SE432112B - Forfarande for bestemning av kreatinkinas i prover innehallande atp - Google Patents

Description

'r 1 10 15 20 25 30 35 79Û6066=1 2 Lundin (i Methods in Enzymology (M. DeLuca, ed.)Vo1. 57, sid 56-65, Acedemic Press 1978). Lämpliga bioluminiscensreagens med stabil ljusemission proportionell mot ATP koncentrationen har beskrivits av Lundin och Myhrman(svensk patentansökan nr 7806296-5).

Bioluminiscensmetoden för bestämning av kreatinkinasaktivitet har genom sin högre känslighet, den lägre störningen av analysen vid turbiditet i proverna och det färre antalet kopplade reaktioner betydande fördelar jämfört med den spektrofotometriska rutinmetoden för vilken ett flertal kit finns kommersiellt tillgängliga. Dessa egenskaper gör att bioluminiscensmetoden är speciellt lämplig för bestämning av kreatinkinasaktivitet i prover, som har en hög bak- grundsabsorbtion eller turbiditet vid den våglängd som används vid den spektrofotometriska metoden (340 nm). Detta gäller t.ex. helblods- prover eller andra prover som innehåller celler.

Bioluminiscensmetoden har tidigare använts för bestämning av kreatinkinas i bl.a. helblod som först torkats in på porösa bärare (USA patenten nr 4.080.265 och 4.001.088). Intorkning av blodprover på porösa bärare, t.ex. papper, som ett sätt att stabilisera enzym- aktivitet under provtransport, har beskrivits av Levin och Berezov (Lab.Delo (Moscow) 1972 (3) sid 145-148). Enligt ovanstående biolu- miniscensmetod (USA patent nr 4.080.265 och 4.001.088) utstansas små bitar av det papper, på vilket blodprov intorkats, och inkuberas med partiellt renat biolminiscensreagens under 20 timmar vid 20°C.

Härvid bryts en stor del av den ATP, som släppts ut från blodkropparna ned. Detta minskar interferensen i analysen från bakgrundshalten av ATP. Slutligen tillsättes det ena substratet i kreatinkinasreaktionen, nämligen kreatinfosfat, och ökningen i ljusemission mätes efter 30 minuter. Det andra substratet, ADP, tillsättes enligt metoden inte.

Förmodligen utnyttjas de halter ADP som spontant uppkommit under inkubationen. Halten ADP under själva analysen blir i så fall beroende av halten av de enzymsystem, vilka omsätter adeninnukleotider, och som föreligger 1 prov och reagens. Dessa halter kan variera mellan olika prover och mellan olika reagenspreparationer (bioluminiscens- reagenset är enligt metoden endast partiellt renat). Detta kan ge en variation i ADP halten och därmed i kreatinkinasaktiviteten, vilket medför en osäkerhet i bestämningen av denna aktivitet.

Enligt föreliggande uppfinning inkuberas provet innehållande ATP, t.ex. helblod intorkat på porös bärare, i en buffertlösning 6 l - 10' M, M. Detta leder till en snabb nedbrytning innehållande bioluminiscensreagens och AMP i en halt av 10- 4 -3 #10 av ATP (figur l) till en halt som inte stör analysen. Utan att upp- företrädesvis 10- gm 15 3 7906066-1 finningen binds till någon speciell reaktionsmekanism är det troligt att nedbrytningen beror på adenylatkinasreaktionen (ATP + AMP--å> 2 ADP). Sedan merparten ATP nedbrutits och kreatinkinas fr'gjorts från eventuell porös bärare (vilket kräver inkubering vid ' ca l5 min) tillsättes de bägge substraten ADP och kreatinfosfat.

För att få en god hämning av adenylatkinasaktiviteten bör ADP lösningen innehålla någon effektiv hämmare av detta enzym t.ex. dia- denosinpentafosfat (figur 2). Bildningen av ATP i adenylatkinas- och kreatinkinasreaktionerna följes genom att mäta ljusemissionen.

Genom att tillsätta en känd mängd ATP kan ökningen av ljuse emissionen omräknas till ATP bildning per minut, d.v.s. till enzym- aktivitet.

Enligt den enklaste utformningen av uppfinningen sättes till provet en buffertlösning innehållande bioluminiscensreagens och efter inkubering ADP och kreatinfosfat. Bioluminiscensreagenset kan emellertid tillsättas efter inkuberingen förutsatt att buffertlösningen innehåller magnesiumjoner eller några andra tvåvärda joner *som kan fungera som kofaktorer i adenylatkinasreaktionen utan att interferera med de senare stegen i analysen. Det är också möjligt att tillsätta ADP, för att mäta adenylatkinasaktiviteten, och därefter kreatinfosfat, för att mäta summan av adenylatkinas- och kreatinkinasaktiviteterna.

Detta förfarande är nödvändigt i situationer då adenylatkinasaktivi- teten inte kan försummas. Då adenylatkinasaktiviteten kan försummas :an ADP och kreatinfosfat tillsättas i ett steg, vilket förenklar analysen. Adenylatkinashämmaren kan då lämpligen tillsättas i samma steg. Uppfinningen innefattar även andra möjliga uppdelningar av de i analysen ingående komponenterna på olika lösningar förutsatt att AMP tillsatsen ökar nedbrytningen av bakgrunden av ATP i proverna.

Den enligt uppfinningen beskrivna metoden har jämfört med metoden enligt USA patenten nr 4.080.265 och 4.001.088 följande fördelar: l) Inkuberingstiden för att bryta ned ATP har minskats från 20 timmar till ca l5 minuter. 2) Tillsatsen av AMP och effektiv adenylatkinashämmare t.ex. diadenosinpentafosfat ger en nästan total hämning av ATP bildningen i adenylatkinasreaktionen (2 ADP---5nTP+AMP) figur 2). (janför 3) Tillsatsen av ADP i kontrollerade halter ökar förutsättningarna för en god reproducerbarhet och tillförlitlighet såväl inom provserierna som dag till dag. 20 30 D.) UI ïåüéïßvóótï 4 Användes ett bioluminiscensreagens med stabil ljusemission t.ex. enligt svensk patentansökan 7806296-2 uppstår ytterligare fördelar.

Utföres analysen enligt Lundin och Styrelius (Clin.Chim.Acta 87 (l9ïê)l99) kan kreatinkinasaktiviteter från 1 U/l och uppåt be- stämmas förutsatt att adenylatkinasaktiviteten inte begränsar känsligheten. Enligt uppfinningen (men inte enligt Lundin och Styrelius) bidrar AMP till hämningen av ATP bildningen i adenylat- kinasreaktionen. En hög känslighet kan utnyttjas antingen för att bestämma låga kreatinkinasaktiviteter eller för att använda låga provvolymer.

Den kanske största fördelen med ett bioluminiscensreagens med stabil ljusemission är att bestämningen av kreatinkinasaktiviteten kan utföras kinetiskt, vilket ökar tillförlitligheten. Vid de kreatin- kinasaktiviteter som förekommer i t.ex.Iunnant helblod kan en kinetisk analys utformas så att mättiden understiger l min, vilket är en fördel speciellt om automatiska analysmaskiner skall utnyttjas.

Den enligt uppfinningen beskrivna metoden kan användas för bestämning av kreatinkinasaktiviteten i t.ex. helblod eller andra kroppsvätskor, vilka genom lys av celler resulterar i en ATP halt, som skulle kunna interferera med bestämningen. Tekniken är inte begränsad till prover från människa. Proverna kan antingen analyseras direkt eller torkas in på porösa bärare. Det senare förfarandet underlättar in- sändandet av proverna till centrala laboratorier för t.ex. screening- undersökningar.

Ett exempel där intorkning på porösa bärare är aktuellt är screening för olika muskelsjukdomar i människa som Duchennes muskeldystrofi.

Denna sjukdom är en av de vanligaste ärftliga sjukdomarna och drabbar enbart pojkar, vilka långsamt förtvinar och avlider i allmän- het före 20 års ålder. En omfattande screening för denna sjukdom med hjälp av kreatinkinasbestämning med bioluminiscensmetoden pågår bl.a. i Tyska förbundsrepubliken. Denna screening, som är frivillig, avser att utnyttjas för genetisk rådgivning till de drabbade familjer- na.

En annan applikation för metoden enligt uppfinningen är screening för Porcine stress syndrom, vilken sjukdom hos svin ger upphov till dålig kvalitet på köttet och orsakar miljonförluster årligen.

Metoden enligt uppfinningen kan användas för bestämning av kreatinkinas 10 15 20 25 30 35 5 7906066-1 i kapillärblod. Genom att serum ej behöver prepareras blir metoden snabbare, enklare och patienten behöver inte tappas på så mycket blod vilket är viktigt för t.ex. infarktpatienter och barn. Det borde t.o.m. vara möjligt att utforma komersiella kit för enkla bestämningar av kreatinkinas möjliga att genomföra på t.ex. akut- mottagningar.

Metoden kommer nu att belysas genom följande icke-begränsande exempel.

Exemgel Detta exempel illustrerar beredning av reagenskit, utförande av analys samt resultat från en analysserie genomförd för att kontrollera en metod för screening för human muskeldystrofi med helblod intorkat på papper. Bioluminiscensreagenset, ATP Monitoring Reagent, har beretts enligt svensk patentansökan 7806296-5 och är kommersiellt tillgängligt liksom även tillhörande ATP Standard. Reagenskitet räcker för 200 bestämningar och innehåller följande flaskor (en av vardera slaget).

ATP Monitoring Reagent (eldflugeluciferas, D-luciferin, 50 mg bovint serumalbumin, 0,5 mmol magnesiumacetat, 0,1 pmol oorganiskt pyrofosfat) ATP Standard (0,1/umol ATP, 2,0_pmol magnesiumsulfat) ADP reagens (l,0,umo1 ADP, 0,0l.)nmol diadenosinpentafosfat) CP reagens (500_umol kreatinfosfat) CK buffert (1,25 mM AMP, 1,25 mM EDTA, 25 mM N-acetylcystein och 0,125 M imidazol, pH 6,7 justerat med ättiksyra).

Alla reagens utom CK buffert föreligger i frystorkad form. Före användningen löses ATP Monitoring Reagens i 40 ml CK buffert (denna blandning kallas CK reagens nedan), ATP Standard i 10 ml dest vatten, ADP reagens i 5 ml dest vatten och CP reagens i 5 ml dest vatten.

Analysen tillgår på följande sätt: 1) Från den torkade blodfläcken stansas en liten skiva ut. Skivans storlek bör vara så avpassad att den motsvarar någon eller några mikroliter helblod. 2) Skivan inkuberas i 200 pl CK reagens i ca 15 min vid 25°C så att merparten ATP bryts ned vilket kan avläsas genom att mäta ljus- emissionen. 3) 25 pl ADP reagens tillsättes och adenylatkinasaktiviteten bestämes genom mätning av ljusemissionen. 10 15 7906066-í 6 4) 25 pl CP reagens tillsättes och summana¥"adenylatkinas- och kreatinkinasaktiviteterna bestämmes genom mätning av ljusemi- ssionen.

För screening är det inte nödvändigt att bestämma adenylatkinas- aktiviteten. I detta fall kan ADP reagens och CP reagens blandas och 504pl av blandningen tillsättas (steg 3 och 4 slås ihop till ett steg).

För att göra det möjligt att omräkna ökningshastigheten i ljus- emissionen beroende på ATP bildningen i kreatinkinasreaktionen till ökningshastighet i ATP koncentration kan bestämningarna *avslutas med tillsats av en känd ATP koncentration och den språngvisa ökningen av ljusemissionen uppmätas (inre standardmetodik). Eftersom analysen inte utförs med mättande ADP koncentration är det emellertid bättre att kalibrera bestämningarna genom att vid varje analystillfälle inkludera analys av en känd kreatinkinasstandard lämpligen i form av en torkad blodfläck på samma bärare som används för proverna och med tillsatt humant kreatinkinas. En standardkurva med sådana kreatin- kinasstandarder visas i figur 3.

Claims (5)

7, 7906066-1 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för bestämning av kreatinkinasaktivitet i ett prov genom mätning av en ljusemission som upp- kommer i närvaro av ett på eldflugeluciferas och D-luci- ferin baserat bioluminiscensreagens til1_följd av ATP- bildning efter tillsats av ADP och kreatinfosfat, k ä n n e- t e o k n a t a v, att provet, ifall detta innehåller endogent ATP av en sådan halt att en noggrann bestämning av kreatinkinasaktiviteten försvåras, först inkuberas med AMP för nedbrytning av merparten av detta endogena ATP och att ADP och kreatinfosfat därefter tillsättes.

2. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n e t e c k n a t a v, att provet inkuberas under cirka 15 minuter.

3. Förfarande enligt kravet 2, k ä n n e t e c k n a t a v, att inkuberingen sker vid 25°C.

4. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e- t e c k n a t a v, att man vid bestämningen även till- sätter en effektiv adenylatkinashämmare.

5. Förfarande enligt kravet 4, k ä n n e t e c k n a t a v, att adenylatkinashämmaren utgöres av diadenosinpenta- fosfat. 7906066-1 i 5 Figurtexter Fig. l Nedbrytning av ATP i närvaro av AMP (l,25 mM) i helblodsprov intorkat på papper. Efter nedbrytningen av ATP tillsattes ADP (20 PM) och diadenosinpentafosfat (DAPP; 0,2 pM) samt kreatin- fosfat (CP; 10 mM). Fig. 2 Hämning av adenylatkinasreaktionen med diadenosinpentafosfat (DAPP; 0,2)mH). Reaktionsbetingelser som i Fig. 1, men utan DAPP i försöket avbildat till vänster i figuren. Fig. 3 Korrelation mellan metoden enligt uppfinningen och spektrofoto- metrisk metod för kreatinkinasbestämningen. Kreatinkinasstandarder av intorkat helblod, vari kreatinkinasaktiviteten i serum bestämts spektrofotometriskt, analyserades med metoden enligt uppfinningen (reaktionsbetingelser som i figur 1).