DE2922283C2

DE2922283C2 -

Info

Publication number: DE2922283C2
Application number: DE2922283A
Authority: DE
Inventors: Lawrence Edmond Louisville Ky. Us Gravely; Vernon Louis Georgtown Ky. Us Geiss; Charles Fred Middletown Ky. Us Gregory
Original assignee: Brown and Williamson Tobacco Corp
Current assignee: Brown and Williamson Holdings Inc
Priority date: 1978-06-15
Filing date: 1979-05-31
Publication date: 1989-12-07
Also published as: GB2023995B; CA1134297A; FR2437794A1; GB2023995A; US4557280A; DE2922283A1; FR2437794B1; BE876993A; CH655230A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Tabak unter Verwendung des Mikroorganismus Cellulo monas sp. NRRL B-8063.

Aus verschiedenen Gründen ist es oftmals erwünscht, den Nitrat- und Nicotingehalt von Tabak zu vermindern. So haben z. B. in den letzten Jahren Zigaretten mit niedrigem Nicotin gehalt eine erhebliche Aufmerksamkeit beim Verbraucher ge funden. Weiterhin ist ein Bedarf nach Zigaretten mit niedri ger Abgabe entstanden, und zahlreiche Techniken sind ver fügbar geworden, um den Nitrat- oder Nicotingehalt des Ta baks zu vermindern.

Bei der Entfernung oder Verminderung des Nitratgehalts wird nach der üblichsten Methode die Verwendung von Chemikalien zur selektiven Nitratentfernung aus Tabakextrakten durch Ionenverzögerungstechniken in Betracht gezogen. Die Verminde rung des Nicotingehalts von Tabak ist sowohl durch chemische Maßnahmen als auch durch eine mikrobielle Behandlung bewirkt worden. In den US-PSen 40 11 141, 40 37 609 und 40 38 993 werden mikrobielle Behandlungen zur Verminderung des Nicotin gehalts von Tabak beschrieben.

Weiterhin ist in der DE-OS 26 34 186 bereits die Ver wendung des Mikroorganismus Cellulomonas sp. beschrie ben. Dieser Mikroorganismus wird in dem in der genann ten Veröffentlichung beschriebenen Verfahren ausschließ lich zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak ein gesetzt, wobei der Mikroorganismus dem Tabakmaterial direkt zum Abbau des Nikotins zugesetzt wird. Damit der Nikotinabbau durch die Einwirkung des Mikroorganismus Cellulomonas sp. aufgrund der biochemischen Mechanismen ausreichend wirksam werden kann, muß der Feuchtigkeitsge gehalt des Tabaks in diesem Verfahren des Standes der Tech nik mindestens 50 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht von Tabak und Wasser, betragen.

In keiner der genannten Veröffentlichungen wird die selek tive, gleichzeitige Verminderung sowohl des Nitrat - als auch des Nikotingehalts von Tabak in ein und demselben Behandlungsverfahren beschrieben, wobei der Gehalt aller übrigen Aromakomponenten nicht vermindert werden soll.

Es war daher Aufgabe der Erfindung, ein wirksames Ver fahren zur Verminderung sowohl des Nitrat- als auch des Nikotingehalts von Tabak in ein und denselben Verfahrens gang zur Verfügung zu stellen.

Durch die Erfindung wird somit ein Verfahren zur Verminde rung des Nitrat- und Nikotingehalts von Tabak durch mikro bielle Behandlung zur Verfügung gestellt, bei dem Tabak materialien unter kontrollierten Bedingungen der Einwir kung des Mikroorganismus Cellulomonas sp. unterworfen werden, der dazu imstande ist, durch eine biochemische Reaktion Nitrate und Alkaloide (Nikotin) abzubauen. Cellu lomonas sp. wird in Gegenwart einer Nitrat enthaltenden Verbindung in relativ kleinen Mengen gezüchtet. Der er findungsgemäß hergestellte Tabak hat einen verminderten Nitrat- und Nikotingehalt. Bei der Einarbeitung in ein Tabakrauchprodukt wird ein milder Rauch mit einem vermin derten Gehalt an Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nikotin erhalten. Jedoch erfolgen keine Verluste an erwünschten Aroma-, Geschmacks- und Raucheigenschaften.

Der Erfindung liegt die Tatsache zugrunde, daß bestimmte Mikroorganismen in wäßriger Lösung, wenn sie mit Tabak in Kontakt kommen, den Nitrat- und Nikotingehalt des Ta baks vermindern bzw. abbauen. Es wurde festgestellt, daß bei einem Tabakmaterial, das mit einer reinen Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 behandelt wird, die in einem Nitrat enthaltenden Medium gezüchtet worden ist, sowohl das Nitrat als auch die Alkaloide (Nikotin) in Tabakmate rialien gleichzeitig abgebaut werden. Hierbei wird ein Tabakmaterial erhalten, das beim Einbringen in eine Mischzigarette zu verminderten Abgaben von Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nikotin beiträgt. Die verwendete Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 ist in der US-PS 40 38 993 beschrieben. Auf diese Druckschrift wird ausdrücklich Bezug genommen.

Weiterhin wird vorzugsweise eine Nitrat enthaltende Verbindung zu dem Wachstumsmedium, z. B. Kaliumnitrat gegeben. Jedoch können auch andere Nitrat enthaltende Verbindungen, z. B. Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und dergleichen, verwendet werden.

Bei der erfindungsgemäßen Anwendung der Kultur ist es zweck mäßig, Tabakblättchen oder -stengel zu behandeln und das Nitrat und das Nicotin gleichzeitig zu entfernen oder einen wäßrigen Extrakt von jedem Material herzustellen, das Nitrat und das Nicotin zu entfernen und hierauf den behandelten Ex trakt zu dem ursprünglichen Tabakmaterial oder einem rekon stituierten Tabak zurückzugeben. Die Möglichkeit, den Extrakt zu behandeln und sodann zu dem ursprünglichen Tabak zurückzu geben, vermeidet Verluste an löslichen Stoffe, die auftreten, wenn mit Wasser extrahiert wird und dieses als Träger zur Entfernung von Nitrat und Nicotin verworfen wird. Hierdurch werden auch Verluste von anderen, gewünschten Tabakkomponenten vermieden, die bei der Extraktion mit Wasser und Verwer fung auftreten. Das erfindungsgemäße Verfahren gibt auch die Möglichkeit, sowohl Nitrat als auch Nicotin in rekonstitu ierten Tabakproduktionssystemen zu entfernen, wobei der Ta bak extrahiert wird und der Tabak in nachfolgenden Prozeß stufen zurückgegeben wird, da dieses mikrobielle Enzym-System wirksam in einem flüssigen System arbeitet. Bei dem Ver fahren wird das Nitrat aufgebrochen und in gasförmigen Stick stoff umgewandelt, der an die Atmosphäre abgegeben wird. Es wurde festgestellt, daß der pH-Wert des wäßrigen Mediums, das den Mikroorganismus enthält, vor der Zugabe der Tabakma terialien in einem Bereich von mindestens mehr als 5,6 gehal ten werden muß, um einen Mikroorganismus zu ergeben, der mit Erfolg gleichzeitig Nitrate und Nicotin abbaut. Der bevor zugte Anfangs-pH-Wert des wäßrigen Mediums ist etwa 7 bis 9,5. Es wurde auch gefunden, daß der Anteil der Nitrat enthal tenden Verbindung in dem wäßrigen Medium mindestens etwa 0,1 Gew.% und vorzugsweise etwa 1 Gew.% in dem Medium betragen muß. Obgleich höhere Mengen der Nitrat enthaltenden Materiali en verwendet werden können, trägt jedoch eine Erhöhung der Menge an Nitratverbindung über 1 Gew.% hinaus nicht nennens wert zu den Abbaueigenschaften der Mikroorganismen bei, ob gleich auch höhere Konzentrationen anwendbar sind und der Mikroorganismus die Nitratverbindungen auch bei höheren Kon zentrationen abbaut.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zur gleichzeitigen Verminderung des Nitrat- und Nicotinge halts von Tabak ein wäßriges Medium hergestellt, das den Cellulomonas sp. NRRL B-8063 enthält.

Bei der Herstellung eines wäßrigen Mediums wird Nähragar lösung (erste Lösung) hergestellt, indem ein handelsübliches Nähragar zu destilliertem Wasser gegeben wird, wobei die Agarmenge im allgemeinen mindestens 5 g/l beträgt. Hierzu wird eine Nitrat enthaltende Verbindung, vorzugsweise Kalium nitrat, in einer Menge von mindestens 0,1 Gew.% Nitrat/Volu meneinheit Wasser und im allgemeinen von etwa 1 Gew.% Nitrat/ Volumeneinheit Wasser zugesetzt. Diese Lösung wird sodann in Form von Schrägkulturen in Röhrchen sterilisiert; d. h. Röhr chen, die das Nähragar enthalten, werden in einem Autoklaven mindestens 15 Minuten bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und mindestens 121°C schräggelegt, um eine Schrägoberfläche zu ergeben. Das sterilisierte Medium wird sodann in einen Kühl schrank für den späteren Gebrauch gegeben.

Sodann wird eine zweite Lösung hergestellt, die Nicotin und eine Nitrat enthaltende Substanz enthält, welche durch die Kultur behandelt werden soll, die in dem sterilisierten Me dium gezüchtet worden ist. Eine solche zweite Lösung kann eine Nährbrühe sein, die nur Nitrate enthält und die dadurch hergestellt worden ist, daß man eine handelsübliche Nährbrühe in destilliertem Wasser auflöst, wobei die Menge der Nähr brühe etwa 5 bis 10 g/l beträgt. Für den Fachmann wird er sichtlich, daß die Konzentration der Nährbrühe und der Erhalt einer verwendbaren Kultur variiert werden kann. Diese Lösung wird sodann mindestens 15 min bei mindestens 1,05 atü und 121°C oder mehr in einem Autoklaven sterilisiert. Kalium nitrat oder andere Nitrat enthaltende Verbindungen können zu dieser Lösung vor der Sterilisation zugesetzt werden.

Ein weiteres Beispiel für eine zweite Lösung kann eine Tabak extraktbrühe sein, die sowohl Nitrate als auch Nicotin ent hält. Die Tabakextraktbrühe wird in der Weise hergestellt, daß man gewöhnlich etwa 100 g Tabakmaterial, z. B. ein im Rauch kanal geräuchertes Burleystengelgemisch, nimmt und dieses mit etwa 1000 ml Wasser vermischt, worauf das Gemisch in einem Autoklaven mindestens 30 bis 60 Minuten bei mindestens 1,05 atü und 121°C oder mehr gekocht wird. Der resultierende, flüssige Extrakt wird sodann entfernt und das Flüssigkeits volumen wird durch Zugabe von destilliertem Wasser auf die ursprüngliche Menge des Extrakts eingestellt. Der Extrakt wird sodann mit Hefeextrakt vermischt, wobei der Anteil des Hefeextrakts im allgemeinen mindestens 0,3 Gew.% des Volumens der Flüssigkeit beträgt. Gewünschtenfalls können jedoch auch größere Mengen von Hefeextrakt verwendet werden. Das Gemisch wird in Kolben, die mit Baumwolle zugestöpselt sind, abgege ben und mindestens 15 Minuten bei 1,05 atü oder mehr und 121°C oder mehr für die nachfolgende Fortpflanzung der Kultur steri lisiert. Vor der Verwendung zum Wachstum der Kultur wird der pH-Wert mit einer geeigneten Säure oder Base auf etwa 7,2 eingestellt.

Der Mikroorganismus Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wird auf Nähragar-Schrägkulturen, die die Nitrat enthaltende Verbin dung enthalten, 3 bis 5 Tage bei 20 bis 40°C inkubiert. Das resultierende Wachstumsprodukt wird sodann dazu verwendet, um die Tabakextraktbrühe zu inokulieren, wobei das Inokulum von den Schrägkulturen entfernt wird, indem die Schrägober fläche mit einer vorgewählten Menge von sterilem, destillier tem Wasser gewaschen wird. Die Tabakextraktbrühe wird so dann im allgemeinen etwa 24 Stunden bei etwa 20 bis 40°C ge rührt, um das Wachstum der zugesetzten Mikroorganismen zu fördern. Kleinere oder größere Wachstumsperioden, z. B. bis zu etwa 48 Stunden, sind annehmbar.

Das resultierende Inokulum bzw. der resultierende Impfstoff ist sodann zur Verwendung zur Behandlung von weiteren Tabak materialien bereit, um deren Nitrat- und Nicotingehalt zu vermindern.

Die Erfindung wird in den Versuchen und Beispielen erläutert.

Versuch 1

Dieser Versuch beschreibt die Verfahrensweise zur Herstel lung des Inokulums bzw. des Impfstoffs.

(a) Nähragar + 1,0% Kaliumnitrat

Handelsüblicher Nähragar (entwässerte Form) wurde zu destilliertem Wasser im Verhältnis von 23 g/l gegeben. Die 23 g Nähragar enthielten 3 g Rindfleisch extrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar. Zu dieser Lösung wurde 1 Gew.% Kaliumnitrat/Volumeneinheit Wasser gegeben. Die re sultierende Lösung hatte einen End-pH-Wert von 6,8.

Dieses Medium wurde sodann als Schrägkultur in Röhrchen in einem Autoklaven 15 min bei 1,05 atü und 121°C sterilisiert, abgekühlt und für die spätere Verwendung zum Wachstum von Kulturen gekühlt.

(b) Nährbrühe

Eine Lösung von Nährbrühemedien wurde hergestellt, indem ent wässerte Nährbrühe in einer Menge von 8 g/l zu destilliertem Wasser gegeben wurde. Die Nährbrühe enthielt 5 g Pepton und 3 g Rindfleichextrakt. Das resultierende, wäßrige Medium wurde sodann 15 min bei 1,05 atü und 121°C zum späteren Gebrauch beim Wachstum der Kultur sterili siert.

(c) Im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe

Eine im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extrakt brühe wurde hergestellt, indem 100 g im Rauchkanal geräucher te/Burleystengel zu 1000 ml Wasser gegeben wurden und indem das Gemisch 40 min bei 1,05 atü und 121°C im Autoklaven gekocht wurde. Der resultierende Flüssigkeitsextrakt wurde entfernt, und das Flüssigkeitsvolumen wurde auf seine ursprüngliche Menge mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Flüssigkeit wurde sodann mit Hefeextrakt (HE) in einer Menge von 0,5 Gew.% Hefeextrakt/Volumeneinheit Flüssigkeit vermischt, und das Ge misch wurde in Kolben eingefüllt, die mit Baumwolle zuge stöpselt und 15 min bei 1,05 atü und 121°C zur nachfolgenden Kulturfortpflanzung sterilisiert wurden.

(d) Inokulierung der Brühe

Der Mikroorganismus, Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wird auf den Nähragar- Schrägkulturen 3 bis 5 Tage lang bei 30°C inkubiert. Flüssige Medien, wie z. B. Nährbrühe oder eine im Rauchkanal geräucher te/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe, werden mit einem steri len Waschwasser von Schrägkulturen in einer Rate von 2% (Vol/Vol) inokuliert. Der pH-Wert der Brühe vor der Inokulierung wird mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf 7,2 bis 7,5 ein gestellt. Die Kolben werden sodann etwa 24 h bei 30°C mit 220 U/min gerührt.

Versuch 2

Dieser Versuch beschreibt den Nitrat- und Nicotinabbau, der in Burleystengel-Extrakt bei verschiedenen pH-Werten statt findet.

Ein wäßriger Extrat von Burleystengeln wurde gemäß Versuch 1(c) hergestellt und in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 250 ml/Kolben eingegeben. Diese Medien wurden zur Bestimmung der Nitrat- und Nicotinabbaukapazität von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 ver wendet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. NRRL B-8063 bei einem pH-Wert von 7,2 den größten Teil des in dem Extrakt verfügbaren Nitrats und Nicotins abbaute, während bei einem niedrigeren pH-Wert (5,6 und 4,8), wenn überhaupt, nur ein sehr geringer Abbau stattfand.

Versuch 3

Dieser Versuch zeigt den Nitratabbau in anderen Materialien als Tabak.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde bei den unten beschriebenen Bedingungen in einem Medium aus Nährbrühe + 0,1% KNO₃ gezüchtet, wo bei ein Versuchsfermentator von New Brunswick (MF 214) verwen det wurde. Die Inokulierungskultur wurde wie in Versuch 1 hergestellt, wobei das Nähragar von Versuch 1(a) und die nicotinfreie Nährbrühe von Versuch 1(b) verwendet wurden. Die Züchtungsbedingungen waren wie folgt:

Rühren (U/min)\|300
Belüften (cm³/min)	4000
Medium	Nährbrühe + 0,1% KNO₃ (Gew./Vol.)
Volumen des Mediums (1)	8
Temperatur (°C)	30
pH	7,0
Inokulierungsrate (Vol/Vol)	5%
Inokulierungsalter (h)	20
Inokulierungsmedium	Nährbrühe + 0,1% KNO₃
Antischaummittel	p-1200
pH-Kontrolle	2N HCl
	2N NaOH

Die folgenden Veränderungen des Nitratgehalts traten auf:

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß das Nitrat durch die Cellulomonas sp. NRRL B-8063 Kultur vor 29 h bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,2 entfernt wurde.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt den Nitrat- und Nicotinabbau, der in einer Burley-Extraktbrühe mit einer relativ hohen Nitrat konzentration auftritt.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem Fermentator in Burley-Extraktbrühe, hergestellt gemäß Versuch 1(c) gezüchtet. Die Wachstumsbedingungen waren die gleichen wie in Versuch 3, mit der Ausnahme, daß das Wachstumsmedium Burley-Extraktbrühe war. Die folgenden Veränderungen in den Nitrat- und Alkaloidgehalten traten auf:

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. NRRL B-8063 den größten Teil des in dem Extrakt verfügbaren Nitrats und Nicotins abbaute.

Versuch 4

Dieser Versuch zeigt verschiedene Gehalte einer Nitrat ent haltenden Verbindung, die beim Züchten eines Mikroorganismus zum Abbau von Nitraten verwendet werden kann.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einer nicotinfreien Nährbrühe (NB) + 0,1% KNO₃, hergestellt gemäß Versuch 1(b), gezüchtet. Die Kultur wurde dazu verwendet, um Nährbrühe mit variierenden Mengen von KNO₃, zugesetzt auf Gew./Vol.-Basis, zu inokulieren. Die folgenden Veränderungen traten beim Rühren dieser Kultur und bei 30°C und 160 U/min auf:

Es wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. NRRL B-8063 einen Teil des Nitrats bei allen anfänglichen Nitratkonzentrationen von 335 bis 3000 µg/ml Nitrat in der Nährbrühe abbaute und eine kleine Menge des Nitrats oberhalb 4980 µg/ml abbaute. Die geringfügige Veränderung der Kontroll-Nitratkonzentration liegt nahe am Analysenfehler. Sie war nicht auf eine mikro bielle Einwirkung zurückzuführen, da zu den Kontrollmedien keine Kultur gegeben worden war.

Versuch 5

Dieser Versuch zeigt den Effekt der Belüftung auf die im Tabakextrakt gezüchteten Kulturen.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem wäßrigen Extrakt von im Rauch kanal geräucherten/Burleystengeln, hergestellt gemäß Versuch 1(c), bei den folgenden kontrollierten Bedingungen in einem Versuchsfermentator von New Brunswick (MF 214) gezüchtet:

Rühren (U/min)\|600
Belüften (cm³/min)	8000
pH	7,3
Temperatur (°C)	30
Zeit (h)	22
Antischaummittel	p-1200
Inokulierungsrate (Vol/Vol)	5%
Volumen des Mediums (1)	8
Art des Mediums	wäßriger Extrakt von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln. Der pH-Wert wurde mit 2N HCl und 2N NaOH kontrolliert

Die Zunahme der Zellmasse und die chemischen Veränderungen während des Züchtens bzw. Wachsens waren wie folgt:

Die obigen Werte zeigen, daß bei den angewendeten Bedingun gen, insbesondere einer hohen Belüftungsrate (8000 cm³/min), das Nitrat nicht abgebaut wird, daß jedoch die Alkaloide abgebaut wurden.

Die auf diese Weise gezüchtete Kultur zur Behandlung von Burleyblättchen wie folgt verwendet:

Die Behandlung wurde in einem Kunststoffbeutel (nichtbelüftete Umgebung) 24 h bei 30°C durchgeführt, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden:

Es wird ersichtlich, daß in einer nichtbelüfteten Umgebung Cellulomonas sp. NRRL B-8063 sowohl Nitrat als auch Nicotin abbaute. Der Burleytabak mit vermindertem Nitrat- und Nicotingehalt wurde mit anderen Tabakmaterialien vermischt und mit einer Kontroll mischung verglichen, die unbehandelten Burleytabak enthielt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Chemische Eigenschaften der Mischung

Diese Mischungen wurden zu Zigaretten verarbeitet und in der Maschine geraucht, wobei die folgenden Abgaben von Stickoxi den, Cyanwasserstoff und Nicotin festgestellt wurden.

Die Werte zeigen eine 38,8%ige Verminderung der Stickoxide (NOx), eine 19,7%ige Verminderung des Cyanwasserstoffs und eine 15,3%ige Verminderung des Nicotins.

Versuch 6

Dieser Versuch zeigt den Effekt der Belüftung beim Wachstum der Kultur, wobei die verminderte Belüftung die Umgebung für den Nitratabbau in flüssigen Systemen liefert.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem wäßrigen Extrakt von im Rauch kanal geräucherten/Burleystengeln, hergestellt gemäß Versuch 1(c), bei folgenden Bedingungen in einem Versuchsfermentator gezüchtet:

Rühren (U/min)
600 (1. 4 h) 300 (letztes 20 h)
Belüften (cm³/min)	8000 (1. nur 4 h)
	keines (letztes 20 h)
pH	7,0
Temperatur (°C)	30
Zeit (h)	24
Antischaummittel	p-1200
Inokulierungsrate (Vol/Vol)	5%
Medium (Vol.)	8 l
Typ des Mediums	wäßriger Extrakt von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln

der pH-Wert wurde mit 2N HCl und 2N NaOH kontrolliert.

Die Zunahme der Zellmasse und die chemischen Veränderungen während des Wachstums waren wie folgt:

Die obigen Werte zeigen, daß bei den angewendeten Bedingun gen, insbesondere einer hohen anfänglichen Belüftungsrate (4 h) und anschließend keiner nennenswerten Belüftung (20 h), sowohl Nitrat als auch Alkaloide abgebaut wurden. Insbeson dere wird ersichtlich, daß der Nitratabbau sehr bald nach Un terbrechung der Belüftung begann.

Die, wie hierin beschrieben, gezüchtete Kultur wurde zur Be handlung eines im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Ge miches über einen Zeitraum von 27 h verwendet, wobei das In okulum mit einer Rate von 2,4 ml/g Tabakgewicht angewendet und der Tabak bei 30°C inkubiert wurde. Es traten die folgen den chemischen Veränderungen auf:

Die behandelten Tabake wurden mit anderen Tabakmaterialien vermischt und mit einer Kontrollmischung verglichen, die un behandelte Stengel enthielt. Nachstehend sind die erhaltenen Werte bei zwei verschiedenen Gehalten von behandelten Mate rialien zusammengestellt:

Chemische Eigenschaften der Mischung

Diese Mischungen wurden zu Zigaretten verarbeitet und in der Maschine geraucht, wobei die folgenden Unterschiede zwischen den Kontroll- und Versuchsprodukten festgestellt wurden:

Die Werte der Rauchabgabe zeigen eine 27%ige und 60%ige Ver minderung der Stickoxide und eine 21,7%ige und 60,4%ige Ver minderung des Cyanwasserstoffs für normale und 2,5× normale Zusatzmengen von behandeltem Stengelmaterial. Die Werte zei gen auch eine signifikante Erhöhung der Anzahl der Züge, wenn behandelte Materialien in die Mischung mit 2,5× normaler Rate eingearbeitet wurden.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Verfahrensweise, die zum Ex trakt von Tabakblättchen mit Wasser zur Entfernung von Nitrat und Nicotin angewendet wurde. Der Extrakt wurde mit Cellulo monas sp. NRRL B-8063 zur Entfernung von Nitrat und Nicotin behandelt und danach wurde der modifizierte Extrakt in den ursprüng lichen Tabak zurückgegeben.

Ein Tabakextrakt wurde hergestellt, indem 100 g Burleyblätt chen mit 1 l Wasser vermischt wurden, und die Mischung wurde 2 h bei Raumbedingungen stehengelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Extrakt gesammelt, indem die Flüssigkeit dekantiert wurde und der Tabak zur Entfernung von zusätzlicher Flüssig keit gepreßt wurde. Der Tabak wurde in Raumluft zum Trocknen ausgebreitet, während der Extrakt (700 ml) der nachstehend beschriebenen, mikrobiellen Behandlung unterworfen wurde.

Eine reife Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem geson derten Tabakextraktmedium, hergestellt gemäß Versuch 1(c), gezüchtet und zu dem oben beschriebenen Tabakextrakt mit einer Rate von 10% (Vol/Vol) gegeben. Vor der Zugabe der Kultur wurde der pH-Wert des Extrakts auf 7,0±0,1 erhöht. Die Kultur wurde in dem Extrakt in einem Erlenmeyerkolben auf einem Drehschüttler mit 30°C inokuliert. Die folgenden chemi schen Veränderungen traten während der 18stündigen Inkuba tionszeit auf:

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 - Behandlung von Burleyblättchenextrakt

Es wird ersichtlich, daß das Nitrat und das Nicotin wegen der Behandlung fast vollständig abgebaut wurden (96,5% bzw. 93,9%).

Nach 18 h wurde der behandelte Extrakt zu dem ursprünglich extrahiertem Tabak in drei Stufen wegen der großen Menge des betreffenden Extrakts zurückgegeben. Dies erfolgte in der Weise, daß eine Portion zugegeben wurde, gründlich gemischt wurde und vor der nächsten Zugabe an der Luft getrocknet wurde. Während dieser Verfahrensweise traten die folgenden chemischen Veränderungen auf:

Tabakanalyse

Es wird ersichtlich, daß die Nitrate und Alkaloide (Nicotin) aus dem Extrakt entfernt worden waren und daß ihr Anteil da her in dem Tabak, in den der behandelte Extrakt zurückgege ben wurde, signifikat vermindert wurde. 80% des Nitrats und 100% der Alkaloide wurden durch diese Methode entfernt. Ein Teil des Nitrats und der Alkaloide wurden aus dem Tabak durch die Kultur während des Trocknens nach der Rückgabe entfernt.

Die hierbei erhaltenen Tabake wurden für Herstellungsverfah ren verwendet.

Versuch 7

Dieser Versuch beschreibt einige Unterschiede im Endprodukt, die erhalten werden können, wenn man eine Ultrafiltrations einrichtung im Zusammenhang mit der Tabakextraktion, Extrakt behandlung und Extraktrückgabe gemäß Beispiel 2 anwendet. In diesem Beispiel wurde der gleiche Tabak wie in Beispiel 2 verwendet.

Ein Burleyblättchenextrakt wurde wie in Beispiel 2 herge stellt. Der Extrakt wurde sodann mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,2 Mikron in einer Ultrafiltrations vorrichtung filtriert, bevor der filtrierte Extrakt mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063 inokuliert und gemäß Beispiel 2 behandelt wurde. Nach der Behandlung wurde der Extrakt er neut filtriert, bevor die Rückgabe begonnen wurde. Die auf dem Filter während der ersten Filtration zurückgehaltenen Materialien wurden gleichfalls in den extrahierten Tabak zurückgegeben.

Die auf dem Filter während der zweiten Filtration zurückge haltende Materialien wurden nicht in den Tabak zurückgegeben. In dem Extrakt traten die folgenden chemischen Veränderungen auf:

Chemische Veränderungen während der Ultrafiltration und Behandlung des Burleyextrakts mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063

Die folgenden chemischen Veränderungen wurden in dem extra hierten Tabak während der Extraktion und Behandlung gemessen:

Tabakanalyse

Es wird ersichtlich, daß die Nitrate und Alkaloide (Nicotin) aus dem Extrakt durch Cellulomonas sp. NRRL B-8063 entfernt wurden. Je doch erfolgte im Gegensatz zu Beispiel 2 keine weitere Ent fernung aus dem extrahierten Tabak während der Zurückgabe. In diesem Beispiel kommt die mikrobielle Kultur niemals in Kontakt mit dem Tabak, während in Beispiel 2 die Kultur den Tabak während der Rückgabe kontaktiert.

Die hierbei erhaltenen Tabake wurden für Herstellungsvorgänge verwendet.

Versuch 8

Dieser Versuch zeigt die Wirksamkeit von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 zur Entfernung von Nitrat und Nicotin aus der Extraktbrühe von rekonstituierten Tabakmaterialien.

Eine wäßrige Extraktbrühe wurde wie folgt hergestellt. 150 g rekonstituierter Tabak wurden in 1 l Wasser 1 min in einem Waringmischer aufgeschlämmt. Nach der Aufschlämmung wurde das Gemisch 10 min bei Raumtemperatur gehalten und danach durch Zentrifugieren abgetrennt und mit destilliertem Wasser zur Sterilisierun bei 121°C und 1,05 atü während 15 min auf das ursprüngliche Volumen gebracht. Es wurden verschie dene Zubereitungen hergestellt, zu denen Hefeextrakt (HE) mit 0,5% (Gew./Vol.) vor der Sterilisation zugesetzt wurde. Im Rauchkanal geräucherter/Burleystengel-Extrakt (mit 0,5% Hefeextrakt) wurde gemäß Versuch 1(c) hergestellt und als Kontrollextrakt verwendet. Die pH-Werte der Brühen wurden vor der Inokulierung mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063 auf 7,2 eingestellt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Kontrolle

Versuch

Es wird ersichtlich, daß die Kultur das Nitrat und die Alkaloide (Nicotin) der rekonstituierten Tabakmaterialien mit oder ohne Zugabe von Hefeextrakt wirksam abbauen kann.

Versuch 9

Dieser Versuch zeigt die Effekte von aeroben und anaeroben Tabakbehandlungen.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einer im Rauchkanal geräucherten/ Burleyextraktbrühe, hergestellt gemäß Versuch 1(c), jedoch ohne Zugabe von Hefeextrakt, 25,5 h in einem Versuchsfermen tator unter folgenden Bedingungen gezüchtet:

Nach 25,5 h wurde die Kultur zur Behandlung von im Rauch kanal geräucherten/Burleystengeln unter aeroben und an aeroben Bedingungen verwendet, wobei die folgenden Ergeb nisse erhalten wurden:

Alle Behandlungen erfolgten bei einem Feuchtigkeitsgehalt von 75% und sie wurden 24 h bei 30°C in Kunststoffbeuteln durchge führt. Weiterhin wurden anaerobe Behandlungen mit anaeroben Systemzylindern "GASPAK" durchgeführt, wobei ein Katalysator zum Binden von atmosphärischem Sauerstoff verwendet wurde. Aus den obi gen Werten wird ersichtlich, daß die Erfindung unter anaeroben Bedingungen und unter Bedingungen, bei den eine Verfüg barkeit von Sauerstoff nicht kontrolliert wird, durchgeführt werden kann.

Versuch 10

Dieser Versuch beschreibt die Effekte der Behandlung von Ta bak mit Zellen sowie überstehender Flüssigkeit vom Zellwachs tum.

Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in Kolben mit im Rauchkanal geräucher ter/Burleystengel-Extraktbrühe mit 0,5% (Gew./Vol) zugesetztem Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1(c), gezüchtet.

Die Inokulierung des Kolbens und die Inkubation erfolgten wie in Beispiel 1(d). Am Ende der Wachstumsperiode wurde die Kul tur gemäß Fig. 1 behandelt.

Bei dem in der Figur dargestellten Verfahren wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle I

Herstellung der Kultur

Die resuspendierten Zellen und gefiltertes, überstehendes Produkt wurden zur Inokulierung von gesonderten, frischen Kolben von im Rauchkanal geräucherter/Burley-Extraktbrühe mit 10 ml/Kolben (250 ml Extrakt/500 ml Kolben) verwendet. Es wurde 24 h bei 30°C mit 220 U/min inkubiert. Der Extrakt wurde, wie in Beispiel 1(c), hergestellt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle II

Die resuspendierten Zellen, die ursprüngliche Kultur, fil triertes überstehendes Produkt und nichtfiltriertes über stehendes Produkt wurden alle gesondert zur Behandlung von 50 g-Proben von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln mit etwa 75% Feuchtigkeit über einen Zeitraum von 24 h bei 30°C in Kunststoffbeuteln verwendet. Bei einer Kontrollprobe wurde der pH-Wert eingestellt und es wurde mit Wasser ohne Inokulum behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Tabelle III

Tabakbehandlungen

Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die überstehende Flüssigkeit, wenn sie von der Kultur abgetrennt wird, nicht die Fähigkeit hat, Nitrate und Nicotin in Tabak abzubauen.

Claims

1. Verfahren zum gleichzeitigen Abbauen von Nikotin und Nitrat im Tabak unter Verwendung des Mikroorganismus Cellulomonas sp., dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 einsetzt, die in einem Medium gezüchtet worden ist, das mindestens 0,1 Gew.%, vorzugs weise etwa 1 Gew.% einer Nitratverbindung enthält, wobei der pH-Wert dieses Mediums in einem Bereich von mindestens mehr als 5,6, vorzugsweise zwischen 7,0 und 9,5 gehalten werden muß, und entweder Tabak in wäßrigem Medium oder Tabakextrakt mit dieser Kultur bei pH-Werten von 7,0 bis 9,5 während einer Zeitdauer von etwa 18 h bei Temperaturen von 20 bis 40°C behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;
b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;
c) Cellulomonas sp. NRRL B-8063 zu der Brühe zusetzt
d) Cellulomonas sp. NRRL B-8063 inkubiert; und
e) die Cellulomonas sp. NRRL B-8063 enthaltende Tabakextraktbrühe zu dem Tabak aus Stufe b) zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Zugabe von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 der Tabakextrakt brühe Hefeextrakt zusetzt, wobei der Anteil des Hefe extraktes vorzugsweise 0,1-2,0 Gew.% der Brühe beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;
b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;
c) die Tabakextraktbrühe durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein erstes Retentions produkt zurückgehalten wird und der Durchtritt von vorgewählten Extraktkomponenten gestattet wird, wodurch ein erstes durchgegangenes Produkt behalten wird, und daß man
d) das erste durchgegangene Produkt, das die vorgewählten Extraktionskomponenten enthält, mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063 zur Entfernung von Nitrat und Nikotin behandelt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man

e) das erste behandelte durchgegangene Produkt durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein zweites Retentionsprodukt zurückgehalten wird, das Cellulomonas sp. NRRL B-8063 enthält, und daß der Durch tritt des behandelten Extraktes gestattet wird, wobei der behandelte Extrakt ein zweites durch gegangenes Produkt darstellt;
f) das zweite durchgegangene Produkt mit dem ersten Retentionsprodukt vermischt; und daß man
g) das Gemisch aus dem zweiten durchgegangenen Produkt und dem ersten Retentionsprodukt zu dem in der Stufe b) herausgenommenen Tabak zusetzt.