DE3050334C2

DE3050334C2 - Verfahren zur Bestimmung von tumorassoziierten, glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen (TAGS) in einer Körperflüssigkeitsprobe und Reagenz zur Durchführung des Verfahrens

Info

Publication number: DE3050334C2
Application number: DE3050334T
Authority: DE
Inventors: Adachi Takasaki Gunma Masakazu
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-07-25
Filing date: 1980-07-25
Publication date: 1986-04-17
Also published as: WO1982000525A1; DE3050334T1; EP0057236A4; NL8020265A; GB2093993A; DK470781A; EP0057236A1

Description

% 25

Die Erfindung betrifft die Bestimmung von tumorassoziierten, glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen, z. B. Glykoproteide oder Glykolipide (nachfolgend TAGS genannt) in einer Körperflüssigkeitsprobe.
Die Bestimmung der Menge von spezifischen Glykoproteiden in Körperflüssigkeitsproben von Krebskranken ist bekannt. Bt. diesem Verfahren macht man von der Antigenität hauptsächlich des Proteinteils von Glykoproteiden Gebrauch. Zum Beispiel h"*simmt man Äj-Foetoproteinmengen und die Mengen an karzinoembryonalem Antigen zur Bestimmung von primären Hepatomen und von Krebs der Verdauungsorgane, insbesondere

'■ Rektumkrebs und dergleichen (si<*iie Igaku no Ayumi, Bd. 106, Nr. 5, Fifth Saturday Special Issue, S. 235—250

[1978]). Diese Verfahren sind jedoch nicht befriedigend, weil sie nur für bestimmte Krebs- und Tumortypen anwendbar sind.

Die zum Stand der Technik zählende, nicht vorveröffentlichte Patentanmeldung 30 03 301 (DE-OS 30 03 301) befaßt sich mit einem Verfahren zur Bestimmung von tumorassoziierten, glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen (TAGS) in einer Körperflüssigkeitsprobe, bei dem man die TAGS in einer Probe dt." Körperflüssigkeit mit einem sich spezifisch mit Galactose-(/? 1 — 3 oder β 1 — 4)-N-Acetylgalactosamin-Bindungen bindenden Lectin unter Bildung eines TAGS-Lectinkomplexes umsetzt und die Menge des TAGS-Lectinkomplexes oder an nicht reagiertem Lectin bestimmt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches, billiges und quantitatives Verfahren zur Bestimmung von TAGS-Niveaus in Körperflüssigkeiten zu zeigen.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Die Erfindung betrifft auch ein Reagens zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
F i g. 1 ist eine grafische Darstellung der Körperflüssigkeiten von Patienten, die unter verschiedenen Krebsen leiden, sowie von bei gesunden Personen gefundenen Mengen an TAGS, bestimmt in Obereinstimmung mit dem Beispiel 2-1, und

F i g. 2 ist eine grafische Darstellung der in verschiedenen Körperflüssigkeiten gefundenen Mengen an TAGS, bestimmt gemäß dem Beispiel 2-2.

Für die vorliegende Erfindung können verschiedene Körp ^flüssigkeiten verwendet werden. Geeignete Körperflüssigkeiten sind z. B. Blut, Gewebeflüssigkeiten, Lymphe, Hydrotorax, Ascites, amniotische Flüssigkeiten, \ Magensaft, Urin, Pankreassaft, cerebrospinale Flüssigkeiten oder Speichel. Besonders bevorzugt, insbesondere

\ 55 in Form von Serum oder Plasma, ist Blut.

Die Menge der für die Proben verwendeten Körperflüssigkeit liegt im allgemeinen bei 1 bis 10 ml, vorzugsweise 2 bis 5 ml.

Erfindungsgemäß kann die Bestimmung von TAGS-Niveaus in einer Körperflüssigkeitsprobe entweder dadurch durchgeführt werden, daß man TAGS aus der Körperflüssigkeit durch Umsetzung mit dem Lecitin unter Bildung eines TAGS-Lecitinkomplexes isoliert und daß man die Menge des TAGS-Lecitinkomplexes oder an nichtumgesetztem Lecitin nach dessen Abtrennung mißt oder indem man ein markiertes Lecitin direkt einer Körperflüssigkeitsprobe zugibt unter Bildung eines markierten TAGS-Lecitinkomplexes, worauf man den markierten TAGS-Lecitinkomplex oder das nichtumgesetzte markierte Lecitin abtrennt und dessen Menge bestimmt.

Zum Abtrennen der TAGS-Fraktion aus der Körperflüssigkeitsprobe können übliche Extraktions- oder Trennverfahren für Giykoproteide enthaltende Substanzen angewendet werden, z. B. Aussalzen, Ausfällen, Lösungsmittelextraktion, Zentrifugieren, Dialyse, Molekularsiebe oder enzymatische Inaktivierung oder eine Kombination von einem oder mehreren dieser Verfahren. Zum Beispiel kann man eine TAGS-Fraktion durch

Zugabe einer die Ausfällung oder die Denaturierung bewirkende Menge von Sulfoalicylsäure, Trichloressigsäure oder ZinksuIFat zu Blutserum oder -plasma oder durch Erhitzen von Blutserum oder -plasma unter Ausfällung von Albumin und Immunoglobulin gewinnen, worauf man die ausgefällten Proteine durch Filtrieren abtrennt und das Filtrat dialysiert

Insbesondere gibt man vorzugsweise eine ausreichende Menge des Schutzproteins zu der Probe, nachdem man Albumine und Immunoglobuline aus der Probe entfernt hat, weil dies die Bestimmung unter kontrollierten Bedingungen ermöglicht.

Bei der Verwendung von Blutproben kann man als Probe Blutserum, das durch übliche Blutserum-Sammelmethoden gewonnen wurde, oder Blutplasma, das durch übliche Blutplasma-Sammelmethoden gewonnen wurde, unter Verwendung eines Antikoagulationsmittels, wie Heparin, EDTA oder Zitronensäure, wobei man Vorzugsweise Blutplasma, das unter \'erwendung von Heparin als Antikoagulationsmittel gesammelt wurde, verwendet. Die Proben können gegebenenfalls, sofern erwünscht, mit Wasser der geeigneten wäßrigen Pufferlösungen verdünnt werden, z. B. in solchen Fällen, in denen das TA.GS-Niveau verhältnismäßig hoch ist, wie in Asciten.

Erfindungsgemäß können solche Lectine, die sich spezifisch mit Galactose-{/? 1 — 3 oder/? 1 — 4)-N-acetylgalactosamin binden, wie beschrieben wird in J.B.C., 250,8518—8523 (1975); Biochem. Biophys. Res. Comm., 62,144 (1975); Z. Immun^:tätsforsch_ 138,423-433 (1969); Br. J. Fxp. Pathol, 27, 228-236 (1946); Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, Nr. 5, S. 2215-2219 (1978); Biochemistry, 13, 196-204 (1974), Carbohydrate Research. 51, 107-118 (1976), ζ. B. Erdnußlectin, Ricinuslectin (Ricinus communis) verwendet werden.

Substanzen, die zum Markieren der Lectine verwendet werden können, um diese durch Radiometrie, Fluorimetrie oder Kolorimetrie nachweisbar zu machen, sind Enzmye, fluoreszierende Substanz:" und radioaktive Substanzen. Geeignete Enzyme sind z. B. Glukoamylase, Glukoseoxidase, Peroxidase, Alkai'phosphatase und Hämociapeptide und deren aktive Fragrr:.:nte. Beispiele für geeignete fluoreszierende Substanzen sind Fluoreszein, Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin und Dansylchlorid (5-Dimethylamino-l-naphthalinsulfonylchIorid) Beispiele für geeignete radioaktive Substanzen sind radioaktives Jod und Tritium. Um Lectine mit den vorerwähnten Markierungssubstanzen zu markieren, können alle üblichen Methoden zum Markieren von Proteinen, wie Antigenen und Antikörpern, mit Enzymen, Fluoreszierungsmiftel und radioaktive Substanzen verwendet werden. Beispielsweise kann man Lectine mit radioaktiven Isotopen nach dem in »Radioimmunoassay«, S. 45—56 (1978), veröffentlicht von der Asakura Publishing Cc, Tokyo, beschriebenen Verfahren markieren.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden markierte oder unmarkierte Lectine vorzugsweise in Mischung mit geeigneten Lösungsmitteln verwendet. Alle Lösungsmittel, welche markierte oder nichtmarkierte Lectine nicht denaturieren, z. B. physiologische Kochsalzlösung, Wasser, 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7,5) oder 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH etwa 7,4), können verwendet werden. Die Menge des in dem Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel enthaltenen Lectins kann je nach den Agglutinationswerten (die durch die End- oder Maximalverdünnung von Serienzweifachverdünnten-Proben definiert wird), der Art der Markierung oder der

ΐ nachzuweisenden Substanzen gewählt werden und liegt im allgemeinen bei etwa 0,01 bis etwa 100μg/ml,

vomigsweise 0,03 bis 40 ug/ml. Die vorerwähnten markierten oder unmarkierten Lectinlösungen können weiter verdünnt werden.

]: Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine vorbestimmte Menge einer TAOS-Fnktion

! oder einer Körperflüssigkeit per se mit einer gegebenen Menge des Lectins oder des markierten Lectins

j vermisc.it, und die erhaltene Mischung läßt man bei etwa 45° C oder darunter, vorzugsweise etwa 4 bis 40⁰C und

!■ insbesondere etwa 20 bis 40°C, zum Reagieren stehen. Df c TAGS-nicht-markiertes oder -markiertes-Lectin-

j Komplex oder das nichtumgesetzte nich?markierte oder markierte Lectin können von dem Reaktionsgemisch in

; üblicher Weise abgetrennt v/erden, z. B. chromatografisch, elektrophoretisch, durch Aussalzen, durch Fraktio-

nieren. Dialyse, Gelfiltration oder durch Absorption oder durch eine Kombination dieser Trennverfahren von

\[ Agargel. Agarosegel oder Polyacrylamidgel.

!' Zur Abtrennung des nichtumgsetzten markierten oder unmarkierten Lectins aus dem Reaktionsgemisch wird

is eine geeignete Menge des Fällungsmittels für den TAGS-Lectin-Komplex zu der obigen Reaktionsmischung

zugegeben, und der entstandene Komplex kann z. B. durch Zentrifugieren abgetrennt werden, wobei man die

j! nichtumgesetzte markierte oder nichtmarkierte Lectinfraktion als überstehende Flüssigkeit erhält. Typische

[j Ausfällmittel sind Poryäthylenglykol, Ammoniumsulfat (bis zur Sättigung) und Rivanol (Acrinol). Die Zentrifu-

!j gierbedingungen können je nach der Art des verwendeten Ausfällmittels gewählt werden. Wird z. B. Polyäthy-

lenglykol als Fällungsmittel verwendet, so wird die Zentrifugierung vorzugsweise bei etwa 1000 g etwa 30 bis 60

I! Minuten durchgeführt.

k In den Fällen, in denen der TAGS-markiertes oder unmarkiertes Lectin-Komplex von dem nichtumgesetzten

j¹ Lectin abgetrennt wird, erfolgt die Abtrennung des Komplexes von dem nichtumgesetzten Lectin einfach, indem

! man von dem Unterschied in der Diffusionsgeschwindigkeit des Komplexes und dem riichtumgesLizten Lectin in

* Agargel, Agarosegel oder Polyacrylamidgel Gebrauch macht. Gibt man d^;e Reaktionsmischung zu einem Gel in

einem Gefäß, so· diffundiert nichtumgesetztes Lectin in das Gel, während der TAGS-Lectin-Komplex auf dem

k Gel, d. h. außerhalb des Gels verbleibt, ohne daß er eindiffundiert. Deshalb können beide voneinander in üblicher

Weise einfach getrennt werden. Hinsichtlich der Zubereitung der Gele liegen keine Beschränkungen vor, und die üblichen Verfahren können für diesen Zweck angewendet werden, z. B. kann man eine bestimmte Menge Agar, Agarose oder Polyacrylamid zu einem Verdünnungsmittel, welches die Proteine nicht denaturier:, geben, beispielsweise destilliertes Wasser, Zitrat oder Tris-HCl-Pufferlösund (pH etwa 7,5) und anschließend unter schwachem Rühren auf 60 bis 80°C zum Zwecke der Auflösung erwärmen und dann die Lösung in ein geeignetes Gefäß, wie ein Reagenzglas, gießen und dort abkühlen lassen, wobei sie wie Gelee erstarrt. Man wählt die Konzentration des Gels in Abhängigkeit von der Dimension (d. h. dem Molekulargewicht, der Stereostruktur und dergleichen]! dei itfarkierungssubstanz und des markierten Lectin-Komplexes. Erfindungsgemäß verwendet man im allgemeinen Gele von etwa 0,4 bis 2,0 Gew.-%, vorzugsweise 0,7 bis 1,0 Gew.-%. Erforderlichenfalls kann

das gebildete Gel ein Konservierungsmittel enthalten. Die Oberfläche des so hergestellten Gels kann flach oder konkav sein, wobei man die letztere Form bevorzugt, weil die gebildeten Komplexe nicht an den Wandungen des Gefäßes anhaften.

Die Menge an TAGS-markiertem oder unmarkiertem Lectin-Komplex oder an nichtumgesetztem markierten oder unmarkierten Lectin, mißt man in üblicher Weise, und das TAG-Niveau in der Körperflüssigkeit kann man dann aus dem erhaltenen Wert berechnen.

Zum Messen dar Menge an restlichem, nichtmarkierten Lectin, sind verschiedene Methoden geeignet. Vorzugsweise gibt man jedoch zu den Proben eine Substanz, die in der Lage ist, mit dem Lectin spezifisch unter Agglutination oder Ausfällung zu reagieren, wobei man dann die Änderung visuell oder durch Messen mittels

ίο optischer Analyse, z. B. der optischen Dichte, beobachtet. Beispiele für geeignete lectinagglutinierende Substanzen sind Glykoproteine mit einer Galactose-(/? 1 —► 3 oder β 1 —► 4)-N-acetylgalactosamin-Endgruppe, z. B. Kaninchenerythrocyten, Erythrocyten von Neuraminidase-behandelten Schafen und dergleichen, sowie Sephadex, Glasperlen und dergleichen, die mit den vorerwähnten Glykoproteinen bedeckt sind.

In der Praxis kann man das Verfahren in der nachfolgenden Weise anwenden. Die vorerwähnte Reaktionsmischung wird serienmäßig mit jeweils zweifacher Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel, z. B. mit 0,15 m Phosphatpufferlösung oder physiologische Kochsalzlösung verdünnt, und Aliquote der Verdünnung werden auf Platten oder Objektträger oder kleine Reagenzgläser gegeben, und jeder Aliquot wird mit einer Substanz, die fähig ist, das Lectin spezifisch unter Rühren zu agglutinieren, vermischt, und die Platten oder anderen Träger, weiche die mischung enthalten, IaSi man dann bei 45⁰C oder weniger, vorzugsweise 4 b's 40°C. während 30 Minuten oder mehr, vorzugsweise 60 bis 90 Minuten, stehen, um die End- oder Maximalverdünnung, bei welcher eine Agglutination noch stattfindet, zu beobachten. Diese Maximalverdünnung wird als Agglutinationswert bezeichnet. Die bei der Erfindung verwendbaren Lectine weisen im wesentlichen den gleichen Agglutinationswert auf.
Wird z. B. ein Enzym (wie Peroxidase) zum Markieren des Lectins verwendet, so wird eine vorbestimmte Menge des Reaktionsgemisches auf die Oberfläche des Gels in einem Reagenzglas getropft und dort bei etwa Raumtemperatur, vorzugsweise bei 4 bis 25°C, 1 bis 48 Stunden stehen gelassen. Dann gibt man eine gegebene Menge eines geeigneten Substrats für das Enzym (z. B. Wasserstoffperoxid) zu dem Reaktionsgemisch, bei dem durch diese Behandlung eine Enzymreaktion bewirkt wird, und stoppt diese dann nach einer geeigneten Zeit ab und mißt die optische Dichte der erhaltenen Mischung, falls erforderlich, unter Verwendung eines Farbstoffs oder Farbbildners (z. B. o-Phenylendiamin). Wird eine fluoreszierende Substanz zur Markierung des Lectins verwendet, so wird eine vorbestimmte Menge eines Verdünnungsmittels, wie eine Pufferlösung, zu dem Reaktionsgemisch auf dem Gel nach der Inkubierung gegeben, und die Intensität der Fluoreszenz der erhaltenen Mischung wird gemessen.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Reagenz verwendet, das ein sich spezifisch mit Ga!actose-(/? 1 —► 3 oder/? 1 — 4)-N-acetylgalactosamin-Bindungen bindendes Lectin enthält.

Das Lectinreagenz kann auch einen Stabilisator und/oder ein Konservierungsmittel für das Lectin, wie ein Protein mi? niedrigem Zuckergehalt- z. B. Rinderserumalbumin, enthalten. Bevorzugt ist das Pflanzenlectinreagenz gefriergetrocknet und wird zum Gebrauch mit einem Rekcnstituierungsmittel, enthaltend ein auf Wasser aufgebautes oder mit Wasser mischbares Lösungsmittel (pH etwa 6 bis 7,8, vorzugsweise 7 bis 7,2) wiederaufbereitet. Gewünschtenfalls kann das Reagenz auch Puffer zur Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Wertes in dem rekonstituierten Reagenzsystem und Konservierungsmittel und/oder Stabilisatoren, die einen Abbau des Materials vor der Anwendung verhindern, enthalten. Ein pH von etwa 6 bis 7,8, insbesondere ein pH von 7 bis 7,2, kann angewandt werden, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Das Rekonstituierungsmittel kann vorzugsweise Wasser als Lösungsmittel enthalten und kann z. B. eine physiologische Kochsalzlösung oder Phosphatpufferlösung sein. Ein wassermischbares Lösungsmittel, das die Reaktion nicht beeinträchtigt, kann ebenfalls zugegeben werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Diagnose aller Krebs- und Tumorarten, wie Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Rektumkrebs, Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Luftröhrenkrebs, Prostatakrebs, Liposarkom, bösartiges Melanom, bösartiges Lymphom, primäres Magensarkom, Hepatom in frühen oder spaten Stadien anwendbar und deshalb besonders zum Nachweis von Krebs im Frühstadium geeignet. Die Erfindung wird ü den Beispielen näher erläutert. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile oder Prozentsätze auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Bestimmung unter Verwendung der
Inhibierungsreaktion von Blutzellenagglutination

(1) Herstellung der Testprobe

Blut wurde von 7 Patienten mit Magenkrebs, 4 Patienten mit Lungenkrebs, 3 Patienten mit Brustkrebs und jeweils 1 Patienten mit Darmkrebs, Rektumkrebs, Eierstockkrebs, Mundhöhlenkrebs, Zungenkrebs, Luftröhrenkrebs, Gebärmutterkrebs, Prostatakrebs, bösartigem Melanom, Liposarkom, bösartigem Lymphom und primärem Magensarkom sowie 7 gesunden Personen gesammelt, und die Plasmaproben wurden in üblicher Weise zubereitet Zu den Plasmaproben wurde eine 6°/oige wäßrige Sulfosalicylsäurelösung anteilartig unter Rühren zugegeben, bis das Verhältnis des Additivs zum Plasma 1 :1 VoI.-% betrug. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung mit 3000 bis 3500 Upm während 10 Minuten zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit Wasser und 0,15 m Phosphatpufferlösung während 24 Stunden unter Zubereitung der Testprobe dialysiert.

IU24 + +	—	_ _ —	,4-4-4-	— —	XIlI	_ _ _ _	₊
512 + 4-					XIV	4-
256			Eierstockkrebs		XV		Liposarkom
128 4-4-4-	• 4- 4-	4-	Mundhöhlenkrebs		XVI	4- 4-	bösartiges Melanom
64 - -	-4- l	Zungenkrebs	4-		bösartiges Lymphom
32 +		Luftröhrenkrebs			primäres Magensarkom
16	VII	Gebärmutterkrebs	(3) Beobachtung
8 +4	VIII	Prnitri lakrehl
4 2 1 +4	IX
Anmerkung:	X
I gesunde Person	XI
Il Magenkrebs	YlI
III Brustkrebs
IV Lungenkrebs
V Colonkrebs
V/l DaUnm^oKc

(2) Bestimmung

Zu jeder der gemäß (1) erhaltenen Testproben wurde ein gleiches Volumen von 0,15 m Phosphatpufferlösung, in welcher 0,8 μg/ml Erdnußlectin gelöst waren, gegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten unter Rühren bei 20 bis 27°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer 0,15 m Phosphalpufferlösung verdünnt unter Ausbildung einer Zweifach-Verdünnungsserie, von denen jede auf eine V-förmige Platte in einer Menge von 50 μΙ gegeben wurde und mit 50 μΙ Kaninchenerythrocyten (1 χ 10⁸ bis 2 χ 10⁸ Zellen/ml) unter Rühren vermischt νΛ,-rde. Nachdem man die Verdünnung bei 37° C während I Stunde behandelt hatte, wurde das Auftreten von Agglutination von Erythrocyten in jeder der Verdünnungen untersucht. Maximale Verdünnungswerte, bei denen noch eine Agglutination auftrat, wurden als Agglutinationswert bezeichnet, und die Bestimmung wurde unter Anwendung dieses Wertes durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Aggluti- Krankheit nalions-

zahl I Il III IV V VI VII VIII IX X Xl XII XIII XIV XV XVI

Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 wird ersichtlich, daß alle gesunden Personen Agglutinationswerte von 128 oder darüber aufwiesen, während von Krebs befallene Patienten wesentlich geringere Agglutinationswerte hatten als die Gesunden: 6 von 7 Patienten mit Magenkrebs zeigten einen Agglutinationswert von 8 oder darunter, während der andere einen solchen von 32 zeigte. Alle 4 Patienten mit Lungenkrebs zeigten einen Agglutinationswert von 1. Hinsichtlich der anderen Krebsarten wiesen nahezu alle Patienten einen Agglutinationswert von 8 oder darunter auf, mit Ausnahme des Agglutinationswertes von 32 der bei einem Patienten mit Uteruskrebs und einem anderen mit primärem Magensarkom festgestellt wurde. Wie schon erwähnt, betrugen die Agglutinationswerte bei' Patienten mit bösartigen Tumoren oder Krebs in allen Fällen 32 oder weniger, während gesunde Personen einen solchen von 128 oder darüber aufweisen. Deshalb stellt dieses Verfahren eine wirksame Methode dar, um Niveaus in einer Probe der Körperflüssigkeit außerhalb des Körpers zu bestimmen und kann vorteilhaft zur Diagnose verschiedener bösartiger Tumore oder Krebsarten angewendet werden.

Beispiel 2

Bestimmung unter Verwendung von Enzym-markiertem Lectin

(1) Aktivierung von Peroxidase

Zu 1 ml einer 0,3 m wäßi 'gen Natriumhydrogencarbonatlösung, in welcher 5 mg Peroxidase aus Meerrettich gelöst waren, wurden 0,1 ml einer 0,1 m Fluorodinitrobenzoläthanollösung gegeben, und die Mischung wurde schwach während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt Dann wurde zu der Mischung 1 ml einer 0,06 m wäßrigen NaJC>4-Lösung gegeben, und die Lösung wurde während 30 Minuten schwach bei Raumtemperatur gerührt- Die erhaltene Mischung wurde dann mit 1 ml einer 0,1 m wäßrigen Äthylenglykollösung vermischt und 1 Stunde schwach bei Raumtemperatur gerührt, und anschließend wurde die Reaktionsmischung mit 0,01 m Kohler.säure/Natriumhydrogencarbonat-Pufferlösung (pH 95) bei 4° C während eines Tages dialysiert unter Erhalt einer aktivierten Peroxidasezubereitung.

(2) Markierung von Lectin mit Peroxidase

5 mg Lectin (Erdnußlectin) wurden in 3 ml der gemäß (1) zubereiteten Peroxidasezubereitung gelöst, und die Mischung wurde während 2 bis 3 Stunden unter schwachem Rühren bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Zugabe von 5 mg NaBH₄ zum Reaktionsgemisch ließ man dieses während 3 Stunden bei 4⁰C stehen, und die erhaltene Lösung wurde mit 0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,4) 1 Tag lang dialysiert und anschließend durch Sephadex G 150 Gel-Säulenchromatografie einer Gelfiltration unterworfen (Eluiermittel: 0,1 m Tns-HCI-Pufferlösung, pH 7,4). Die optischen Dichten (OD₂₈₀ und OD_WZ) jeder Fraktion wurden gemessen und die Fraktionen, bei denen sich die Peaks von OD₂Ho und OA03 überlappten, wurden gesammelt.

(3) Zubereitung von Agarosegel

Agarose wurde in 0,0t m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) in einer Menge von 1 Vol.-% suspendiert, und die Suspension wurde unter Auflösung auf 70 bis 8O⁰C erhitzt. Zu dieser Lösung wurden 0,0t w/w % Thimerosal gegeben, und die erhaltene Lösung wurde in Reagenzgläser in einer Menge von 1 ml/Reagenzglas gegeben und anschließend bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei man 1 w/w % Agarosegel erhielt.

Beispiel 2-1

_M Polyäthylenglykolmethode

(1) Herstellung der Testprobe

5 ml Blut wurden mittels einer mit Heparin (500 Einheiten) behandelten Blutentnahmevorrichtung jeweils von ->5 25 Krebspatienten, 2 Patienten mit Krankheiten, die anders als Krebs waren, und 23 gesunden Personen entnommen und mit 2000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Das überstehende Plasma wurde als Testprobe verwendet.

(2) Bestimmung

Die gemäß (1) erhaltenen Testproben wurden in 2 Reagenzgläser in einer Menge von 200 μΙ/Reagenzglas gegeben, und dazu wurden jeweils 50 μΙ der Peroxidase-markierten Lectin-Zubereitung, enthaltend 3,5 μ^/πιΙ Lectin in Tris-HCl-Pufferlösung (pH etwa 7,5), hergestellt gemäß Beispiel 2, gegeben. Nach schwachem Ruhren ließ man die Mischung 1 Stunde bei 20 bis 30⁰C zur Umsetzung stehen. Dann wurden zu einem der Reagenzgläser 250 ul einer Lösung von 8% (w/v) Polyäthylenglykol (Molekulargewicht: 6000) in 0,1 m Tns-HCl-Pufferlosung gegeben, und die Mischung wurde schwach gerührt und stellte die Probe A dar, und 250 μΐ einer 0.1 m Tris-HCl-Pufferlösung wurde zu dem anderen Reagenzglas gegeben, und die Mischung wurde schwach gerührt und bildete dann die Probe B. Beide Proben A und B wurden 30 bis 60 Minuten bei 20 uis 30¹V umgesetzt unc. dann 40 bis 60 Minuten mit 1000 g auf einem Schwingrotor zentrifugiert. 50 μΐ der überstehenden Flüssigkeit wurden gesammelt, und dazu wurden 2 ml einer zuvor hergestellten physiologischen Kochsalzlösung gegeben. Nach ausreichendem Rühren wurde die Mischung mit 500 μΐ einer Substratlösung, enthaltend OJ m Zitrat-PuF-ferlösung o-Phenylentfiamin (Endkonzentration 6 Gew.-%) und 0,1 Gew.-% Wasserstoffperoxid vernuscht und im Dunkeln 30 Minuten bei 20 bis 30° C umgesetzt. Die Substratlösung war zuvor hergestellt und vorzugsweise bei 4° C aufbewahrt worden. Anschließend wurde 1 ml einer 2 η Chlorwasserstoffsäure zu dem Reaktionsge-

misch gegeben, um die Umsetzung abzubrechen, und die Farbe der Probe wurde spektrofotometnscn, ausgedrückt durch die optische Dichte bei 492 nm, bestimmt.

Die Menge an f AGS-Lectin-Komplex, ausgedrückt als Differenz (c), erhalten durch Abziehen der optischen Dichte (a) von Probe A von der optischen Dichte (b) der Probe B, wurde in Fig. 1 aufgetragen, in welcher das Symbol O für gesunde Personen steht und die Ziffern (I)-(27) folgende Patienten bezeichnen: (1) und (8

so Magenkrebs, (2), (6), (9), (16) und (17) Lungenkrebs, (3), (5), (7), (8), (13) Magenkrebs (Frühstadium) (4) und (14) fortgeschrittener Magenkrebs, (10) Herzversagen, (11) Lymphadenitis, (12) Dickdarmkrebs mit Lebermetastasen (15) Gebärmutterkrebs mit Lungenmetastasten, (19) Hydatidenmole, (20) Dickdarmkrebs, (21) Gebarmutterkrebs, (22) und (26) Eileiterkrebs, (23) Rektaikrebs, (24) Prostatakrebs, (25) Harnröhrenkrebs, (17) Hepatom Aus den Ergebnissen, die in F i g. 1 gezeigt werden, ist ersichtlich, daß die Proben mit C-Werten hoher als bei

den Proben von gesunden Personen TAG in Mengen enthielten, die höher waren als bei den Proben der gesunden Personen. Daraus läßt sich mit großer Wahrscheinlichkeit ableiten, daß die Personen mit hohen C-Werten Tumor- oder Krebszellen haben.

Beispiel 2-2

Gelfiltrationsmethode

(1) Blut wurde von 14 Krebspatienten und 8 gesunden Personen gesammelt, und die Testproben wurden m gleicher Weise wie in Beispiel 2 behandelt.

(2) Bestimmung

5 μΙ einer Verdünnung der Testprobe, die gemäß (1) hergestellt worden war und 10⁴fach mit H-Lösung, bestehend aus destilliertem Wasser mit darin gelöst 8% Natriumchlorid, 0,4% Kaliumchlorid, 0,05% Natriumhydrogenphosphat, 0,06% Kaiiumdihydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Magnesiumchlorid, 0,1% Kalziumchlorid und 1% Glukose, verdünnt worden war, wurden mit 50 μΙ der gemäß Beispiel 2 hergestellten Peroxidase-markierten Lectin-Zubereitung, lOOfach verdünnt mit 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH 7,4) versetzt und auf einem Wasserbad bei 23°C 15 Minuten inkubiert. Die inkubierte Mischung wurde dann vorsichtig auf die Oberfläche eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Agarosegels gegeben. Nach Inkubierung des den Gel enthaltenden Reagenzglases auf einem Wasserbad von 23°C während 1 Stunde, wurden zu dem Agarosegel 2 ml einer 0,1 m Phosphat-Pufferlösung (pH etwa 7,4) gegeben und dabei gerührt. Die überstehende Flüssigkeit wurde unmittelbar darauf in ein sauberes Reagenzglas gegeben zu dem dann 400 μΐ der Substratlösung der Peroxidase-Zubereitung gemäß Beispiel 2 gegeben wurden. Nach ausreichendem Rühren ließ man die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Die Enzymreaktion wurde durch 1 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure abgebrochen, und das Reaktionsgemisch wurde in einem Thermomischer oder dergleichen ausreichend gerührt. Die optische Dichte der so behandelten Mischung wurde mit einem Spektrofotometer bei 492 nm gemessen. Als Blindprdbe wurde eine Mischung aus 400 ml der Substratlösung und 1 ml einer 1 η Chlorwasserstoffsäure verwendet. Die gemessenen Werte der optischen Dichte wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 2-1 bewertet, und die berechnete Menge von TAG-Lect'm wurde in Fig.2 aufgetragen, in welcher das Symbol Q für gesunde Personen steht und die Zahlen (1) bis (1) folgende Patienten bedeuten:

(1) Magenkrebs,

(2) Hydatidenmole,

(3) Dickdarmkrebs,

(4) Uteruskrebs,

(5) Eierstockkrebs,

(6) Rektalkrebs,

(7) Prostatakrebs,

(8) Harnröhrenkrebs,

(9) Hepatomund (10) Brustkrebs.

Aus den in F i g. 2 gezeigten Ergebnissen geht hervor, daß ein merklicher Unterschied im Niveau von TAG in der Körperflüssigkeit bei gesunden Personen und Patienten, die unter verschiedenen tCrebsarten leiden, besteht.

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Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von tumorassoziierten glykosidische Bindungen enthaltenden Substanzen (TAGS) in einer Körperflüssigkeitsprobe, bei dem man die TAGS in einer Probe der Körperflüssigkeit mit

einem Lectin unter Bildung eines TAGS-Lectinkomplexes umsetzt und die Menge des TAGS-Lectinkomple-

xes oder an nicht reagiertem Lectin bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lecnin ein Lectin verwendet, das sich spezifisch mit Galactose-(/?i — 3 oder/i —«■ 4)-N-Acetylgalactosamin-Bindungen bindet

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein markiertes Lectin verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der Körperflüssigkeit ein Schutzprotein gibt

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die Umsetzung bei 4 bis 40⁰C durchgeführt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Lectin Erdnußlectin oder Ricinuslectin ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Menge an nichtumgesetztem Lectin durch Agglutination des nichtumgesetzten Lectins bestimmt

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das nichtumgesetzte Lectin mit einem Galactose-(/?i —>-3 oder ß\ —►4)-N-Acetylgalactosamin-Endgruppen enthaltenden Glykoprotein oder Se-

phadex oder Glasperlen, die damit beschichtet sind, agglutiniert wird.

S. Reagenz zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein sich

t spezifisch mit Galactose-f/i — 3 oder/ft -*- 4)-N-Acetylgalactosamin-Bindungen bindendes Lectin enthält.

9. Reagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Lectin Erdnußlectin ist.