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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Rezeptoraktivität für Lipoproteine unter Verwendung Fluoreszenzmarkierter Lipoproteine sowie entsprechende Sets zur Durchführung der Bestimmung.
Zellen besitzen Membranrezeptoren für Lipoproteine, beispielsweise für LDL, welche die zelluläre Aufnahme der Lipoproteine vermitteln. Anschliessend erfolgt der Einschluss dieser Lipoproteine in Lysosomen, in denen dann auch der Abbau der Lipoproteine erfolgt.
Bestimmte Zellen, wie beispielsweise Makrophagen, besitzen Rezeptoren zur Aufnahme "modifizierter" Lipoproteine, beispielsweise Rezeptoren für azetylierte LDL. Die Aufnahme dieser modifizierten Lipoproteine wird über sogenannte Scavenger-Rezeptoren vermittelt.
Untersuchungen zur Zellrezeptor-vermittelten Aufnahme der Plasmalipoproteine und auch modifizierter Lipoproteine gewinnen zunehmend an Bedeutung, da die Rezeptorfunktion (LDL-Rezeptor, Scavenger-Rezeptor) bei der Entstehung von Arteriosklerose eine wichtige Rolle spielt.
Insbesondere ist heute bekannt, dass LDL-Cholesterin ein kausaler Risikofaktor für die Entstehung der Arteriosklerose ist. Eine hohe Aktivität des LDL-Rezeptors kann das Risiko einer Arteriosklerose also minimieren. Modifizierte Formen der Lipoproteine, beispielsweise oxidierte LDL, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle in der Entstehung der Arteriosklerose. Die Bestimmung der für die Aufnahme dieser modifizierten Stoffe entscheidenden Rezeptoraktivität lässt sich durch die Verwendung azetylierter oder oxidierter LDL unter standardisierten Bedingungen verfolgen. Untersuchungen der Scavenger-Rezeptoraktivität sind Gegenstand der Forschung und können in Zukunft zur Beurteilung der individuellen Arteriosklerosedisposition möglicherweise auch klinisch an Bedeutung gewinnen.
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Aus dem Stand der Technik sind beispielsweise mehrere in vitro Untersuchungen zum zellulären Metabolismus von Lipoproteinen unter Verwendung radioaktiv markierter Tracer bekannt (siehe z. B. Goldstein J. L. et al., 1974, J. Biol. Chem., 249, p. 5133- 5162). Ein Nachteil solcher Methoden, die auf der Verwendung radioaktiver Substanzen beruhen, liegt allerdings in den hohen Sicherheitsanforderungen für das Personal, ein weiterer Nachteil im Problem der Abfallentsorgung radioaktiver Substanzen. Die Methoden sind im allgemeinen äusserst zeitaufwendig und teuer und daher für routinemässige Untersuchungen nur für Speziallaboratorien geeignet.
Neuere Ansätze zielen darauf hin, die radioaktiven Substanzen, die zur Markierung der Lipoproteine verwendet werden, durch Fluorochrome zu ersetzen. Als ein solches geeignetes Fluorochrom
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al., 1981, Arteriosclerosis, 1, p. 177-185). Dabei wird angenommen, dass diese Verbindungen, ähnlich wie dies bei Phospholipiden der Fall ist, mit der Oberfläche der Lipoproteine assoziieren.
Die Verwendung dieser Labels ist u. a. für natives und modifiziertes LDL bekannt, wobei sowohl LDL als auch Scavenger-Rezeptoraktivität mittels Fluoreszenz-Mikroskopie in kultivierten Zellen in vitro und in vivo untersucht worden sind. Die zelluläre Aufnahme der Lipoproteine erfolgt über die für Lipoproteine spezifischen Membranrezeptoren. Das Fluorochrom DiI wird beim Abbau des markierten Lipoproteins quantitativ in den Lysosomen festgehalten und von den Zellen sehr langsam über einen Zeitraum von mehreren Tagen wieder abgegeben. Daher ist die Menge von aufgenommenem DiI proportional zur Menge des zellulär aufgenommenen Lipoproteins. Mittels FACS (= Fluorescence activated cell
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Lymphozyten durchgeführt.
Wie u. a. von Stephan et al., J. Lip. Res. 34,325-330, 1993, beschrieben, ist es für die quantitative Bestimmung der Fluoreszenz-markierten Lipoproteine notwendig, nach erfolgter Inkuba-
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tion der Zellen mit dem Fluorochrom markiertem Lipoprotein eine Extraktion des Fluorochroms unter Verwendung organischer Lösungsmittel vor der eigentlichen Bestimmung durchzuführen. Die Verwendung solcher Extraktionsverfahren mit organischen Lösungsmitteln ist sehr arbeit-un zeitaufwendig. Die geringe Reproduzierbarkeit, beispielsweise aufgrund unvollständiger Extraktion, Pipettierfehlern oder dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels, und die mangelhafte Präzision schränken den Einsatz solcher Methoden insbesondere für routinemässige Untersuchungen ein.
Ein entscheidender Nachteil der Extraktion mit organischen Lösungsmittel ist die Notwendigkeit einer zweiten Extraktionsphase zur Bestimmung des Zellproteins. Die Messung des Zellproteins ist zur quantitativen Bestimmung der Lipoproteinaufnahme und der Zellrezeptoraktivität jedoch zwingend notwendig.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein quantitatives Verfahren zur Erfassung der zellulären Lipoproteinaufnahme, welches eine hohe Präzision, Sensitivität und Geschwindigkeit aufweist, sowie verschiedene Sets zur Durchführung dieses Verfahrens zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass eine Bestimmung der Fluoreszenzintensität der in die Zellen aufgenommen Fluoreszenz-markierten Lipoproteine sowie gegebenenfalls eine Bestimmung des Zellproteins in einem wässrigen Zellextrakt, also unter Vermeidung organischer Lösungsmittel, ohne zusätzliche Extraktionsschritte durchgeführt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Lipoprotein-Rezeptoraktivität durch isolierte und kultivierte Zellen umfasst die Inkubation der Zellen mit einem Fluoreszenzmarkierten Lipoprotein, wobei das Lipoprotein entsprechend der Rezeptoraktivität in die Zellen aufgenommen wird, sowie das nachfolgende Extrahieren der Zellen mit einem wässrigen Extraktionsmittel, sodass zumindest ein Anteil des aufgenommenen Lipoproteins in einem einphasigen Zellextrakt (bzw. Zell-Lysat) erhalten wird, aus dem die Fluoreszenzintensität im Zellextrakt und gegebenenfalls auch das Zellprotein bestimmt werden können.
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Damit wird eine Quantifizierung der zellulären Lipoproteinaufnahme durch die Bestimmung der spezifischen Fluoreszenzintensität des eingesetzten Lipoproteins im wässrigen Zellextrakt möglich.
Die Vermeidung eines organischen Lösungsmittels bei der Extraktion führt dazu, dass ein einphasiger Zellextrakt erhalten wird.
Damit ist es erstmals möglich, eine spektrofluorometrische Bestimmung des entsprechenden Lipoproteins bzw. der entsprechenden Lipoprotein-Rezeptoraktivität direkt in dem erhaltenen Zellextrakt durchzuführen, ohne dass weitere Aufbereitungsschritte notwendig sind. Mittels des erfindungsgemässen Verfahrens ist es auch möglich, in demselben Zellextrakt, an dem auch die Fluoreszenzmessung erfolgt, die Bestimmung des Zellproteins durchzuführen.
Die verwendeten Zellen können humanen und/oder tierischen Ursprungs sein. Es kann sich dabei um adhärent wachsende Zellen oder um nicht adhärent wachsende Zellen handeln. Auch Zellsuspensionen, beispielsweise Suspensionen isolierter Blutzellen wie Monozyten oder Lymphozyten, kommen in Frage. Die Inkubation der Zellen wird entsprechend den ausgewählten Zellen beispielsweise in einer Zellsuspension an adhärent wachsenden Zellen vorgenommen. Zur Bestimmung der LDL-Rezeptoraktivität werden bevorzugterweise glatte Muskelzellen oder Fibroblasten verwendet, für die Bestimmung der Scavenger-Rezeptoraktivität vorzugsweise Makrophagen, glatte Muskelzellen nach Stimulation oder Endothelzellen.
Gewinnung und Kultivierung der Zellen erfolgen gemäss den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden, die Inkubation mit Fluoreszenz-markierten Lipoproteinen zur Bestimmung der zellulären Lipoproteinaufnahme und/oder Zellrezeptoraktivität erfolgt entsprechend der jeweiligen Fragestellung, und die genauen experimentellen Parameter können von jedem Fachmann ohne grösseren experimentellen Aufwand anhand der Fragestellung gewählt werden.
Beispielsweise wird zur Bestimmung der zellulären LDL-Rezeptoraktivität das Lipoprotein in einer Konzentration zwischen 0-
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100 /m1 zugesetzt. Die Inkubationsdauer beträgt mindestens 30 Minuten bis mehrere Stunden bei einer Temperatur zwischen 20 bis 40oC, vorzugsweise wird 5 Stunden bei 370C inkubiert.
Mittels des erfindungsgemässen Bestimmungsverfahrens ist es erstmals möglich, eine direkte quantitative Bestimmung der Aufnahme und der Bindung Fluoreszenz-markierter Lipoproteine durchzuführen. Das Verfahren ist grundsätzlich für alle humanen und/oder tierischen Zellen anwendbar und eignet sich zur Quantifizierung der Rezeptoraktivität von Zellen für verschiedene, mit einem fluoreszierenden Mittel markierte Lipoproteine. Die zu bestimmenden Lipoproteine können beispielsweise LDL, HDL, Chylomikronen oder VLDL Partikel sein. Es können aber auch chemisch modifizierte, denaturierte oder metabolisierte Lipoproteine oder Derivate davon sein. Beispielsweise können oxidierte LDL, azetylierte LDL, acetoazetylierte LDL und weitere bestimmt werden.
Zur Bestimmung der LDL-Rezeptoraktivität von Säuger-Zellen wird bevorzugterweise Fluoreszenz-markiertes natives LDL mit den entsprechenden Zellen inkubiert.
Will man die Scavenger-Rezeptoraktivität bestimmen, so inkubiert man modifiziertes, vorzugsweise azetyliertes Fluoreszenz-markiertes LDL mit den entsprechenden Zellen.
Das für die Bestimmung der Rezeptoraktivität verwendete Lipoprotein kann aus unterschiedlichen Quellen stammen, vorzugsweise ist es humanen Ursprungs. Grundsätzlich können aber Lipoproteine auch aus tierischem Plasma gewonnen und mit dem Fluoreszenzmarker markiert werden.
Die Markierung erfolgt vorzugsweise mit einem für biologische Zwecke bewährten fluoreszierenden Mittel. Es kann sich um ein Fluorochrom oder um einen Fluorphor handeln, vorzugsweise wird mit 1, 1'-Dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanin- perchlorat (DiI) markiert.
Während der Markierung des Lipoproteins mit dem fluoreszierenden
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Mittel kann eine unerwünschte Oxidation des Lipoproteins durch die Anwesenheit von Ascorbinsäure, EDTA oder Kombinationen davon verhindert werden. Die Markierung des entsprechenden Lipoproteins mit dem fluoreszierenden Mittel erfolgt in einer wässrigen Lösung vorzugsweise in Anwesenheit geringer Mengen an organischen Lösungsmitteln z. B. DMSO und wird bevorzugterweise unter Schütteln durchgeführt. Gegebenenfalls ist ein an dem Lipoprotein defizientes Serum (LPDS) in der wässrigen Lösung enthalten.
Unter den bevorzugten erfindungsgemässen Bedingungen bei der Markierung der Lipoproteine bleibt beispielsweise der a-TocopherolGehalt des Lipoproteins konstant.
Das wässrige Extraktionsmittel zum Extrahieren der Zellen bewirkt das Ablösen zumindest eines Anteils der Fluoreszenz-markierten Lipoproteine von den Rezeptoren. Dabei kann jegliches wässrige Extraktionsmittel, das dieses Ablösen bewirkt und bei welchem ein einphasiger Zellextrakt erhalten wird, eingesetzt werden.
Vorzugsweise enthält das wässrige Extraktionsmittel ein kationisches, anionisches oder ampholytisches Tensid, weist bevorzugt einen alkalischen pH Wert auf und löst die Zelle zumindest teilweise auf, wobei das fluoreszierende Mittel in Lösung bleibt.
Beispielsweise enthält das Mittel SDS in verdünnter Natronlauge, vorzugsweise wird 0, 1 N NaOH mit 0, 1% Natriumdodecylsulfat verwendet.
Die Extraktion des fluoreszierenden Mittels aus den Zellen erfolgt durch Zugabe des wässrigen Extraktionsmittels, welches vorzugsweise auch eine zumindest teilweise Lyse der Zellen bewirkt, vorzugsweise unter leichtem Schütteln für etwa eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Durch die erfindungsgemässe Benutzung eines wässrigen Extraktionsmittels kann das fluoreszierende Mittel überraschenderweise vollständig und in reproduzierbarer Weise aus den Zellen extrahiert werden, sodass die Fluoreszenz direkt in dem Zellextrakt bestimmt werden kann. Unter Vermeidung organischer Lösungsmittel entfällt daher der Verfahrensschritt, dass eine organische Phase,
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die das extrahierte fluoreszierende Mittel enthält, vom verbleibenden Zellrest abgetrennt werden muss. Gerade hiedurch werden entscheidend grobe und systematische Fehler, beispielsweise durch Pipettierungenauigkeit und durch Verdampfen des organischen Lösungsmittels, vermieden.
Der grosse Vorteil der erfindungsgemässen Methode liegt auch in der Möglichkeit, dass eine Bestimmung des Zellproteins in demselben Zellextrakt, an dem auch die Fluroeszenzmessung erfolgt, durchgeführt werden kann.
Dies war bisher aufgrund des zweiphasigen Systems nicht möglich.
Somit wird durch das erfindungsgemässe Verfahren erstmals eine quantitative Bestimmung der zellulären Bindung und Aufnahme Fluoreszenz-markierter Lipoproteine mit hoher Sensitivität und Präzision zur Verfügung gestellt.
Die Fluoreszenzintensität wird mittels hierfür gängiger Methoden bestimmt. Beispielsweise erfolgt die Messung unter Verwendung eines Fluorometers als Einzelküvettenmessung oder mittels Mikrotiterplatte bei einer Anregungswellenlänge von 520 nm und bei einer Emissionswellenlänge von 580 nm. Die jeweilige Wahl der Wellenlänge richtet sich nach dem verwendeten fluoreszierenden Mittel.
Die Detektionsgrenze für die spezifische Fluoreszenz liegt unter den erfindungsgemässen Bedingungen zur Durchführung der Bestimmung etwa bei 5 ng Dil-LDL-Protein/ml. Das erfindungsgemässe Verfahren ist damit um einen Faktor 20-30 x sensitiver als andere im Stand der Technik beschriebene Verfahren.
Bevorzugterweise wird neben der Bestimmung der für die entsprechenden Lipoproteine bzw. der für die modifizierten Lipoproteine spezifischen Rezeptoraktivität im selben Zellextrakt auch eine Proteinbestimmung durchgeführt. Diese Proteinbestimmung erfolgt mittels der gängigen Methoden, beispielsweise gemäss der Methode von Lowry et al., 1951 (J. Biol. Chem. 193, p. 265-275).
Erfindungsgemäss werden auch verschiedene Sets zur erfindungsgemässen Bestimmung der Zellrezeptoraktivität für Lipoproteine in Zellen zur Verfügung gestellt. Ein Set enthält neben einem
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Fluoreszenz-markierten Lipoprotein ein wässriges Extraktionsmittel, welches zur Herstellung eines einphasigen Zellextrakts geeignet ist. Dieses Extraktionsmittel ist auch, zumindest teilweist, zum Lysieren der Zellen geeignet. Das Extraktionsmittel enthält eine mit Wasser mischbare Substanz und bewirkt, dass zumindest ein Anteil des aufgenommenen Lipoproteins in dem einphasigen Zellextrakt erhalten wird.
In einem weiteren Set ist zusätzlich ein Mittel zur Markierung des Lipoproteins mit einem fluoreszierenden Mittel enthalten.
Das Mittel für die Zell-Lyse und Extraktion des fluoreszierenden Mittels kann in seiner Zusammensetzung bereits früher beschriebenen Zusammensetzungen entsprechen. Bevorzugterweise wird mittels des erfindungsgemässen Sets LDL als Lipoprotein zur Verfügung gestellt, um die LDL-Rezeptoraktivität zu bestimmen. Zur Bestimmung der Scavenger-Rezeptoraktivität stellt ein bevorzugtes erfindungsgemässes Set ein azetyliertes LDL zur Verfügung.
Das entsprechende Lipoprotein ist vorzugsweise mit DiI markiert bzw. enthält das Mittel zur Markierung des Lipoproteins vorzugsweise DiI. Zur Verhinderung der Oxidation des Lipoproteins während der Markierung mit dem fluoreszierenden Mittel kann das erfindungsgemässe Set weiters Ascorbinsäure, EDTA oder eine Kombination davon enthalten. Die im Set enthaltenen nicht-markierten Lipoproteine werden zur Bestimmung der unspezifischen Lipoprotein-Aufnahme im Zellrezeptorassay verwendet.
Das Fluoreszenz-markierte Lipoprotein kann erfindungsgemäss auch zur Bestimmung des in vivo-Abbaus des betreffenden Lipoproteins verwendet werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem zu bestimmenden Lipoprotein um LDL, welches beispielsweise mit Dir markiert ist. Grundsätzlich ist die Verwendung der Markierung für jede Lipoproteinklasse möglich. Dies eröffnet auch die Möglichkeit der Untersuchung des Abbaus anderer Lipoproteine in vivo.
Für die Bestimmung der Lipoproteinumsatzrate wird das markierte Lipoprotein dem zu untersuchenden Tier injiziert und nach bestimmten Zeitintervallen über eine Dauer von mehreren Tagen
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Blutproben entnommen. Die Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins wird direkt in den entsprechenden Plasmaproben bestimmt. Aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins im Plasma kann nach einem etablierten mathematischen Verfahren (siehe Matthews, The theory of tracer experiments with 131J-labeled plasma proteins, Phys. Med. Biol. 2, 36- 53,1957) die Umsatzmenge des Lipoproteins pro Tag berechnet und die sogenannte "fractional catabolic rate" ermittelt werden.
Erfindungsgemäss wird auch ein Set zur Bestimmung der Aufnahme eines Lipoproteins in Blutzellen bzw. Organen eines Säugers unter Verwendung einer Vorrichtung zur Detektion der Fluoreszenz zur Verfügung gestellt. Dieses Set enthält ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein gemäss den bereits beschriebenen Ausführungsformen, eine Injektionsvorrichtung zur Verabreichung des markierten Lipoproteins sowie eine Vorrichtung, die für die Abnahme von Blut bzw. Plasma geeignet ist.
Aus der Messung der Fluoreszenzintensität bzw. der Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins nach bestimmten Zeitintervallen kann die aufgenommene Menge an Lipoprotein bzw. dessen Umsatzrate in vivo, wie bereits früher beschrieben, ermittelt werden.
Erfindungsgemäss wird weiters eine Präparation enthaltend ein Fluoreszenz-markiertes Lipoprotein geeignet zur Verabreichung an einen Säuger für diagnostische Zwecke zur Verfügung gestellt.
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren noch näher erläutert werden, ohne sie auf diese zu beschränken : Es zeigen : Fig. 1 : Ein Flussschema zum spektrofluorometrischen Assay zur Bestimmung der DiI-LDL-Aufnahme durch kultivierte Zellen ; Fig. 2 : Die Fluoreszenzintensität von DiI-LDL in Lysereagenz
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gelöst (die Fluoreszenzintensität ist über einen Bereich von 0, 005 bis 14 g LDL Protein/ml linear (r2 = 0, 999) ; die spezifische Markierung beträgt 27 ng DiI/gg LDL Protein) ; Fig. 3a :
Die konzentrationsabhängige Aufnahme von DiI-LDL durch normale humane Hautfibroblasten in 35 mm Schälchen (die Zellen wurden mit 0 bis 100 g DiI-LDL Protein/ml für 5 Stunden bei 370C inkubiert und anschliessend in 1000 gl Lyse-Reagenz lysiert ; die angegebenen Werte sind bezüglich der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Bestimmungen ; der Proteingehalt betrug im Mittel 0, 16 mg/Schälchen ; das Insert zeigt eine Scatchard Plot-Analyse der Daten ; der Km-Wert beträgt etwa 10,2 g/ml und die maximale Aufnahmegeschwindigkeit als Mass für die LDL-Rezeptoraktivität 9, 4 /mg Zellprotein/5 Stunden) ; Fig. 3b :
Die konzentrationsabhängige Aufnahme von DiI-LDL durch U-937 Zellen (die Zellsuspensionen (3 x 106 Zellen/ml) wurden mit 0 bis 100 g DiI-LDL Protein/ml für 5 Stunden bei 370C inkubiert ; nach Waschen wurden die Zellen in 1 ml Lysereagenz ge- löst ; die Werte wurden bezüglich der unspezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Bestimmungen ; der zelluläre Proteingehalt betrug 0,25 g/Schälchen); das Insert zeigt eine Scatchard Plot-Analyse und ergibt einen Km-Wert von etwa 53 g/ml ; die maximale Aufnahmekapazität beträgt 2,1 g/ml Zellprotein/5 Stunden) ; Fig. 4a : Die Abbildung zeigt die konzentrationsabhängige Aufnahme und den Metabolismus von 125J-DiI-LDL durch humane Hautfibroblasten.
Verglichen werden die Daten, die durch Bestimmung der DiI-Fluoreszenz und der 125J-Radioaktivität erhalten worden sind ; die Zellen wurden mit 125J-DiI-LDL in einer Konzentration von 0 bis 100 ag/ml für 5 Stunden bei 370C inkubiert ; die Ana-
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der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Versuchen ; der mittlere Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0, 10 mg/Schälchen) ; Fig. 4b :
Die konzentrationsabhängige Bindung von 125J-DiI-LDL durch humane Haut-Fibroblasten (die Inkubation mit unterschied-
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bei 40C für 2 Stunden durchgeführt ; die geschlossene Quadrate zeigen die 125J-Radioaktivität und die gefüllten Quadrate repräsentieren die Dil-Fluoreszenzintensität von doppelt markiertem, gebundenem LDL ; die Resultate sind als Durchschnittswerte aus 3 Versuchen dargestellt ; der durchschnittliche Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0, 17 mg/Schälchen) ;
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Daten aus der Bestimmung der DiI-Fluoreszenz und der 125J-Radio- aktivität werden verglichen ; die Zellen wurden mit 0 bis 100 g/ml 125J-DiI-acLDL für 5 Stunden bei 370C inkubiert ; die nicht
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gefüllten Quadrate dargestellt ;
die Werte wurden bezüglich der nicht-spezifischen Aufnahme korrigiert und repräsentieren einen Mittelwert aus 3 Versuchen ; der mittlere Gehalt an zellulärem Protein beträgt 0, 33 mg/Schälchen) ;
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pämischen Patienten und Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (FH) (die Plasmacholesterinkonzentrationen der Kontrollpersonen betrugen 98 69 mg/dl, die der Patienten mit heterozygoter FH 310 43 mg/dl und die der Patienten mit homozygoter FH 651 69 mg/dl ; die durchschnittliche Aufnahmekapazität von
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DiI-LDL der analysierten Fibroblasten ist durch die horizontalen Linien dargestellt ; die individuellen Werte, die 2 bis 3 Experimente repräsentieren, sind durch die Punkte dargestellt) ; Fig. 7 :
Eine charakteristische Abbaukurve für DiI-LDL in einem normalen Kaninchen (Kontrolle) und einem Kaninchen mit einem LDL-Rezeptordefekt (WHHL-Kaninchen). Das markierte LDL wurde zu diesem Zweck den Kaninchen injiziert, und nach bestimmten Zeitintervallen wurden über eine Dauer von 3 Tagen Blutproben entnommen ; die Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins in entnommenem Plasma ist in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt.
Beispiel 1 : Isolierung und Markierung der Lipoproteine LDL wurde aus frisch gewonnenem CDP-Plasma gesunder menschlicher Blutspender nach der Methode von Havel et al. (J. Clin. Invest.
1955,34, 1345-1353) wie folgt gewonnen. Plasma wurde mit einer
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019 g/mlAnschliessend wurde der Unterstand auf eine Dichte von 1, 060 g/ml eingestellt und LDL (d-1, 019-1, 060 g/ml) wurde nach nochmaliger Ultrazentrifugation (150000 x g 24 Stunden, 10 C) aus dem Überstand gewonnen. Um Oxidation zu verhindern wurde die Lipoproteinfraktionierung in Anwesenheit von 0, 1 g/l EDTA durchgeführt. Lipoprotein-armes Serum (LPDS) wurde durch Ultrazentrifugation bei einer Dichte von 1, 25 g/ml (150000 x g, 48 Stunden) aus dem Überstand gewonnen. LDL und LPDS wurden gegen 5 mM Tris, 154 mM NaCl, 0, 1 g/l EDTA bei pH 7, 4 und 40C dialysiert.
Der Fluoreszenzfarbstoff 1, 1-Dioctadecyl-3, 3, 3'3'-tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat (DiI) fluoresziert im Rhodamin-Bereich. Aufgrund seiner strukturellen Analogie zu den Phospholipiden wird DiI relativ stabil in die Phospholipidhülle von Lipoproteinen eingebaut. Die Markierung von LDL mit dem Farbstoff erfolgte nach der von Innerarity et al. (Methods of Enzy-
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EDTA) auf eine Konzentration von 1, 5 mg Lipoprotein/ml eingestellt. 3 ml dieser Verdünnung wurden mit 9 ml LPDS (4 g Protein/ml) gemischt. Als Oxidationsschutz wurden 12 gl einer 100 mM Ascorbinsäurelösung zugegeben und das Gemisch über einen 0, 45 am Filter sterilfiltriert.
DiI (D282, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 6 mg/ml bei 370C gelöst. 2251 dieser Stammlösung wurden unter vorsichtigem Rühren in das LDL-LPDS-Gemisch gegeben (50 1 Dil [3 ng/ml] pro mg LDL). Der Ansatz wurde mit Argon oder Stickstoff überschichtet und 8 Stunden lichtgeschützt bei 370C unter leichtem Schütteln inkubiert.
Die DiI-markierten Lipoproteine wurden durch Ultrazentrifugation reisoliert. Dazu wurde das Gemisch mit kristallinem NaCl auf die Dichte d-1, 065 g/ml eingestellt, in Quick seal centrifuge tubes (5/8 x 3 inch, Beckman, Irvine, CA, USA) überführt und in
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Puffer (pH 7, 4 ; 154 mM NaCl ; 0, 25 mM EDTA) dialysiert.
LDL und DiI-LDL wurden gemäss der Methode von Fraenkel-Conrat (1957, Methods in Enzymology, Academic Press New York, 247-269), die von Basu et al. (1976, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 73,3178- 3182) für Lipoproteine modifiziert worden ist, azetyliert. Alle
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Beispiel 2 : Zellkulturen Humane Hautbiopsien wurden von 4 normocholesterinämischen Spendern und von 11 Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (FH) gewonnen ; 9 Patienten waren phänotypisch heterozygot und 2 homozygot für die FH. Von den Hautbiopsien auswachsende Fibroblasten wurden in DMEM (Fa. Sigma, St. Louis, USA) mit 10% FBS (Fa. Biochrom, Berlin, Germany), 100 U/ml Penizillin und 100 jjg/ml Streptomyzin kultiviert. P388 D1 (IL-1) (Monozyten-Makrophage von der Maus, ATCC TIB61) und U-937 (Histiocytic lymphoma, human, ATCC CRL 1593) Zellinie wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, USA) bezogen und in RPMI 1640 (Fa. Sigma, St. Louis, USA) mit 10% FBS, 100 U/ml Penizillin und 100 g/m1 Streptomyzin kultiviert.
Alle Zellen wurden bei 37oC, 5 % CO. in einem befeuchteten Inkubator gehalten.
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5 bis 10 Mal passagierte humane Haut-Fibroblasten, hergestellt nach Beispiel 2, wurden in 35 mm Plastikschalen (Nunc, Wiesbaden) kultiviert und in DMEM mit 10% FBS, 100 U/ml Penizillin und 100 g/ml Streptomyzin kultiviert. Nach 72 Stunden wurde das Medium durch DMEM mit 10% LPDS ersetzt und die Zellen für weitere 48 Stunden inkubiert.
Um die Aufnahme des DiI-LDL zu untersuchen, wurden Fibroblasten für 5 Stunden bei 37 C mit zunehmenden Konzentrationen von DiILDL (0, 5,10, 20,50, 100 g Protein/ml) inkubiert. Die Spezifität der Aufnahme wurde bei einem Gehalt von 10 gg DiI-LDL/ml mit einem 50ig-fachen Überschuss an unmarkiertem LDL bestimmt.
Alle Inkubationen wurden dreifach durchgeführt.
Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal mit PBS enthaltend 0, 4% BSA und dreimal mit PBS alleine gewaschen. Anschliessend wurde 1 ml des Zell-Lyse-Reagens (1 g/l SDS gelöst in 0, 1 N NaOH) zugegeben. Die Inkubation der Zellen wurde unter leichtem Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt.
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1000 microplate reader" (Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) bei einer Anregungswellenlänge von 520nm und einer Emissionswellenlänge von 580 nm durchgeführt. Zelluläres Protein wurde in einer Doppelbestimmung von 40 gl Proben gemäss der Methode von Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem., 193, p. 265-275, die für Mikrotiterplatten adaptiert wurde, durchgeführt. Als Standard diente in Lyse-Reagens gelöstes Rinderserum-Albumin.
Parallel dazu wurde die Fluoreszenz von mit Lyse-Reagens (1 : 2000) verdünntem DiI markiertem Lipoprotein ermittelt, um die spezifische Fluoreszenzintensität der DiI-LDL-Präparation zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden in ng Zell-assoziiertem DiI-LDL/mg Zellprotein dargestellt (Fig. 1). Eine Scatchard Plot-Analyse der fluorimetrischen Daten wurde zur Berechnung der Km und der maximalen Geschwindigkeit der DiI-LDL-Aufnahme durchgeführt.
Die Aufnahme des DiI-LDL folgt, wie aus der Fig. 3 ersichtlich ist, einer typischen Sättigungskurve und zeigt eine hohe Affi-
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:DiI-Lipoprotein durch nicht adhärente Zellen Für die Experimente mit nicht adhärenten Zellen (U 937) wurden 35 mm Plastikschalen für die Kultivierung verwendet (3 x 106 Zellen/Schälchen). Die Zellen wurden mit DiI-LDL (0, 5,10, 20, 50,100 g/ml) bei 37 C für 5 Stunden inkubiert. Die Spezifität der Aufnahme wurde wiederum unter Verwendung von 10 g DiI-
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stimmt. Alle Inkubationen wurden in 2 ml RPMI 1640 mit 100 U/ml Penizillin und 100 ug/ml Streptomyzin durchgeführt.
Nach 5 Stunden Inkubation wurden die Zellen in Zentrifugenröhrchen überführt und 2 x mit PBS (37 C) enthaltend 0, 4% BSA und 0, 25 g/l EDTA gewaschen und anschliessend 2 x mit PBS-EDTA alleine. Nach jedem Waschschritt wurden die Zellen bei 690 x g für 5 Minuten
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zentrifugiert und in 5 ml Puffer resuspendiert. Die Zentrifugenröhrchen wurden vor dem letzten Waschschritt gewechselt, um Verunreinigungen durch freies DiI-LDL zu reduzieren. Nach der letzten Zentrifugation wurde der Puffer entfernt, und das ZellPellet wurde in 1 ml Zell-Lyse-Reagens aufgelöst. Die weiteren Verfahrensschritte entsprechen genau jenen, die für die Fibroblasten angewandt worden sind.
Fig. 3b zeigt die Aufnahme von DiI-LDL durch die nicht adhärente humane Monozyten-Zellinie U-937. Im Vergleich zu humanen Fibroblasten zeigen diese Zellen eine geringere Affinität und eine geringere Aufnahme von DiI-LDL.
Beispiel 5 : Untersuchungen der mit Dil und 125J markierten Lipoproteine DiI-LDL und DiI-acLDL wurden nach der Methode von Goldstein J.
L. et al., 1974, J. Biol. Chem., 249,5133-5162, und Drevon C. et al., 1981, J. Lip. Res. 22,37-46 mit 125J (Amersham-Buchler, Braunschweig, Germany) markiert. Anschliessend wurden die Zellen mit den doppelt markierten Lipoproteinen inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurde das Medium abgenommen und separiert, die Zellen gewaschen und, wie bereits in Beispiel 3. beschrieben, lysiert. In ein und derselben Probe des Zell-Lysats wurde die Fluoreszenz, die Radioaktivität und der Zellproteingehalt bestimmt. Die Fluoreszenzmessungen wurden zur Berechnung der Aufnahme von DiI-Lipoproteinen verwendet. Mittels der Radioaktivitätsmessung im Zell-Lysat wurde die Menge an Zell-assoziiertem 125J-Lipoprotein bestimmt. Der Lipoproteinabbau wurde über die nicht-Jodid-TCA-lösliche Radioaktivität des Zellüberstandes ermittelt.
Hiefür wurden 800 cl des Zellüberstandes mit 400 1 eisgekühlter Trichloressigsäure (20% w/v TCA) gemischt, für 10 Minuten stark geschüttelt und 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. 800 p. l des TCA-Überstandes wurden mit 400 1 AgN03 (5% w/v) gemischt, für 10 Minuten geschüttelt und für weitere 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Die Radioaktivität von 1 ml des Überstandes wurde bestimmt.
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Beispiel 6 : Spezifität des fluorometrischen Assay bei der Bestimmung der LDL- und der Scavenger Rezeptoraktivität Die zelluläre Aufnahme von jeweils lOug Protein/ml DiI-LDL und von DiI-acLDL in normalen humanen Fibroblasten und in P388D1 Zellen mit einem 50-fachen Überschuss an nicht markiertem Lipoprotein wurde bestimmt (siehe Tabelle 1).
Wie erwartet, war die Aufnahme von DiI-acLDL durch P388-Zellen entsprechend der hohen Scavenger-Rezeptoraktivität hoch. Durch gleichzeitige Inkubation mit einem Überschuss an nicht markiertem acLDL wurde die Aufnahme des markierten acLDL merklich inhibiert, während nicht modifiziertes LDL in dieser Hinsicht nicht effizient war. Die Aufnahme von DiI-LDL war gering und wurde durch einen Überschuss an nicht markiertem acLDL nicht beeinflusst.
Im Gegensatz dazu steht das Resultat bei der Aufnahme der entsprechenden Lipoproteine durch Fibroblasten : es wurde keine spezifische Aufnahme von DiI-acLDL in normalen humanen Fibroblasten beobachtet. DiI-LDL hingegen wurde von Fibroblasten mit hoher Geschwindigkeit aufgenommen. Nicht markiertes LDL wirkte im Überschuss als effizienter Kompetitor, nicht hingegen unmarkiertes acLDL.
Beispiel 7 : Bestimmung des Lipoprotein-Abbaus in vivo Für die Bestimmung der Lipoproteinumsatzrate wird das markierte Lipoprotein dem zu untersuchenden Tier injiziert und nach bestimmten Zeitintervallen über eine Dauer von 3 Tagen Blutproben (ca. 0, 6 ml EDTA Blut) entnommen. Die Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins wird direkt in den entsprechenden Plasmaproben bestimmt. Das Plasma wird hierzu 1 : 40 mit 0, 9%-iger NaCl-Lösung verdünnt. Aus der Abnahme der Fluoreszenzintensität des markierten Lipoproteins im Plasma kann nach einem etablierten mathematischen Verfahren (siehe Matthews, The theory of tracer experiments with 131J-labeled plasma proteins, Phys. Med.
Biol. 2 : 36-53, 1957) die Umsatzmenge des Lipoproteins pro Tag
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berechnet werden (fractional catabolic rate). Eine charakteristische Abbaukurve für DiI-LDL in einem normalen Kaninchen und einem Kaninchen mit LDL-Rezeptordefekt (WHHL) ist in Fig. 7 dargestellt.
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Tabelle 1:
EMI19.1
<tb>
<tb> Zelltyp <SEP> DiI-acLDL <SEP> DiI-acLDL <SEP> + <SEP> DiI-acLDL <SEP> + <SEP> DiI-LDL <SEP> DiI-LDL <SEP> + <SEP> Dil-LDL <SEP> +
<tb> LDL <SEP> acLDL <SEP> LDL <SEP> acLDL
<tb> P388D1 <SEP> 10,73 <SEP> +/-0,60 <SEP> 10,73 <SEP> +/-0,13 <SEP> 1,25 <SEP> +/- <SEP> 0,09 <SEP> 2,22 <SEP> +/- <SEP> 0,03 <SEP> 0,36 <SEP> +/- <SEP> 0,05 <SEP> 1,84 <SEP> +/- <SEP> 0,04
<tb> humane <SEP> Haut
<tb> Fibroblasten <SEP> 0, <SEP> 08 <SEP> +/- <SEP> 0,02 <SEP> 0,08 <SEP> +/- <SEP> 0,01 <SEP> 0,105 <SEP> +/-0,03 <SEP> 4,79 <SEP> +/- <SEP> 0,14 <SEP> 0,40 <SEP> +/- <SEP> 0,05 <SEP> 4,85 <SEP> +/- <SEP> 0,47
<tb>