DE3017684C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebenen neuen Epoxysuccinylaminosäurederivate sowie Arzneimittel mit Thiolprotease-inhibierender Wirkung, welche diese Derivate als Wirkstoff neben einem inerten Träger enthalten.

Aus US-PS 39 11 111 ist E-64, nämlich N-[N-(L-3-trans­ carboxyoxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]agmatin bekannt. Dessen Zwischenprodukte werden in Chemical Abstrackts, 87, 202108y (1977), 87, 58238c (1977), 87, 202125b (1977) und 87, 68128z (1977) beschrieben, und Epoxysuccinsäurederivate werden auch in der DE-OS 28 09 036 und in Chemical Abstract, 87, 681239a (1977) beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen unterscheiden sich von den bekannten Verbindungen durch die Inhibierungsaktivität gegenüber Thiolprotease, insbesondere kalzium-aktivierter neutraler Thiolprotease (nachfolgend CANP genannt), die im Überschuß im Muskelgewebe von von Muskeldystrophie befallenen Säugetieren vorkommt und durch gute Absorption und Verteilung im Gewebe, nachdem man sie solchen Säugern (einschließlich Menschen) verabreicht hat, ohne daß die vaskulare Permeabilität beschleunigt wird.

Wenn nicht anders angegeben, bedeutet nachfolgend der Ausdruck "Alkyl" sowohl geradkettige als verzweigtkettige Alkylgruppen und die Epoxybernsteinsäurederivate sind Transisomere, d. h., daß zwei Carbonylgruppen an dem Oxiranring in Transkonfiguration vorliegen.

Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in denen R¹ Wasserstoff, R² ein Alkyl mit 4 Kohlenstoffatomen und n eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist.

Eine Verbindung der Formel (I) kann man herstellen, indem man beispielsweise folgendes Verfahren anwendet:

worin R⁴ Wasserstoff oder ein Alkalimetall und R⁵, R¹ ausgenommen Wasserstoff oder ein Alkalimetall, bedeutet, mit einem Chlorierungsmittel, wie Oxalylchlorid oder Thionylchlorid behandelt unter Ausbildung des entsprechenden Säurechlorids. Zu dem Säurechlorid gibt man dann eine Aminosäureverbindung der allgemeinen Formel

worin R², R³ und n die vorher angegebene Bedeutung haben, tropfenweise unter Eiskühlung unter Bildung der Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ gleich R⁵ ist.

Bei dieser Amidierung kann man zu der Verbindung der Formel (III) eine Base, wie Triethylamin, Pyridin oder Methylmorpholin zugeben. Wird die Verbindung der Formel (III) direkt in Form ihres Säureadditionssalzes verwendet, so erhält man sie für die Umsetzung nach der Entfernung der Säure mit einer Base, wie einem Alkalihydroxid, Triethylamin, Pyridin oder Methylmorpholin; alternativ kann man sie auch in Gegenwart einer der vorerwähnten Basen umsetzen.

Die Verbindung der Formel (II), in welcher R⁴ Wasserstoff bedeutet, kann man auch direkt in eine Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ gleich R⁵ ist, ohne Chlorierung überführen. In diesem Fall wird die Verbindung der Formel (II), in welcher R⁴ Wasserstoff bedeutet, mit einer Verbindung der Formel (III) in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid oder 1-Ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid umgesetzt. Vorzugsweise gibt man bei dieser Umsetzung eine N-Hydroxyverbindung, wie N-Hydroxysuccinimid oder 1-Hydroxy-benzotriazol hinzu.

Alternativ kann man die Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ gleich R⁵ ist, herstellen durch Amidierung der Verbindung der Formel

in welcher R² und R⁵ die vorher angegebene Bedeutung haben, mit einem Amin der Formel

H₂N (CH₂) _n NHR³ (V)

in welcher R³ und n die vorher angegebene Bedeutungen haben. Diese Amidierung kann in gleicher Weise wie bei der Umsetzung der Verbindung (II), in welcher R⁴ Wasserstoff bedeutet, mit der Verbindung der Formel (III) durchgeführt werden.

Gemäß einer weiteren Alternative kann man die Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ gleich R⁵ ist, herstellen durch eine Esteraustauschreaktion der Verbindung der Formel (I), worin R¹ eine andere Gruppe innerhalb des Umfangs von R⁵ ist, mit einem Alkohol, welcher die gewünschte Gruppe R⁵ bilden kann, wie Benzylalkohol, Cyclopentanol oder Cyclohexanol, wobei die Umsetzung in Gegenwart eines Katalysators, wie Schwefelsäure, einem Alkalialkoholat oder einem Alkalihydroxid, wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid erfolgt.

Die Verbindungen der Formel (I), in denen R¹ Kalium oder Natrium bedeutet, kann man erhalten, indem man eine Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ gleich R⁵ ist, mit Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid umsetzt, worauf man dann erforderlichenfalls ein organisches Lösungsmittel, wie Ethanol, Azeton, Ethylether oder Petrolether zugibt.

Die Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ Wasserstoff bedeutet, kann man herstellen, indem man eine Verbindung der Formel (I), in welcher R¹ ein Alkalimetall bedeutet, mit einer anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder einer organischen Säure, wie Ameisensäure oder Essigsäure ansäuert und dann mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Ethylether, Benzol oder Chloroform extrahiert.

Falls die Verbindung der Formel (I) eine mit Benzyloxicarbonyl geschützte Aminogruppe hat, kann man eine solche Schutzgruppe durch katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladium-auf-Kohle oder Palladium-Schwarz entfernen.

Die Verbindungen der Formel (II) und (IV) erhält man gemäß dem in der DE-OS 28 09 036 beschriebenen Verfahren oder in ähnlicher Weise.

Die Verbindung der Formel (III) erhält man wie folgt:

Die Verbindung der Formel

in welcher R² die oben angegebene Bedeutung hat und R⁶ eine Schutzgruppe ist, wird mit einer Verbindung der Formel (V) umgesetzt, worauf man nach Entfernung der Schutzgruppe die gewünschte Verbindung erhält. Beispiele für die Schutzgruppe sind übliche auf dem Gebiet der Peptidsynthese verwendete Gruppen, wie tert.-Butoxycarbonyl, Carbobenzoxy oder Methylbenzyloxycarbonyl. Die Amidierung der Verbindung der Formel (VI) mit der Verbindung der Formel (V) kann in gleicher Weise ausgeführt werden wie die Umsetzung der Verbindung der Formel (II), worin R⁴ Wasserstoff bedeutet, mit der Verbindung der Formel (III). Die Entfernung der Schutzgruppe wird in der auf dem Gebiet der Peptidchemie üblichen Weise vorgenommen. Die folgenden Beispiele zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Herstellung.

Beispiel 1

In 80 ml Tetrahydrofuran werden 1,00 g DL-trans-Benzyl­ hydrogenepoxysuccinat, 1,70 g N-L-Leucyl-N′-benzyloxycar­ bonyl-1,7-diaminoheptan, 0,73 g 1-Hydroxybenzotriazol und 0,55 g N-Methylmorpholin gelöst. Zu der Lösung gibt man langsam 0,95 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimid-hydrochlorid unter Eiskühlung und Rühren. Die Mischung wird zwei Stunden unter Eiskühlung und dann zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert, und dazu werden 100 ml Ethylacetat und 100 ml Wasser gegeben, und die Mischung wird kräftig geschüttelt. Die Ethylacetatschicht wird abgetrennt und nacheinander mit einer 10%igen wäßrigen Salzsäurelösung, einer gesättigten wäßrigen Bicarbonatlösung und einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und dann zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographie über Kieselgel (Chloroform : Azeton =10 : 1) gereinigt und aus Ethylazetat/n-Hexan umkristallisiert, wobei man 1,50 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyloxycarbonyloxiran-2-carbonyl)-L- leucyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,7-diaminoheptan, F. 134°C in einer Ausbeute von 67% erhält.

Beispiel 2

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 1,30 g DL-trans-Benzylhydrogenepoxysuccinat und 1,75 g N-L-Leucyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,5-diaminopentan, wobei man 1,80 g N-[N(DL-3-trans-Benzyloxycarbonyloxiran- 2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,5-diaminopentan, F. 145 bis 146°C in einer Ausbeute von 66% erhält.

Beispiel 3

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 1,33 g DL-trans-Benzylhydrogenepoxysuccinat und 1,84 g N-L- Leucyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,2-diaminoethan, wobei man 1,87 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyloxycarbonyloxiran-2-carbonyl)- L-leucyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,2-diaminoethan, F. 148 bis 149°C in einer Ausbeute von 61% erhält.

Beispiel 4

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 1,83 g DL-trans-Benzylhydrogenepoxysuccinat und 1,38 g N-L-Valyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, wobei man 1,73 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyloxycarbonyloxiran-2- carbonyl)-L-valyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, F. 179 bis 180°C in einer Ausbeute von 58% erhält.

Beispiel 5

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 1,00 g DL-trans-Benzylhydrogenepoxysuccinat und 1,54 g N-L-Iso­ leucyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, wobei man 1,65 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyloxycarbonyloxiran-2-carbo­ nyl)-L-isoleucyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, F. 167 bis 168°C in einer Ausbeute von 69% erhält.

Beispiel 6

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 1,15 g DL-trans-Cyclohexylhydrogenepoxysuccinat und 1,68 g N-L-Leucyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, wobei man 1,71 g N-[N-(DL-3-trans-Cyclohexyloxycarbonyl­ oxiran-1-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,4- diaminobutan, F. 139 bis 141°C in einer Ausbeute von 63% erhält.

Beispiel 7

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von 1,07 g DL-trans-Cyclopentylhydrogenepoxysuccinat und 1,68 g N-L-Leucyl-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, wobei man 1,56 g N-[N-(DL-3-trans-Cyclopentyloxycarbo­ nyloxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycarbonyl- 1,4-diaminobutan, F. 137 bis 139°C, in einer Ausbeute von 58,8% erhält.

Beispiel 8

Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung von DL- trans-benzylhydrogenepoxysuccinat und 0,21 g N-L-Leucyl- N′-acetyl-1,4-diamonobutan, und behandelt das Produkt säulenchromatografisch über Kieselgel (Chloroform : Methanol = 50 : 1) und kristallisiert dann aus Chloroform /n-Hexan um, wobei man 0,26 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyloxycarbonyloxiran- 2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-acetyl-1,4-diaminobutan, F. 181 bis 183°C, in einer Ausbeute von 59% erhält.

Beispiel 9

Man arbeitet wie im Beispiel 8 unter Verwendung von 2,22 g DL-trans-Benzylhydrogenepoxysuccinat und 2,20 g N-L-Leucyl- N′-benzoyl-1,4-diaminobutan, wobei man 2,60 g N-[N-(DL-3- trans-Benzyloxycarbonyloxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-N′- benzoyl-1,4-diaminobutan, F. 146 bis 148°C in einer Ausbeute von 64,7% erhält.

Beispiel 10

In 100 ml Tetrahydrofuran werden 2,90 g N-(DL-3-trans- Benzyloxycarbonyloxiran-2-carbonyl)-L-leucin, 2,46 g N-Benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutancarbonat, 1,92 g N-Methylmorpholin und 1,30 g 1-Hydroxybenzotriazol gelöst. Zu einer Lösung gibt man langsam unter Eiskühlung und Rühren 1,8 g 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimidhydrochlorid. Die Mischung wird zwei Stunden unter Eiskühlung und dann zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in einem Gemisch aus 150 ml Ethylacetat und 150 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird kräftig geschüttelt und die Ethylacetatschicht abgetrennt. Die Ethylacetatschicht wird dann nacheinander mit einer 10%igen wäßrigen Salzsäurelösung, einer gesättigten wäßrigen Bicarbonatlösung und einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen und dann zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird aus Ethylacetat/n-Hexan umkristallisiert, wobei man 3,00 g N-[N-(DL-3-trans- Benzyloxycarbonyloxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyl­ oxycarbonyl-1,4-diaminobutan, F. 169 bis 170°C, in einer Ausbeute von 65% erhält.

Beispiel 11

In 20 ml Ethanol werden 2,1 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyl­ oxycarbonyloxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycar­ bonyl-1,4-diaminobutan gelöst. Zu der Lösung gibt man unter Rühren tropfenweise 10 ml einer ethanolischen Lösung von 0,24 g Kaliumhydroxid. Nach zweistündigem Rühren bei Raumtemperatur gibt man zu der Lösung Petrolether und das ausgefallene Produkt aus N-[N-(DL-3-trans-Carboxyiran-2- carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan- Kaliumsalz wird auf einem Filter gesammelt. Der Niederschlag wird in 50 ml Wasser gelöst, mit Salzsäure angesäuert und mit Ethylacetat (3×50 ml) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte werden vereint, mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne konzentriert. Das erhaltene Pulver wird aus Chloroform/Petrolether umkristallisiert, wobei man 1,30 g N-[N-(DL-3-trans-Carboxyoxiran- 2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycarbonyl-1,4-diaminobutan, F. 56°C, in einer Ausbeute von 72% erhält.

Beispiel 12

In 120 ml Methanol wurden 2,00 g N-[N-(DL-3-trans-Benzyl­ oxycarbonyloxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-N′-benzyloxycar­ bonyl-1,4-diaminobutan suspendiert, und dazu wurden 0,20 g Palladium-Schwarz gegeben. Die Mischung wurde kräftig gerührt, und es wurde ein schwacher Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur 4 Stunden eingeleitet. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde auf etwa 20 ml konzentriert. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Petrol-Ether kristallisiert, wobei man 1,10 g N-[N-(DL-3-trans- Carboxyoxiran-2-carbonyl)-L-leucyl]-1,4-diaminobutan, F. 178 bis 181°C (Zersetzung), in einer Ausbeute von 95% erhielt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine überlegene Inhibierungsaktivität gegenüber CANP (vgl. S. 3), das im Überschuß in den Muskeln von Säugern, die unter Muskeldistrophie leiden, vorkommt und weisen eine verbesserte Absorption und Verteilung in dem Gewebe nach der Verabreichung an Säugern auf, verglichen mit den Verbindungen gemäß der DE-OS 28 09 036, Chemical Abstracts, 87 (1977) 68129a und 68128z. Die Muskeldistrophie-inhibierende Aktivität wurde nach der Methode von Ishiura und Mitarbeitern (J. of Biochem. 84, 225 (1978) unter Verwendung von CANP, das aus den Muskeln von an erblicher Muskeldistrophie leidenden Küken gewonnen worden war, erprobt, und die gemessenen Werte für eine 50%ige Inhibierung in Mol-Verhältnissen für das Enzym, ausgedrückt als ID₅₀ (Mol/Mol), werden in Tabelle 1 gezeigt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden von Säugern, wie Ratten oder Kaninchen besser bei subkutaner Verabreichung absorbiert als die Verbindungen gemäß der DE-OS 28 09 036 und Chemical Abstracts, 87, 68129a und 68128z (1977). Zur Messung der Absorption wurden diese Verbindungen subkutan Ratten in einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht, und die Konzentration der Versuchsverbindung im Rattenplasma nach einer Stunde nach der Verabreichung wird in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Die erfindungsgemäßen Verbindungen inhibieren wirksam und spezifisch Thiolproteasen, wie Papain, Bromelain und einige Arten Kathepsin, bei denen einige Sulfhydrylgruppen für deren Aktivität wesentlich sind. Andererseits zeigen sie keine Inhibierungsaktivität gegenüber Proteolyse von Kasein durch Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, einer Säureprotease von Paecilomyces varioti oder Subtilisin BPN′ gegen Esterolyse von Benzoylargininethylester durch Kallikrein noch gegen Fibrinolyse durch Humanplasmin.

Die Papain-inhibierende Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden nach dem Verfahren von K. Hanada und Mitarbeitern (Argic. Biol. Chem., 42, (3) 523 (1978)) unter Verwendung von Papain (80 µm/ml, 2× kristallisiert) untersucht. Die für eine 50%ige Inhibierung benötigte Inhibitormenge wird als ID₅₀ ausgedrückt, in der Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen keine Nebenwirkungen, wie eine Beschleunigung der vaskulären Permeabilität, und sind gegenüber E-65 (vgl. S. 2) und dessen Zwischenprodukten in dieser Hinsicht überlegen.

Geeignete pharmakologische Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen pharmakologischen Verbindungen für orale, parenterale oder rektale Anwendungen, sind z. B. Tabletten, Pulver, Pillen, Dragees, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, sterile injizierbare Formen, Suppositorien oder Zäpfchen. Der Träger kann z. B. ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispiele für geeignete Träger sind z. B. Laktose, Terra-Alba, Saccharose, Talkum, Gelatine, Agar, Pektin, Akaziengummi, Magnesiumstearat oder Stearinsäure. Beispiele für flüssige Träger sind Sirup, Erdnußöl, Olivenöl oder Wasser. Außerdem können die Träger oder Verdünnungsmittel auch retardierende Stoffe enthalten, wie sie bekannt sind, z. B. Glyzerylmonostearat oder Glyzeryldistearat allein oder zusammen mit einem Wachs.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zum Inhibieren von CANP, da im Überschuß der Muskel von unter Muskeldystrophie leidenden Säugern vorkommt, angewendet werden, indem man etwa 5 bis 400 mg/kg/Tag in Einzeldosen oder in zwei bis vier unterteilten Dosen oral oder in Form von injizierbaren Zubereitungen verabreicht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben eine außerordentlich niedrige Toxität. Sie zeigen praktisch keine orale akute Toxizität bei Mäusen in Dosierungen unterhalb 2 g/kg Körpergewicht. Nach oraler Verabreichung von 1 g/kg/Tag an Versuchstiere während 30 Tagen wurden keine Nebenwirkungen festgestellt.

Claims (2)

1. Epoxysuccinylaminosäurederivate der allgemeinen Formel worin R¹ Wasserstoff, Kalium oder Natrium, Benzyl oder Cycloalkyl mit 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, R² Alkyl mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, R³ Wasserstoff, Benzyloxycarbonyl, Acetyl oder Benzoyl und n eine ganze Zahl von 2 bis 7 bedeuten.

2. Arzneimittel mit Thiolprotease-inhibierender Wirkung, enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung gemäß Patentanspruch 1 neben einem inerten Träger.