DE3016555A1

DE3016555A1 - Verfahren zur messung von glykosyliertem haemoglobin und apparat zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE3016555A1
Application number: DE19803016555
Authority: DE
Inventors: Kenneth H Gabby; Paul M Gallop
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 1979-04-30
Filing date: 1980-04-29
Publication date: 1980-11-13
Also published as: IT8067683A0; GB2049184A; JPS55154465A; US4268270A; FR2455744A1; IT1128435B

Description

PATENTANWÄLTE DR. DIETER V. BEZOLD 3Q 1 6 5 5

DIPL. ING. PETER SCHÜTZ DIPL. ING. WOLFGANG HEUSLER

MARIA-THERESIA-STRASSE 22

Postfach ₈₆ o2 60 D-eOOO MUENCHEN 86

_ g _ TEUEFON 089/47 69 O6

4768

AB SEPT. 1980: 4 70 60 TELEX 522 638 TELEGRAMM SOMBEZ

US-Ser. No. 34,755 1o 78o

Filed April 3o, 1979 . V/HO

THE CHILDREN'S HOSPITAL MEDICAL CENTER 3oo Longwood Avenue, Boston, Mass., V.St.A.

Verfahren zur Messung von glykosyliertem Hämoglobin und Apparat zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft die Messung von Langzeit-Durchschnitts-Blutzuckerspiegeln .

Bei der Messung von Blutzuckerspiegeln bzw. -konzentrationen ist es wünschenswert, eine Methode anzuwenden, die die durchschnittliche Langzeitkonzentration genau wiedergibt und nicht Kurzzeitschwankungen; die Methode sollte einfach und wirtschaftlich sein. Da die Konzentrationen an löslichem Blutzucker extensive KurzZeitschwankungen sowohl bei Diabetikern als auch bei normalen Patienten aufweisen können, sind andere Meßverfahren zur Bestimmung der Blutzuckerkonzentrationen untersucht worden. Ein solches al-

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ZUGELASSEN BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT ■ PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE 3STSCHECK MÖNCHEN NR. 6 9148-800 · BANKKONTO HYPOBANK MÜNCHEN (BLZ 700 200 40) KTO. 60 60 25 73 78 SWIFT HYPO DE MM

ternatives Meßverfahren ist die Hämoglobinfraktionierung, genannt HbA₁ . Diese kleinere Fraktion wird durch eine langsame, nichtenzymatische Kondensation von Glucose mit der N-terminalen Aminogruppe der ß-Kette des HbA, der Hauptkomponente des Hämoglobins, gebildet. Die Beobachtung von Rahbar (Rahbar,}.Clin. Chim. Acta 22 (1968), 296-298; Trivelli et al., N. Engl. J. Med. 284 (1971), 353-357; und Gabbay et al., J. Clin. Endocrinal. Metab. 44 (1977), 859-865), daß die HbA₁ ^Fraktion bei Patienten, die an Diabetes mellitus leiden, um das 2- bis 3-fache erhöht ist, hat dazu geführt, die Messung der HbA. -Fraktion durch Ionenaustauscherverfahren als ein diagnostisches Mittel heranzuziehen, um die Kontrolle des Diabetes zu verfolgen.

Eine andere Methode, um die A₁ -Fraktion quantitativ zu bestimmen, wurde beschrieben von Flückiger et al. FEBS Lett. 71 (1976), 356-36O. Die Glykosylierung der Hämoglobinfraktion an anderen Stellungen als der terminalen Aminoposition der Hämoglobinkette wird quantitativ bestimmt durch Erhitzen des Proteins unter sauren Bedingungen und colorimetrische Messung der gebildeten Furfuralverbindungen mit 2-Thiobarbitursäure.

Im wesentlichen sind Gegenstände der Erfindung ein Verfahren und ein Apparat zum Messen von glykosyliertem Hämoglobin durch Untersuchen der in Hämolysaten gebundenen Glucosereste, das in einem Aspekt durch eine angemessene Oxidation des glykosylierten Hämoglobins und die rasche Messung der resultierenden Aldehydverbindungen gekennzeichnet ist.

Die Erfindung stellt ein Verfahren und einen Apparat zum genauen und einfachen Messen von glykosyliertem Hämoglobin bereit. Die Erfindung nützt die Tatsache aus, daß eine Hexose, die an die verschiedenen Aminogruppen von Hämoglo-

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binketten gebunden ist, Aldehydverbindungen freisetzt, wenn das glykosylierte Hämoglobin in geeigneter Weise oxidiert wird.

In einem Aspekt ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Glykosylierung gemessen wird durch Oxidieren einer Hämoglobinprobe und Messen der Menge an gebildeten Aldehydverb indungen .

In einigen bevorzugten Ausführungsformen kann die Hämoglobinprobe vor der Oxidation reduziert werden, so daß die gebundene und jetzt reduzierte Hexosebindung bei geeigneter Oxidation eine zusätzliche Aldehydverbindung bilden kann; das Hämoglobin wird immobilisiert und abgetrennt von löslichen Zuckern vor der angemessenen Oxidation entweder durch Ausfällung oder durch selektive Bindung an ein Harz. In der Abhängigkeit von der gewählten Verfahrensweise kann das immobilisierte Hämoglobin - aber es braucht nicht - vor der Oxidation wieder gelöst werden; und schließlich werden die bei der angemessenen Oxidation erzeugten Aldehydverbindungen colorimetrisch gemessen.

In anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die roten Blutkörperchen mit normaler, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, um die löslichen Zucker zu entfernen; die Körperchen bzw. Zellen werden in destilliertem Wasser Iysiert; das Hämolysat wird zentrifugiert; das glykosylierte Hämoglobin wird reduziert und angemessen oxidiert; und schließlich werden die bei der angemessenen Oxidation erzeugten Aldehydverbindungen colorimetrisch gemessen.

In einem anderen Aspekt ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß eine bekannte Menge an Haptoglobin in das Hämolysat eingetaucht wird, um eine voraussagbare Menge an Hämoglobin zu binden, und daß der Gehalt an glykosylier-

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tem Hämoglobin gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das glykosylierte Hämoglobin durch Eintauchen der an Haptoglobin gebundenen Hämoglobinprobe in eine Tritium-haltige reduzierende Verbindung bestimmt, und dann wird das Radioaktivitätsniveau der Probe gemessen.

Die Erfindung ermöglicht es, das Niveau bzw. die Konzentration an glykosyliertem Hämoglobin schnell und einfach in einem einzigen Reaktionsgefäß zu bestimmen.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und die erfindungsgemäße Verfahrensweise beschrieben; zunächst werden die Zeichnungen erläutert.

Fig. 1 und 2 stellen Pließschemas für alternative Methoden dar, die Äquivalente an Glucoseresten in Hämoglobin zu analysieren.

Fig. 3 stellt eine perspektivische Ansicht des Apparates zur Durchführung dieser Methoden dar.

Fig. 4 stellt eine perspektivische Ansicht eines Stopfens mit verschiedenen Filtern dar, der in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zur Anwendung kommt.

Fig. 5 stellt eine Schnittansicht des Stopfens der Fig. 3 dar, wobei die Schnittebene der Linie 5-5 entspricht.

In Fig. 1 wird ein Fließschema für eine Methode zur Analyse der Äquivalente von Glycosegruppen in Hämoglobin gezeigt. Das gesamte Blut wird zentrifugiert, und die roten Blutkörperchen werden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung (o,9 % NaCl) gewaschen. Die Zellen werden in sechs Volumeneinheiten destilliertem Wasser suspendiert und werden zwei Minuten so belassen, um zu lysieren. Ein

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Puffer wird hinzugefügt, und das Hämolysat wird dann bei 18 ooo Umdrehungen/Minute 3o Minuten lang zentrifugiert, um die Zellmembranen zu entfernen.

Aliquote von 1oo,ul-Proben des geschleuderten (spun) Hämolysats - jedes davon enthält 2,5 bis 3,5 mg Hämoglobin werden in zwei Reagenzgläser gebracht. Ein Vergleich ohne Hämolysat wird auch gefahren. Die Hämoglobinkonzentration wird in üblicher Weise bestimmt und unter Verwendung von zusätzlichen 1oo,ul-Aliquoten, die mit 5,ο ml Drabkin'sche Lösung (o,2o g K₀ Fe (CN),, o,o5 g KCN und 1,oo g NaHCO.,, gelöst in 1 1 destilliertem Wasser) gemischt wurden. Die Absorption dieser Aliquote wird bei 54o nm gegen Drabkin'sche Lösung gemessen, um die Hämoglobinkonzentration zu berechnen.

Zur Ausfällung des Hämoglobins in den zu untersuchenden Proben werden 1,o ml einer o,5 %-igen CuSO..5 H₃O-Lösung und 1oo,ul einer ο,75 %-igen Na WO .2 H„0-Lösung hinzugefügt und mit jeder Probe gemischt. Nach 1 Minute werden die Reagenzgläser 2 Minuten lang bei 25oo Umdrehungen/Minute zentrifugiert, und die überstehenden Flüssigkeiten, die die löslichen Zucker (die nicht an Hämoglobin gebundenen Zucker) enthalten, werden verworfen. Anstelle der Zentrifugation kann auch eine Filtration angewandt werden, um die löslichen Zucker zu entfernen.

An diesem Punkt kann der Hämoglobinpfropfen direkt mit Perjodat oxidiert werden, wie in Fig. 1 gezeigt, oder er kann erst wieder aufgelöst werden. Die direkte Oxidation der Hämoglobinausfällung ist einfach, aber hat den Nachteil, daß es sich um eine heterogene Reaktion handelt, bei der die vollständige Oxidation des Hämoglobins etwas langer dauert. Die Auflösung des Pfropfens in einer Säure, wie HCl, vor der Oxidation erlaubt die schnellere Oxida-

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tionscharakteristik einer homogenen Reaktion, obwohl beide Wege gut durchführbar sind.

Die Oxidation wird entweder durch Suspendieren der feinverteilten Hämoglobinpfropfen in o,5 ml o,o2 m NaIO. (Perjodat) oder durch Hinzufügen von Perjodat zu dem Hämoglobin in Lösung durchgeführt. Nach dieser Stufe sind die verbleibenden Stufen für das gelöste und ungelöste Hämoglobin dieselben. Nach 15 minütiger häufiger Wirbelmischung werden 1oo,ul o,25 m Pb (NO-,) _, die mit Natriumacetat auf pH 8 titriert worden sind, hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden und die überschüssigen Perjodat- und Jodatprodukte auszufällen, da sie den colorimetrisehen Test stören. Die Röhrchen werden dann 2 Minuten lang zentrifugiert, oder die Inhalte werden gefiltert; die überstehende Flüssigkeit, die die Aldehyde enthält, ist klar und fertig zur colorimetrischen. Analyse.

Um den Aldehydgehalt colorimetrisch zu bestimmen, werden Aliquote von 5oo ,ul der klaren überstehenden Flüssigkeit in neuen Reagenzgläsern gemischt und 1o Minuten lang inkubiert mit 1oo ,ul filtrierter 1 %-iger (W/V, Gewicht/Volumen, in wäßriger Lösung) S-Methyl^-benzothiazolinonhydrazon-hydrochlorid-monohydrat (MBTH), welches bei 4°C für nicht länger als To Tage gelagert worden ist. Als nächstes wird 1,oo ml an o,4o %-igem FeCl₃-OH₉O hinzugefügt, und nach 5 Minuten werden 3,00 ml analysenreines Aceton unter Mischen schnell hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Die Absorption, die der. Aldehydmenge nach der Oxidation und daher den Äquivalenten an Glucoseresten vor der Oxidation direkt proportional ist, wird bei 67o nm gegen den nicht-hämoglobinhaltigen Vergleich gemessen.

Die Duplikate werden gemittelt, und die Absorption (optische Dichte) wird wie folgt berechnet:

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(durchschn. OD,-/mg Hb = ^b/O

_67o/my U^ (durchschn. OD₅₄₀) (1,47 mg/ml/OD_54o) (o,1 ml) (51)

^(Q1W

(OD₅₄₀) (7,5o)

Die Absorption wird in Äquivalente an Gly.coseresten pro ml Hämoglobin übergeführt durch colorimetrische Analyse der Proben, und zwar gleichzeitig mit Standards, die nach einer Methode, wie der ( H)-NaBH.-Reduktionsmethode, beschrieben in Bookchin und Gallop, Biochem. Biophys. Res. Comm. 32, (1968), 86, kalibriert worden sind. Alternativ können Sorbitol oder Fructose als Standards benutzt werden. Diese Standards, die eine Reihe von Zuckerkonzentrationen enthalten, ergeben eine Standardkurve, auf der die Probenwerte aufgetragen werden.

In Variationen des Obigen kann das Hämoglobin in dem Hämolysat immobilisiert werden und von den löslichen Zuckern getrennt werden durch Bindung an ein Kationenaustauscherharz, wie z. B. Biorex-7o (Biorad), CG-5o (Röhm & Haas) oder Dowex-5o (Dow), statt es mit CuSO₄ und Na₃WO₄ auszufällen. Die verbleibenden Schritte sind im wesentlichen dieselben wie beschrieben.

Die Empfindlichkeit irgendeiner Abwandlung des oben beschriebenen Verfahrens kann durch anfängliches Reduzieren des glykosylierten Hämoglobins mit NaBH₄ vor der Oxidation erhöht werden, wobei eine zusätzliche Hydroxylgruppe aus der gebundenen Hexose bei der Oxidation in eine Aldehydgruppe übergeführt wird. Das Hämoglobin wird mit einem 100-fachen molaren Überschuß an NaBH. in einem Phosphatpuffer von pH 7,5 1 Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt. Der NaBH₄-überschuß wird von dem reduzierten Hämoglobin durch Zentrifugieren oder Filtration entfernt.

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In der Fig. 2 ist ein Fließschema für eine andere Abwandlung des oben beschriebenen Verfahrens zur Analyse von Äquivalenten an Glucoseresten in Hämoglobin gezeigt; der Hauptunterschied ist das Fehlen der Hämoglobin-Immobilisierungsstufe in der Variation nach Fig. 2. Die Oxidation wird bei Verwendung dieser Abwandlung viel wirksamer durchgeführt, weil das Hämoglobin in Lösung ist, wenn das Perjodat zugefügt wird.

Das gesamte Blut wird dreimal mit normaler, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen; dieses Waschen entfernt die meisten löslichen Zucker. Die Körperchen bzw. Zellen werden in 6 Vol.-Teilen destillierten Wassers suspendiert und dürfen 2 Minuten lang lysieren. Ein o,5 m Phosphatpuffer von pH 6,8 wird zur Herstellung einer o,o5 m Phosphatpufferlösung hinzugefügt; und das Hämolysat wird dann bei 18 ooo Umdrehungen/Minute 3o Minuten lang zentrifugiert, um die Membranen der roten Blutkörperchen zu entfernen .

Falls gewünscht, wird die Reduktion des glykosylierten Hämoglobins durch Zugabe von o,1 ml NaBH (bei einer Konzentration von 5 mg/ml) zu o,1 ml Hämolysat vollzogen, und es wird 1o Minuten lang inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von o,7 ml o,o36 m Phosphorsäure beendet.

Wenn das glykosylierte Hämoglobin nicht reduziert worden ist, werden o,6 ml destilliertes Wasser zu einer o,1 ml-Hämoglobinprobe vor der Oxidation hinzugefügt. Eine angemessene Oxidation wird erreicht durch Versetzen der Probe mit o,1 ml o,2 m Natriumperjodat und 15-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur. Dann werden o,3 ml o,38 m PbNO-(untitriert) hinzugefügt, nachgefolgt von der Zugabe von o,l ml 1,4 m NaOH. Die Ausfällung wird durch Filtrieren oder 2-minütiges Zentrifugieren entfernt.

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Zu 1,o ml der klaren überstehenden Flüssigkeit, die die Aldehyde enthält, wird o,1 ml 1 %-iger MBTH hinzugefügt. Nach 1o-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden o,5 ml o,8%-iges Eisen(III)-chlorid hinzugefügt, und es wird ein 5-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur erlaubt. Schließlich werden 3 ml destilliertes Wasser unter schnellem Mischen hinzugefügt. Die Absorption und die Äquivalente an GIycoseresten pro ml Hämoglobin werden wie vorstehend beschrieben bestimmt.

Der zur Durchführung der Erfindung brauchbare Apparat ist in Fig. 3 dargestellt. Der Apparat wendet das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von an Hämoglobin gebundenen Glycoseresten an, wie hier offenbart. Der Rand 6 des Stopfens 3 paßt eng, aber beweglich^ innerhalb des äußeren Reagenzglases 2. Der Stopfen 3, dessen Innerstes den Filter 4 enthält, ist unbeweglich in das Ende des inneren Rohrs 1 eingepaßt.

Bei einer Betriebsart enthält das Rohr 2 ein Kationenaustauscherharz, das geeignet ist, Hämoglobin zu binden. Das Rohr 1 enthält 1oo,ul des Hämolysats der bekannten Hämoglobinkonzentration in einem o,o5 m Natriumphosphatpuffer. Das Rohr 1 wird aufwärts gezogen, um es dem Hämolysat und dem Puffer zu erlauben, durch das Filter 4 zu dem Harz zu laufen. Nach einigen Minuten bindet sich das Hämoglobin an das Harz, und das Rohr 1 wird niedergeschoben. Nichtgebundenes Material, einschließlich der Zucker in Lösung, läuft aufwärts durch das Filter 4 und wird verworfen. Als nächstes wird o,5 ml o,o2 m NaIO. in das Rohr 1 eingeführt, welches dann aufwärts gezogen wird, um das Durchlaufen des NaIO . durch das Filter 4 auf den Boden des Rohrs 2 mit dem harzgebundenen Hämoglobin zu erlauben.

Während die Oxidationsreaktion fortschreitet, wird das Rohr 1 aus dem Rohr 2 ganz herausgezogen, und der Stopfen 3 wird

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durch den Stopfen 3¹, gezeigt in den Fig. 4 und 5, ersetzt. Der Stopfen 3¹ ist dem Stopfen 3 der Fig. 3 ähnlich, aber er enthält eine Schicht feiner Glaswolle 7.

Nach Beendigung der Oxidation werden 1oo,ul ο ,25 m--Pb(NO₃) „, das mit wasserfreiem Natriumacetat auf pH 8 titriert worden ist, zu den Inhalten des Rohrs 2 zugefügt, um den Überschuß an IO,- und IO.-Produkten auszufällen. Das mit "dem Stopfen 3" ausgerüstete Rohr 1 wird wieder in das Rohr 2 eingesetzt und niedergedrückt, um es der überstehenden Flüssigkeit, die die zu messenden Aldehydprodukte enthält, zu erlauben, durch die Filter 4 und 7 aufwärts zu laufen. Die überstehende Flüssigkeit wird mit 1 %-igem MBTH gemischt, 1.0 Minuten inkubieren gelassen, dann colorimetrisch analysiert, wie vorstehend beschrieben.

Anstelle des Kationenaustauscherharzes zur Bindung des Hämoglobins kann CuWO. zur Ausfällung des Hämoglobins angewendet werden, wobei eine Modifikation des in Fig. 3 gezeigten Apparates verwendet wird; diese Modifikation i feineres Filter 4 Jm Rohr 2 werden I00 ,ul Hämolysat der bqkannten Hämoglobinkonzentration in Puffer (bereitet wie vorstehend beschrieben) mit 1,0 ml CuSO..5H„0 und ToO/ o,75 %-igem Na„W0 .2H₂O gemischt, um das Hämoglobin auszufällen. Das Rohr 1 wird dann in das Rohr 2 eingesetzt und niedergedrückt, um es dem nichtausgefällten Material zu erlauben, durch das Feinfilter 4 aufwärts zu laufen, so daß es verworfen werden kann. Die verbleibenden Stufen sind dieselben wie jene in Verbindung mit der zuerst beschriebenen Apparateausführung Beschriebenen.

Der Betrieb der Apparateausführung, bei der Kupferwolframat angewendet wird, kann modifiziert werden durch Hinzufügen der Stufe der Wiederauflösung der Wolframat-Hämoglobin-Ausfällung mit HCl vor der Oxidation. Das HCl wird dem

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Rohr 1 zugefügt, nachdem das nichtausgefällte Material verworfen worden ist, und das Rohr 1 wird aufwärts gezogen, um es der HCl zu erlauben, durch das Filter 4 zu der Wolframat-Hämoglobin-Ausfällung abwärts zu laufen. Dieser zusätzliche Schritt erlaubt eine vollständigere homogene Oxidatxonsreaktion·

Der Betrieb der oben beschriebenen Ausführungsform kann weiter modifiziert werden durch - als ein erster Schritt Hämolysieren des gesamten Blutes in Rohr 2 mit einer normalen, physiologischen Kochsalzlösung, gefolgt von destilliertem Wasser. Auch kann die Empfindlichkeit der beschriebenen Tests in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Röhrchenzusammenstellung erhöht werden durch Hinzufügen - zwischen den Stufen der Hämoglobinimmobilisierung und der Perjodatoxidation - die Stufe des Reduzierens des glykosylierten Hämoglobins mit NaBH₄. Ein 100-facher molarer Überschuß an NaBH. wird hinzugefügt zum Rohr 1, welches aufwärts gezogen ist, um es dem NaBH. zu erlauben, durch das Filter 4 abwärts zu laufen, so daß es das glykosylierte Hämoglobin am Boden des Rohrs 2 reduzieren kann.

Der in Fig. 3 gezeigte Apparat kann auch in Verbindung mit dem früher beschriebenen Verfahren (gezeigt in Fig. 2) benutzt werden, bei dem das Hämoglobin nicht vor der Oxidation immobilisiert wird. Die Reagenzien sind dieselben, wie in dem vorstehend beschriebenen Verfahren, und der Apparat wird im allgemeinen wie vorstehend beschrieben benutzt, mit angemessenen Modifikationen.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung wendet die Haptoglobinbindung an. Ein Glasstab, der mit einer bekannten Menge an Haptoglobinkugeln überzogen ist, wird in ein Hämolysat von roten Blutkörperchen getaucht, so daß eine voraussagbare Menge an repräsentativem Hämoglobin (glyko-

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syliert und unglykosyliert) herausgefischt wird, gebunden an das Haptoglobin.(Ein Molekül Haptoglobin bindet ein Molekül Hämoglobin.) Das resultierende Träger-Hämoglobin-Addukt (SHA) wird durch Eintauchen in eine physiologische Kochsalzlösung gewaschen, dann in eine eingestellte ( H)-NaBH.-Lösung getaucht, wobei die Glycosereste spezifisch reduziert und markiert werden. Das SHA. wird gewaschen und dann in einem Szintillationszähler einer Zählung unterworfen. Dieses Verfahren ist genau und vermeidet die Notwendigkeit zur Messung der Hämoglobinmenge in den Proben; es ist somit ein für die Automation geeignetes Verfahren. Ein anderer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß die Waschstufe keine besonderen Vorkehrungen gegen den Verlust irgendeiner der Hämoglobinproben erfordert, da der Haptoglobin-Hämoglobin-Komplex durch die gesamte Analyse hindurch auf dem Träger stark gebunden bleibt.

Andere Ausführungsformen der Erfindung sind in den vorstehenden Ansprüchen enthalten. Zum Beispiel kann das Hämoglobin von dem löslichen Blutzucker unter Verwendung einer Dialyse oder leimender Säulen (sizing columns) abgetrennt, werden. Überschüssige Perjodatprodukte können unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, wie Dowex-1, entfernt werden, anstelle eines Ausfällungsreagens. Diese Produkte können auch durch schnelle Dialyse entfernt werden, einem Verfahren, das von selbst zur Automation führt. Darüber hinaus kann das gesamte Verfahren automatisiert werden, zum Beispiel unter Verwendung kontinuierlicher Ströme oder abgesonderter Analysengeräte. Die Oxidation kann unter Verwendung irgendeines Salzes der Periodensäure oder mit anderen Substanzen, wie Bleitetraacetat, durchgeführt werden. Eine Gaschromatographie kann anstelle der colorimetrischen Analyse zur Messung des Pormaldehyds verwendet werden (das Hauptaldehydprodukt); dieses Verfahren macht die Entfernung von überschüssigem Perjodat überflüssig. Al-

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dehydverbindungen können auch enzymatisch gemessen werden. Die colorimetrische Analyse kann zum Beispiel unter Verwendung einer Verbindung, wie Chromotropsäure, anstelle von MBTH, durchgeführt werden; allerdings wird MBTH aus Gründen der Einfachheit und der Empfindlichkeit bevorzugt.

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Claims

PATENTANWALT E

DR. DIETER V. BEZOLD

DIPL. ING. PETER SCHÜTZ

DIPL. ING. WOLFGANG HEUSLER

MARIA-THERESIA-STRASSE 22 POSTFACH gg 02 60

D-8OOO MUENCHEN

üS-Ser. No. 34,755
Filed April 3o, 1979

TELEFON 089/47 69 06 4768 19

AB SEPT. 1980s 4706006 TELEX 532 638 TELEGRAMM SOMBEZ

1o 78o
V/HO

THE CHILDREN'S HOSPITAL MEDICAL CENTER 3oo Longwood Avenue, Boston, Mass., V.St.A.

Verfahren zur Messung von glykosyliertem Hämoglobin und Apparat zur Durchführung des Verfahrens

Patentansprüche

(j\J Verfahren zur Messung von glykosyliertem Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet , daß man

- eine Probe, die Hämoglobin und eine unbekannte Menge an glykosyliertem Hämoglobin enthält, vorsieht,

- das glykosylierte Hämoglobin oxidiert zur Erzeugung von Aldehydverbindungen und

- die Menge der so erzeugten Aldehydverbindungen be-

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ZUGELASSEN BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE

stimmt, wobei die Menge der Aldehydverbindungen direkt proportional ist der unbekannten Menge an glykosyliertem Hämoglobin.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß man das Oxidieren durch Umsetzen des glykosylierten Hämoglobins mit einem Salz der Periodensäure durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge der Aldehydverbindungen colorimetrisch bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich den Schritt des Abtrennens von nicht an Hämoglobin gebundenen Zuckern von dem Hämoglobin in der Probe vor dem Oxidieren umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Abtrennen das Ausfällen des
Hämoglobins umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß das Ausfällen die Umsetzung des Hämoglobins mit CuSO. und Na_WO.umfaßt.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e η n"-zeichnet , daß das Ausfällen die Bindung des Hämoglobins an ein Kationenaustauscherharz umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß es weiter den Schritt des Wiederauflösens des Hämoglobins vor dem Oxidieren umfaßt.

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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Stufe des Wiederauflösens des Hämoglobins das Auflösen des Hämoglobins in HCl umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es weiter den Schritt des Reduzierens des glykosylierten Hämoglobins mit einem Reduziermittel vor dem Oxidieren umfaßt, wodurch die Menge der erzeugten Aldehydverbindungen durch die Oxidation erhöht wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1o, dadurch gekennzeichnet , daß das Reduziermittel aus NaBH. besteht.
12. Verfahren zur Messung von glykosyliertem Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet , daß man

- eine Hämoglobinprobe von unbekannter Größe erhält durch Eintauchen einer bekannten Menge von Haptoglobin in ein Hämolysat von roten Blutkörperchen, um dadurch die Hämoglobinprobe von bekannter Größe darauf zu binden, und

- danach den Gehalt an dem glykosyliertem Hämoglobin der Hämoglobinprobe bestimmt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß der Schritt des Bestimmens des Gehalts der Hämoglobinprobe an glykosyliertem Hämoglobin die Schritte umfaßt:

- Eintauchen der Hämoglobinprobe in eine Tritium-haltige reduzierende Verbindung, um dadurch die an Hämoglobin gebundenen Zuckergruppen radioaktiv zu markieren, und

- Messen des Radioaktivitätsniveaus der Hämoglobinprobe, wobei das Radioaktivitätsniveau dem Gehalt der Hämoglobinprobe an dem glykosyliertem Hämoglo-

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bin direkt proportional ist.
14. Verfahren nach Anspruch 1.3, dadurch gekennzeichnet, daß die Tritium-haltige reduzierende Verbindung aus ( H)-NaBH. besteht.
15. Apparat zur Messung von glykosyliertem Hämoglobin, gekennzeichnet durch:

- eine erste Vorrichtung zur Aufnahme einer Probe, die das Hämoglobin einschließlich der unbekannten Menge an glykosyliertem Hämoglobin enthält,

- eine zweite Vorrichtung zum Oxidieren des glykosylierten Hämoglobins, wodurch Aldehydverbindungen erzeugt werden, und

- eine dritte Vorrichtung zur Bestimmung der Menge an den so erzeugten Aldehydverbindungen, wobei die Menge an Aldehydverbindungen der unbekannten Menge an glykosyliertem Hämoglobin direkt proportional ist.
16. Apparat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Vorrichtung zur Bestimmung der Menge an erzeugten Aldehydverbindungen eine Vorrichtung zur colorimetrischen Analyse umfaßt.
17. Apparat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß die erste Vorrichtung zur Aufnahme einer Probe, die das Hämoglobin enthält, umfaßt:

- eine Behältervorrichtung und

- eine Pufferlösung,

wobei die zweite Vorrichtung zum Oxidieren des glykosylierten Hämoglobins ein Salz der Periodensäure umfaßt, und wobei die Vorrichtung zur colorimetrischen Analyse eine chemische Verbindung umfaßt, die mit den Aldehydverbindungen zu colorimetrisch analysierbaren Produkten

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abreagiert, und eine Vorrichtung zur Messung des durch
die colorimetrisch analysierbaren Produkte hindurchtretenden Lichts einer vorbestimmten Wellenlänge.
18. Apparat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß die chemische Verbindung, die mit den Aldehydverbindungen abreagiert, aus 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon-hydrochlorid-monohydrat besteht.
19. Apparat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß er weiter umfaßt:

- Mittel zum Abtrennen des Hämoglobins von löslichen Zuckern,

- Mittel zum Entfernen von überschüssigen IO-d" ^un^
IO.-Produkten, und

- Mittel zum Beenden der Wirkung der chemischen Verbindung, die mit den Aldehydverbindungen reagiert.
20. Apparat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Abtrennen des Hämoglobins von löslichen Zuckern aus einem kationischen Austauscherharz besteht.
21. Apparat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Abtrennen des Hämoglobins von löslichen Zuckern aus einer chemischen Lösung besteht, die mit dem Hämoglobin einen unlöslichen Niederschlag gibt.
22. Apparat nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Lösung aus CuSO. und Na2W0. in wäßrigen Lösungen besteht.
23. Apparat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Entfernen eines IO~- und IO .-Überschusses aus einer chemischen Verbindung be-

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steht, die mit 1O₃ und 10. einen unlöslichen Niederschlag gibt.
24. Apparat nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet , daß die chemische Verbindung aus Pb J₂ besteht.
25. Apparat nach Anspruch 19, dadurch ge k e η η zeichnet , daß das Mittel zum Entfernen des 1O₃- und IO.-Überschusses einen Schnell-Dialysator umfaßt.
26. Apparat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er weiter ein Mittel zum Wiederauflösen des immobilisierten Hämoglobins umfaßt.
27. Apparat nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Wiederauflösen des immobilisierten Hämoglobins aus HCl besteht.
28. Apparat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er weiter ein Mittel zum Reduzieren des Hämoglobins vor der Oxidation umfaßt.
29. Apparat nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zum Reduzieren des Hämoglobins vor der Oxidation aus NaBH. besteht.
30. Apparat zur Messung von glykosyliertem Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet , daß er die folgenden Vorrichtungen umfaßt:

- eine erste Vorrichtung, die eine Reaktionszone für ein glykosyliertes Hämoglobin vorsieht,

- eine zweite Vorrichtung zum Einbringen der Reaktanten in die Reaktionszone, wodurch Reaktionsprodukte erzeugt werden, und

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- eine dritte Vorrichtung zum selektiven Abtrennen von Portionen dieser Reaktionsprodukte, ohne alle der Reaktionsprodukte aus der Reaktionszone zu entfernen und wodurch ein Teil der Reaktionsprodukte dadurch zur Bestimmung der Menge an in der Reaktionszone erzeugten Aldehydverbindungen benützt wird, wobei die Menge an Aldehydverbindungen dem glykosylierten Hämoglobin direkt proportional ist.
31. Apparat nach Anspruch 3o, dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktanden eine Bleiverbindung und eine Perjodatverbindung einschließen und daß die dritte Vorrichtung zum selektiven Abtrennen von Portionen der Reaktionsprodukte ein Filter einschließt, das genügend kleine Poren hat, um ein Durchlaufen der niedergeschlagenen Produkte aus der Reaktion mit den Blei- und Perjodatverbindungen zu verhindern.
32. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Abtrennen das Waschen der roten Blutkörperchen mit normaler, physiologischer Kochsalzlösung umfaßt.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter umfaßt den Schritt des Reduzierens des glykosylierten Hämoglobins mit NaBH. vor dem Oxidieren, wodurch die Menge an durch die Oxidation erzeugten Aldehydverbindungen erhöht wird.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Reduzierens des glykosylierten Hämoglobins durch die Zugabe von Säure, wodurch das Reduzieren beendet wird, vollendet wird.
35. Apparat nach Anspruch 19, dadurch g e k e η η -

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zeichnet , daß das Mittel zum Abtrennen, des Hämoglobins von löslichen Zuckern aus normaler, physiologischer Kochsalzlösung besteht.
36. Apparat nach Anspruch 23, dadurch g e k e η η zeichnet , daß die chemische Verbindung aus Bleiacetat besteht.
37. Apparat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß er weiter Mittel zum Beenden der Wirkung des NaBH. umfaßt.
38. Apparat nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Beenden der Wirkung des NaBH. aus Phosphorsäure besteht.
39. Apparat nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zur colorimetrischen Analyse weiter Eisen(III)-chlorid umfaßt.
40. Apparat zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12, gekennzeichnet durch

- einen festen Träger,

- eine bekannte Menge von Haptoglobin auf diesem Träger und

- ein Mittel zur Bestimmung der Äquivalente an Glykosegruppen in einer Hämoglobinprobe, die an das Haptoglobin gebunden sind.
41. Apparat nach Anspruch 4o, dadurch gekennzeichnet , daß das Mittel zur Bestimmung der Äquivalente an Glykosegruppen auf der Hämoglobinprobe aus (³H)-NaBH₄ besteht.

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