DE29519705U1 - Set zur Durchführung einer Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine - Google Patents
Set zur Durchführung einer Bestimmung der Rezeptoraktivität für LipoproteineInfo
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Description
Immuno Aktiengesellschaftr &Agr;&tgr;1221 Wien
Set zur Durchführung einer Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptüruktivität
für Lipoproteine unter Verwendung Fluoreszenzmarkierter
Lipoproteine sowie entsprechende Sets zur Durchführung der Bestimmung.
Zellen besitzen Membranrezeptoren für Lipoproteine, beispielsweise
für LDL, weicht» die zelluläre Aufnahme der Lipoproteine
vermitteln. Anschließend erfolgt.der Einschluß dieser Lipoproteine
in Lysosomen, i.n denen dann auch der Abbau der Lipoproteine
erfolgt.
Bestimmte Zellen, wie beispielsweise Makrophagen, besitzen Rezeptoren
zur Aufnahme "modifizierter" Lipoproteine, beispielsweise.
Rezeptoren für azetylierta LDL. Die Aufnahme dieser modifizierten
Lipoproteine wird über sogenannte Soavenger-Rezeptoren vermittelt.
Untersuchungen zur Zellrs^eptor-verraittelten Aufnahme der Piasmalipoproteine
und auch modifizierter Lipoproteine gewinnen zunehmend an Bedeutung, da die Rezeptorfunktion (LDL-Rezeptor,
Scavenger-Rezeptor) bei der Entstehung von Arteriosklerose eine
wichtige Rolle spielt.
Insbesondere ist heute bekannt, daß LDL-Cholesterin ein kausaler
Risikofaktor für die Entstehung der Arteriosklerose ist. Ein©
hone Aktivität de3 LDL-Rsaeptors kann das Risiko einer Arteriosklerose
also minimieren. Modifizierte Formen der Lipoproteine, beispielsweise oxidierte LDL, spielen ebenfalls eine wichtige
Rolle in der Entstehung der Arterioaklerose. Die Bestimmung der
für die Aufnahme dieser modifizierten Stoffe entscheidenden
Rezeptoraktivität läßt sich durch die Verwendung azetylierter
oder oxidierter LDL unter standardisierten Bedingungen verfolgen. Untersuchungen der Scavenger-Rezeptoraktivität sind Gegenstand
der Forschung und können in Zukunft zur Beurteilung der individuellen Arteriosklerosedisposition möglicherweise auch
klinisch an Bedeutung gewinnen.
Aus dem Stand der Technik sind beispielsweise mehrere in vitro
Untersuchungen zum zellulären Metabolismus van Lipoproteinen
unter Verwendung radioaktiv markierter Tracer bekannt (siehe
z.B. Goldstein J.L. et al., 1974, J«Biol.Chem., 249, p_5133-5162).
Ein Nachteil solcher Methoden, die auf der Verwendung radioaktiver Substanzen beruhen, liegt allerdings in den hohen
Sicherheitsanforderungen für das Personal, ein weiterer Nachteil
int Problem der Abfallentsorgung radioaktiver Substanzen. Die Methoden sind im allgemeinen äußerst zeitaufwendig und teuer .und
daher für routinemäßige Untersuchungen nur für- Speziallaboratorien
geeignet.
Neuere Ansätze zielen darauf hin, die radioaktiven Substanzen,
die zur Markierung der Lipoproteine verwendet werden, durch Fluorochrome zu ersetzen. Als fein solches geeignetes Fluorochrom
wird beispielsweise 1 r 1'-Dioctadocyl-3,3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat
(DiI) verwendet (siehe z.B. Pitas R.E. et al., 1981, Arteriosclerosis, 1, &rgr;,177-185). Dabei wird angenommen,
daß diese Verbindungen, ähnlich wia dies bei Phospholipiden
der Fall ist, mit der Oberfläche der Lipoproteine assoziieren.
Die Verwendung dieser Labels ist u.a. für natives und modifiziertes
LDIj bekannt, wobei sowohl LDL als auch Scavenger-Rezeptoraktivität
mittels Fluoreszenz-Mikroskopie in kultivierten Zellen in vitro und in vivo untersucht worden sind. Die. zelluläre
Aufnahme der Lipoproteine erfolgt über die für Lipoproteine spezifischen Membranrezeptoren. Das Fluorochrom DiI wird beim
Abbau des markierten Lipoproteins quantitativ in den Lysosomen
festgehalten und von den Zellen sehr langsam über einen Zeitraum von mehreren Tagen wieder abgegeben. Daher ist die Menge von
aufgenommenem DiI proportional zur Menge des cellular aufgenommenen
Lipoproteins. Mittels 1FACS (= Fluorescence activated cell
sorter)-Analyse wurden hierzu serniquantitativts Bestimmungen der
Aufnahme von DiI-LDL an Fibroblasten, isolierten Monozyten oder
Lymphozyten durchgeführt.
Wie u.a. von Stephan et al., J.Lip.Res. 34, 325-330, 1993, heschrieben,
ist es für die quantitative Bestimmung der Fluoreszenz-markierten Lipoproteine notwendig, nach erfolgter Inkuba-
tion der Zellen mit dem Fluorochrom markiertem Lipoprotein eine
Extraktion des Fluorochroms unter Verwendung organischer Lösungsmittel
vor der eigentlichen Bestimmung durchzuführen. Die Verwendung solcher Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln
ist sehr arbeite- und zeitaufwendig· Die geringe Reproduzierbarkeit, beispielsweise aufgrund unvollständiger Extraktion,
Pipettierfehlern oder dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels,
und die mangelhafte Präzision schränken den Einsatz solcher Methoden insbesondere für routinemäßige Untersuchungen
ein. Ein entscheidender Nachteil der Extraktion mit organischen Lösungsmittel ist die Notwendigkeit einer zweiten
Extraktionsphase zur Bestimmung des Zellproteins. Die Messung des Zellproteins ist zur quantitativen Bestimmung der Lipoproteinaufnähme
und der Zellrezeptoraktivität Jedoch zwingend notwendig.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein quantitatives Verfahren zur Erfassung der zellulären Lipoproteinaufnähme, welches
eine hohe Präzision, Sensitiv!tat und Geschwindigkeit aufweist,
sowie verschiedene Sets zur Durchführung dieses Verfahrens zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß
dadurch gelöst, daß eine Bestimmung der Fluoreszenzintensität
dar in die Zellen aufgenommen Fluoreszenz-iuar-Jti&x-fcen Lipoproteine:
sowie gegebenenfalls eine Bestimmung des Zellproteins
in einem wäßrigen Zellextrakt, also unter Vermeidung organischer Lösungsmittel, ohne zusätzliche Extraktionsschritte durchgeführt
wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur quantitativen Bestimmung der
Lipoprotein-Rezept-.oraktivität durch isolierte und kultivierte
Zellen umfaßt die Inkubation der Zellen mit einem Fluoreszenzmarkierten
Lipoprotein, wobei das Lipoprotein entsprechend der Rezeptoraktivität in die Zellen aufgenommen wird, sowie das
nachfolgende extrahieren der Zellen mit einem wäßrigen Extraktionsmittel, sodaß zumindest ein Anteil des aufgenommenen Lipoproteins
in einem einphasigen Zellextrakt (bzw. Zell-Lysat) erhalten
wird, aus dem die FluoreszenzintensitSt im Zellextrakt
und gegebenenfalls auch das 2ellprotein bestimmt werden können.
Damit wird eine Quantifizierung der zellulären Lipopxotelaaufnahme
durch die Bestimmung der spezifischen Fluoreszenzintensität des eingesetzten Lipoproteins im wäSrigen Zellextrakt möglich.
Die Vermeidung eines organischen Lösungsmittels bei der Extraktion
führt dazu, daß ein einphasiger Zellextrakt erhalten wird,
namit ist es erstmals möglich, eine spektrofluororaetrische Bestimmung
des entsprechenden Lipoproteins bzw. der entsprechenden Lipoprotein-Rezeptoraktivität direkt in dem erhaltenen Zellextrakt
durchzuführen, ohne daß weitere Aufbereitungsschritte notwendig sind. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es
auch möglich, in demselben Zellextrakt, an dem auch die FluoreszenzmesBung
erfolgt, die Bestimmung des Zellproteins durchzuführen.
Die verwendeten Zellen können humanen und/oder tierischen Ursprungs
sein. Es kann sich dabei um adhärent wachsende Zellen oder um nicht adhärent wachsende Zellen handeln. Auch Zellsuspensionen,
beispielsweise Suspensionen isolierter Blutzellen wie Monozyten oder Lymphoayten, kommen in Frage. Die Inkubation
der Zellen wird entsprechend den ausgewählten Zellen beispielsweise
in einer Zellsuapension an sdhärent wachsenden Zellen
vorgenommen. Zur Bestimmung der LDL-Rezeptoraktivität werden bevorzugterweise glatte Muskelzellen oder Fibroblasten verwendet,
für die Bestimmung der Scavenger-Rezeptorak-tivitSt vorzugsweise
Makrophagen, glatte Muskelzellen nach Stimulation oder
Endothelzellen-
Gewinnung und Kultivierung flat 2ellen erfolgen gemäß den aus dem
Stand der Technik bekannten Methoden, die Inkubation mit Fluoreszenz-markierten Lipoproteinen zur Bestimmung der zellulären
Lipaproteinaufnahme und/oder Zellrezeptoraktivität erfolgt entsprechend
der jeweiligen Fragestellung, und die genauen experimentellen
Parameter können von jedem Fachmann ohne größeren experimentellen Aufwand anhand der Fragestellung gewählt werden.
Beispielsweise wird zur Bestimmung der zellulären LDL-Rezeptoraktivität
das Lipoprotein in einer Konzentration zwischen 0 -
100 |xg/ml zugesetzt. Die Inkubationsdauer beträgt mindestens 30
Minuten bis mehrere stunden bei einer Temperatur zwischen 20 bis 40"C, vorzugsweise wird 5 Stunden bei'37"C inkübiert.
Mittels des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfehrens ist es erstmals
möglich, eine direkte quantitative Bestimmung der Aufnahme und der Bindung Fluoreszenz-markierter Lipoproteine durchzuführen.
Das Verfahren ist grundsätzlich für alle humanen und/oder tierischen Zellen anwendbar und eignet sich zur Quantifizierung
der Rezeptoraktivität von Zellen für verschiedene, mit einem fluoreszierenden Mittel markierte Lipoproteine. Die zu bestimmenden
Lipoproteine können beispielsweise LDL, HDL, Chylomikronen
oder VLDL Partikel sein. Es können aber auch chemisch modifizierte,
denaturierte oder metabolisierte Lipoproteine oder Derivate davon sein. Beispielsweise können oxidierte LDL, aaetylierte
LDL, acetoazetylierte LDL und weitere bestimmt werden.
Zur Bestimmung der LOL-Rezeptoraktivität von Säuger-Zellen wird
bevorzugterweise Fluoreszenz-markiertes natives LDL mit den
entsprechenden zellen inkubiert.
Will man die Scavengex-Rezeptoraktivität bestimmen, so inkubiert
man modifiziertes, vorzugsweise azetyliertes Fluoreszenz-markiertes
LDL mit den entsprechenden Zellen.
Das für die Bestimmung der Rezeptoraktivität verwendete Lipoprotein
kann aus unterschiedlichen Quellen stammen, vorzugsweise ist es humanen Ursprungs. Grundsätzlich können aber Lipoproteine
auch aus tierischem Plasma gewonnen und mit dem Fluoreszenzmarker markiert werden.
Die Markierung erfolgt vorzugsweise mit einem für biologische Zwecke bewährten fluoreszierenden Mittel. Es kann sich um ein
Fluorochrom oder um einen Fluorphor handeln, vorzugsweise wird mit 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3 '-tetramethylindocartoocyaninperchlorat
(DiI) markiert.
Während der Markierung des Lipoproteins mit de/n fluoreszierenden
Mittel kann sine unerwünschte Oxidation des Lipoproteins durch
' die Anwesenheit von Ascorbinsäure, EDTA oder Kombinationen davon
verhindert werden. Die Markierung des entsprechenden Lipoproteins mit dem fluoreszierenden Mittel erfolgt in einer wäßrigen
Lösung vorzugsweise in Anwesenheit geringer Mengen an organischen
Lösungsmitteln z.B. DMSO und wird bevorzugterweise unter Schütteln durchgeführt. Gegebenenfalls ist ein an dem Lipoprotein
def±yJ entes Serum (T.POS) in der wäßrigen Lösung enthalten.
Unter den bevorzugten erfindungsgemäßen Bedingungen bei der Markierung
der Lipoproteine bleibt beispielsweise der ct-Tocopherol-Gehalt
des Lipoproteins konstant.
Das wäßrige Extraktionsmittel zum Extrahieren der Zellen bewirkt
das Ablösen zumindest eines Anteils der Fluoressenz-markierten
Lipoproteine von den Rezeptoren. Dabei kann jegliches wäßrige Extraktionsmittel, das dieses Ablösen bewirkt und bei welchem
ein einphasiger Zellextrakt erhalten wird, eingesetzt werden.
Vorzugsweise enthält das wäßriga Extraktionsmittel ein kationisches, anionisches oder ampholytisches Tensid, weist bevorzugt
einen alkalischen pH Wert auf und löst die Zelle zumindest teilweise auf, wobei das fluoreszierende Mittel in Lösung bleibt.
Beispielsweise enthält das Mittel SDS in verdünnter· Natronlauge, vorzugsweise wird 0,1 N NaOH mit 0,1% Natrlumdodecylsulfat verwendet.
Die Extraktion des fluoreszierenden Mittels aus den Zellen erfolgt
durch Zugabe des wäßrigen Extraktionsmittels, welches vorzugsweise auch eine zumindest teilweise Lyse der Zellen bewirkt,
vorzugsweise unter leichtem Schütteln für etwa eine bis
zwei Stunden bei
Durch die erfindungsgemäße Benutzung eines wäßrigen Extraktionsmittels
kann das fluoreszierende Mittel überraschenderweise vollständig und in reproduzierbarer Weise aus den Zellen extrahiert
werden, sodaß die Fluoreszenz direkt in dem Zellextrakt bestimmt werden kann. Unter Vermeidung organischer Lösungsmittel
entfällt daher dar Verfahrensechritt, daß eine organische Phase,
• »
die das extrahierte fluoreszierende Mittel enthalt, vom verbleibenden
isellrest abgetrennt werden muß. Gerade hiedurch werden
entscheidend grobe und systematische Fehler, beispielsweise durch Pipettierungenauigkeit und durch Verdampfen des organischen
Lösungsmittels, vermieden. Der große Vorteil der erflndungsgemäßsn
Methode liegt auch in der Möglichkeit, daß eine
Bestimmung des Zellproteins in demselben Zellextrakt, an dem
auch die Fluroeszenzmessung erfolgt, durchgeführt werden kann.
Dies war bisher aufgrund des zwelphasigen Systems nicht möglich. Somit wird durch das erfindungsgemäße Verfahren erstmals eine
quantitative Bestimmung der zellulären Bindung und Aufnahme
Fluoreszenz-markierter Lipoproteine mit hoher Sensitivität und
Präzision zur Verfügung gestellt.
Die Fluoressenzintensität wird mittels hierfür gängiger Methoden bestimmt. Beispielsweise erfolgt die Messung unter Verwendung
eines Fluorometers als Einzelküvettenraessung oder mittels Mikrotiterplatte
bei einer Anregungswellenlänge von 520 mn und bei einer Emissionswellenlänge von 580 nm. Die jeweilige Wahl der
Wellenlänge richtet sich nach dem verwendeten fluoreszierenden
Mittel.
Die Detektionsgrenze für die spezifische Fluoreszenz liegt unter
den erfindungsgemäßen Bedingungen zur Durchführung der Bestimmung etwa bei 5 ng Dil-LDL-Protein/ml. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist äafflit um einen Faktor 20-30 &khgr; sensitiver als andere
im Stand der Technik beschriebene Verfahren.
Bevorzugterweise wird neben der Bestimmung der für die entsprechenden
Lipoproteine bzw. der für die modifizierten Lipoproteine
spezifischen Rezeptoraktivität im selben Zellextrakt auch eine Prüteiiibestimmung durchgeführt. Diese ProteinbeStimmung erfolgt
mittels der gängigen Methoden, beispielsweise gemäß dftx- Methode von liowry et al., 1951 (J.Biol.Chem. 193, p- 265-275).
Erfindungsgemäß werden auch verschiedene Sets zur erfindungsgemäßen
Bestimmung der 2ellrezeptoraktivität für Lipoproteine in Zellen aux" Verf(igung gestellt. Bin Set enthält neben einem
Fluoreszenz-markierten Lipoprotein ein wäßriges Extraktionsmittel,
welches zur Herstellung eines einphasigen Ze.ilextrakts geeignet ist- Dieses Extraktionsmittel ist auch, zumindest
teilweiöt, zum Lysieren der Zellen geeignet. Das Extraktionsinittel
enthält eine mit Wasser mischbare Substanz und bewirkt,
daß zumindest ein Anteil des aufgenommenen Lipoproteins in dem
einphasigen Zellextrakt erhalten wird.
in einem weiteren Set ist zusätzlich ein Mittel zur Markierung
des Lipoproteins mit einem fluoreszierenden Mittel enthalten.
Das Mittel für die Zell-Lyse und Extraktion des fluoreszierenden
Mittels kann in seiner Zusammensetzung bereits früher beschriebenen Zusammensetzungen entsprechen. Bevorzugterweise wird mittels
des erfindungsgemäßen Sets LDL als Lipoprotein zur Verfügung
gestellt, um die LDL-Rezeptoraktivität zu bestimmen. Zur
Bestimmung der Scavenger-Rezeptoraktivität stellt ein bevorzugtes
erfindungsgemäßes Set ein azetyliertes LDL zur Verfügung.
T5as entsprechende Lipoprotein ist vorzugsweise mit DiI markiert
bzw. enthält das Mittel zur Markierung des Lipoproteins vorzugsweise
DiI. Zur Verhinderung der Oxidation des Lipoproteins während der Markierung mit deai fluoreszierenden Mittel kann das
erfindungsgemäße Set weiters Ascorbinsäure, EDTA oder eine Kombination
davon enthalten. Die im Set enthaltenen nicht-markierten Lipoproteine wexden &zgr;&ugr;&tgr; Bestimmung der unspezifischen Lipoprotein-Auf
nähme im Zellrezeptorassay verwendet.
Das FluoresKenz-marki&rte Lipoprotein kann erfindungsgemäß auch,
zur Bestimmung des in vivo-Abbaus des betreffenden Lipoproteins
verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem zu bestimmenden Lipoprotein um LDL, welches beispielsweise mit DiI
markiert ist. Grundsätzlich ist die Verwendung der Markierung
für jede Lipoproteinklasse möglich. Dies eröffnet auch die Möglichkeit der Untersuchung des Abbaus anderer Lipoproteine in
vivo.
Für die Bestimmung der Lipoproteinumsatzrate wird das markierte
Lipoprotcin dem zu untersuchenden Tier injiziert und nach bestimmten
Zeitintervallen über eine Dauer von mehreren Tagen
Blutproben entnommen. Die Fluoreszenzintensität des markierten
Lipoproteins wird direkt in den entsprechenden Piasmapraben bastimmt.
Aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität des !markierten
Lipoproteins im Plasma kann nach einem etablierten mathematischen
Verfahren (siehe Matthews, The theory of tracer experiments with 13lJ-labeled plasma proteins r Phys. Mea. Bic-i. i, 36-53,
1957) die Umsatzmenge des Lipoproteins pro Tag berechnet und die sogenannte "fractional eatabollc rata" ermittelt werden.
Erfindungsgemäß wird auch ein Set zur Bestimmung der Aufnahme
eines Lipoproteins in Blutzellen bzw. Organen eines Säugers
unter Verwendung einer Vorrichtung zur Detektion der Fluoreszenz
zur Verfügung gestellt. Dieses Set enthält ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein gemäB den bereits beschriebenen Ausführungsfarmen,
eine Injektionsvorrichtung zur Verabreichung des markierten
Lipoproteins sowie eine Vorrichtung, die für die Abnahme
von Blut bzw. Plasma geeignet ist.
Aus der Messung der Fluoreszenzintensität bzw. der Abnahme der
Fiuoreszenzi.ntensität des markierten Lipoproteins nach bestimmten
y.eitintervallen kann die aufgenommene Menge an Lipoprotein
bzw, dessen Umsatzrate in vivo, wie bereits früher beschrieben,
ermittelt werden.
Erfindungsgemäß wird weitere ©ine Präparation enthaltend ein
Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein geeignet zur Verabreichung an
einen Säuger tür diagnostische Zwecke zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren noch näher erläutert werden, ohne sie auf
diese zu beschränken:
Es zeigen:
Fig. 1: Ein Flußschema zum spektrofluorometrischen Assay zur
Bestimmung der DiI-LDL-Au£nahme durch kultivierte Zellen;
Fig. 2: Die Fluoreszenzintensität von DiI-LDL in Lysereagenz
gelöst (die Fluoreszenzintensität isL über einen Bereich von
0,005 bis 14 &mgr;&sfgr; DDL Protein/ml linear (rs = 0,999); die spezifische
Markierung beträgt 27 ng &Oacgr;LI/&mgr;g LDL Protein);
Fig. 3a: Die konzentrationsabhängige Aufnahme von DiI-LDL durch
normale humane Hautfibroblasten in 33 mm Schälchen (die Zellen
wurden, mit 0 bis 100 &mgr;g DiI-LDL Protein/ml für 5 Stunden bei
37 °C inkubiex-t und anschließend in 1000 &mgr;&idiagr; Lyse-Reagenz lysiert;
die angegebenen werte sind bezüglich der nicht-spezifischen Aufnahme
korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Bestimmungen; der Probeingehalt betrug im Mittel 0,16 mg/Schälchen;
das insert zeigt eine Scatchard Plot-Analyse der Daten;
der Km-Wert beträgt etwa 10,2 fig/ml und die maximale Aufnahmegeschwindigkeit
als Maß für die LDL-Rezeptoraktivität 9,4 (ig/mg
Zellprotein/5 Stunden);
Fig. 3bi Die konzäntrationsabhängige Aufnahme von DiI-LDL durch
U-937 Zellen (die Xellsuspensionen (3 &khgr; 106 2ellen/ml) wurden
mit 0 bis 100 Jig DiI-LDL Protein/ml für 5 Stunden bei 37"C inkubiert;
nach Wagchen wurden die Zellen in 1 ml Lyeereagena gelöst;
die Werte wurden bezüglich der unspezifischen Aufnahme
korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Bestimmungen;
der zelluläre Proteingehalt betrug 0,25 jxg/Schälchen) ;
das Insert zeigt eine Scatchard Plot-Analyse und ergibt einen
K1n-WeTt von etwa 53 \ig/ml; die maximale Aufnahmekapazität
beträgt 2,1 |ig/ml Zellprotein/5 Stunden);
• Fig. 4a; Die Abbildung zeigt die konzentrationsabhängige Aufnahme
und den Metabolismus von 125J-DiI-LDX4 durch humane Hautfibroblasten.
Verglichen werden die Daten, die durch Bestimmung der Dil-Fluoreszenz und der ' z 5J-Radioaktivität erhalten worden
sind; die Zellen wurden mit 125J-DiI-LDL in einer Konzentration
von 0 bis 100 &mgr;g/&pgr;ll· für 5 Stunden bei 37"C inkubiert; die Analyse
wurde bezüglich der Dil-Fluoreszenzintensität (offene
Quadrate), der Zell-assoziierten 12SJ-Radioaktivität. (Rauten)
s und der '£sJ-markierten Degradationsprodukte (Punkte) durchgeführt;
gesamtes metabolisiertes 125J-LDL (geschlossene Quadrate)
- 11 -
stellt die Summe der zell-assoziierten 1 E 5J-JRadioaktivitSt und
dex- 12SJ-Degradationsprodukte dar; die Werte wurden bezüglich
der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren
einen Mittelwert aus 3 Versuchen; der mittlere Gehalt an
aellulärem Protein beträgt 0,10 mg/Sehälchön} ,-
Fig. 4b: Die konzentrationsabhängige Bindung von 125J-DiI-LDIi
durch humane Haut-Fibroblasten {die Inkubation mit unterschiedlichen
Konzentrationen von 125J-DiI-LDL {0 bis 100 &mgr;&sfgr;/&tgr;&agr;&idiagr;) wurde
bsi 4"C für 2 Stunden durchgeführt; die geschlossene Quadrate
zeigen die 13 ^-Radioaktivität und die gefüllten Quadrate repräsentieren
die Dil-Flunreszenzintensität von doppelt markiertem,
gebundenein LDL; die Resultate sind als Durchschnittswerte aus 3 Versuchen dargestellt; der durchschnittliche Gehalt an
zellulärem Protein beträgt 0,1? mg/Schälchen};
Fig. 5: Die konzentrationsabhängige Aufnahme und den Metabolismus
von 1 a 5j-Dil-acLDL durch murine Makrophagen (P388D1); (die
Daten aus der Bestimmung der DiI-Fluoreszenz und der 1 ^«!-Radioaktivität
werden verglichen; die Zellen wurden mit 0 bis 1ÖÖ Hg/ml 1 25J-DiI-acLDL für 5 Stunden bei 370C inkubiert; die nicht
gefüllten Quadrate zeigen die DiI-Fluoreszenzintensität,, die
gefüllten Rhomben die Zell-assoziierte 'iSJ-Rad±oaktiv±tät und
die gefüllten Kreise die 12SJ-Degradationsprodukte; das gesamte
metabolisiertfi 1Z5J-acLDL als Summe der Zell-assoziierten 126J-Radioaktivität
und der 125J-Degradationsprodukte ist durch die
gefüllten Quadrate dargestellt; die Werte wurden bezüglich der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen
Mittelwert aus 3 Versuchen; der mittlere Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0,33 mg/Schälchen);
Fig. 6: Die maximale Aufnahmegeschwindigkeit (LDL-Rezeptoraktivität)
für DiI-LDL durch kultivierte Fibroblasten von normolipämischen
Patienten und Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie
(FH) (die Plasraacholesterinkonzentrationen der Kontrollpersonen
betrugen 98 ± 69 mg/dl, die der Patienten mit heterozygoter
FH 310 ± 43 mg/dl und die der Patienten mit homozygoter FH 651 ± 69 mg/dl; die durchschnittliche Aufnahmekapazität von
- 12 -
DiI-LDL eier analysierten Fibroblasten Ist durch die horizontalem.
Linien dargestellt; die individuellen Werte, die 2 bis 3 Experimente repräsentieren, sind durch die Punkte dargestellt);
Fig. 7: Eine charakteristische Abbaukurve für DiI-LDL in normalen Kaninchen (Kontrolle) und einem Kaninchen mit einem
LDL-Rezeptordefekt (WHHL-Kaninchen). Das markierte LDL wurde zu
diesem zweck den Kaninchen injiziert, und nach bestimmten ?,&itintervallen
wurden über eine Dauer van 3 Tagen Blutproben entnommen; die Abnahme der Fluöreszenzintensität des markierten
Lipoproteins in entnommenem Plasma ist in Abhängigkeit von der zeit dargestellt.
Ii Isolierung vmij Markierung der Lipoproteine
LDL wurde aus frisch gewonnenem CDP-Plasma gesunder menschlicher
Blutspender nach der Methode von Havel et al. (J. Clin. Invest.
1955, 34, 1345-1353) wie folgt gewonnen. Plasma wurde mit einer
Natriumchloridlösung hoher Dichte auf d-1,019 g/ml eingestellt
und bei 150000 &khgr; g für 24 Stunden bei 10"C ultrazentrifugiert.
Anschließend wurde der Unterstand auf eine Dichte von 1,060 g/ml eingestellt und LDL (d - 1,019 - 1,060 g/ml), wurde nach nochmaliger
Ultrazentrifugation (150000 &khgr; g 24 Stunden, 10eC) aus dem
Überstand gewonnen. Um Oxidation zu verhindern wurde die Lipoproteinfraktionierung
in Anwesenheit von 0pl g/l EDTA durchgeführt.
Lipoprotein-armes Serum (LPDS) wurde durch Ultrasientri-'
fugation bei einer Dichte von 1,25 g/ml (150000 &kgr; gr 48 Stunden)
aus dem Überstand gewonnen, LDL und LPDS wurden gegen 5 inM Tris,
154 mM NaCl, 0,1 g/l EDTA bei pH 7,4 und 40C dialysiert.
Der Fluoreszenzfarbstbff 1,l-Dioctadecyl-3,3,3'3'-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat
(DiI) fluoresziert im Rhodamin-Bereich.
Aufgrund seiner strukturellen Analogie zu den Phospholipiden wird DiI relativ stabil in die Ptiospholipidhülle von
Lipoproteinen eingebaut* Die Markierung von LDL mit dem Farbstoff
erfolgte nach der von Innerarity et al. (Methods of Enzymology
129, Academic Press, N.Y. 542-565, 1986) beschriebenen
Methode mit geringen Modifikationen. LDL wurde mit PBS (0,1 g/l
- 13 -
EDTA) auf eine Konzentration von 1,5 mg Lipoprotein/ral eingestellt.
3 ml dieser Verdünnung wurden mit 9 ml LPDS (4g Protein/ml)
gemischt. Als Oxidationsschutz wurden 12 &mgr;&idiagr; einer 100
mM Ascorbinsäurelösung zugegeben und das Gemisch über einen 0,45
\m Filter sterilfiltriert.
DiI (D282, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wurde in Dimethylsulfoxid
(DMSO) in einer Konzentration von 6 mg/ml bei 37°C gelöst.
225|il dieser Stammlösung wurden unter vorsichtigem Rühren
in das LDL-LPDS-Gemisch gegeben (50 &mgr;&idiagr; DiI [3 ng/ml] pro mg
LDL). Der Ansatz wurde mit Argon oder Stickstoff überschichtet
und 8 Stunden lichtgeschützt bei 370C unter leichtem Schütteln
inkubiert.
Die DiI-markierten Lipoproteine wurden durch Ultraaentrifugation
reisoliert. Dazu wurde das Gemisch mit kristallinem NaCl auf die Dichte a - 1,055 g/ml eingestellt, in Quick seal centrifuge
tubes (5/8 &khgr; 3 inch, Beckinan, Irvine, CA, USA) überführt und in
einem Ti Rotor 24 Stunden bei 45000 g und 10*C zentrifugiert
(Ultrazentrifuge L8-60M, Beckman, Irvine, CA USA). Die Dil-markierten
LDL.wurden durch "tube-slicing" aus dem Überstand gewonnen und 24 Stunden lang unter Lichtschutz bei 40C gegen Tris-Puffer
(pH 7,4; 154 mM NaCl; 0,25 mM EDTA) dialysiert-
LDL und DiI-LDL wurden gemäß der Methode von Frsenkel-Conrat
(1957, Methods in Enzymology, Academic Press New York, 247-269),
die von Baau et al. (1976, Proc.Natl.Acsa.Soi, USA 73, 3178-3182)
für Lipoproteine modifiziert worden ist, azetyliert. Alle Lipaproteinpräparationen wurden nach Sterilfiltration (0,45 &mgr;&pgr;&igr;)
bei 4"C in sterilen Behältern gelagert.
In Pig. 2 ist die lineare Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der Konzentration des DiI-LDL in Lyse-Reagenz dargestellt.
In einer typischen Präparation, die 20-30 ng DiI^g LDL Protein
enthält, war das minimale Detektionslimit bei etwa 0,0005 &mgr;g
Dil-LDL-Protein/ml,
- 14 -
Beispiel 2: Zellkultüren
Humane Hautbiopsien wurden von 4 normocholesterinäraigchen Spendern
und von 11 Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie
(FH) gewonnen; 9 Patienten waren phänotypisch heterozygot und 2
homozygot für die FH. Von den Hautbiopsien auswachsende Fibroblasten
wurden in DMEM (Fa. Sigma, St. Louis, USA) mit 10% FBS (Fa. Biochrom, Berlin, Germany), 100 U/ml Penizillin und 100
&mgr;&sfgr;/&igr;&eegr;&idiagr; Streptomyzin kultiviert. P388 Dl (IL-I) (Monozyten-Makrophage
von der Maus, ATCC TIB61) und U-937 (Histiocytic lymphoma,
human, ATCC CRL 1593) Zellinien wurden von der American 1'ype
Culture Collection (Rockville, USA) bezogen und in RPMI 1640 (Fa. Sigma, St. Louis, USA) mit 10% FBS, 100 U/ml Penizillin und
100 t^g/ntl Streptomyzin kultiviert. Alle zellen wurden bei 37°c,
5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator gehalten.
Beispiel 3: Quantitative spektrofluorametrie der Aufnahme von
Dil-Lipoprötein durch adhäreivte Zellen
5 bis 10 Mal passagierte humane Haut-Fibroblasten, hergestellt
nach Beispie]. 2, wurden in 36 nun Plastikschalen (Nunc,
Wiesbaden) kultiviert und in DMEM mit 10% FBS, 100 U/ral Penicillin
und 100 &mgr;g/&pgr;^l Streptomyzin kultiviert. Nach 72 Stunden
wurde das Medium durch DMEM mit 10% LPDS ersetzt und die Zellen
für weitere 48 Stunden inkubiert.
Um die Aufnahme des DiI-LDL zu untersuchen, wurden Fibroblasten für 5 Stunden bei 3?"C mit zunehmenden Konzentrationen von DiI-LDL
(0, 5r 10, 20, 50, 100 &mgr;&ogr; Protcin/ml) inkubiert. Die Spezifität
der Aufnahme wurde bei einem Gehalt von 10 &mgr;g Dil-LDL/ml
mit einem 50ig-fachen Überschuß an unmarkiertern LDL bestimmt.
Alle Inkubationen wurden dreifach durchgeführt.
Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PDS enthaltend
0,4% BSA und dreimal mit PBS alleine gewaschen. Anschließend
wurde 1 ml des Z©11-Lyse-Reagens (1 g/1 SDS gelöst in 0,1 N
NaOH) zugegeben. Die Inkubation der Zellen wurde unter leichtem Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Fluoreszenz wurde in einer Doppelbestimmung von 200 &mgr;&idiagr; des
Lysate auf schwarzen Mikrotiterplatten in einer« "Fluürolite
1000 microplate reader" (Dynatech Laboratories, Chantilly, USA)
bei einer Anregungswellenlänge von 520nra und einer Emissionswellenlänge
von 580 nm durchgeführt. Zelluläres Protein wurde in
einer Doppelbestimmung von 40 &mgr;&idiagr; Proben gemäß der Methode von
Lowry et al., 1951, J.Biol.Chem., 193, p.265-275, die für Mikrotiterplatten
adaptiert wurde, durchgeführt. Als Standard diente in Lyse-Reagens gelöstes Rinderserum-Albumin. Parallel dazu wurde
die Fluoreszenz von mit Lyse-Reagens (1:2000) verdünntem DiI markiertem Lipoprotein ermittelt, um die spezifische Fluoreszenzintensität
der Dil-LDL-Präparation zu bestimmen. Die Ergebnisse
wurden in ng Zell-assoziiertem Dil-LDL/mg zellprotein
dargestellt (Fig. 1). Eine Scatchard Plot-Analyse der fluorimetrischen
Daten wurde zur Berechnung der Kjn und der maximalen
Geschwindigkeit der DiI-LDL-Aufnähme durchgeführt.
Die Aufnahme d&S DiI-LDL folgt, wie. aus der Pig. 3 ersichtlich
ist, einer Typischen Sättigungskurve und zeigt eine hohe Af finitat
der Fibroblasten für das markiert*» LDL. Die Sättigung
liegt bei etwa 30 &mgr;&udiagr;[ DiI-LDL Protein/ml.
Beispiel 4: Quantitative SpeJctrofluororaetrie <äer Aufnahme von
Dil-Lipopratein durch nicht adhärente Zellen
die Experimente mit nicht adhärenten Zellen (U 937) wurden 35 mm Plastikschalen für die Kultivierung verwendet (3 &khgr; 106
Zellen/Schälchen). Die Zellen wurden mit; üil-LDL (0, 5, 10, 20,
b0, 100 &mgr;g/&pgr;Il) bei 37"C für 5 Stunden inkubiert. Die Spesifität
der Aufnahme», wurde wiederum unter Verwendung von 10 &mgr;g DiI-LDL/ml
mit einem 50ig-fachen Überschuß an unttiarkiertem LDL bestimmt.
Alle Inkubationen wurden in 2 ml RPMl 1640 mit 100 U/ml
Penizillin und 100 &mgr;$/&pgr;&igr;1 Streptomyzin durchgeführt:. Nach 5 Stun
don Inkubation wurden die Zellen in Zentrifugenröhrchen überführt
und 2 &khgr; mit PBS (3VC) .enthaltend 0,4% BSA und 0,25 g/l
EDTA gewaschen und anschließend 2 &kgr; mit PBS-EDTA allein©. Nach
jedem Waschschritt wurden die Zellen bei 690 &khgr; g für 5 Minuten
zentrifugiert und in 5 nil Puffer resuspendiert. Die Zentrifugenröhrchen
wurden vor dem letzten Waschschritt: gewechselt, um Verunreinigungen
durch freies DiI-LDL zu reduzieren. Nach der letzten Zentrifugation wurde der Puffer entfernt, und das Zeil-Pellet
wurde in 1 ml Zell-Lyse-Reagens aufgelöst. Die weiteren
Verfahrensschritte entsprechen genau jenen, die für die Fibroblasten
angewandt worden sind.
Fig. 3b zeigt die Aufnahme von DiI-LDL durch dia nicht adhärente
humane Monozyten-Zellinie U-937. Im Vergleich zu humanen Fibroblasten
zeigen diese Zellen eine geringere Affinität und eine geringere Aufnahme von DiI-LDL.
Beispiel 5: Untersuchungen der mit DiI und 125J markierten
Lipoproteine
DiI-LDL und Dil-acLDL wurden nach der Methode von Goldstein J.
L. et al., 1974, J. Biol. Chenu, 249, 5133-5162, und Drevon C.
et al., 19Bl, J.Lip. Res. 22, 37-46 mit 1?3J (Amöraham-Buehler,
Braunschweig, Germany) markiert. Anschließend wurden flie 2eiiftn
mit den doppelt markierten Lipoproteinen inkubiert. Nach Ende
der Inkubation wurde das Medium abgenommen und separiert, die
zellen gewaschen und, wie bftrftits in Beispiel 3. beschrieben,
lysiert. In ein und derselben Probe des Zeil.-Lysate wurde die
Fluoreszenz, die Radioaktivität und der Zellproteingehalt bestimmt.
Die Fiuorf?.szen7.njessungen wurden zur Berechnung der Aufnahme
von Di T-T,i.poproteinen verwendet. Mittels der Radioaktivitätsmessung
im Zell-Lysat wurde die Menge an Zell-assoziiertem
1SsJ-Lipoprotein bestimmt. Der Lipoproteinabhau wurde über die
nicht-Jodid-TCA-löslichö Radioaktivität des Zellüberstandes
ermittelt. Hiefür wurden 800 &mgr;&idiagr; des Zeilüberstandes mit 4ÖÖ &mgr;&idiagr;
eisgekühlter Trichloressigsäure (20% w/V TCA) gemischt, für 10
Minuten stark geschüttelt und 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert:.
BOO &mgr;&idiagr; des TCA-Uberstandes wurden mit 400 &mgr;&idiagr; AgN03 (5%
w/v) gemischt, für 10 Minuten geschüttelt und für weitere 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Die Radioaktivität von 1 ml
des Übp.rstandes wurde bestimmt.
Beispiel 6: Spezifität des fluorometrischen Assay bei der
Bestimmung der LDL- und der Scavenger Rezeptöraktivität
Di© zelluläre Aufnahme von Jeweils l(tyg Protein/ml DiI-LDt, und
von Dil-acLDL in normalen humanen Fibroblasten und in P388D1
Zellen mit einem 50-fachen Überschuß an nicht markiertem Lipoprotein
wurde bestimmt (siehe Tabelle 1).
Wie erwartet, wer die Aufnahme von Dil-acLDL durch F388-Zellen
entsprechend der hohen Scavsnger-Rezeptoreiktivitöt hoch. Durch
gleichzeitige Inkubation mit einem Überschuß an nicht markiertem acLDL wurde die Aufnahme des markierten acLDL merklich inhibiert,
während nicht modifiziertes j.dl in dieser Hinsicht nicht
effizient war. Die Aufnahme von Dii-r.,nL war gering und wurde
durch einen Überschuß an nicht markiertem acLDL nicht beeinfluß L.
Im Gegensatz dazu steht das Resultat bei der Aufnahme der entsprechenden
Lipoproteine durch Fibroblasten: es wurde keine spezifische Aufnahme von Dil-acLDL in normalen humanen Fibroblasten
beobachtet- Dil-i.DL hingegen wurde von Fibroblaeten mit hoher
Geschwindigkeit aufgenommen. Nicht markiertes LDL wirkte im Überschuß als effizienter !Competitor, nicht hingegen unmarkiertes
acLDL.
Beispiel 7: Bestimmung des Lipoprotein-Äbbaus in vivo
Für die Bestimmung der Lipoproteinumsatzrate wird das markierte
Lipoprot.ein dem zu untersuchenden Tier injiziert unä nach bestimmtön.
Zeitintervallen über eine Dauer von 3 Tagen Blutproben (ca. 0,6 tu 1 EDTA Blut) entnommen. Die Fluoreszenz intensität des
markierten Lipoproteins wird direkt in den entsprechenden Pias- ■
maproben bestimmt. Das Pla3ma wird hierzu 1 : 40 mit 0,9%-iger
NaCl-Lösung verdünnt. Aus der Abnahme der FluoreszenzintensiL-St
des markierten Lipoproteins im Plasma kann nach einem etablierten mathematischen Verfahren (siehe Matthews, The theory of
tracer experiments with l3lJ-labeled plasma proteins, Phys. Med,
Biol. 2: 36-53, 1957) die Umsatzmenge des Lipoproteins pro Tag
berechnet werden (fractional catabolic rate). Eine charakteristische
Abbaukurve für DiI-LDL in einem normalen Kaninchen und
einem Kaninchen mit LDL-Rezeptordefekt (WHHL) ist in Fig. 7
dargestellt-
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Claims (1)
1. Set zur Durchführung eines Verfahrens zur Bestimmung der
Rezeptoraktivitat für Lipoproteine in Säuger-Zellen durch Inkubieren
der Zellen mit einem Fluoreszenz-markierten Lipoprotein,
wobei das Lipoprotein entsprechend der für das Lipoprotein spesifischen
Rezeptoraktivität eufgenommen wird, Extrahieren der Zellen mit einem wäßrigen Extraktionsmittel, sodaß zumindest ein
Anteil des aufgenommenen Lipoproteins in einem einphasigen ZeIlextrakt
erhalten wird, -und Bestimmen der Fluoreszenzintengität
im Zcllextrakt, welches Set enthält:
a) ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein, und
b) ein wäßriges Extraktionsmittel·, geeignet zur Herstellung
eines einphasigen Zellestrakts.
2. Set nach Anspruch 1, enthaltend
a) ein Lipoprotein,
b) ein Mittel aur Markierung des Lipoproteins mit einem Fluorochrom,
und
c) ein wäßriges Extraktionsmittel, geeignet zur Herstellung
eines einphasigen. ZelleKtrakts.
3. Set nach Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als
ein weiterer Bestandteil ein an dem Lipoprotein äefizieivtes
Serum enlhalten ist.
4. Set nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadux-cli gekennzeichnet,
daß das wäßrige Extraktiionsmittel ein Tensid enthält
und vorzugsweise einen alkalischen pH aufweist.
5. Set nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige
Extraktionsmitke.l SDS in verdünnter Natronlauge enthält.
6. Seu nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet
, daß das Lipoprotein zur Bestimmung der LDL-Rözeptor-
\ aktivität LDL ist.
- 21 -
* 7- Set nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß das LDL zur Bestimmung der Scavenger-Rezep-fcoraktivität
chemisch modifiziert, insbesondere azetyliert ist.
8. Set nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Lipoprotein mit DiI markiert ist bzw. das Mittel zur Markierung des Lipoproteins DiI enthält.
9. Set nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß weiters Ascorbinsäure, EDTA oder Kombinationen davon zur Verhinderung der Oxidation des Lipoproteins wahrend
der Markierung mit dem Fluorochxom enthalten sind.
1 0. Set zur Bestimmung der Aufnahme eines Lipoproteins in
Blutzellen bzw. Organen eines Säugers unter Verwendung einer Vorrichtung zur Detektion der Flureszenz enthaltend
a) ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein,
b) eine Injektionsvorrichtung zur Verabreichung des Lipoproteins
und
c) eine Abnahmevori-ichtrung für Blut bzw. Plasma.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE29519705U DE29519705U1 (de) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | Set zur Durchführung einer Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE29519705U DE29519705U1 (de) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | Set zur Durchführung einer Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE29519705U1 true DE29519705U1 (de) | 1996-04-18 |
Family
ID=8016617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE29519705U Expired - Lifetime DE29519705U1 (de) | 1995-12-12 | 1995-12-12 | Set zur Durchführung einer Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE29519705U1 (de) |
-
1995
- 1995-12-12 DE DE29519705U patent/DE29519705U1/de not_active Expired - Lifetime
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