DE2922284C2

DE2922284C2 -

Info

Publication number: DE2922284C2
Application number: DE2922284A
Authority: DE
Inventors: Lawrence Edmond Louisville Ky. Us Gravely; Vernon Louis Georgetown Ky. Us Geiss; Charles Fred Middletown Ky. Us Gregory
Original assignee: Brown and Williamson Tobacco Corp
Current assignee: Brown and Williamson Holdings Inc
Priority date: 1978-06-15
Filing date: 1979-05-31
Publication date: 1988-12-22
Also published as: GB2028628A; FR2437795A1; CA1244363A; US4556073A; BE876994A; GB2028628B; CH655231A5; DE2922284A1; FR2437795B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reduzieren des Nitratgehalts von Tabak oder Tabakextrakt, wobei man entweder den Tabak in einem wäßrigen Medium oder Tabakextrakt 16 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 5 bis 37°C mit einem Micrococcus kontaktiert, der fähig ist, den Nitratgehalt des Tabaks zu reduzieren. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Behandlung von Tabakmaterialien, um deren Nitratgehalt zu vermindern. Diese Tabakmaterialien ergeben dann beim Einarbeiten in ein Tabakrauchprodukt einen Rauch mit vermindertem Gehalt an Stickoxiden und Cyanwasserstoff, ohne daß die günstigen Aroma- und Geschmackseigenschaften oder andere erwünschte Raucheigenschaften verloren gehen.

Aus verschiedenen Gründen ist es oftmals anzustreben, den Nitratgehalt von Tabak zu vermindern. So haben z. B. in den letzten Jahren Zigaretten mit verminderter Abgabe eine erhebliche Aufnahme beim Verbraucher gefunden. Zahlreiche Techniken sind zur Verminderung der Rauchabgabe verfügbar geworden.

Bei der Entfernung oder Verminderung des Nitratgehaltes wurden bei den üblichsten Methoden Chemikalien zur selektiven Nitrat- und Ionenentfernung aus Tabakextrakten durch Ionenretardierungs- (US-PS 38 47 164) und Ionenaustauschertechniken (US-PS 36 16 801) angewendet. Es ist jedoch auch eine Behandlung bekannt, die eine Verminderung des Nitratgehaltes von Tabak ermöglicht und bei der Mikroorganismen verwendet werden.

Ein Verfahren, den Nitratgehalt von Tabakprodukten durch den Einsatz von Mikroorganismen zu verringern, wurde in der DE-AS 28 11 690 und in der DE-PS 28 16 427 beschrieben. Bei dem in den genannten Veröffentlichungen beschriebenen Mikroorganismus handelt es sich um Enterobacter aerogenes, wobei die Einwirkung der Mikroorganismen während des Veredelungsverfahrens von Tabak sowohl unter anaeroben als auch aeroben Bedingungen erfolgen kann.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein weiteres, äußerst wirksames Verfahren zur Verminderung des Nitratgehalts von Tabak mittels der Einwirkung von Mikroorganismen zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß man als Mikroorganismus Micrococcus denitrificans einsetzt, der in einem Nährmedium gezüchtet wurde, das Nitrat enthält.

Bei einem Verfahren, bei dem Tabak in wäßrigem Medium oder Tabakextrakt 16 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 5 bis 37°C mit dem genannten Micrococcus denitrificans kontaktiert wird, werden die Tabakmaterialien durch eine biochemische Reaktion in ihrem Gehalt an Nitraten vermindert. So behandelte Tabakmaterialien ergeben bei der Einarbeitung in ein Tabakrauchprodukt einen milden Rauch mit verminderten Stickoxid- und Cyanwasserstoffgehalten, ohne daß Verluste an den gewünschten Aroma-, Geschmacks- oder anderen Raucheigenschaften auftreten.

Die Erfindung beruht auf der Tatsache, daß bestimmte Mikroorganismen in wäßriger Lösung, wenn sie vorher in nitrathaltigen Medien gezüchtet wurden, beim Kontakt mit Tabak den Nitratgehalt des Tabaks vermindern. Es ist festgestellt worden, daß bei Tabakmaterialien, die mit einer reinen Kultur von speziellen Mikroorganismen behandelt werden, der Nitratgehalt der Tabakmaterialien vermindert wird. Hierdurch wird ein Tabakmaterial hergestellt, das beim Einbringen in eine Mischzigarrette zu einer Verminderung der Abgabe von Stickoxiden und Cyanwasserstoff beiträgt.

Als besonders wirksam hat sich dabei die Verwendung der bei der American Type Culture Collection hinterlegten und freigegebenen Stämme ATCC 17 741 sowie ATCC 19367 der Art Micrococcus denitrificans erwiesen.

Zur Erhöhung der Wirksamkeit der mikrobiologischen Denitrifizierung können Nitrat enthaltende Verbindungen in Kombination mit den Kulturen von Micrococcus denitrificans eingesetzt werden, z. B. Kaliumnitrat, Natriumnitrat oder Ammoniumnitrat.

Unter Verwendung der erfindungsgemäß vorgesehenen Kultur ist es zweckmäßig, Burley- oder im Rauchkanal geräucherte Blättchen oder Stengel zu behandeln und die darin vorhandenen Nitrate zu entfernen oder einen wäßrigen Extrakt eines dieser Materialien herzustellen und die Nitrate zu entfernen und sodann den behandelten Extrakt wieder zu den ursprünglichen Tabakmaterialien zuzusetzen. Durch die Möglichkeit, den Extrakt zu behandeln und ihn sodann wieder zu dem ursprünglichen Tabak zuzusetzen, werden Gewichtsverluste an löslichen Materialien vermieden, die bei der Verwendung von Wasser bei der Extraktion und dessen Verwerfung als Träger zur Entfernung von Nitrat auftreten. Hierdurch werden auch Verluste an anderen erwünschten Tabakkomponenten vermieden, die beim Extrahieren mit Wasser und Verwerfen auftreten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch zur Herstellung von rekonstituierten Tabakprodukten geeignet, bei der der Tabak extrahiert wird und der Extrakt in nachfolgende Prozeßstufen zurückgegeben wird, da dieses (mikrobielle) Enzymsystem wirksam in einem flüssigen System funktioniert. Bei dem Verfahren wird das Nitrat aufgebrochen und in gasförmigen Stickstoff umgewandelt, der an die Atmosphäre freigesetzt wird.

Erfindungsgemäß geht man bei einer bevorzugten Methode zur Verminderung des Nitratgehaltes des Tabaks so vor, daß man ein wäßriges Medium herstellt, das den Micrococcus denitrificans enthält, durch den der Nitratgehalt vermindert wird.

Bei der Herstellung eines wäßrigen Mediums wird eine (erste) Nähragarlösung hergestellt, indem ein handelsüblicher Nähragar zu destilliertem Wasser gegeben wird, wobei die Agarmenge im allgemeinen mindestens 5 g/l beträgt. Bei einer vorgeschlagenen Methode wird hierzu eine Nitrat enthaltende Verbindung, vorzugsweise Kaliumnitrat, in einer Menge von mindestens 0,1 Gew.-% Nitrat/Volumeneinheit Wasser und im allgemeinen von etwa 1 Gew.-% Nitrat/Volumeneinheit Wasser zugesetzt.

Diese Lösung wird dann als Schrägkultur in Röhrchen oder Gläschen sterilisiert; d. h. Reagenzgläser, die die Nähragarlösung enthalten, werden sodann schräg angeordnet, um eine Schrägoberfläche in einem Autoklaven zu ergeben, und sie werden mindestens 15 Minuten lang bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und bei 121°C erhitzt. Das sterilisierte Medium wird sodann für den späteren Gebrauch in einem Kühlschrank gegeben.

Eine zweite Lösung wird hergestellt, die eine Nitrat enthaltende Substanz enthält und die durch die in dem ersten Medium gewachsene Kultur behandelt werden soll. Eine solche zweite Lösung kann eine Nährbrühe sein, die Nitrate enthält und die hergestellt worden ist, indem eine handelsübliche Nährbrühe in destilliertem Wasser aufgelöst worden ist, wobei die Menge der Nährbrühe etwa 5 bis 10 g/l beträgt. Die Konzentration der Nährbrühe kann aber auch vom Fachmann verändert werden, wobei eine einsetzbare Kultur erhalten wird. Diese Lösung wird gleichfalls mindestens 15 Minuten bei mindestens 1,05 atü und 121°C oder mehr in einem Autoklaven sterilisiert. Kaliumnitrat oder andere Nitrat enthaltende Verbindungen können zu dieser Lösung vor der Sterilisation gegeben werden.

Ein weiteres Beispiel für eine zweite Lösung ist eine Tabakextraktbrühe, die Nitrate enthält. Die Tabakextraktbrühe wird hergestellt, indem man gewöhnlich etwa 100 g Tabakmaterial, z. B. ein im Rauchkanal geräuchertes Burleystengelgemisch, genommen wird, und dieses mit etwa 1000 ml Wasser vermischt wird, wonach dieses Gemisch in einem Autoklaven etwa 30 bis 60 Minuten bei mindestens 1,05 atü und 121°C oder mehr gekocht wird.

Der resultierende, flüssige Extrakt wird sodann entfernt und das Flüssigkeitsvolumen wird auf die ursprüngliche Menge des Extraktes durch Zugabe von destilliertem Wasser eingestellt. Der Extrakt wird sodann mit Hefeextrakt vermischt, wobei der Anteil des Hefeextrakts im allgemeinen mindestens 0,3 Gew.-% des Volumens der Flüssigkeit beträgt. Gewünschtenfalls können jedoch auch größere Hefeextraktmengen verwendet werden. Das Gemiscch wird in Kolben abgegeben, die mit Baumwolle zugestöpselt und mindestens 15 Minuten lang bei 1,05 atü oder mehr und 121°C oder mehr für die nachfolgende Kulturfortpflanzung sterilisiert werden. Vor der Verwendung zum Wachstum der Kultur wird der pH-Wert mit einer geeigneten Säure oder Base auf etwa 7,2 eingestellt. Der Mikroorganismus, Micrococcus denitrificans wird auf den Nähragarschrägkulturen 3 bis 5 Tage bei 5 bis 37°C inkubiert. Das resultierende Wachstum wird sodann zur Inokulierung der Tabakextraktbrühe, deren pH eingestellt worden ist, verwendet. Das Inokulum wird von den Schrägkulturen entfernt, indem die Schrägoberfläche mit einer vorgewählten Menge von destilliertem Wasser gewaschen wird. Die inokulierte Tabakextraktbrühe wird sodann im allgemeinen etwa 24 Stunden bei 5 bis 37°C gerührt, um das Wachstum der Kultur zu fördern.

Das resultierende Inokulum ist sodann zur Verwendung bei der Behandlung von Tabakmaterialien zur Verminderung des Nitratgehalts bereit.

Bei der Behandlung von (festen) Tabakmaterialien wird der pH-Wert des Tabaks mit einem Gemisch aus einer Base und Wasser auf etwa 7,0 bis 7,2 eingestellt. Die Kultur wird sodann mit weiterem Wasser zugesetzt, und der so behandelte Tabak wird gewöhnlich in Kunststoffbeutel gebracht, wo der Nitratabbau stattfindet.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Verfahrensweise zur Herstellung des Inokulums bzw. des Impfstoffs.

(a) Nähragar + 1% Kaliumnitrat

Handelsübliches Nähragar (entwässerte Form) von Difco Laboratories wurde zu destilliertem Wasser im Verhältnis von 23 g/l gegeben. Die 23 g Nähragar enthielten 3 g Rindfleischextrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar. Zu dieser Lösung wurde 1 Gew.-% Kaliumnitrat/Volumeneinheit Wasser gegeben. Die resultierende Lösung hatte einen End-pH-Wert von 6,8.

Dieses Medium wurde sodann als Schrägkultur in Röhrchen in einem Autoklaven 15 min bei 1,05 atü und 121°C sterilisiert, abgekühlt und für die spätere Verwendung zum Wachstum von Kulturen gekühlt.

(b) Nährbrühe

Eine Lösung von Nährbrühemedien wurde hergestellt, indem entwässerte Nährbrühe in einer Menge von 8 g/l zu destilliertem Wasser gegeben wurde. Die Nährbrühe enthielt 5 g Pepton und 3 g Rindfleischextrakt. Das resultierende, wäßrige Medium wurde sodann 15 min bei 1,05 atü und 121°C zum späteren Gebrauch bei dem Wachstum der Kultur sterilisiert.

(c) Tabakextraktbrühe von im Rauchkanal geräuchertem Burleystengel- Tabak

Eine Tabakextraktbrühe von im Rauchkanal geräuchertem Burley stengel-Tabak wurde hergestellt, indem 100 g im Rauchkanal geräucherte Burleystengel zu 1000 ml Wasser zugegeben wurden und indem das Gemisch 40 min bei 1,05 atü und 121°C im Autoklaven gekocht wurde. Der resultierende Flüssigkeitsextrakt wurde entfernt, und das Flüssigkeitsvolumen wurde auf seine ursprüngliche Menge mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Flüssigkeit wurde sodann mit Hefeextrakt (HE) in einer Menge von 0,5 Gew.-% Hefeextrakt/Volumeneinheit Flüssigkeit vermischt, und das Gemisch wurde in Kolben eingefüllt, die mit Baumwolle zugestöpselt und 15 min bei 1,05 atü und 121°C zur nachfolgenden Kulturfortpflanzung sterilisiert wurden.

(d) Inokulierung der Brühe

Der Mikroorganismus, Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungsnummer 17 741), wurde auf den Nähragarschrägkulturen 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Flüssige Medien, z. B. Nährbrühe oder Tabakextraktbrühe von im Rauchkanal geräuchertem Burleystengel- Tabak, wurden im Verhältnis von 2% (Vol/Vol) mit einem sterilen Waschwasser der Kultur von Schrägkulturen inokuliert. Der pH-Wert der Brühe wurde vor der Inokulierung mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf etwa 7,2 bis 7,5 eingestellt. Die Kolben wurden sodann etwa 24 h bei 30°C und 160 U/min durchgerührt.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die Nitratverminderung bzw. den Nitratabbau, die bzw. der in einem im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel- Extrakt und im Rauchkanal geräucherten Stengelextrakt erfolgt.

Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungsnr. 17 741) wurde in einer gemäß Beispiel 1 hergestellten Tabakextraktbrühe von im Rauchkanal geräuchertem Burleystengel-Tabak (+0,5% HE) und in einem im Rauchkanal geräucherten Stengelextrakt, der wie folgt hergestellt worden war, gezüchtet.

15 kg im Rauchkanal geräucherte Stengel wurden mit 240 kg Wasser von 90°C während 30 min extrahiert. Der Extrakt wurde zentrifugiert, gesammelt und mit Hefeextrakt in einer Menge von 0,5% (Gew./Vol.) versetzt. Das Gemisch wurde 15 min bei 1,05 atü und 121°C sterilisiert. Beide Medien wurden nach der pH-Einstellung mit den Waschwässern von 4-tägigen Schrägkulturen mit einer Menge von 10% (Vol/Vol) inokuliert und 24 h bei 160 U/min (Drehen) und 30°C in Erlenmeyerkolben (150 ml/500 ml Kolben) inkubiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß in beiden Extrakten das Nitrat im wesentlichen abgebaut bzw. vermindert wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Effekte der Belüftung der Kutlurmasse während des Nitratabbaus unter Verwendung des Mikroorganismus Micrococcus denitrificans.

Eine Kultur von Micrococcus denitrificans (ATCC 17 741) wurde auf Nähragar +1% KNO₃-Schrägkulturen gezüchtet und sodann in Extraktbrühe von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln +0,5% Hefeextrakt in Schüttelkolben gemäß Beispiel 1 gezüchtet.

Diese Kultur wurde in zwei gleiche Teile aufgeteilt und als Inokulum bzw. Impfstoff für zwei separate Fermentatoren der gleichen Brühe +0,5% Hefeextrakt verwendet. Die Wachstumsparameter für die Kultur in jedem Fermentator waren wie folgt.

Die bei diesen Bedingungen erhaltenen Züchtungsergebnisse sind in der folgenden Zusammenstellung aufgeführt.

Diese Kulturen wurden sodann zur Behandlung von Burleytabakblättchen verwendet, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden.

Es wird ersichtlich, daß die belüftete Kultur die größte Zellmasse ergab und das Blattabaknitrat am besten abbaute. Jedoch ergab auch die nichtbelüftete Kultur ein großes Ausmaß des Abbaus des Blattabaknitrats. Tabak, der mit Kulturen behandelt worden ist, die bei jedem Satz von Bedingungen gezüchtet worden sind, ist für Tabakprodukte annehmbar.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt den Nitratabbau von inokuliertem Tabak.

2,3 kg Burleytabak wurden mit einer belüfteten Kultur von Micrococcus denitrificans (ATCC 17 741) behandelt, die 22 h gemäß Beispiel 3 gezüchtet worden war. Der behandelte Tabak wurde bei 30°C in einem Kunststoffbeutel unter Verwendung der folgenden Materialien behandelt:

Inokulum (ml)2880 Tabakgewicht (g)2270 1N NaOH (ml) 449,5 Leitungswasser (ml)2572

Bei dieser Behandlung wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es wird ersichtlich, daß der Nitratgehalt des behandelten Tabaks von 2,95% auf 1,44% vermindert wurde (51%ige Verminderung), während sich der Nitratgehalt der Kontrollprobe nicht vermindert hatte.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Verminderung von Stickoxiden (NOx) und Cyanwasserstoff (HCN) im Rauch eines Tabakproduktes, wenn ein Tabak verwendet wird, der einem Nitratabbau durch den Mikroorganismus Micrococcus denitrificans unterworfen worden war.

908 g Burleytabakblättchen wurden mit 2864 ml Micrococcus denitrificans vermischt, der in Tabakextrakt von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln gemäß Beispiel 1 gezüchtet worden war. Es wurde kein weiteres Wasser zugesetzt und es erfolgte auch keine pH-Einstellung vor der Inokulierung. Der Tabak wurde gründlich gemischt, in einen Kunststoffbeutel eingegeben und 24 h bei 30°C inkubiert.

Bei dieser Tabakbehandlung diente das flüssige Inokulum zu drei Zwecken:

(1) Einstellung des Anfangstabak-pH-Werts (Ausgangs- pH-Wert bei ∼5,8);
(2) Erhöhung der Tabakfeuchtigkeit (Ziel 75%);
(3) Zuführung der Kultur zum Abbau des Nitrats.

Nach der mikrobiellen Behandlung wurden die Burleytabake mit anderen Standardmischungskomponenten vermischt, wobei der Gesamt mischungsnitratgehalt 1,16% im Vergleich zu 1,69% für die nichtbehandelte Kontrollmischung betrug.

Zwei gesonderte Mischungen wurden zu Zigaretten verformt und auf einer Rauchmaschine mit konstantem Vakuum geraucht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es wird ersichtlich, daß der Anteil der Stickoxide in dem Rauch in der Probe, die den behandelten Tabak enthielt, signifikant vermindert wurde (17,5%). Weiterhin wird die Cyanwasserstoffabgabe in der Probe, die behandelten Tabak enthielt, vermindert (12,6%). Die Abgaben aller anderen Komponenten bleiben praktisch unverändert.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Verminderung von Stickoxiden (NO_x) und Cyanwasserstoff (HCN) in einem Tabakprodukt bei Verwendung eines Tabaks, der einem Nitratabbau durch den Mikroorganismus Micrococcus denitrificans unterworfen waren war. Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17 741) wurde gemäß Beispiel 3 gezüchtet (Fermentator "A"-Bedingungen) und 24 h in geschlossenen Kunststoffbeuteln bei 30°C zur Behandlung von Burleytabak verwendet. Das Nitrat in dem Wachstumsmedium hatte sich nach 17 h erschöpft.

Es wurden die folgenden Materialmengen verwendet:

Inokulum (ml)1716 1N NaOH (ml) 270 Wasser (ml)1555 Tabak (g)1362

Es wurden folgende Ergebnisse der Tabakbehandlung erhalten:

Nach der Behandlung wurden die Burleyblättchen mit anderen Tabakkomponenten vermischt und zu Zigaretten verformt, die auf einer Rauchmaschine mit konstantem Vakuum geraucht wurden. Ein Kontrollprodukt ohne behandelte Blättchen, das jedoch nichtbehandelte Burleyblättchen enthielt, wurde gleichfalls in der Maschine geraucht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die Stickoxide in dem Produkt mit behandeltem Tabak signifikant vermindert worden waren (19,7%). Weiterhin wurde in dem Produkt mit behandeltem Tabak die Cyanwasserstoffabgabe vermindert (9,1%).

Beispiel 7

Dieses Beispiel beschreibt die Extraktion von Tabakblättchen mit Wasser zur Entfernung von Nitrat und die Behandlung des Extrakts mit Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17 741), um daraus das Nitrat zu entfernen, wobei sodann der modifizierte Extrakt zurück in den ursprünglichen Tabak gegeben wird.

Ein Tabakextrakt wurde hergestellt, indem 100 g Burleyblättchen mit 1 l Wasser vermischt wurden und das Gemisch 2 h bei Raumbedingungen stehengelassen wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Extrakt gesammelt, indem die Flüssigkeit dekantiert wurde und der Tabak zur Entfernung zusätzlicher Flüssigkeit gepreßt wurde. Der Tabak wurde in Raumluft zum Trocknen ausgebreitet, während der Extrakt (∼700 ml) einer mikrobiellen Behandlung unterworfen wurde.

Eine reife Kultur von Micrococcus denitrificans wurde mit einem Extraktmedium von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln hergestellt gemäß Beispiel 1, gezüchtet und zu dem Tabakextrakt gegeben, der, wie vorstehend beschrieben, hergestellt worden war. Die Zugabe erfolgte in einer Menge von 10% (Vol/Vol). Vor der Zugabe der Kultur wurde der pH-Wert des Extrakts auf 7,0±0,1 erhöht. Die Kultur wurde in dem Extrakt in einem Erlenmeyerkolben auf einem Drehschüttler bei 30°C inkubiert. Die folgenden chemischen Veränderungen erfolgten während der 18 h Inkubationszeit:

Micrococcus denitrificans-Behandlung
des Burleyblättchen-ExtraktsNO₃ (µg) Burleyblättchen-Extrakt1872 reife Micrococcus denitrificans-Kultur 64 Extrakt nach der Behandlung (18 h) 66

Die Werte zeigen, daß das Nitrat durch die Behandlung fast vollständig abgebaut worden war (etwa 96%).

Nach der 18stündigen Inkubation wurde der behandelte Extrakt zurück in den ursprünglich extrahierten Tabak in drei Stufen wegen des großen Volumens des behandelten Extrakts gegeben. Dies erfolgte, indem ein Teil zugesetzt wurde, gründlich vermischt und an der Luft getrocknet wurde, bevor die nächste Zugabe erfolgte. Die folgenden chemischen Veränderungen resultierten von dieser Verfahrensweise:

TabakanalyseNO₃ (%) Burleyblättchen:
vor der Extraktion1,96 nach der Extraktion0,72 nach der Rückgabe des behandelten Extrakts0,44

Die Werte zeigen, daß 77% des Nitrats durch die Micrococcus denitrificans-Behandlung entfernt worden waren.

Die bei dieser Verfahrensweise erhaltenen Tabake waren für Herstellungsprozesse geeignet.

Bei bestimmten Herstellungsverfahren von rekonstituiertem Tabak ist die Stufe der Extraktion der löslichen Tabakstoffe ein integraler Teil des Gesamtprozesses. Wenn es bevorzugt wird, dann kann der resultierende Extrakttabak durch Papier herstellungstechnicken zu einer Grundplatte verarbeitet werden, zu dem dann der Extrakt, aus dem das Nitrat durch mikrobielle Behandlung entfernt worde ist, auf normale Weise zurückgegeben wird.

Beispiel 8

Dieses Beispiel zeigt einige Unterschiede des Endprodukts, die erhalten werden können, wenn man eine Ultrafiltrationseinrichtung in Verbindung mit der Tabakextraktion der Extraktbehandlung und der Zurückgabe des Extrakts gemäß Beispiel 7 anwendet. Der hierbei verwendete Tabak stammte vor der gleichen Quelle wie derjenige des Beispiels 7.

Ein Burleyblättchenextrakt wurde wie in Beispiel 7 hergestellt. Der Extrakt wurde sodann mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikron in einer Ultrafiltrationsvorrichtung filtriert, bevor der filtrierte Extrakt mit Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17 741) inokuliert und gemäß Beispiel 7 behandelt wurde. Nach der Behandlung wurde der Extrakt erneut filtriert (Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikron), bevor die Zurückführung begonnen wurde. Die auf dem Filter während der ersten Filtration zurückgehaltenen Materialien und das durchgegangene Produkt von der zweiten Filtration wurden zu dem extrahierten Tabak zurückgegeben.

Die durch den Filter während der zweiten Filtration zurückgehaltenen Materialien wurden nicht in den Tabak zurückgegeben. Die folgenden chemischen Veränderungen traten in dem Extrakt auf:

Chemische Veränderungen während der Ultrafiltration und
Behandlung mit Micrococcus denitrificans von BurleytabakNO₃ (µg/ml) Burleyblättchen-Extrakt1872 reife Micrococcus denitrificans-Kultur 64 Extrakt nach der Filtration2028 Extrakt nach der Micrococcus denitrificans-Behandlung 646

Die folgenden chemischen Veränderungen wurden in dem Tabak während der Extraktion und Behandlung gemessen:

TabakanalyseNO₃ (%) Burleyblättchen:
vor der Extraktion1,96 nach der Extraktion0,72 nach Zurückgabe des behandelten Extrakts0,85

Diese Ergebnisse zeigen, daß Nitrat aus dem Extrakt durch Micrococcus denitrificans entfernt wird, daß aber im Gegensatz zu Beispiel 7 keine weitere Entfernung von dem extrahierten Tabak während der Rückgabeverfahrensweisen stattfindet. In diesem Beispiel kontaktieren die Mikrobenzellen den Tabak nicht, während in Beispiel 7 die Zellen den Tabak während der Rückgabe kontaktieren und weitere chemische Veränderungen hervorrufen.

Die hierbei erhaltenen Tabake waren für Herstellungszwecke geeignet.

Andere Filter (mit anderen Porengrößen) können in der ersten Filtrationsstufe (in den Beispielen 7 und 8) verwendet werden, um zu verhindern, daß viele der größeren, extrahierten Moleküle der möglichen mikrobiellen Einwirkung ausgesetzt sind. Bei jeder Verwendung ist der resultierende Extrakt weniger modifiziert, und es wird ein weniger stark modifizierter Tabak erhalten.

Beispiel 9

Dieses Beispiel beschreibt die Fähigkeit von Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 19 367), Nitrate im Tabak abzubauen.

Micrococcus denitrificans (ATCC-Hinterlegungsnr. 19 367) wurde in einer Extraktbrühe von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln (+0,5% HE), hergestellt gemäß Beispiel 1, gezüchtet. Die Kontroll- und Versuchskulturbrühen wurden vor dem Gebrauch mit 2,4 ml 1N NaOH/Kolben auf einen pH-Wert von ungefähr 7,2 eingestellt. Alle Kolben wurden 24 h bei 30°C und 160 U/min inkubiert. Diejenigen Kolben, die für das Zellwachstum verwendet werden wurden, wurden mit Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 19 367) in einer Menge von 2% (Vol/Vol) inokuliert. Die nachfolgende Tabelle zeigt den Nitratabbau durch diese Kultur.

Satz 1

Micrococcus denitrificans wurde in der gleichen Weise, wie eben beschrieben, gezüchtet und chemische Analysen wurden in verschiedenen Zwischenzeitintervallen durchgeführt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Satz 2

Die Versuchskulturen der Sätze 1 und 2 wurden dazu verwendet, um Burleyblättchen 24 h bei 30°C in Kunststoffbeuteln wie folgt zu behandeln:

Es wird ersichtlich, daß Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 19 367) bis zu 63% des Nitrats in Burleyblättchen abbaute, während bei dem Kontrolltabak eine geringe Verminderung des Nitrats festzustellen war.

Beispiel 10

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit von Micrococcus denitrificans (ATCC Hinterlegungs-Nr. 17 741) zur Entfernung von Nitrat aus einem Extrakt eines rekonstituierten Tabakgemisches.

Ein wäßriger Extrakt wurde wie folgt hergestellt. 150 g rekonstituierter Tabak wurden in 1 l Wasser etwa 1 min in einem Waringmischer aufgeschlämmt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur gehalten, und sodann wurde die Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt und zu dem ursprünglichen Volumen zurückgebracht, um 15 min bei 121°C und 1,05 atü sterilisiert zu werden. Hefeextrakt (HE) wurde in einer Menge von 0,5% (Gew./Vol.) vor der Sterilisation zugesetzt. Ein Extrakt von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln (mit einem Zusatz von 0,5% Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1) wurde als Standardextrakt verwendet. Der pH-Wert der Brühe wurde eingestellt, bevor der Standard (Kontrolle)-Extrakt und der Versuchsextrakt mit Micrococcus denitrificans inokuliert wurde. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Diese Werte zeigen, daß die Kultur das Nitrat eines Extrakts von rekonstruierten Tabaken wirksam abbauen kann.

Beispiel 11

Dieses Beispiel zeigt die Effekte von aerobischen und anaerobischen Tabakbehandlungen.

Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17 741) wurde in einer Extraktbrühe von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln mit zugesetzten 0,5% Hefeextrakt lang in einem Versuchsfermentator unter folgenden Bedingungen gezüchtet:

Parameter

Rühren (U/min)300 Belüften (cm³/min)0 Medium:
im Rauchkanal geräucherter Burleystengel-Extrakt+0,5% HE Volumen des Mediums (1)8 Temperatur (°C)30 Ausgangs-pH-Wert (nichtkontrolliert)7,8 Inokulierungsrate (%)5 Inokulierungsalter (h)24 Antischaummittelp-1200

Die Kultur war am Beginn und nach 24 h durch folgende Werte charakterisiert:

Nach 24 h wurde die Kultur zur Behandlung von Burleytabak unter aerobischen und anaerobischen Bedingungen verwendet, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurde:

Alle Tabake hatten einen Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 75% und sie wurden 24 h bei 30°C Kunststoffbeuteln gelagert. Die anaerob erfolgenden Behandlungen wurden in Standzylindern für anaeroben Systeme "Gaspak" unter Verwendung von Katalysatoren zur Bindung von Luftsauerstoff durchgeführt.

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die Erfindung unter anaeroben Bedingungen und unter Bedingungen, wenn eine Verfügbarkeit von Sauerstoff nicht kontrolliert wird, durchgeführt werden kann.

Beispiel 12

Dieses Beispiel zeigt den Effekt der Behandlung von Tabak mit Zellen sowie der überstehenden Flüssigkeit vom Zellwachstum.

Micrococcus denitrificans (ATCC Nr. 17 741) wurde in Kolben mit Extraktbrühe von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln unter Zusatz von 0,5% (Gew./Vol.) Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1(c), gezüchtet, Die Inokulierung des Kolbens und die Inkubation erfolgten wie in Beispiel 1(d). Am Ende der Wachstumsperiode wurde die Kultur gemäß Fig. 1 behandelt.

Bei den in der Figur dargestellten Verfahrensweisen wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle I

Kulturherstellung

Im Rauchkanal geräucherte Burley-Extrakt-Brühe mit 0,5% HE

Die resuspendierten Zellen und das filtrierte überstehende Produkt wurden zur Inokulierung von gesonderten, frischen Kolben mit Extrabrühe von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln mit 10 ml/Kolben (250 ml Extrakt/500 ml Kolben) verwendet. Es wurde 24 h bei 30°C und 160 U/min inkubiert. Der Extrakt wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle II

Die resuspendierten Zellen, die ursprüngliche Kultur, das filtrierte überstehende Produkt und das nichtfiltrierte überstehende Produkt wurden alle gesondert zur Behandlung von 50 g-Proben von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln mit etwa 75% Feuchtigkeit über einen Zeitraum von 24 h bei 30°C in Kunststoffbeuteln verwendet. Bei einer Kontrollprobe wurde der pH-Wert eingestellt und es wurde ohne Inokulum mit Wasser behandelt.

Tabelle III

Zur Tabakbehandlung zugesetzte Materialien

Die folgenden Angaben Ergebnisse wurden bei diesen Tabakbehandlungen erhalten:

Tabelle IV

Tabakbehandlungen

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die überstehende Flüssigkeit, in der die Kultur gezüchtet wird, keine genügende Kultur zum Abbau von Nitraten in Tabak ergibt.

Claims

1. Verfahren zum Reduzieren des Nitratgehaltes von Tabak oder Tabakextrakt, wobei man entweder den Tabak in einem wäßrigen Medium oder Tabakextrakt 16 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 5 bis 37°C mit einem Micrococcus kontaktiert, der fähig ist, den Nitratgehalt des Tabaks zu reduzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man Micrococcus denitificans einsetzt, der in einem Nährmedium gezüchtet wurde, das Nitrat enthält.

2. Verfahren zum Reduzieren des Nitratgehalts von Tabak oder Tabakextrakt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Micrococcus denitrificans ATCC 17 741 oder ATCC 19 367 einsetzt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium eine Nitrat enthaltende Verbindung enthält, die aus der Gruppe Kaliumnitrat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat ausgewählt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Nitratverbindung im Bereich von etwa 0,1 bis 1,0 Gew.-% des wäßrigen Mediums liegt.

5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontaktierung bei einem pH-Wert von 7 bis 9,5 durchführt.

6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Tabak in das wäßrige Medium einmischt;
b) den Tabak aus dem wäßrigen Medium herausnimmt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;
c) den Micrococcus denitrificans zu der Brühe zusetzt;
d) den Micrococcus denitrificans inkubiert; und
e) die den inkubierten Micrococcus denitrificans enthaltende Brühe zu Tabak zusetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man Hefeextrakt zu der Brühe vor der Zugabe von Micrococcus denitrificans zusetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des Hefeextraktes etwa 0,1 bis 2,0 Gew.-% der Brühe beträgt.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Tabak in ein wäßriges Medium einmischt;
b) den Tabak aus dem wäßrigen Medium entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;
c) die Tabakextraktbrühe durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein erstes Retentionsprodukt zurückgehalten wird und der Durchtritt von vorgewählten Extraktkomponenten gestattet wird, wodurch ein erstes durchgegangenes Produkt erhalten wird, und daß man
d) das erste durchgegangene Produkt, das die vorgewählten Extraktkomponenten enthält, mit Micrococcus denitrificans zur Entfernung von Nitrat behandelt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man

e) das erste, behandelte, durchgegangene Produkt durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein zweites Retentionsprodukt zurückgehalten wird, das den Micrococcus denitrificans enthält, und daß der Durchtritt des behandelten Extrakts gestattet wird, wobei der behandelte Extrakt ein zweites durchgegangenes Produkt darstellt;
f) das zweite, durchgegangene Produkt mit dem ersten Retentionsprodukt vermischt; und daß man
g) das Gemisch aus dem ersten und zweiten durchgegangenen Produkt zu dem herausgenommenen Tabak zusetzt.