gewebe aufzuschließen;

- in-Kontakt-bringen des Gewebes mit der Lösung während einer Zeitdauer und einer Temperatur, die ausreicht, um das Gewebe im wesentlichen aufzuschliessen, während die im Gewebe enthaltenen lebensfähigen Zellen intakt bleiben; und

- Abtrennen der lebensfähigen Zellen vom aufgeschlossenen Gewebe.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zellen Mikroblutgefäß-Endothelialzellen sind.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Gewebe Fettgewebe ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Enzymzusammensetzung eine Substanz enthält, die aus Kollagenase, Dispase, Trypsin, Elastase, Papain, Chymopapain, Pronase, Hyaluronidase und Mischungen davon ausgewählt ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, bei dem man anschließend die innere Wandoberfläche einer länglichen, im wesentlichen rohrförmigen, physiologisch kompatiblen Membran mit den abgetrennten lebensfähigen Zellen beschichtet, um ein Gefäßtransplantat mit einer verbesserten Widerstandsfähigkeit gegenüber Okklusion herzustellen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Membran aus Polytetrafluorethylen, Dacron, Polyurethan, Polyurethanharnstoff oder Kombinationen davon hergestellt wird.