DE2922283C2 - - Google Patents
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- DE2922283C2 DE2922283C2 DE2922283A DE2922283A DE2922283C2 DE 2922283 C2 DE2922283 C2 DE 2922283C2 DE 2922283 A DE2922283 A DE 2922283A DE 2922283 A DE2922283 A DE 2922283A DE 2922283 C2 DE2922283 C2 DE 2922283C2
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- A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
- A24B15/24—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes by extraction; Tobacco extracts
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung
von Tabak unter Verwendung des Mikroorganismus Cellulo
monas sp. NRRL B-8063.
Aus verschiedenen Gründen ist es oftmals erwünscht, den
Nitrat- und Nicotingehalt von Tabak zu vermindern. So haben
z. B. in den letzten Jahren Zigaretten mit niedrigem Nicotin
gehalt eine erhebliche Aufmerksamkeit beim Verbraucher ge
funden. Weiterhin ist ein Bedarf nach Zigaretten mit niedri
ger Abgabe entstanden, und zahlreiche Techniken sind ver
fügbar geworden, um den Nitrat- oder Nicotingehalt des Ta
baks zu vermindern.
Bei der Entfernung oder Verminderung des Nitratgehalts wird
nach der üblichsten Methode die Verwendung von Chemikalien
zur selektiven Nitratentfernung aus Tabakextrakten durch
Ionenverzögerungstechniken in Betracht gezogen. Die Verminde
rung des Nicotingehalts von Tabak ist sowohl durch chemische
Maßnahmen als auch durch eine mikrobielle Behandlung bewirkt
worden. In den US-PSen 40 11 141, 40 37 609 und 40 38 993
werden mikrobielle Behandlungen zur Verminderung des Nicotin
gehalts von Tabak beschrieben.
Weiterhin ist in der DE-OS 26 34 186 bereits die Ver
wendung des Mikroorganismus Cellulomonas sp. beschrie
ben. Dieser Mikroorganismus wird in dem in der genann
ten Veröffentlichung beschriebenen Verfahren ausschließ
lich zur Verminderung des Nikotingehalts von Tabak ein
gesetzt, wobei der Mikroorganismus dem Tabakmaterial
direkt zum Abbau des Nikotins zugesetzt wird. Damit der
Nikotinabbau durch die Einwirkung des Mikroorganismus
Cellulomonas sp. aufgrund der biochemischen Mechanismen
ausreichend wirksam werden kann, muß der Feuchtigkeitsge
gehalt des Tabaks in diesem Verfahren des Standes der Tech
nik mindestens 50 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht
von Tabak und Wasser, betragen.
In keiner der genannten Veröffentlichungen wird die selek
tive, gleichzeitige Verminderung sowohl des Nitrat - als
auch des Nikotingehalts von Tabak in ein und demselben
Behandlungsverfahren beschrieben, wobei der Gehalt aller
übrigen Aromakomponenten nicht vermindert werden soll.
Es war daher Aufgabe der Erfindung, ein wirksames Ver
fahren zur Verminderung sowohl des Nitrat- als auch des
Nikotingehalts von Tabak in ein und denselben Verfahrens
gang zur Verfügung zu stellen.
Durch die Erfindung wird somit ein Verfahren zur Verminde
rung des Nitrat- und Nikotingehalts von Tabak durch mikro
bielle Behandlung zur Verfügung gestellt, bei dem Tabak
materialien unter kontrollierten Bedingungen der Einwir
kung des Mikroorganismus Cellulomonas sp. unterworfen
werden, der dazu imstande ist, durch eine biochemische
Reaktion Nitrate und Alkaloide (Nikotin) abzubauen. Cellu
lomonas sp. wird in Gegenwart einer Nitrat enthaltenden
Verbindung in relativ kleinen Mengen gezüchtet. Der er
findungsgemäß hergestellte Tabak hat einen verminderten
Nitrat- und Nikotingehalt. Bei der Einarbeitung in ein
Tabakrauchprodukt wird ein milder Rauch mit einem vermin
derten Gehalt an Stickoxiden, Cyanwasserstoff und Nikotin
erhalten. Jedoch erfolgen keine Verluste an erwünschten
Aroma-, Geschmacks- und Raucheigenschaften.
Der Erfindung liegt die Tatsache zugrunde, daß bestimmte
Mikroorganismen in wäßriger Lösung, wenn sie mit Tabak
in Kontakt kommen, den Nitrat- und Nikotingehalt des Ta
baks vermindern bzw. abbauen. Es wurde festgestellt, daß
bei einem Tabakmaterial, das mit einer reinen Kultur von
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 behandelt wird, die in einem Nitrat
enthaltenden Medium gezüchtet worden ist, sowohl das
Nitrat als auch die Alkaloide (Nikotin) in Tabakmate
rialien gleichzeitig abgebaut werden. Hierbei wird ein
Tabakmaterial erhalten, das beim Einbringen in eine
Mischzigarette zu verminderten Abgaben von Stickoxiden,
Cyanwasserstoff und Nikotin beiträgt. Die verwendete
Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 ist in der US-PS 40 38 993
beschrieben. Auf diese Druckschrift wird ausdrücklich
Bezug genommen.
Weiterhin wird vorzugsweise eine Nitrat enthaltende
Verbindung zu dem Wachstumsmedium, z. B. Kaliumnitrat
gegeben. Jedoch können auch andere Nitrat enthaltende
Verbindungen, z. B. Natriumnitrat, Ammoniumnitrat und
dergleichen, verwendet werden.
Bei der erfindungsgemäßen Anwendung der Kultur ist es zweck
mäßig, Tabakblättchen oder -stengel zu behandeln und das
Nitrat und das Nicotin gleichzeitig zu entfernen oder einen
wäßrigen Extrakt von jedem Material herzustellen, das Nitrat
und das Nicotin zu entfernen und hierauf den behandelten Ex
trakt zu dem ursprünglichen Tabakmaterial oder einem rekon
stituierten Tabak zurückzugeben. Die Möglichkeit, den Extrakt
zu behandeln und sodann zu dem ursprünglichen Tabak zurückzu
geben, vermeidet Verluste an löslichen Stoffe, die auftreten,
wenn mit Wasser extrahiert wird und dieses als Träger zur
Entfernung von Nitrat und Nicotin verworfen wird. Hierdurch
werden auch Verluste von anderen, gewünschten Tabakkomponenten
vermieden, die bei der Extraktion mit Wasser und Verwer
fung auftreten. Das erfindungsgemäße Verfahren gibt auch die
Möglichkeit, sowohl Nitrat als auch Nicotin in rekonstitu
ierten Tabakproduktionssystemen zu entfernen, wobei der Ta
bak extrahiert wird und der Tabak in nachfolgenden Prozeß
stufen zurückgegeben wird, da dieses mikrobielle Enzym-System
wirksam in einem flüssigen System arbeitet. Bei dem Ver
fahren wird das Nitrat aufgebrochen und in gasförmigen Stick
stoff umgewandelt, der an die Atmosphäre abgegeben wird. Es
wurde festgestellt, daß der pH-Wert des wäßrigen Mediums,
das den Mikroorganismus enthält, vor der Zugabe der Tabakma
terialien in einem Bereich von mindestens mehr als 5,6 gehal
ten werden muß, um einen Mikroorganismus zu ergeben, der mit
Erfolg gleichzeitig Nitrate und Nicotin abbaut. Der bevor
zugte Anfangs-pH-Wert des wäßrigen Mediums ist etwa 7 bis
9,5. Es wurde auch gefunden, daß der Anteil der Nitrat enthal
tenden Verbindung in dem wäßrigen Medium mindestens etwa
0,1 Gew.% und vorzugsweise etwa 1 Gew.% in dem Medium betragen
muß. Obgleich höhere Mengen der Nitrat enthaltenden Materiali
en verwendet werden können, trägt jedoch eine Erhöhung der
Menge an Nitratverbindung über 1 Gew.% hinaus nicht nennens
wert zu den Abbaueigenschaften der Mikroorganismen bei, ob
gleich auch höhere Konzentrationen anwendbar sind und der
Mikroorganismus die Nitratverbindungen auch bei höheren Kon
zentrationen abbaut.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
zur gleichzeitigen Verminderung des Nitrat- und Nicotinge
halts von Tabak ein wäßriges Medium hergestellt, das den
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 enthält.
Bei der Herstellung eines wäßrigen Mediums wird Nähragar
lösung (erste Lösung) hergestellt, indem ein handelsübliches
Nähragar zu destilliertem Wasser gegeben wird, wobei die
Agarmenge im allgemeinen mindestens 5 g/l beträgt. Hierzu
wird eine Nitrat enthaltende Verbindung, vorzugsweise Kalium
nitrat, in einer Menge von mindestens 0,1 Gew.% Nitrat/Volu
meneinheit Wasser und im allgemeinen von etwa 1 Gew.% Nitrat/
Volumeneinheit Wasser zugesetzt. Diese Lösung wird sodann in
Form von Schrägkulturen in Röhrchen sterilisiert; d. h. Röhr
chen, die das Nähragar enthalten, werden in einem Autoklaven
mindestens 15 Minuten bei mindestens 1,05 atü (15 psig) und
mindestens 121°C schräggelegt, um eine Schrägoberfläche zu
ergeben. Das sterilisierte Medium wird sodann in einen Kühl
schrank für den späteren Gebrauch gegeben.
Sodann wird eine zweite Lösung hergestellt, die Nicotin und
eine Nitrat enthaltende Substanz enthält, welche durch die
Kultur behandelt werden soll, die in dem sterilisierten Me
dium gezüchtet worden ist. Eine solche zweite Lösung kann eine
Nährbrühe sein, die nur Nitrate enthält und die dadurch
hergestellt worden ist, daß man eine handelsübliche Nährbrühe
in destilliertem Wasser auflöst, wobei die Menge der Nähr
brühe etwa 5 bis 10 g/l beträgt. Für den Fachmann wird er
sichtlich, daß die Konzentration der Nährbrühe und der Erhalt
einer verwendbaren Kultur variiert werden kann. Diese Lösung
wird sodann mindestens 15 min bei mindestens 1,05 atü und
121°C oder mehr in einem Autoklaven sterilisiert. Kalium
nitrat oder andere Nitrat enthaltende Verbindungen können zu
dieser Lösung vor der Sterilisation zugesetzt werden.
Ein weiteres Beispiel für eine zweite Lösung kann eine Tabak
extraktbrühe sein, die sowohl Nitrate als auch Nicotin ent
hält. Die Tabakextraktbrühe wird in der Weise hergestellt, daß
man gewöhnlich etwa 100 g Tabakmaterial, z. B. ein im Rauch
kanal geräuchertes Burleystengelgemisch, nimmt und dieses mit
etwa 1000 ml Wasser vermischt, worauf das Gemisch in einem
Autoklaven mindestens 30 bis 60 Minuten bei mindestens
1,05 atü und 121°C oder mehr gekocht wird. Der resultierende,
flüssige Extrakt wird sodann entfernt und das Flüssigkeits
volumen wird durch Zugabe von destilliertem Wasser auf die
ursprüngliche Menge des Extrakts eingestellt. Der Extrakt
wird sodann mit Hefeextrakt vermischt, wobei der Anteil des
Hefeextrakts im allgemeinen mindestens 0,3 Gew.% des Volumens
der Flüssigkeit beträgt. Gewünschtenfalls können jedoch auch
größere Mengen von Hefeextrakt verwendet werden. Das Gemisch
wird in Kolben, die mit Baumwolle zugestöpselt sind, abgege
ben und mindestens 15 Minuten bei 1,05 atü oder mehr und 121°C
oder mehr für die nachfolgende Fortpflanzung der Kultur steri
lisiert. Vor der Verwendung zum Wachstum der Kultur wird der
pH-Wert mit einer geeigneten Säure oder Base auf etwa 7,2
eingestellt.
Der Mikroorganismus Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wird auf
Nähragar-Schrägkulturen, die die Nitrat enthaltende Verbin
dung enthalten, 3 bis 5 Tage bei 20 bis 40°C inkubiert. Das
resultierende Wachstumsprodukt wird sodann dazu verwendet,
um die Tabakextraktbrühe zu inokulieren, wobei das Inokulum
von den Schrägkulturen entfernt wird, indem die Schrägober
fläche mit einer vorgewählten Menge von sterilem, destillier
tem Wasser gewaschen wird. Die Tabakextraktbrühe wird so
dann im allgemeinen etwa 24 Stunden bei etwa 20 bis 40°C ge
rührt, um das Wachstum der zugesetzten Mikroorganismen zu
fördern. Kleinere oder größere Wachstumsperioden, z. B. bis
zu etwa 48 Stunden, sind annehmbar.
Das resultierende Inokulum bzw. der resultierende Impfstoff
ist sodann zur Verwendung zur Behandlung von weiteren Tabak
materialien bereit, um deren Nitrat- und Nicotingehalt zu
vermindern.
Die Erfindung wird in den Versuchen und Beispielen erläutert.
Dieser Versuch beschreibt die Verfahrensweise zur Herstel
lung des Inokulums bzw. des Impfstoffs.
Handelsüblicher Nähragar (entwässerte Form)
wurde zu destilliertem Wasser im Verhältnis von
23 g/l gegeben. Die 23 g Nähragar enthielten 3 g Rindfleisch
extrakt, 5 g Pepton und 15 g Agar. Zu dieser Lösung wurde
1 Gew.% Kaliumnitrat/Volumeneinheit Wasser gegeben. Die re
sultierende Lösung hatte einen End-pH-Wert von 6,8.
Dieses Medium wurde sodann als Schrägkultur in Röhrchen in
einem Autoklaven 15 min bei 1,05 atü und 121°C sterilisiert,
abgekühlt und für die spätere Verwendung zum Wachstum von
Kulturen gekühlt.
Eine Lösung von Nährbrühemedien wurde hergestellt, indem ent
wässerte Nährbrühe in einer Menge von
8 g/l zu destilliertem Wasser gegeben wurde. Die Nährbrühe
enthielt 5 g Pepton und 3 g Rindfleichextrakt. Das resultierende,
wäßrige Medium wurde sodann 15 min bei 1,05 atü und
121°C zum späteren Gebrauch beim Wachstum der Kultur sterili
siert.
Eine im Rauchkanal geräucherte/Burleystengel-Tabak-Extrakt
brühe wurde hergestellt, indem 100 g im Rauchkanal geräucher
te/Burleystengel zu 1000 ml Wasser gegeben wurden und indem
das Gemisch 40 min bei 1,05 atü und 121°C im Autoklaven gekocht
wurde. Der resultierende Flüssigkeitsextrakt wurde entfernt,
und das Flüssigkeitsvolumen wurde auf seine ursprüngliche
Menge mit destilliertem Wasser eingestellt. Die Flüssigkeit
wurde sodann mit Hefeextrakt (HE) in einer Menge von 0,5 Gew.%
Hefeextrakt/Volumeneinheit Flüssigkeit vermischt, und das Ge
misch wurde in Kolben eingefüllt, die mit Baumwolle zuge
stöpselt und 15 min bei 1,05 atü und 121°C zur nachfolgenden
Kulturfortpflanzung sterilisiert wurden.
Der Mikroorganismus, Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wird auf den Nähragar-
Schrägkulturen 3 bis 5 Tage lang bei 30°C inkubiert. Flüssige
Medien, wie z. B. Nährbrühe oder eine im Rauchkanal geräucher
te/Burleystengel-Tabak-Extraktbrühe, werden mit einem steri
len Waschwasser von Schrägkulturen in einer Rate von 2% (Vol/Vol)
inokuliert. Der pH-Wert der Brühe vor der Inokulierung
wird mit Salzsäure oder Natriumhydroxid auf 7,2 bis 7,5 ein
gestellt. Die Kolben werden sodann etwa 24 h bei 30°C mit
220 U/min gerührt.
Dieser Versuch beschreibt den Nitrat- und Nicotinabbau, der
in Burleystengel-Extrakt bei verschiedenen pH-Werten statt
findet.
Ein wäßriger Extrat von Burleystengeln wurde gemäß Versuch
1(c) hergestellt und in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 250 ml/Kolben
eingegeben. Diese Medien wurden zur Bestimmung der
Nitrat- und Nicotinabbaukapazität von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 ver
wendet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. NRRL B-8063
bei einem pH-Wert von 7,2 den größten Teil des in dem Extrakt
verfügbaren Nitrats und Nicotins abbaute, während bei einem
niedrigeren pH-Wert (5,6 und 4,8), wenn überhaupt, nur ein
sehr geringer Abbau stattfand.
Dieser Versuch zeigt den Nitratabbau in anderen Materialien
als Tabak.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde bei den unten beschriebenen Bedingungen
in einem Medium aus Nährbrühe + 0,1% KNO₃ gezüchtet, wo
bei ein Versuchsfermentator von New Brunswick (MF 214) verwen
det wurde. Die Inokulierungskultur wurde wie in Versuch 1
hergestellt, wobei das Nähragar von Versuch 1(a) und die
nicotinfreie Nährbrühe von Versuch 1(b) verwendet wurden.
Die Züchtungsbedingungen waren wie folgt:
Rühren (U/min)|300 | |
Belüften (cm³/min) | 4000 |
Medium | Nährbrühe + 0,1% KNO₃ (Gew./Vol.) |
Volumen des Mediums (1) | 8 |
Temperatur (°C) | 30 |
pH | 7,0 |
Inokulierungsrate (Vol/Vol) | 5% |
Inokulierungsalter (h) | 20 |
Inokulierungsmedium | Nährbrühe + 0,1% KNO₃ |
Antischaummittel | p-1200 |
pH-Kontrolle | 2N HCl |
2N NaOH |
Die folgenden Veränderungen des Nitratgehalts traten auf:
Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß das Nitrat durch
die Cellulomonas sp. NRRL B-8063 Kultur vor 29 h bei einem pH-Wert von
7,0 bis 7,2 entfernt wurde.
Dieses Beispiel zeigt den Nitrat- und Nicotinabbau, der in
einer Burley-Extraktbrühe mit einer relativ hohen Nitrat
konzentration auftritt.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem Fermentator
in Burley-Extraktbrühe, hergestellt gemäß Versuch
1(c) gezüchtet. Die Wachstumsbedingungen waren die gleichen
wie in Versuch 3, mit der Ausnahme, daß das Wachstumsmedium
Burley-Extraktbrühe war. Die folgenden Veränderungen in den
Nitrat- und Alkaloidgehalten traten auf:
Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. NRRL B-8063
den größten Teil des in dem Extrakt verfügbaren Nitrats und
Nicotins abbaute.
Dieser Versuch zeigt verschiedene Gehalte einer Nitrat ent
haltenden Verbindung, die beim Züchten eines Mikroorganismus
zum Abbau von Nitraten verwendet werden kann.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einer nicotinfreien Nährbrühe (NB) +
0,1% KNO₃, hergestellt gemäß Versuch 1(b), gezüchtet. Die
Kultur wurde dazu verwendet, um Nährbrühe mit variierenden
Mengen von KNO₃, zugesetzt auf Gew./Vol.-Basis, zu inokulieren.
Die folgenden Veränderungen traten beim Rühren dieser Kultur
und bei 30°C und 160 U/min auf:
Es wird ersichtlich, daß Cellulomonas sp. NRRL B-8063 einen Teil des
Nitrats bei allen anfänglichen Nitratkonzentrationen von
335 bis 3000 µg/ml Nitrat in der Nährbrühe abbaute und eine
kleine Menge des Nitrats oberhalb 4980 µg/ml abbaute. Die
geringfügige Veränderung der Kontroll-Nitratkonzentration
liegt nahe am Analysenfehler. Sie war nicht auf eine mikro
bielle Einwirkung zurückzuführen, da zu den Kontrollmedien
keine Kultur gegeben worden war.
Dieser Versuch zeigt den Effekt der Belüftung auf die im
Tabakextrakt gezüchteten Kulturen.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem wäßrigen Extrakt von im Rauch
kanal geräucherten/Burleystengeln, hergestellt gemäß Versuch 1(c),
bei den folgenden kontrollierten Bedingungen in einem
Versuchsfermentator von New Brunswick (MF 214) gezüchtet:
Rühren (U/min)|600 | |
Belüften (cm³/min) | 8000 |
pH | 7,3 |
Temperatur (°C) | 30 |
Zeit (h) | 22 |
Antischaummittel | p-1200 |
Inokulierungsrate (Vol/Vol) | 5% |
Volumen des Mediums (1) | 8 |
Art des Mediums | wäßriger Extrakt von im Rauchkanal geräucherten Burleystengeln. Der pH-Wert wurde mit 2N HCl und 2N NaOH kontrolliert |
Die Zunahme der Zellmasse und die chemischen Veränderungen
während des Züchtens bzw. Wachsens waren wie folgt:
Die obigen Werte zeigen, daß bei den angewendeten Bedingun
gen, insbesondere einer hohen Belüftungsrate (8000 cm³/min),
das Nitrat nicht abgebaut wird, daß jedoch die Alkaloide
abgebaut wurden.
Die auf diese Weise gezüchtete Kultur zur Behandlung von
Burleyblättchen wie folgt verwendet:
Die Behandlung wurde in einem Kunststoffbeutel (nichtbelüftete
Umgebung) 24 h bei 30°C durchgeführt, wobei die folgenden
Ergebnisse erhalten wurden:
Es wird ersichtlich, daß in einer nichtbelüfteten Umgebung
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 sowohl Nitrat als auch Nicotin abbaute. Der
Burleytabak mit vermindertem Nitrat- und Nicotingehalt wurde
mit anderen Tabakmaterialien vermischt und mit einer Kontroll
mischung verglichen, die unbehandelten Burleytabak enthielt.
Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Diese Mischungen wurden zu Zigaretten verarbeitet und in der
Maschine geraucht, wobei die folgenden Abgaben von Stickoxi
den, Cyanwasserstoff und Nicotin festgestellt wurden.
Die Werte zeigen eine 38,8%ige Verminderung der Stickoxide
(NOx), eine 19,7%ige Verminderung des Cyanwasserstoffs und
eine 15,3%ige Verminderung des Nicotins.
Dieser Versuch zeigt den Effekt der Belüftung beim Wachstum
der Kultur, wobei die verminderte Belüftung die Umgebung für
den Nitratabbau in flüssigen Systemen liefert.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem wäßrigen Extrakt von im Rauch
kanal geräucherten/Burleystengeln, hergestellt gemäß Versuch 1(c),
bei folgenden Bedingungen in einem Versuchsfermentator
gezüchtet:
Rühren (U/min) | |
600 (1. 4 h) 300 (letztes 20 h) | |
Belüften (cm³/min) | 8000 (1. nur 4 h) |
keines (letztes 20 h) | |
pH | 7,0 |
Temperatur (°C) | 30 |
Zeit (h) | 24 |
Antischaummittel | p-1200 |
Inokulierungsrate (Vol/Vol) | 5% |
Medium (Vol.) | 8 l |
Typ des Mediums | wäßriger Extrakt von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln |
der pH-Wert wurde mit 2N HCl und 2N NaOH kontrolliert.
Die Zunahme der Zellmasse und die chemischen Veränderungen
während des Wachstums waren wie folgt:
Die obigen Werte zeigen, daß bei den angewendeten Bedingun
gen, insbesondere einer hohen anfänglichen Belüftungsrate
(4 h) und anschließend keiner nennenswerten Belüftung (20 h),
sowohl Nitrat als auch Alkaloide abgebaut wurden. Insbeson
dere wird ersichtlich, daß der Nitratabbau sehr bald nach Un
terbrechung der Belüftung begann.
Die, wie hierin beschrieben, gezüchtete Kultur wurde zur Be
handlung eines im Rauchkanal geräucherten/Burleystengel-Ge
miches über einen Zeitraum von 27 h verwendet, wobei das In
okulum mit einer Rate von 2,4 ml/g Tabakgewicht angewendet
und der Tabak bei 30°C inkubiert wurde. Es traten die folgen
den chemischen Veränderungen auf:
Die behandelten Tabake wurden mit anderen Tabakmaterialien
vermischt und mit einer Kontrollmischung verglichen, die un
behandelte Stengel enthielt. Nachstehend sind die erhaltenen
Werte bei zwei verschiedenen Gehalten von behandelten Mate
rialien zusammengestellt:
Diese Mischungen wurden zu Zigaretten verarbeitet und in der
Maschine geraucht, wobei die folgenden Unterschiede zwischen
den Kontroll- und Versuchsprodukten festgestellt wurden:
Die Werte der Rauchabgabe zeigen eine 27%ige und 60%ige Ver
minderung der Stickoxide und eine 21,7%ige und 60,4%ige Ver
minderung des Cyanwasserstoffs für normale und 2,5× normale
Zusatzmengen von behandeltem Stengelmaterial. Die Werte zei
gen auch eine signifikante Erhöhung der Anzahl der Züge, wenn
behandelte Materialien in die Mischung mit 2,5× normaler Rate
eingearbeitet wurden.
Dieses Beispiel beschreibt die Verfahrensweise, die zum Ex
trakt von Tabakblättchen mit Wasser zur Entfernung von Nitrat
und Nicotin angewendet wurde. Der Extrakt wurde mit Cellulo
monas sp. NRRL B-8063 zur Entfernung von Nitrat und Nicotin behandelt
und danach wurde der modifizierte Extrakt in den ursprüng
lichen Tabak zurückgegeben.
Ein Tabakextrakt wurde hergestellt, indem 100 g Burleyblätt
chen mit 1 l Wasser vermischt wurden, und die Mischung wurde
2 h bei Raumbedingungen stehengelassen. Zu diesem Zeitpunkt
wurde der Extrakt gesammelt, indem die Flüssigkeit dekantiert
wurde und der Tabak zur Entfernung von zusätzlicher Flüssig
keit gepreßt wurde. Der Tabak wurde in Raumluft zum Trocknen
ausgebreitet, während der Extrakt (700 ml) der nachstehend
beschriebenen, mikrobiellen Behandlung unterworfen wurde.
Eine reife Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einem geson
derten Tabakextraktmedium, hergestellt gemäß Versuch 1(c),
gezüchtet und zu dem oben beschriebenen Tabakextrakt mit einer
Rate von 10% (Vol/Vol) gegeben. Vor der Zugabe der Kultur
wurde der pH-Wert des Extrakts auf 7,0±0,1 erhöht. Die
Kultur wurde in dem Extrakt in einem Erlenmeyerkolben auf
einem Drehschüttler mit 30°C inokuliert. Die folgenden chemi
schen Veränderungen traten während der 18stündigen Inkuba
tionszeit auf:
Es wird ersichtlich, daß das Nitrat und das Nicotin wegen
der Behandlung fast vollständig abgebaut wurden (96,5% bzw.
93,9%).
Nach 18 h wurde der behandelte Extrakt zu dem ursprünglich
extrahiertem Tabak in drei Stufen wegen der großen Menge des
betreffenden Extrakts zurückgegeben. Dies erfolgte in der
Weise, daß eine Portion zugegeben wurde, gründlich gemischt
wurde und vor der nächsten Zugabe an der Luft getrocknet
wurde. Während dieser Verfahrensweise traten die folgenden
chemischen Veränderungen auf:
Es wird ersichtlich, daß die Nitrate und Alkaloide (Nicotin)
aus dem Extrakt entfernt worden waren und daß ihr Anteil da
her in dem Tabak, in den der behandelte Extrakt zurückgege
ben wurde, signifikat vermindert wurde. 80% des Nitrats und
100% der Alkaloide wurden durch diese Methode entfernt. Ein
Teil des Nitrats und der Alkaloide wurden aus dem Tabak durch
die Kultur während des Trocknens nach der Rückgabe entfernt.
Die hierbei erhaltenen Tabake wurden für Herstellungsverfah
ren verwendet.
Dieser Versuch beschreibt einige Unterschiede im Endprodukt,
die erhalten werden können, wenn man eine Ultrafiltrations
einrichtung im Zusammenhang mit der Tabakextraktion, Extrakt
behandlung und Extraktrückgabe gemäß Beispiel 2 anwendet.
In diesem Beispiel wurde der gleiche Tabak wie in Beispiel 2
verwendet.
Ein Burleyblättchenextrakt wurde wie in Beispiel 2 herge
stellt. Der Extrakt wurde sodann mit einem Filter mit einer
Porengröße von 0,2 Mikron in einer Ultrafiltrations
vorrichtung filtriert, bevor der filtrierte
Extrakt mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063 inokuliert und gemäß Beispiel 2
behandelt wurde. Nach der Behandlung wurde der Extrakt er
neut filtriert, bevor die Rückgabe begonnen wurde. Die auf
dem Filter während der ersten Filtration zurückgehaltenen
Materialien wurden gleichfalls in den extrahierten Tabak
zurückgegeben.
Die auf dem Filter während der zweiten Filtration zurückge
haltende Materialien wurden nicht in den Tabak zurückgegeben.
In dem Extrakt traten die folgenden chemischen Veränderungen
auf:
Die folgenden chemischen Veränderungen wurden in dem extra
hierten Tabak während der Extraktion und Behandlung gemessen:
Es wird ersichtlich, daß die Nitrate und Alkaloide (Nicotin)
aus dem Extrakt durch Cellulomonas sp. NRRL B-8063 entfernt wurden. Je
doch erfolgte im Gegensatz zu Beispiel 2 keine weitere Ent
fernung aus dem extrahierten Tabak während der Zurückgabe.
In diesem Beispiel kommt die mikrobielle Kultur niemals in
Kontakt mit dem Tabak, während in Beispiel 2 die Kultur den
Tabak während der Rückgabe kontaktiert.
Die hierbei erhaltenen Tabake wurden für Herstellungsvorgänge
verwendet.
Dieser Versuch zeigt die Wirksamkeit von Cellulomonas sp. NRRL B-8063
zur Entfernung von Nitrat und Nicotin aus der Extraktbrühe
von rekonstituierten Tabakmaterialien.
Eine wäßrige Extraktbrühe wurde wie folgt hergestellt. 150 g
rekonstituierter Tabak wurden in 1 l Wasser 1 min in einem
Waringmischer aufgeschlämmt. Nach der Aufschlämmung wurde
das Gemisch 10 min bei Raumtemperatur gehalten und danach
durch Zentrifugieren abgetrennt und mit destilliertem Wasser
zur Sterilisierun bei 121°C und 1,05 atü während 15 min
auf das ursprüngliche Volumen gebracht. Es wurden verschie
dene Zubereitungen hergestellt, zu denen Hefeextrakt (HE)
mit 0,5% (Gew./Vol.) vor der Sterilisation zugesetzt wurde.
Im Rauchkanal geräucherter/Burleystengel-Extrakt (mit 0,5%
Hefeextrakt) wurde gemäß Versuch 1(c) hergestellt und als
Kontrollextrakt verwendet. Die pH-Werte der Brühen wurden
vor der Inokulierung mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063 auf 7,2 eingestellt.
Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Es wird ersichtlich, daß die Kultur das Nitrat und die Alkaloide
(Nicotin) der rekonstituierten Tabakmaterialien mit oder
ohne Zugabe von Hefeextrakt wirksam abbauen kann.
Dieser Versuch zeigt die Effekte von aeroben und anaeroben
Tabakbehandlungen.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in einer im Rauchkanal geräucherten/
Burleyextraktbrühe, hergestellt gemäß Versuch 1(c), jedoch
ohne Zugabe von Hefeextrakt, 25,5 h in einem Versuchsfermen
tator unter folgenden Bedingungen gezüchtet:
Nach 25,5 h wurde die Kultur zur Behandlung von im Rauch
kanal geräucherten/Burleystengeln unter aeroben und an
aeroben Bedingungen verwendet, wobei die folgenden Ergeb
nisse erhalten wurden:
Alle Behandlungen erfolgten bei einem Feuchtigkeitsgehalt von
75% und sie wurden 24 h bei 30°C in Kunststoffbeuteln durchge
führt. Weiterhin wurden anaerobe Behandlungen mit anaeroben
Systemzylindern "GASPAK" durchgeführt, wobei ein Katalysator zum Binden
von atmosphärischem Sauerstoff verwendet wurde. Aus den obi
gen Werten wird ersichtlich, daß die Erfindung unter anaeroben
Bedingungen und unter Bedingungen, bei den eine Verfüg
barkeit von Sauerstoff nicht kontrolliert wird, durchgeführt
werden kann.
Dieser Versuch beschreibt die Effekte der Behandlung von Ta
bak mit Zellen sowie überstehender Flüssigkeit vom Zellwachs
tum.
Cellulomonas sp. NRRL B-8063 wurde in Kolben mit im Rauchkanal geräucher
ter/Burleystengel-Extraktbrühe mit 0,5% (Gew./Vol) zugesetztem
Hefeextrakt, hergestellt gemäß Beispiel 1(c), gezüchtet.
Die Inokulierung des Kolbens und die Inkubation erfolgten wie
in Beispiel 1(d). Am Ende der Wachstumsperiode wurde die Kul
tur gemäß Fig. 1 behandelt.
Bei dem in der Figur dargestellten Verfahren wurden die
folgenden Ergebnisse erhalten:
Die resuspendierten Zellen und gefiltertes, überstehendes
Produkt wurden zur Inokulierung von gesonderten, frischen
Kolben von im Rauchkanal geräucherter/Burley-Extraktbrühe
mit 10 ml/Kolben (250 ml Extrakt/500 ml Kolben) verwendet.
Es wurde 24 h bei 30°C mit 220 U/min inkubiert. Der Extrakt
wurde, wie in Beispiel 1(c), hergestellt. Es wurden folgende
Ergebnisse erhalten:
Die resuspendierten Zellen, die ursprüngliche Kultur, fil
triertes überstehendes Produkt und nichtfiltriertes über
stehendes Produkt wurden alle gesondert zur Behandlung von
50 g-Proben von im Rauchkanal geräucherten/Burleystengeln
mit etwa 75% Feuchtigkeit über einen Zeitraum von 24 h bei
30°C in Kunststoffbeuteln verwendet. Bei einer Kontrollprobe
wurde der pH-Wert eingestellt und es wurde mit Wasser ohne
Inokulum behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Aus den obigen Werten wird ersichtlich, daß die überstehende
Flüssigkeit, wenn sie von der Kultur abgetrennt wird, nicht
die Fähigkeit hat, Nitrate und Nicotin in Tabak abzubauen.
Claims (5)
1. Verfahren zum gleichzeitigen Abbauen von Nikotin und
Nitrat im Tabak unter Verwendung des Mikroorganismus
Cellulomonas sp., dadurch gekennzeichnet, daß man eine
Kultur von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 einsetzt, die in einem Medium
gezüchtet worden ist, das mindestens 0,1 Gew.%, vorzugs
weise etwa 1 Gew.% einer Nitratverbindung enthält, wobei
der pH-Wert dieses Mediums in einem Bereich von
mindestens mehr als 5,6, vorzugsweise zwischen 7,0 und
9,5 gehalten werden muß, und entweder Tabak in wäßrigem
Medium oder Tabakextrakt mit dieser Kultur bei pH-Werten
von 7,0 bis 9,5 während einer Zeitdauer von etwa 18 h bei
Temperaturen von 20 bis 40°C behandelt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man
- a) den Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;
- b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;
- c) Cellulomonas sp. NRRL B-8063 zu der Brühe zusetzt
- d) Cellulomonas sp. NRRL B-8063 inkubiert; und
- e) die Cellulomonas sp. NRRL B-8063 enthaltende Tabakextraktbrühe zu dem Tabak aus Stufe b) zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man vor der Zugabe von Cellulomonas sp. NRRL B-8063 der Tabakextrakt
brühe Hefeextrakt zusetzt, wobei der Anteil des Hefe
extraktes vorzugsweise 0,1-2,0 Gew.% der Brühe beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man
- a) Tabak in eine wäßrige Lösung einmischt;
- b) den Tabak aus der wäßrigen Lösung entfernt, wodurch eine Tabakextraktbrühe zurückbleibt;
- c) die Tabakextraktbrühe durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein erstes Retentions produkt zurückgehalten wird und der Durchtritt von vorgewählten Extraktkomponenten gestattet wird, wodurch ein erstes durchgegangenes Produkt behalten wird, und daß man
- d) das erste durchgegangene Produkt, das die vorgewählten Extraktionskomponenten enthält, mit Cellulomonas sp. NRRL B-8063 zur Entfernung von Nitrat und Nikotin behandelt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
man
- e) das erste behandelte durchgegangene Produkt durch eine semipermeable Membran leitet, wobei die Membran eine genügend große Porengröße hat, daß ein zweites Retentionsprodukt zurückgehalten wird, das Cellulomonas sp. NRRL B-8063 enthält, und daß der Durch tritt des behandelten Extraktes gestattet wird, wobei der behandelte Extrakt ein zweites durch gegangenes Produkt darstellt;
- f) das zweite durchgegangene Produkt mit dem ersten Retentionsprodukt vermischt; und daß man
- g) das Gemisch aus dem zweiten durchgegangenen Produkt und dem ersten Retentionsprodukt zu dem in der Stufe b) herausgenommenen Tabak zusetzt.
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