DE3111593A1

DE3111593A1 - D-allose-derivate, verfahren zu ihrer herstellung und diese enthaltende antitumormittel

Info

Publication number: DE3111593A1
Application number: DE19813111593
Authority: DE
Inventors: Kenichi Kamakura Kanagawa Edanami; Toshio Sagamihara Kanagawa Kuroda; Masahide Yokohama Kanagawa Yamada
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-03-24
Filing date: 1981-03-24
Publication date: 1982-03-11
Also published as: DE3152632C2; US4349546A; DE3111593C2; JPS5940400B2; JPS56158797A

Description

Es ist bekannt, daß zahlreiche Nitrosoharnstoff-Derivate antitumorale Wirkung zeigen. So sind beispielsweise 1-(2-Chloräthyl)-2-(methylcyclohexyl)-1-nitrosoharnstoff (Me-CCNU)₁ 1,3-bis-(2-Chloräthyl)-1-nitrosoharnstoff (BCNU) und 1-(2-Chloräthyl)-S-cyclohexyl-i-nitrosoharnstoff (CCNU) gegen Hirntumoren, Melanome, Lymphbme etc. im Frühstadium wirksam.

Weiter sind zahlreiche Verbindungen, wie Streptozotocin (J. Amer. Chem. Soc, (1967), Bd. 89, S. 4808), Chlorozotozin (J.Med. Chem., (1975) Bd. 18 (1), S. 104 und Glycopyranosidamin-Derivate (JP-OS 144 319/1979) als Zucker-Nitrosoharnstoff-Derivate mit antitumoraler Wirkung beschrieben.

Für ein ausgezeichnetes Antitumormittel ist es jedoch auch erforderlich, daß der Wirkstoff spezifisch und selektiv auf die Tumorzellen, und möglichst gering auf normale Zellen wirkt.

Aufgabe der Erfindung ist es , neue Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die mit großer Sicherheit für normale Zellen eine hohe antitumorale Wirkung entfalten. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Die erfindungsgemäßen D-Allose-Derivate der allgemeinen Formel I, d.h. die 3-[3-(2-Halogenäthyl)-3-nitrosoharnstoff ]-3-desco$r-D-allose-Derivate können durch Behandlung der Verbindungen der allgemeinen Formel II mit einem Nitrosierungsmittel und anschließende Hydrolyse der Schutzgruppe in Gegenwart einer Säure hergestellt werden.

L ' J

— ο- Ί Beispiele für Nitrosierungsmittel sind Alkalimetallnitrite, wie Natriumnitrit und Kaliumnitrit,, niedere Ester der salpetrigen Säure, wie Amylnitrit und Butylnitrit, Distickstofftrioxid und Stickstofftetroxid. Bevorzugt sind Natriumnitrit und Kaliumnitrit.

Die Menge des eingesetzten Nitrosxerungsmittels liegt bei 1 bis 5 Mol, vorzugsweise 1,1 bis 1,5-Mol pro Mol Verbindung der allgemeinen Formel II.

Beispiele für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Säuren sind anorganische und organische Säuren, wie Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure und Chlorwasserstoff säure. Bevorzugt ist Trifluoressigsäure.

Die Umsetzung erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 1 bis 3. Bei Verwendung einer anorganischen Säure erfolgt die Reaktion jedoch vorzugsweise in einem Zweiphasensystem von Diäthyläther/Wasser oder Chloroform/Wasser. Die Reaktionstemperatur beträgt O bis 5 C, vorzugsweise etwa 2 C.

Die Reaktionszeit und der Reaktionsdruck sind nicht kritisch. Im allgemeinen erfolgt die Umsetzung innerhalb 1/2 bis 1 Stunde unter atmosphärischem Druck.

Die Aufarbeitung des erhaltenen Produkts erfolgt auf übliche Weise durch Konzentrieren bei 20 bis 40, vorzugsweise 25 bis 30 C. Zur Entfernung des Salzes folgt anschließend eine Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, wie einem stark sauren Harz, beispielsweise Amberlite IR 120 (H ).

Die Reinigung erfolgt beispielsweise durch Chromatographie an Silicagel (WAKO C-300).in an sich bekannter Weise.

Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen Formel II sind ebenfalls neu. Sie können wie folgt hergestellt werden:

3-Amino-3-deoxy-1,2,5,6-di-O-isopropyliden-a-D-allofuranose (vgl. Carbohydr. Rev., (1968),Bd. 6 S. 276), wird mit einem entsprechenden Harnstoff bildenden Mittel, wie Chloräthyliso cyanat, Bromäthylisocyanat oder Jodäthylisocyanat unter BiI-dung der Verbindung der allgemeinen Formel II umgesetzt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I sind neu und sicherer in der Anwendung als übliche Antitumor mittel; sie wirken weniger myelotoxisch und sind insbesondere wirksam gegen Leukämie, Lewis-Lungenkarzinom und Melanom.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben für Mäuse einen LD₅₀-Wert von 65,5 bis 550 mg/kg. Sie sind besonders sichere Antitumormittel, da sie eine weit geringere Myelotoxizität zeigen als die bekannte Verbindung 1-(2-Chloräthyl)-2-(4-methylcyclohexyl)-1-nitrosoharnstoff (Me-CCNü). Die erfindungs gemäßen Cytostatika können in üblicher Weise, beispielsweise peroral, intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden.

Sie können direkt oder als Gemisch mit pharmazeutisch üblichen Trägern und Hilfsstoffen zu den verschiedensten Präparaten, wie Tabletten, Pillen, Granulat, Puder, Kapseln, Sirupen und Injekitonslösungen konfektioniert werden.

Die erfindungsgemäßen Antitumormittel eignen sich besonders zu Injektionspräparaten, da sie in Wasser löslich sind' und Wasser aufgrund seiner niedrigen Toxizität gegenüber Lebewesen ein bevorzugtes Verdünnungsmittel ist.

Die erfindungsgemäßen Antitumormittel können mit anderen Antitumormitteln oder krebshemmenden Mitteln, Antibiotika, Antiphlogistika oder Mittel zur aktiven Immunisierung verwendet werden.

Für die Konfektionierung geeignete Träger sind Polyvinylpyrrolidin, Natriumchondroitinsulfat, Gelatine, menschliches

Serumalbumin, Dextran Τ-10, Calciumgluconat, Calciurtipantothenat, Calciumlactat, ß-Cyclodextrin, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, pflanzliche Öle, Carboxymethylcellulose, Propylenglykol, Hydroxypropy!cellulose, Citronensäure, Natriumhydrogenphosphat, Mannit und Polyvinylalkohol .

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispieli

2,0 g 3-[3-(2-Chloräthyl)-harnstoff]-3-desoxy-1,2,5,6-di-0-isopropyliden-a-D-allofuranose werden in 20 ml 85prozentige Trifluoressigsäure gelöst und auf 0 bis 5°C abgekühlt.

Anschließend wird die Lösung mit 0,5 g Natriumnitrit versetzt und 1 Stunde gerührt. Dann wird die Lösung bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck konzentriert. Der ölige Rückstand wird in wenig Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit Amberlite IR 120 (H⁺)-harzgefüllten Säule gegeben.

Anschließend wird mit Wasser eluiert, das dann unter vermindertem Druck konzentriert wird, wobei die Temperatur nicht mehr als 40 C betragen soll. Der ölige Rückstand wird in wenig Methanol gelöst und an 0,5 g Silicagel (WAKO C-300) adsorbiert. Das Silicagel wird auf eine mit Silicagel gefüllte Säule an oberster Stelle gegeben und mit einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 9 : 1 eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40 C konzentriert. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0,5 g 3-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoharnstoff]-desoxy-D-allose als hellgelbes Pulver erhalten (Ausbeute 31,3 % d.Th.).

F. 56 bis 59°C (Zers.)

[a]^²; + 20° (C = 1,09 CH₃OH).
35

L . J

Elementaranalyse für C_nH_- N_O_C1:

y 16 j '

ber.: gef.:

IR-Spektrum (KBr) -1 ,,.

34,46$ 5,14$ 13,40$ 34,25$ 5,03$ 13,12$

1680 cm

-1

N=O^}

1500 cm NMR-Spektrum (CH₃OD-TMS)

64,10 (2H, t, J=6 Hz, N-CH₃-)

55,10 (4/5 H, d, J 65,27 (1/5 H, d, J 68,50 (1 H, d, J_3f

₁ ₁ _NH=

= 6 Hz, = 4 Hz, 9 Hz, NH)

= 4 Hz, a-H₁)

Herstellung der Ausgangsverbindung

Eine Lösung von 3,0 g 3-Amino-3-desoxy-1,2,5,6-di-O-isopropyliden-a-D-allofuranose in 50 ml wasserfreiem Aceton wird auf 0 bis 5°C abgekühlt und unter Rühren mit 2,0 ml 2-Chloräthylisocyanat versetzt. Nach weiterem einstündigem Rühren wird das Gemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Diäthyläther digeriert und die gebildeten Kristalle abfiltriert. Nach dem Umkristallisieren werden 3,07 g 3-[3-(2-Chloräthyl)-harnstoff]-3-desoxy-1,2,5,6-di-O-isopropyliden-a-D-allofuranose erhalten (Ausbeute: 61 % d.Th.).
F.: 157 bis 158,5°C

[α]

22

+

(C = 1, CHCl₃)

Elementaranalyse für

IR-Spektrum (KBr)

O₆Cl: CHN

ber.: 49,38$ 6,9i£ 7,68$ gef.: 49,51$ 6,98$ 7,49$

3390 cm 1690 cm

-1

^(V N-H^} ^{V C=0^}

NMR-Spektrum (CDCl₃-TMS)

61,30, 1,43, 1,50 (12H, s χ 3, CH₃

63,57 (4H, s, CH₃CH₂Cl)

64,55 (1H, t, J_{1 2}=J_{3 3}= 4 Hz, H₃)

65,50 (1Η, d, J= 7 Hz, NH)
65,75 (1H, d, J_{1 2}= 4 Hz, H₁)
65,75 (1H, NH).

Die folgenden Tierversuche zeigen die antitumorale Wirkungen von 3-[3-(2-Chloräthyl)-3-nitrosoharnstoff]-3-desoxy-D-allose (im folgenden kurz CNUA bezeichnet) als eines der erfindungsgemäßen Nitrosoharnstoffderivate der allgemeinen Formel I.

Versuch 1:

Antileukämietest

a) Versuchstiere: Etwa 6 Wochen alte CDF-Mäuse mit einem

Gewicht von je 22 +^ 1 g, wobei eine Versuchsgruppe aus 7 männlichen Mäusen besteht.

b) Versuchsmethode:

Je 1 χ 10 Leukämie L-1210 Zellen, werden jeder Maus in das Abdomen implantiert. Nach 24 Stunden wird eine bestimmte Menge CNUA, in isotonischer Natriumchloridlösung gelöst, der Maus intraperitoneal, intravenös bzw. peroral verabreicht. Nach 60 Tagen wurde die Geschwindigkeit der Apothanacie in % und die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

15 20 25 30 35

--10--

Tabelle I

Dosis (mg/kg/Tag)	Verabrei- . chungsart	%	Zahl der . Überlebenden
11,3	iPi Tag ^x	86	1/7
22_;5	Il	157	3/7
45	Il	>757	7/7
60	Il	>757	4/7
11;3	ipj Tag 1-3	143	1/7
22,5	Il	>757	5/7
• 45	Il	>757	5/7
60	Il	>757	4/7
5	iv, Bag I	29	0/7
10	Il	43	0/7
20	Il	86	1/7
4o	It	> 757	4/7
50	It	400	2/7
100	po, Tag 1	86	0/7
200	Il	100	3/7
300	Il	100	2/7
4oo	It	57	2/7

a) ip: = intraperitoneal

iv: = intravenös

po: = peroral

Tag 1: Der Wirkstoff·CNUA wird 1 Tag, d.h. 24 Stunden

nach der Implantation von L-I210 verabfolgt.

Tag 1-3: Der Wirkstoff wird einmal täglich innerhalb

von drei aufeinanderfolgenden Tagen verabfolgt.

b) ILS: Die Geschwindigkeit der Apothanasie in % wird nach folgender Gleichung berechnet:

Durchschnittszahl Durchschnittszahl der Überlebenstage - der Überlebenstage in der behandelten in der Kontroll-

_ILS = ^GruPP^e ?^ruPP^e X100

Durchschnittszahl der Überlebenstage

in der behandelten Gruppe

c) Zahl der Überlebenden ist gleich die Anzahl Mäuse, die 60 Tage oder länger in der Gruppe überlebten.

Versuch 2:

Antileukämietest

a) Versuchstiere: siehe Versuch 1.

b) Ver'suchsmethode:

Je einmal 10 Leukämie P-388 Zellen wurden in das · Abdomen jeder Maus implantiert. Nach 24 Stunden wird eine bestimmte Menge CNUA als isotonische Natriumchloridlösung jeder Maus verabfolgt. Es wurde die Geschwin-

3Q digkeit der Apothanasia in % und die Anzahl der überlebenden Tiere nach 60 Tagen festgestellt.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle II zusammenge^faßt-

10

	Tabelle II	^:-..-·..· .:. 3111593
	ILS (%)
Dosis (mq/kg/Tag)	50	Zahl der Über- lbenden
3,75	90	0/7
7;5	24:0	0/7
15	>500	3/7
30	> 500	5/7
^5	>500	7/7
60	6/7

Versuch 3:

Untersuchung der therapeutischen Wirkung auf Lewis-Lungenkarzinome

a) Versuchstiere: Etwa 6 Wochen alte BDF-Mäuse mit einem

Körpergewicht von 22 +_ 1g, in Gruppen von 7 männlichen Mäusen.

b) Versuchsmethode:

je 5 χ 10 Lewis-Lungenkarzinomzellen werden jeder Maus unter die Haut implantiert. Nach 24 Stunden wird eine bestimmte Menge CNUA jeder Maus intraperitoneal bzw. peroral verabfolgt. Nach 60 Tagen wird die Geschwindigkeit der Apothanasia und die Anzahl der überlebenden Tiere bestimmt.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

35

Γ - . ΐ%'-~ '".'"":' ι οι ι urn ο Π

	....13. .. ..	ILS	■ 3111593
	Tabelle III	0
	Verabrei- chunqsart	0	Zahl der Überlebenden
Dosis mg/kg/Tag	iPi Tag 1	68	0/7
5	It	>172	0/7
10	ti	4	2/7
20	Il	21	6/7
40	ip_s Tag 1-9*	29	0/7
2_Γ23	Il	35	1/7
4,45	ti	80	0/7
6_?67	iv, Tag- 1	> 200	0/7
15	ti	>200	1/7
30	Il	6/7
40	Il	5/7
50

* "Tag 1-9" bedeutet die kontinuierliche Gabe des Wirkstoffs einmal täglich während neun aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend am Tag 1.
25

Versuch 4:

Untersuchung der therapeutischen Wirkung am Melanom

a) Versuchstiere: 6 Wochen alte BDF-Mäuse mit einem Körper-30 gewicht von 22 +_ 1 g, in Gruppen von je

7 männlichen Mäusen

b) Versuchsmethode:

Je 5 χ 10 ß-16 Melanomzellen werden jeder Maus unter die 35 Haut implantiert. Nach 24 Stunden wird eine bestimmte Menge CNÜA intraperitoneal bzw. peroral verabreicht. Nach

L . J

60 Tagen wird die Geschwindigkeit der Apothanasia und die Anzahl der überlebenden Tiere festgestellt.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV 10

Dosis mg/kg/Tag	Verabreichungs art	ILS (%)	Zahl der Überlebenden
5 10	Tag' ¹I ¹^ Il	0 16	0/7 0/7
20	Il	48	1/7
40	Il	6o	2/7
1_;12	Tag 1-9, ip	10	0/7
2₇23	ti	25	0/7
4,45	Il	30	0/7
6_f67	Il	35	0/7
2O	Tag ¹J ^iv·	65	1/7
40	Il	155	1/7
6o	Il	35	0/7

L J

1 Versuch 5;

a) Versuchstiere;

100 mg/kg A'thylnitrosoharnstoff werden trächtigen DDY-Mäusen intraperitoneal 3 bis 4 Tage vor der An-5 kunft des Wurfs verabreicht. Nach der Geburt werden die mit einem Lungen-Autotumor geborenen Mäuse als Versuchstiere in Gruppen von je 10 Mäusen verwendet.

b) Versuchsmethoden;.

10 Vier Wochen nach der Geburt wird eine bestimmte Menge CNUA intravenös bzw. peroral zu bestimmten Zeiten verabfolgt. Nach 9 Wochen wird der Bereich des Tumors bei jeder Maus gemessen und die Hemmungsrate in % berechnet.

c) Versuchsergebnisse:

Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle V-1 zusammengefaßt.

Tabelle V - 1

Verabrei-

chungs-

art

iv

po

Zeitpunkt der Verabreichung

Dosis

Bereich des

Tumors

(Wochen nach der ^g/kg) (_mm^₊ s.E.) .Geburt^ —

Kontrolle" lj-45+pj 30 5,6 40 χ 2 0

5,6,7,8

Hemmungsrate

49_r2

40 χ 2' 0^79+0^31 46 _r 5

XX

40 χ 1 O₇91+p₇8l 37₇2

Kontrolle 1.41+0.44 133x4

200x4

267x4 0

₇55+

333x4

O₇66+p₇l4

X ρ < 0.01
XX ρ <0j05

44_r7 44_r7 6l₇o 53,2

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Verbindung CNUA eine starke antitumorale Wirkung gegenüber Leukämie L-1210, P-388, Lewis-Lungenkarzinom, ß-16 Melanom und Lungen-Autotumor zeigt, in dem sie das Leben der Warmblüter mit derartigen Tumoren verlängert oder die Proliferation von Tumorzellen hemmt.

Toxizitätsbestimmung

Eine isotonische Lösung von CNUA in wäßrigem Natriumchlorid wird männlichen DDY-Mäusen mit einem Gewicht von je 20 bis 22,5 g intraperitoneal, intravenös bzw. peroral verabreicht; die LD_5Q-Werte sind in der Tabelle V-2 zusammengefaßt.

Tabelle V-2

Verabreichungsart -^D₅₀

ip 65,5

iv 80

P° ⁵⁵°

Vergleichsversuch

Es wird die Wirkung von CNUA und 1-(2-Chloräthyl)-3-(trans-4-methylcyclohexyl)-1-nitrosoharnstoff (Me-CCNU) durch Zählung der periphären Leukozyten untersucht.

a) Testtiere:

6 Wochen alte DDY-Mäuse mit einem Körpergewicht von je 22 _+ 1 g, in Gruppen von 5 männlichen Mäusen.

b) Versuchsmethode:

CNUA und Me-CCNU werden am ersten Tag intraperitoneal verabfolgt. Anschließend wird der Schwanzvene in bestimmten Zeitabständen Blut entnommen, um die Leukozyten zu zählen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammenge-

faßt. Der Wirkstoff wurde als isotonische Natriumchloridlösung verabreicht.

Tabelle VI

10

15

Periphere Leukozyten, gezählt nach der ip-Abgabe C%, basierend auf Kontrollversuch)

Verbin dung	mg/kg	2 Tag	4 Tag	7 Tag	10 Tag	14 Tag
CNUA	30 60	84₇O 78 ₇ 2	82_;.2 6O₇O	85_r6 64_;5	84₇7 " 8O₇O	159 100
Me-CCNU	20 49	55,P 56_;O	53_;3	5O₇2 34₇O	59,5 4o_f7	145

Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, ist die Myelotoxizität von CNUA geringer als die von Me-CCNU.

25 30 35

Claims

VOSSlUS- VOSSlUS- TAUC-KJN ER· HEUNEMANN · RAUH

PATENTAN WALTE

SIEBERTSTRASSE 4--8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O7S CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN- TELEX 5-29 453 VOPAT D

24. März 198I

u.Z.: R 083 (DV/kä)
Case: OP 81010-02

WAKAMOTO PHARMACEUTICAL CO., LTD., Tokyo, Japan

" D-Allose-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende Antitumormittel "

20

Patentansprüche

1. j D-Allose-Derivate der allgemeinen Formel I

30

HO-

V-OH

OH

NH-C-N-CH2CH2X

Il I O NO

(I)

35

in der X ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom bedeutet.

_ ■) —

2. D-Allose-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der X ein Chloratom bedeutet.

3. Verfahren zur Herstellung der D-Allose-Derivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

Ό —ι

CH₃

(II)

CH₃

CH₃ NH-C-NHCH₉ CH₉ X

Il ο

20

in der X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat,- mit einem Nitrosierungsmittel in Gegenwart' einer Säure behandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure Trifluoressigsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder eine anorganische Säure einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Nitrosierungsmittel ein Alkalimetallnitrit oder Distickstofftrioxid einsetzt.

6. Antitumormittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an

einer Verbindung gemäß Anspruch 1.
35

7. Verbindungen der allgemeinen Formel II

CH₅ ο -

(II)

^CH₃

NH-C-NHCH₂CH₂X

I! ο

15 in der X ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom bedeutet.