DE2921975C2 - Verfahren und Reagenz für die Biolumineszenz - Google Patents
Verfahren und Reagenz für die BiolumineszenzInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen durch Inkontaktbringen
der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz auf Basis von D-Luciferin,
Luciferase und Magnesiumionen zum Herbeiführen einer Reaktion, in der das Adenosintriphosphat und
D-Luciferin unter Lichtemission an die Luciferase gebunden werden, und Messen der ein Maß für die
Adenosintriphosphatkonzentraiion darstellenden Intensität
des emittierten Lichts. Die Erfindung betrifft auch ein Reagenz für die Biolumineszenz zur Verwendung
bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen, auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und
Magnesiumionen.
Anwendungszweck der Erfindung ist die Bestimmung
Anwendungszweck der Erfindung ist die Bestimmung
ίο von Konzentrationen des Adenosintriphosphats, im
nachfolgenden als ATP bezeichnet z. B. bei ATP-Umwandlungsreaktionen
oder ATP umwandelnden Systemen.
Von ATP abhängige Biolumineszenzreagenzien sind
Von ATP abhängige Biolumineszenzreagenzien sind
is an sich bekannt Diese Reagenzien basieren auf dem
Enzym Luciferase und einem Substrat nämlich D-Luciferin und MagnesiuEiionen und bestimmte andere
Metallionen, an die das andere Substrat ATP, in komplexer Weise gebunden werden muß, damit eine
Reaktion stattfindet Wird das ATP mit dem Reagenz in Kontakt gebracht finden mehrere durch die Luciferase
katalysierte Reaktionen statt die in schematisch vereinfachter Form und zum Teil hypothetisch in der
F i g 1 dargestellt sind. Die Reaktionen 1 bis 3 sind im einzelnen an Luciferase aus dem gemeinen amerikanischen
Glühwürmchen Photinus pyralis untersucht worden. Übersichtsaufsätze hierzu sind: M. DeLuca
(1976), »Advance in Enzymology« (A.Meister, Verfasser), Band 44, Seiten 37-68, John Wiiey&Sons, New
York, sowie W. D. McElroy, H.H. Seliger und M. DeLuca (1974), »The Physiology of Insecta«, 2.
Auflage (M. Rockstein, Verfasser), Band 11, Seiten 411 —460, Academic Press, New York.
Aus Luciferase (E) wird bei der Reaktion 1 ATP und D-Luciferin (LH2), freies Pyrophosphat (PPi) und
enzymgebundenes Luciferyladenylat gebildet. Diese Reaktion begrenzt nicht die Geschwindigkeit weiterer
Reaktionen. Der entstehende Enzym-Luciferyladenylat-Komplex
unterliegt zwei Vorgängen, welche die Emissionsrate des anfangs emittierten Lichts begrenzen,
nämlich einer Konformationsänderung und dem Entzug eines Protons aus dem Luciferyladenylat (s. M. DeLuca
und W. D. McElroy, (1974), Biochemistry, Band 13, Seiten 921 -925). Bei der Reaktion 2 wird Luciferylade-
<5 nylat durch Sauerstoff oxidiert unter Bildung von
Adenosinmonophosphat, das nachfolgend als AMP bezeichnet wird, angeregtem Oxylaciferin (P*), die
beide enzymgebunden bleiben, und Kohlendioxid. In der Reaktion 3 geht das Oxyluciferin unter Emission eines
so Photons in den Grundzustand über. Die zur Emission
des Photons erforderliche Energie entstammt der Oxidation des Luciferins und nicht dem Aufspalten der
Pyrophosphatbindung des ATP.
Der bei der Reaktion 3 entstehende Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex
ist stabil und kann durch Gelfiltration isoliert werden, wenn die Reaktion in Gegenwart
von Pyrophosphatase durchgeführt wird (B. J. Gates und M. DeLuca (1975), Arch, Biochem, Biophys., Band
169, Seiten 616—621). In Abwesenheit von Pyrophosphatase
wird ein Enzym-Oxyluciferin-Komplex ohne AMP isoliert der die gleiche Aktivität wie ein freies Enzym
aufweist (s. den zuletzt genannten Aufsatz von Gates und DeLuca).
Die Stabilität des Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplexes
führt dazu, daß die Mischung aus Luciferase, D-Luciferin und ATP eher einen Lichtblitz als eine
konstante Lichtemission ergibt. Die maximale Lichtintensität wird innerhalb einer Sekunde erreicht und
nimmt danach auf einen gleichbleibenden Pegel ab, bei dem die Regenerierung von freiem Enzym im
vvesentlichen bei der gleichen Geschwindigkeit stattfindet wie die Emission des Lichts. Aufgrund der Tatsache,
daß die freien Produkte die Reaktionen inhibieren, ist der gleichbleibende Pegel jedoch ni'At vollkommen
konstant
Die Bestimmung des ATP wird üblicherweise so ausgeführt, daß die eine unbekannte ATP-K onzentration
enthaltende Probe mit einem die Luciferase, das D-Luciferin und Magnesiumionen enthaltenden Biolumineszenzrcagenz
vermischt wird. Zur Erzielung einer maximalen Zuverlässigkeit der Analyse muß dab?i das
Vermischen in geeigneter Weise bei einer vorgegebenen Reaktionsgeschwindigkeit und in einer solchen
Meßlage erfolgen, daß die anfängliche Charakteristik des Meßlichtes aufgenommen werden kann (siehe
A. Liindin und A. Thore (1975), AnaL Biochem, Band 66,
Seiten 47-63). Nach Aufnahme der entstehenden Lichtintensität wird die Analyse mit einer Probe, die
eine bekannte ATP-Konzentration enthält, und mit einer Leerprobe ohne ATP wiederholt Die unbekannte
ATP-Konzentration wird aus diesen drei Messungen berechnet. Falls die Probe Stoffe enthält, die bei der
Analyse störend wirken können, wird eine interne Standardisiertechnik angewendet, d. h., die Probe wird
mit und ohne Zugabe einer bekannten ATP-Konzentration analysiert.
Bereits im Jahre 1952 wurden ATP-abhängige Biolumineszenzsysteme als zur Verfügung stehend
aufgezeigt, und zwar nicht nur zur Bestimmung dis ATP, sondern im Prinzip auch zur Bestimmung jeglicher
Substanz, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnimmt
(B. L Strehler und J. R. Trotter (1952), Arch. Biochem. Biophys., Band 40, Seiten 28-41). Die
Möglichkeit, ein Biolumineszenzreagenz einem ATP-Umwandlungssystem zuzugeben, um die ATP-Konzentration
k*ntinuierlich durch Messung der Lichtintensität zu verfolgen, hat jedoch sehr geringe praktische
Bedeutung erlangt Die Ursache hierfür beruht zum Teil auf der Tatsache, daß die Aktivität der Luciferase
während der Reaktion infolge der vorstehend beschriebenen Produktinhibierung abnimmt und zum Teil auf
der Tatsache, daß die Luciferasereagenzien durch ATP-Umwandlungssysteme verunreinigt werden. Das
Interesse an dem Verfahren vergrößerte sich jedoch, als es möglich wurde, durch Verwendung von gereinigter
Luciferase und bei synthetischer Hersteilung des Luciferins während einer Reaktionszeit von mehreren
Minuten eine vernachlässigbare Abnahme der Lichtin-•ensität sowie der ATP-Konzentration zu erzielen (A.
Lundin und A. Thore (1975), Anal. Biochem. 66, Seiten 47-63). Geeignete Bedingungen für die Analyse
wurden untersucht und das Verfahren erwies sich als brauchbar für ATP-Konzentrationen bis zu 10~6 mol/1
(A. Lundin, A. Rickardsson und A.Thore (1977), Anal. Biochem., Band 75, Seiten 611 - 620). Trotz wiederholter
Versuche ließ sich jedoch ein Reagenz mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften in nur sehr
wenigen Fällen herstellen.
Dennoch wurde die analytische Verwendbarkeit eines Reagenz mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften
für kinetische Bestimmungen von Substraten und Enzymen, Endpunktbestimmungen von Substraten,
Überwachung von Photophosphorylation und verfolgende Beobachtung von lytischen Reaktionen aufgezeigt
(A. Lundin, A. RickardsFon und A. Thore (1976), Anal. Biochem.. Band 75. Seiten 611-620; A. Lundin,
A. Rickardsson und A. Thore (1977), »Proceedings of
the 2nd Bi-Annual ATP Methodology Symposium, SAI Technology Company, San Diego; A. Lundin, A. Thore
und M. Baltscheffsky (1977), FEBS Lett, Band 79, Seiten 73 - 76; A. Lundin (1978), »Methods in Enzymology« (M.
DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press, New York; A. Lundin und M. Baltscheffsky (1978), »Methods
in Enzymology« (M. DeLuca, Verfasser), Band 57, Academic Press, New York; A. Lundin und I. Styrelius
ίο (1978), CIin. Chem. Acta und A. Thore und A. C Eriksson
(1977), FOA-Report).
Die Schwierigkeiten bei der reproduzierbaren Herstellung
eines Reagenz mit den oben angegebenen Eigenschaften lassen jedoch vermuten, daß die vorstehend
angegebenen Verwendungen nicht außerhalb derjenigen Laboratorien zum Einsatz gekommen sind,
an denen die Verfahrensweisen entwickelt wurden.
Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein entsprechend verbessertes, gattungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung
von ATP aufzuzeigen, bei dem ein zuverlässig meßbarer, stabiler Verlauf des Lichtintensitätspegels
entsteht, sowie ein in reproduzierbarer Weise herstellbares, zuverlässiges Reagenz der gattungsgemäßen Art
anzugeben.
Die erfindungsgemäße Lösung der Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen.
Die einem ATP-abhängigen Biolumineszenzreagenz zugegebenen Zusätze führen zu einer Lichtemission, die
während der gesamten Meßzeit der ATP-Konzentration proportional ist Da das Biolumineszenzreagenz
selbst nur geringe Mengen an ATP verbraucht, ergeben Proben mit einer konstanten ATP-Konzentration eine
konstante Lichtemission, was die Verwendung des Reagenz zu ATP-Bestimmungen erleichtert. Ferner läßt
sich ein Reagenz mit den oben angegebenen Eigenschaften anderen ATP-Umwandlungssystemen zugeben,
so daß es in einfacher Weise ermöglicht wird, Änderungen der ATP-Konzentration durch kontinuierliche
Messung der Lichtintensität zu verfolgen und zu überwachen. Als ATP-Umwandlungssysteme kommen
z. B. Kombinationen von Enzymen und möglicherweise einem Substrat, das in einer Reaktion ATP bindet oder
aufbraucht, in Frage. Die analytische Verwendung des Reagenz umfaßt die Bestimmung von ATP und
Substanzen und Enzymen, die an ATP-Umwandlungsreaktionen teilnehmen, innerhalb der Gebiete der
klinischen Chemie und der klinischen Mikrobiologie und bei der biochemischen und biologischen Forschung,
insbesondere auf dem Gebiet der Bioenergetik.
Im Stand der Technik ergab sich in verschiedenen Reagenzien eine Schwankung der Stabilität des
Lichtpegels, die sich von einer wenige Prozent pro Minute betragende Abschwächung der Lichtintensität
bis zu einer Abnahme auf die Hälfte der ursprünglichen Lichtintensität nach 1 Minute erstreckte. Erfindungsgemäß
wird jedoch aufgezeigt, daß es die Zugabe von L-Luciferin ermöglicht, in reproduzierbarer Weise ein
Reagenz herzustellen, das die gewünschten Eigenschaften, d.h. einen stabilen Lichtemissionspegel, aufweist.
Die Wirkung des L-Luciferins auf die Stabilität des Lichtpegels wurde bisher nicht beobachtet und bei
analytischen Anwendungen dürfte es nahegelegen haben, die Gegenwart derartiger Analoge zu vermeiden,
weil diese bekanntlich, mit dem D-Luciferin konkurrierend, die lichterzeugende Luciferasereaktion
inhibieren (J. L. Denburg, R. T. Lee und W. D. McElroy, Arch. Biochem. and Biophys. 134(1969), S. 381-394).
Obwohl die Erfindung nicht durch irgendeine
Obwohl die Erfindung nicht durch irgendeine
spezifische Theorie bezüglich der Reaktionsmechanik bei der Zugabe des L-Luciferins eingeschränkt ist,
könnte eine derartige Zugabe zur Folge haben, daß ein geringer Teil der gesamten Luciferasemenge als
inaktiver Enzym-Produkt-Komplex vorliegt. Da die freie Enzymkonzentration infolge der Bildung eines
Enzym-Produkt-Komplexes abnimmt, wird der Enzym-Luciferin-Komplex
wahrscheinlich unter Bildung von freiem Enzym dissoziiert, wie dies durch die Reaktion 5
in der F i g. 1 gezeigt ist. Durch Verwendung des L-Luciferins, d. h. eines konkurrierenden Inhibitors, läßt
sich die Luciferasemenge ohne entsprechende Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit vergrößern. Dieses
trifft zu, unabhängig davon, ob das L-Luciferin mit ATP gemäß Reaktion 1 reagiert oder gemäß Reaktion 5
einen enzyminhibierenden Komplex bildet. Die wesentliche Voraussetzung ist lediglich, daß die Reaktionen
umkehrbar und schneller als die Reaktionen 2 bis 4 ablaufen (die Reaktion 4 wird nachstehend im einzelnen
erörtert).
Zum Begriff »konkurrierender Inhibitor« wird hingewiesen auf Segel, »Enzyme Kinetics« (1975), Verlag
Wiley-Interscience«, New York, wonach ein »konkurrierender
Inhibitor« ein nichtmetabolisierbares Analog oder Derivat des echten Substrats oder ein alternatives
Substrat des Enzyms oder ein Produkt der Reaktion sein kann.
insofern freies AMP und freies öxyiucit'erin bei der
Reaktion gebildet werden, ist es von Interesse zu untersuchen, ob dies auch die Inhibierung des Produkts
beeinflußt. Wenn z. B. ATP in einer Konzentration von 10~6 mol/1 zur Erzeugung von AMP in einer Konzentration
von 10-6 mol/1 und Oxyluciferin in einer Konzentration von 10-6 mol/1 führen wurden, so würde die
inhibierende Wirkung des AMP die Aktivität der Luciferase um weniger als 0,5% beeinflussen, weil die
Inhibierungskonstante K, des AMP 2,4 χ ΙΟ"4 mol/1
beträgt (siehe R. T. Lee, J. L Denburg und W. D. McElroy (1970), Arch. Biochem. Biophys., Band 141,
Seiten 38 — 52). Dagegen würde die Bildung von Oxyluciferin, für das K, 2,3 χ 10-? mol/I beträgt (T. Goto,
I. Kubota, N. Suzuki und Y. Kishi (1973), »Chemiluminiscence and Bioluminiscence«, Verfasser: M. J. Cormier,
D.M. Hercules und J.Lee, Seiten 325-335, Plcr.-jm
Press, New York), die Luciferaseaktivität beträchtlich herabsetzen. Folglich kann es unter bestimmten
Bedingungen von Wichtigkeit sein, der Wirkung des freien Oxyluciferins entgegenzuwirken. Durch Zugabe
des L-Luciferins wird die anfängliche Inhibierung der Luciferase so groß, daß eine zusätzliche Inhibierung
durch das Oxyluciferin, welches bei der Reaktion kontinuierlich gebildet wird, vernachlässigbar ist Die
Zugabe von inhibierenden Konzentrationen des L-Luciferins
stabilisiert folglich den Lichtpegel.
Bei der Analyse mußte die Konzentration des D-Luciferins eine sättigende sein, d. h., so hoch, daß eine
geringe Konzentrationsänderung die Reaktionsgeschwindigkeit nicht beeinflußte. Dies war wichtig, weil
-andernfalls geringe Volumenänderungen die Reaktionsgeschwindigkeit
beeinflußt hätten. Ferner können Bestandteile biologischer Proben die zur Luciferasereaktion
verfügbare Konzentration des D-Luciferins beeinflussen und auf diese Weise die Reaktion
inhibieren. Eine befriedigende Genauigkeit der Analyse konnte folglich nur bei Sättigungskonzentrationen des
D-Luciferins erzielt werden.
Durch die Zugabe des L-Luciferins zum D-Luciferin läßt sich eine scheinbare Sättigung bei einer niedrigen
Konzentration des D-Luciferins erreichen, ohne daß die Analyse auf irgendeine andere Weise als durch eine
Reduzierung der Meßempfindlichkeit beeinflußt wird. Dies stellt einen zusätzlichen Vorteil der Erfindung dar,
weil das D-Luciferin eine teure Substanz ist, die nur in Ausnahmefällen in Sättigungskonzentrationen zugegeben
werden kann.
Die infolge der Zugabe des L-Luciferins verringerte Luciferaseaktivität ist durch eine Erhöhung der
Ό Luciferasekonzentration kompensierbar. Es kann somit
das Verhältnis von Luciferin zu Luciferase optimal eingestellt werden, z. B. in bezug auf die Kosten der
Reagenzherstellung, ohne daß dadurch die Empfindlichkeit der Analyse beeinträchtigt wird. Die diesbezügliche
Wichtigkeit der Erfindung geht aus der Tatsache hervor, daß auf dem Weltmarkt für nur eine der entwickelten
Anwendungen ein Bedarf zur Durchführung von etwa 5 Mill. Analysen pro Jahr besteht Eine geringfügige
Verringerung der Kosten des Reagenz pro Analyse führt somit zu erheblichen Kosteneinsparungen. Dies
bedeutet, daß die Erfindung auch in dieser Hinsicht einen sehr wesentlichen Beitrag liefert.
Zusammenfassend ist zu folgern, daß der Einsatz des L-Luciferins es ermöglicht, daß Verhältnis Luciferin/Luciferase
optimal zu gestalten, z. B. in bezug auf Herstellungskosten des Reagenz, sowie auch in bezug
auf eine Erhöhung der Stabilität des Lichtpegels. Eine geeignete Konzentration des D-Luciterins ist diejenige,
die zu einer Inhibierung der Luciferasereaktion und somit der Lichtintensität von mindestens 25% führt,
weil bei geringerer Inhibierung die Auswirkung auf die Stabilität des Lichtpegels und die zur Sättigung
benötigte Konzentration des D-Luciferins zu klein ist, um bei der Analyse von wirtschaftlicher Bedeutung zu
sein. Ein besonders bevorzugter Bereich beträgt 50 bis 90%. Eine Inhibierung der Intensität von mehr als 90%
führt u. a. dazu, daß unnötige große Anforderungen an die Meß- und Registriergeräte gestellt werden müssen
und erfordert auch eine solche Erhöhung der einzusetzenden Luciferpsemenge, daß die Analyse unwirtschaftlich
wird. Ferner entsteht bei großen Luciferasemengen leicht eine Störung der Analyse.
Gemäß einer spezifisch bevorzugten Ausführungs-ίοππ
der Erfindung wird der konkurrierende Inhibitor
zusammen mit Pyrophosphat dem Reagenz zugegeben. Es ist an sich bekannt, daß Pyrophosphatkonzentrationen,
welche die Luciferasereaktion inhibieren, auch einer Abnahme der Lichtintensität entgegenwirken
(W. D. McElroy, J.W. Hastins, J.Coulombre und
V. Sonnenfeld (1953), Arch. Biochem. Biophys, Band
46 (1953), Seiten 399-416). Dies ist bisher jedoch nicht zur Verbesserung der Anaiysebedingungen bei der
Bestimmung von ATP verwendet worden.
Es wurde in überraschender Weise festgestellt, daß die kombinierte Verwendung von Pyrophosphat in viel
geringerer Konzentration als vorher üblich, vorzugsweise in einer Höchstkonzentration von 10—' mol/1 und
insbesondere in einer Konzentration von nicht mehr als 10~5 mol/1 zusammen mit dem konkurrierenden Inhibitor
in der vorstehend angegebenen Konzentration zu einem sehr stabilen Lichtpegel führt Durch diese
Kombination wird eine Stabilität des Lichtpegels erhalten, wie sie ansonsten nur durch erhebliche
größere Inhibierung der Luciferase unter Verwendung
von entweder Pyrophosphat oder L-Luciferin erreichbar
ist Bei einer konkurrierenden Inhibierung mit L-Luciferin von etwa 50% und einer Pyrophosphatkonzentration
von 10~6 mol/1 beträgt der Abfall der
Lichtintensitätskurve weniger als 3%. Bei einer Inhibierung von etwa 75% und einer Pyrophosphatkonzentration
von 10"6mol/l wird ein in der Größenordnung
von 1 % liegender Abfall der Lichtintensitätskurve erhalten. Eine derart stabile Lichtintensität erlaubt es
natürlich, viel weniger aufwendige Meß- und Registriergeräte einzusetzen, und sie stellt vor allem eine sehr
gute Voraussetzung für eine kontinuierliche Analyse bei ATP umwandelnden Reaktionen dar. Bei der Erfindung
sind die üblicherweise verwendeten Pyrophosphate einsetzbar.
Es wird an dieser Stelle keine spezifische Theorie der Reaktionsmechanik festgelegt. Es ist jedoch möglich,
daß das Pyrophosphat mit dem AMP im Enzym-Oxyluciferin-AMP-Komplex
gemäß der Reaktion 4 der F i g. 1 reagiert. Zur Bildung des ATP aus Pyrophosphat und
AMP wird Energie benötigt. Diese Energie ergibt sich wahrscheinlich aus der Rückumwandlung des Enzyms in
die ursprüngliche, vor der Oxidationsreaktion bestehende Konformation (Reaktion 2 der Fig. 1). Eine
Änderung der Konformation würde eine Erklärung dafür bieten, daß die Produktinhibierung nicht konkurrierend
ist (J. J. Lemasters und C. R. Hacknebrock (1977). Biochemistry, Band 16, Seiten 445-447),
während Oxyluciferin ein konkurrierender Inhibitor ist (siehe Goto und Mitarbeiter (1973), a.a.O.). Die
Reaktion mit Pyrophosphat würde somit eine starke, nicht konkurrierende Inhibierung (siehe Goto und
Mitarbeiter (1973), a. a. O.) in eine schwächere, konkurrierende
Inhibierung umwandeln. Der Wirkung der konkurrierenden Inhibierung auf den Lichtpegel kann
durch die erfindungsgemäße Zugabe des L-Luciferins entgegengewirkt werden (siehe oben). Gemäß der
Reaktion 4 der F i g. 1 führt die Luciferasereaktion in Gegenwart von Pyrophosphat insgesamt zu keinem
Aufbrauchen des ATP. Dies würde zur Stabilisierung des Lichtpegels beitragen.
Zusätzlich zur Mitwirkung bei der Abspaltung des Enzyms aus dem Enzym-Oxyluciferin-AM P- Komplex
könnte das Pyrophosphat in inhibierenden Konzentrationen dazu beitragen, die Reaktion 1 in F i g. 1 in
Rückwärtsrichtung zu treiben. Durch Zugabe von Pyrophosphat könnte somit die gesamte Enzymkonzentration
erhöht werden, ohne eine entsprechende Vergrößerung der Lichtintensität. Ein kleinerer Anteil
der gesamten Enzymkonzentration wird dadurch in Form eines inaktiven Enzymproduktkomplexes gegenwärtig
sein. Inhibierende Pyrophosphatkonzentrationen würden somit zur Stabilisierung des Lichtpegels
beitragen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird dem Biolumineszenzreagenz Coenzym
A zugegeben, d. h. entweder in Kombination mit nur dem konkurrierenden Inhibitor oder in Kombination
mit dem konkurrierenden Inhibitor und Pyrophosphat Es hat sich auch gezeigt, daß die Zugabe von
Coenzym A den Lichtpegel stabilisiert Die Tatsache, daß sich eine Erhöhung der Lichtintensität durch
Zugabe von nur Coenzym A erreichen läßt ist an sich bekannt (siehe die Veröffentlichung von R-L. Airth,
W. C Rhodes und W. D. McElroy (1958), Biochem. Biophys. Acta, Band 27, ab Seite 519), jedoch ist die
Verwendung von Coenzym A zur Verbesserung der analytischen Bedingungen bei der Bestimmung von ATP
bisher nicht beschrieben worden.
Die Reaktionsmechanik des Coenzyms A besteht wahrscheinlich darin, daß die Verbindung mit Oxyluciferin
im Enzym-Oxyluciferin-AM P-Komplex gemäß der Reaktion 4 in der F i g. 1 reagiert (in der das Coenzym A
mit CoA bezeichnet ist). Die Reaktion zwischen dem Coenzym A und dem Oxyluciferin ändert die nicht
konkurrierende Produktinhibierung des Enzyms und des Oxyluciferin-AMP-Komplexes in eine schwache
konkurrierende Inhibierung durch AMP, die unter normalen analytischen Bedingungen nicht vernachlässigbar
ist.
Das Coenzym A übt somit seine Wirkung aus, ohne
Das Coenzym A übt somit seine Wirkung aus, ohne
ίο die Luciferasereaktion zu hemmen. Hier ergibt sich ein
Unterschied zum L-Luciferin und, in bestimmten Fällen, auch zu Pyrophosphat. Die mit L-Luciferin und
Pyrophosphat erhaltene Inhibierung ist jedoch bei vielen analytischen Anwendungen ohne Wichtigkeit,
weil die Empfindlichkeit des Luciferaseverfahrens im allgemeinen sogar nach der Inhibierung zufriedenstellend
ist. Wenn dies nicht der Fall ist kann die Konzentration der Luciferase erhöht werden, vorausgesetzt,
daß das Luciferasepräparat keinen hohen Anteil an Verunreinigungen aufweist, die bei der Analyse
stören. Bei bestimmten Anwendungen der Erfindung kann es somit von speziellem Interesse sein, ein
hochgereinigtes Luciferasepräparat zu verwenden. Verschiedene Verfahren zur Reinigung von Luciferase
sind an sich bekannt und alle diese Verfahren lassen sich in den meisten Fällen einsetzen. Wenn die Anforderungen
an Reinheit sehr hoch sind, besteht eine bevorzugte Äusführungsform der Erfindung in der Verwendung
eines Reagenz, das Luciferase enthält, die mittels der isoelektrischen Fokussierung gereinigt worden ist.
Luciferase läßt sich ferner gegen unspezifische Aktivierung dadurch schützen, daß die richtigen Reaktionsbedingungen
gewählt und schützende Substanzen, wie z. B. Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder
Ethylendiamintetraessigsäure hinzugegeben werden.
Bei bestimmten biologischen Proben ist die Verwendbarkeit von Pyrophosphat und Coenzym A durch
Enzymsysteme begrenzt, die diese Substanzen abbauen. In diesen Fällen läßt sich die Wirkung derartiger
Enzyme dadurch verhindern, daß ein Inhibitor zugegeben wird, der die Luciferasereaktion nicht beeinflußt.
Die Pyrophosphataseaktivität läßt sich z. B. durch Mangan- oder Fluoridionen inhibieren. Wird die
synthetische Natur des L-Luciferins in Betracht gezogen, erscheint es, daß dieses in den biologischen
Proben vermutlich keiner enzymatischen Degradierung unterliegt
Bei der Herstellung eines Biolumineszenzreagenz mit gewünschten Eigenschaften muß die Auswahl an
Substanzen aus der Gruppe bestehend aus L-Luciferin, Pyrophosphaten und Coenzym A je nach der Verwendung
bestimmt werden, weil die Anforderungen verschiedener Verwendungen in bezug auf Empfindlichkeit
Probenzusammensetzung, auftretenden Störreaktionen, Preis des Reagenz, Lagerstabilität usw. variieren.
Wird in Betracht gezogen, daß die Erfindung es ermöglicht eine Auswahl aus einer großen Gruppe von
Substanzen zu treffen, dürften sich für den Fachmann keine Schwierigkeiten beim Auffinden einer geeigneten
Reagenzzusammensetzung für jeden einzelnen Anwendungszweck ergeben.
Zusätzlich zur vorstehenden Beschreibung der Vorteile und Anwendungen der Erfindung ist hinzuzufügen,
daß kontinuierliche Messungen und Beobachtun-
gen von ATP umwandelnden Reaktionen mit dem erfindungsgemäßen, verbesserten Biolumineszenzreagenz
eine Empfindlichkeit aufweisen, die üblicherweise um mehrere Zehnerpotenzen größer ist, als die
Empfindlichkeit eines entsprechenden spektralphotometrischen Verfahrens. Die analytische Verfahrensweise ist jedoch sehr ähnlich der Verfahrensweise bei
gekoppelter spektralphotometrischer Analyse, die z. B.
auf der Grundlage der NAD+/NADH-Umwandlung durchgeführt wird. Bei der Bestimmung von ATP in
ATP nichtumwandelnden Systemen, d. h. in Proben mit konstanter ATP-Konzentration, weist ein Reagenz mit
den oben angegebenen Eigenschaften auch ersichtliche Vorteile auf. Da das Licht konstant ist, werden keine
Anforderungen an die Geschwindigkeit des Vermischens von Reagenz und Proben gestellt. Das
Vermischen muß nicht an der Meßstelle stattfinden und die Lichtmessung kann im Verlauf einer beliebigen
Zeitdauer durchgeführt werden. Hierdurch wird die Empfindlichkeit und auch die Reproduzierbarkcit
vergrößert. Bei der Bestimmung von ATP in Zellensystemen weist das erfindungsgemäße Reagenz auch
große Vorteile auf, weil es die Messung der Konzentration von extrazellulärem und intrazellulärem ATP in
derselben Probe ermöglicht Zuerst wird die Konzentration von extrazellulärem ATP gemessen, wonach ein
lytisches Reagenz, welches das Luciferasesystem nicht beeinflußt, hinzugegeben und die der Konzentration
von intrazellulärem ATP entsprechende Erhöhung der Lichtintensität gemessen wird.
Es ist möglich, die Bestandteile des erfindungsgemäßen Biolumineszenzreagenz getrennt zuzugeben. Es
lassen sich folglich ein oder mehrere der Bestandteile zusammen mit dem zur Erzielung des gewünschten
pH-Werts erforderlichen Puffer hinzugeben.
Anhand des nachstehenden Beispiels wird die Erfindung näher erläutert:
Dieses Beispiel erläutert wie L-Luciferin und Pyrophosphat zusammen ein Reagenz mit stabilem
Lichtpegel bei bereits annehmbarer Inhibierung ergeben. Die verwendete Luciferase wurde mittels isoelektrischer Fokussierung gereinigt. In der Fig.2 ist die
Lichtintensität als Funktion der Zeit nach der Zugabe von ATP in einer endgültigen Konzentration von
10-6mol/l zur jeweiligen Reaktionsmischung gezeigt.
In den Reaktionsmischungen (endgültiges Volumen
1 ml) ist in allen Fällen Luciferase, D-Luciferin
(100 μg/ml), Magnesiumacetat (10 mmol), Rinderserumalbumin (0,1%), Ethylendiamintetraessigsäure (2 mmol),
und 0,1 mol tris (Hydroxymethyl) aminomethanpuffer
unter Einstellung eines pH-Wertes von 7,75 mit
In Fig.2 zeigt A eine mit einem Reagenz ohne
weitere Zusätze erhaltene Lichtkurve mit abfallendem Pegel, die zur kontinuierlichen Messung bei ATP
umwandelnden Systemen nicht geeignet ist Bei B ist die
Wirkung eines Zusatzes von L-Luciferin (10μg/ml)
gezeigt, der zu eir.er !nhibienir.g vor. etwa 70% führt.
Die Abnahmecharakteristik der Kurve ist annehmbar, jedoch lassen sich aufgrund der anfänglichen Spitzenwerte bei hohen ATP-Konzentrationen keine kontinu-
ierlichen Messungen in ATP umwandelnden Systeme durchführen. Werden höhere Konzentrationen des
Zusatzes eingesetzt und dabei größere Inhibierungen erhalten, so ergeben sich jedoch geradlinige und
brauchbare Lichtkurven. Die Wirkung von Pyrophos
phat (10--6mol/l) ist bei C gezeigt Der Abfall der
Lichtkurve ist immer noch zu groß und es ergibt sich anfangs in geringem Ausmaß ein Spitzenwert Bei
höheren und mehr inhibierenden Konzentrationen des Zusatzes nähert sich die Lichtkurve mehr einer
Geraden. Bei D ist die Wirkung von L-Luciferin (10μg/ml) und Pyrophosphat (lO-'mol/l) gezeigt. In
diesem Fall sind der Abfall der Kurve sowie auch der anfängliche Spitzenwert fast vollkommen verschwunden. Dieses Reagenz ist somit zu analytischen Zwecken
gut geeignet. Folglicherweise ergeben nur die Reagenzien, die L-Luciferin (Fig.2, B und D) enthalten, bei
denen anscheinend eine Sättigungskonzentration des Luciferins (D+ L, siehe oben) vorliegt eine maximale
Genauigkeit der Analyse.
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen
durch Inkontaktbringen der zu untersuchenden Probe mit einem Biolumineszenzreagenz
auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen zum Herbeiführen einer
Reaktion, in der das Adenosintriphosphat und D-Luciferin unter Lichtemission an die Luciferase
gebunden werden, und Messen der ein Maß für die Adenosintriphosphatkonzentration darstellenden
Intensität des emittierten Lichts, dadurch gekennzeichnet,
daß man bei der Bestimmung einen konkurrierenden Inhibitor der Reaktion in
Form von L-Luciferin in einer Konzentration einsetzt, die zu einer Inhibbrung von mindestens
25%, vorzugsweise 50 bis 90% der Lichtintensität führt
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Bestimmung auch
Pyrophosphat in einer maximalen Konzentration von 10-4M einsetzt
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man auch Coenzym A bei der
Bestimmung einsetzt
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
Luciferase-Präparat einsetzt das durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß man ein
Luciferase-Präparat mit einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindupgen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure
einsetzt.
6. Reagens für die Biolumineszenz zur Verwendung bei der Bestimmung von Adenosintriphosphatkonzentrationen,
auf Basis von D-Luciferin, Luciferase und Magnesiumionen, dadurch gekennzeichnet,
daß es zusätzlich einen konkurrierenden Inhibitor in Form von L-Luciferin in einer Konzentration, die zu
einer Inhibierung von mindestens 25%, vorzugsweise 50 bis 90% der Lichtintensität führt, enthält.
7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es auch Pyrophosphat in einer
maximalen Konzentration von 10~4M enthält.
8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es auch Coenzym A enthält.
9. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase enthält,
die durch isoelektrische Fokussierung gereinigt worden ist.
10. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Luciferase mit
einem Zusatz an Rinderserumalbumin, Thiolverbindungen und/oder Äthylendiamintetraessigsäure enthält.
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