DE2910414A1 - METHOD FOR MANUFACTURING POLYGLUTARALDEHYDE AND ITS USE - Google Patents

Description

California Institute of Technology,California Institute of Technology,

Eine Gesellschaft nach den Gesetzen des Staates Kalifornien,A company under the laws of the state of California,

"Pasadena, Kalifornien, Y.St.Ä."Pasadena, California, Y.St.Ä.

"Verfahren zur Herstellung von Polyglutaraldehayd und seine
Verwendung"."Process for the preparation of polyglutaraldehyde and its
Use".

beanspruchte Priorität: 17. März 1978, T. St .A., JJr. 887 825.Claimed Priority: March 17, 1978, T. St .A., JJr. 887 825.

Pie vorliegende Erfindung ist in Ausübung einer Arbeit unter MASA-Vertrag durchgeführt worden und unterliegt den Verordnungen des Paragraph 305 der National Aeronautics and Space Act von 1958, Public law 83-568 (72 Stat.'435; 42 USC 2457).The present invention was made in the exercise of a job under the MASA contract and is subject to the Regulations of Section 305 of the National Aeronautics and Space Act of 1958, Public law 83-568 (72 Stat'435; 42 USC 2457).

Hie Erfindung betrifft die Herstellung von Polyglutaraldehyd, die Überführung des Polymerisats in eine fluorescierende Form, die Bindung von Proteinen an das Polymerisat und die Verwendung der Polymerisat-Protein-Additionsprodukte für die biologische und chemische Forschung und Untersuchung.The invention relates to the production of polyglutaraldehyde, the conversion of the polymer into a fluorescent form, the binding of proteins to the polymer and the use of the polymer-protein addition products for biological and chemical research and investigation.

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Die Gewinnung und Charakterisierung von Zellmembranen und ihrer Bestandteile ist wesentlich für das Verständnis der Rolle, die Oberfläehenmenbranen hinsichtlich der Steuerung einer großen Anzahl von biologischen und immunologischen Wirkungen spielen. Die zu diesem Zweck angewendeten gegenwärtigen Techniken sind nicht voll befriedigend«The extraction and characterization of cell membranes and their components is essential to understanding the role they play Surface menebras with regard to the control of a large number play of biological and immunological effects. The current techniques used for this purpose are not completely satisfactory "

Die Kenntnis der Art, der Anzahl und der Verteilung von spezifisch wirkenden Rezeptoren auf Zelloberflächen ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlage, die derartigen biologischen Erscheinungen, wie eines Zellen-Zellen-Erkennens bei der Entwicklung, einer Zellenübertragung und -regulierung durch Hormone und chemische Überträger und von Unterschieden bei normalen und Tumorzelloberflächen zugrundeliegen. Bei früheren Bemühungen ist die Lokalisierung von Antigenen und Kohlehydratresten auf den Zelloberflächen, insbesondere bei roten Blutkörperchen und Lymphozyten, durch ein Binden von Antikörpern oder Lectinen (aus Pflanzen isolierte hämagglutinatierende Substanzen) an solche Makromoleküle, wie Ferritin (einem kristallisier baren Protein mit einem Gehalt von 20 bis 24 Prozent Eisen und 1,2 bis 2 Prozent Phosphor), Hämocyanin oder Peroxidase, die als Markierungsmittel für die Durchstrahlungselektronenmikroskopie gedient haben, bestimmt worden. Jedoch kann vorteilhaft bei der Elektronenmikroskopie mit hoher Rasterfeinheit die topographische Verteilung der molekularen Rezeptoren auf den Oberflächen von Zellen- und Gewebeproben in einfacher Weise durch gleiche histocheiaische Techniken unter Verwendung von kürzlich entwickelten, mittels der Elektronenmikroskopie mit hoher Rastei-The knowledge of the type, the number and the distribution of specifically acting receptors on cell surfaces is of central importance for the understanding of the molecular basis, the biological phenomena such as cell-cell recognition during development, cell transmission and regulation by hormones and chemical vectors and underlying differences in normal and tumor cell surfaces. In previous efforts is the localization of antigens and carbohydrate moieties on the cell surfaces, especially in red blood cells, and lymphocytes, by binding antibodies or lectins (isolated from plants hämagglutinatierende substances) to such macromolecules, such as ferritin (a Crystallizing cash protein with a content of 20 to 24 percent iron and 1.2 to 2 percent phosphorus), hemocyanin or peroxidase, which have served as marking agents for transmission electron microscopy, have been determined. However, the topographical distribution of the molecular receptors on the surfaces of cell and tissue samples can be advantageous in electron microscopy with a high raster resolution in a simple manner by the same histological techniques using recently developed, by means of electron microscopy with a high raster index.

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feinheit auflösbaren Markierungsmitteln bestimmt werden.fineness of dissolvable marking agents can be determined.

Seit kurzem sind im Handel erhältliche Polystyrollatex-Teilehen als immunologische Markierungsmittel zur Anwendung in der Elektronenmikroskopie mit hoher Rasterfeinheit verwendet worden. Die Oberfläche derartiger Polystyrol-Teilchen ist hydrophob, und deshalb werden bestimmte Arten von Makromolekülen, wie Antikörper, unter sorgfältig geregelten Bedingungen auf der Oberfläche absorbiert. Jedoch haften derartige Teilchen in unspezifischer Weise an zahlreichen Oberflächen und Molekülen, und dies begrenzt in schwerwiegender Weise ihre breite Anwendbarkeit.Polystyrene latex parts have recently become commercially available has been used as an immunological marker for application in electron microscopy with high screen fineness. The surface of such polystyrene particles is hydrophobic, and therefore certain types of macromolecules, such as antibodies, absorbed onto the surface under carefully controlled conditions. However, such particles adhere unspecifically Manner on numerous surfaces and molecules, and this severely limits their broad applicability.

■Die Herstellung von kleinen stabilen kugelförmigen Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat-Teilchen? die biologisch verträglich sind, d.h. nicht in unspezifischer Weise mit Zellen oder anderen biologischen Komponenten reagieren, und die funktioneile Gruppen enthalten, an die besondere Proteine und andere biochemische Moleküle kovalent gebunden werden können, ist in der US-PS 3 957 741 beschrieben.■ The production of small, stable, spherical methacrylic acid-hydroxyethyl ester-acrylamide copolymer particles? which are biologically compatible, i.e. do not react in an unspecific manner with cells or other biological components, and which contain functional groups to which special proteins and other biochemical molecules can be covalently bound, is described in U.S. Patent 3,957,741.

Kleinere und noch gleichmäßiger geformte Mikrokügelchen aus Acry!polymerisaten sind in der US-PS 4 138 383 beschrieben. Mikrokügelchen, die eine von Zellmembranen unterschiedliche Dichte aufweisen, sind in der US-PS 4 035 316 offenbart, und fluorescierende Mikrokügelchen auf Basis eines Acrylmischpolyraerisats sind in der am 27. August 1976 hinterlegten US-Patentanmeldung Nr. 718 104 vorgeschlagen worden.Smaller and even more uniformly shaped microspheres made from acrylic polymers are described in US Pat. No. 4,138,383. Microspheres having a density different from that of cell membranes are disclosed in U.S. Patent 4,035,316 and US Pat fluorescent microspheres based on an acrylic copolymer are in U.S. patent application filed Aug. 27, 1976 No. 718 104 has been proposed.

Hydroxlgruppen können durch Bromeyan aktiviert werden, um Proteine und andere chemische Verbindungen mit Aminogruppen an Po-Hydroxl groups can be activated by Bromeyan to make proteins and other chemical compounds with amino groups on Po-

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lymerisatperlehen kovalent zu binden. Methacrylsäurereste, die den Teilchen eine negative ladung verleihen, dürften wahrscheinlich eine unspezifische Bindung an Zelloberflächen verhindern und Carboxylgruppen liefern, an die eine "Vielzahl von biochemischen Molekülen unter Anwendung der Carbodiimid-Methode kovalent gebunden werden können. . " "Lymerisatperlehen to bind covalently. Methacrylic acid residues, which give the particles a negative charge, are likely prevent non-specific binding to cell surfaces and provide carboxyl groups to which a "variety of biochemical Molecules covalently using the carbodiimide method can be bound. . ""

Die Derivatisierungsarbeitsweise ist in unnötiger Weise kompliziert und erfordert eine zusätzliche Stufe, um die Perlchenoberfläche für eine kovalente Bindung an Proteine, wie Antikörper, Lectine und dergleichen, oder an andere Moleküle, wie Desoxyribonucleinsäure, Hormone und dergleichen, herzustellen. Aus diesem Grunde ist das Derivatisierungsverfahren von Mikrokügelchen auf Basis von Acrylpolymerisaten langwierig und hinsichtlieh seiner Anwendbarkeit begrenzt. Monomerer Glutaraldehyd ist als biochemisches Reagens zur kovalenten Bindung von Proteinen, wie Immunglobulinen, an !ferrit in~Polymerisatmikrokügelchen und an andere kleine Teilchen verwendet worden, die dann zur topographischen Darstellung von Rezeptoren auf Zellmembranen angewendet wurden» Der Reaktionsmechanismus von Proteinen mit Glutaraldehyd läßt sich nur schwierig feststellen, da seine Struktur noch unk3.ar ist und man berichtet hat, daß sie mit cyclischen und hydratisierten Formen im Gleichgewicht steht. Die Reaktion ist nichtleicht durchzuführen und liefert häufig unbe'friedigende Ergebnisse, The derivatization procedure is unnecessarily complicated and requires an additional step to allow the bead surface to be covalently bonded to proteins, such as antibodies, Lectins and the like, or to other molecules such as deoxyribonucleic acid, Hormones and the like. It is for this reason that the method of derivatizing microspheres is based on acrylic polymers lengthy and limited in terms of its applicability. Monomeric glutaraldehyde is as biochemical reagent for covalent attachment of proteins, such as Immunoglobulins, to ferrite in polymer microspheres and to others small particles have been used, which are then applied to the topographical representation of receptors on cell membranes "The reaction mechanism of proteins with glutaraldehyde is difficult to determine because its structure is still unclear and has been reported to be cyclic and hydrated Forms is in balance. The reaction is not easy to be carried out and often gives unsatisfactory results,

Die Erfindung befaßt sich nun mit der unmittelbaren Bindung von Proteinen an Polyglutaraldehyd. Im Gegensatz zu monomerem GIutaraldehyd enthält das Polymerisat konjugierte Aldehydgruppen*The invention is now concerned with the direct binding of proteins to polyglutaraldehyde. In contrast to monomeric glutaraldehyde the polymer contains conjugated aldehyde groups *

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Dies gewährleistet die Bildung stabiler Schiff^!scher Basen, die sich nach der Reaktion mit Proteinen bilden, und weiterhin wird, da der hydrophile Polyglutaraldehyd verhältnismäßig lange Ketten aufweist, die sich von der Oberfläche in das umgebende wäßrige Medium erstrecken, die heterogene Reaktion mit Protein erleichtert, This ensures the formation of a more stable ship ^! shear bases which form after reaction with proteins, and further, since the hydrophilic polyglutaraldehyde has relatively long chains which extend from the surface into the surrounding aqueous medium, the heterogeneous reaction with protein is facilitated,

Polyglutaraldehyd kann in einer lösung hergestellt werden, die zum Gießen von Pollen oder Filmen oder zum Überziehen von Oberflächen von Substraten, wie Polymerisat-Mikrokügelchen, insbesondere mit Amino- oder Hydrazidgruppen substituierte Perlchen, geeignet ist. - Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen können unmittelbar durch Suspensionspolymerisation in Gegenwart einer grenzflächenaktiven Verbindung oder durch Ausfällen aus einer eine grenzflächenaktive Verbindung enthaltenden lösung hergestellt werden« Polyglutaraldehyd kann in fluorescierendes Polymerisat durch Umsetzung mit nicht-fluorescierenden Verbindungen, wie m-Aminophenol, umgewandelt werden. Des weiteren kann man magnetische, eine hohe Dichte oder eine hohe· Elektronendichte aufweisende Mikrokügelchen durch Überziehen von Iletalltelichen oder durch Suspensionspolymerisation von Glutaraldehyd in Gegenwart einer Suspension von feinteiligen Metallen oder Metalloxiden herstellen. Höhere Ausbeuten und höhere Molekulargewichte kann man durch Verwendung eines Gemisches von Wasser mit stark polaren Lösungsmitteln erhalten.Polyglutaraldehyde can be produced in a solution that is used for pouring pollen or films or for coating surfaces of substrates such as polymer microspheres, in particular pearls substituted with amino or hydrazide groups, suitable is. - Polyglutaraldehyde microspheres can be used directly by suspension polymerization in the presence of a surface-active compound or by precipitation from a surface-active compound Compound-containing solution can be produced «Polyglutaraldehyde can be converted into fluorescent polymer with non-fluorescent compounds such as m-aminophenol. Furthermore, one can use magnetic, high density or high electron density microspheres by coating metal parts or by suspension polymerisation of glutaraldehyde in the presence of a suspension of finely divided metals or metal oxides. Higher yields and higher molecular weights can be achieved by using a mixture of water with strongly polar solvents obtain.

Diese und zahlreiche andere Vorteile der· vorliegenden Erfindung werden nachstehend zum besseren Verständnis näher erläutert, wobei die Zeichnung mit heranzuziehen ist,These and numerous other advantages of the present invention are explained in more detail below for a better understanding, whereby the drawing is to be used,

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JtT-JtT-

Fig. 1 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von 60 mg Polyglutaraldehyd mit 4,5 mg menschlichen Immunglobulin G- (IgG-) in 50 ml phosphatgepufferter llatriumehloridlösung bei 22°G:Fig. 1 shows the rate of reaction of 60 mg of polyglutaraldehyde with 4.5 mg human immunoglobulin G- (IgG-) in 50 ml Phosphate buffered sodium chloride solution at 22 ° G:

β pH 6,β pH 6,

ο pH 7,4-.ο pH 7.4-.

Pig. 2 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Perlchen eines Vinylpyridin-Acrylamid-hydrazid-Mischpolymerisats (im folgenden als "Poly-VP-AU-hydrazid" bezeichnet) mit-fluorescierendem menschlichen IgG bei 22⁰C und pH 7,4:Pig. 2 shows the reaction rate of beads of a vinylpyridine-acrylamide-hydrazide copolymer (hereinafter referred to as "poly-VP-AU-hydrazide") with fluorescent human IgG at 22 ^° C. and pH 7.4:

• an Poly-YP-AM-hydrasid gebundener Polyglutaraldehyd, ο an Poly-VP-AM-hydrazid gebundener Ivlonoglutaraldehyd, χ Perlenen aus Poly-YP-AM-hydx-azid (Vergleich), £ ' IgG in phosphatgepufferter Batriurachloridlösung (Vergleich).• Polyglutaraldehyde bound to poly-YP-AM hydrasid, ο Ivlonoglutaraldehyde bound to poly-VP-AM hydrazide, χ pearls made of poly-YP-AM-hydx-azide (comparison), £ 'IgG in phosphate-buffered batriurachloride solution (Comparison).

Pig. 3 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Poly-VP-AM-hydrazid-Perlchen mit fluorescierendem menschlichen IgG- bei 4 CiPig. Figure 3 shows the rate of reaction of poly-VP-AM hydrazide beads with fluorescent human IgG- at 4 Ci

• an Poly~VP-AM-hydrazid gebundener Polyglutaraldehyd, ο an Poly-VP-AM-hydrazid gebundener Monoglutax^aldehyd, χ Perlchen üms Poly-VP-AM-hydx-asid (Vergleich), £ IgG in phosphatgepuffex-ter Ifatriumchloridlösung (Vergleich)„• Polyglutaraldehyde bound to poly-VP-AM-hydrazide, ο monoglutaraldehyde bound to poly-VP-AM-hydrazide, χ pearls over poly-VP-AM-hydrazide (comparison), £ IgG in phosphate-buffered i-sodium chloride solution ( Comparison)"

Pig. 4 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Poly-VP-AM-hydrazid-Perlchen mit fluoresciex^%endem antimenschlichen Ziegen-Immunglobulin M bei 4°C und pH 7,4: -Pig. 4 shows the reaction rate of poly-VP-AM-hydrazide ^{beads with fluoresciex%} endemic anti-human goat immunoglobulin M at 4 ° C and pH 7.4: -

ο an Poly-VP-AM-hydrazid gebundener Polyglutaraldehyd, Δ an Poly-yp-AM-hydrasid gebundener Monoglutaraldehyd, χ Perlchen aus Poly-VP-AM-hydrazid (Vergleich).ο polyglutaraldehyde bound to poly-VP-AM hydrazide, Δ monoglutaraldehyde bound to poly-yp-AM hydrazide, χ Poly-VP-AM-hydrazide beads (comparison).

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■ !ig. 5 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von 1.00 mg Polyglutaraldehyd in 50 ml phosphatgepufferter Jatriumchloridlösung mit 7,5 mg Hämoglobin bei 22⁰C als Funktion des pH-Yiertes; ο pH 6,■! Ig. 5 shows the reaction rate of 1.00 mg polyglutaraldehyde in 50 ml phosphate buffered Jatriumchloridlösung with 7.5 mg hemoglobin at 22 ⁰ C as a function of pH Yiertes; ο pH 6,

h PH 7,4, h pH 7.4,

χ pH 8,4, . ■ ·χ pH 8.4,. ■ ·

• Perlchen aus einem Methacrylsäure—hydroxyäthylester—• Pearls from a methacrylic acid — hydroxyethyl ester—

Acrylamid-Mischpolymerisat bei pH 6 (Vergleich). Eig. 6 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit von Perlchen eines Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat mit Hämoglobin bei pH 6 und 22⁰C:Acrylamide copolymer at pH 6 (comparison). Prop. 6 shows the reaction rate of beads of a methacrylic acid-hydroxyethyl ester-acrylamide copolymer with hemoglobin at pH 6 and 22 ⁰ C:

ο an die Perlchen gebundener Polyglutaraldehyd, & an die Perlchen gebundener Monoglutaraldehyd, Φ -Perlchen (Vergleich),ο polyglutaraldehyde bound to the pearls, & monoglutaraldehyde bound to the pearls, Φ pearls (comparison),

Pig. 7 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkung der Konzentration einer grenzflächenaktiven Verbindung auf den Dur damesser der Mikrokügelchen (10 Gewichtsprozent G-lutaraldehyd, pH 11). Fig. 8 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkung des pH-Wertes auf den Durchmesser der Mikrokügelchen.(10 Gewichtsprozent GIutaraldehyd, 1 Gewichtsprozent grenzflächenaktive Verbindung). 3?ig. 9 zeigt in graphischer Darstellung die Wirkung der Konzentration des Glutaraldehyds auf den Durchmesser der Mikrokügelchen (1 Gewichtsprozent grenzflächenaktive Verbindung, pH 11),Pig. 7 graphically shows the effect of concentration a surface-active compound down to the size of the microspheres (10 weight percent G-lutaraldehyde, pH 11). Fig. 8 graphically shows the effect of pH on the diameter of the microspheres. (10 weight percent glutaraldehyde, 1 percent by weight surfactant compound). 3? Ig. 9 shows the effect of concentration in a graph of glutaraldehyde to the diameter of the microspheres (1 percent by weight surface-active compound, pH 11),

Nachstehend wird die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen näher beschrieben. The invention is described in more detail below on the basis of preferred embodiments.

Polyglutaraldehyd wird aus einer wäßrigen Lösung, die 5 bis 50 Gewichtsprozent monomeren Glutaraldehyd enthält, durch ErhöhungPolyglutaraldehyde is made from an aqueous solution containing 5 to 50 Contains percent by weight of monomeric glutaraldehyde, by increasing

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des pH-Wertes der lösung auf Werte oberhalb 7> "vorzugsweise auf Werte von 9 Ms 12, hergestellt. In Abwesenheit eines Katalysators verläuft die Reaktion spontan exotherm. Pur die Anfangszeit der Polymerisation von 30 bis 180 Minuten wird die Lösung vorzugsweise auf eine Temperatur von 15 bis 30⁰C gekühlt und dann bis zur Beendigung der Polymerisation auf eine Temperatur oberhalb 40⁰C erwärmt. Man nimmt an, daß das Polymerisat die nachstehende sich wiederholende Einheit aufweistithe pH of the solution to values above 7>", preferably to values of 9 Ms 12. In the absence of a catalyst, the reaction is spontaneously exothermic Cooled from 15 to 30 ^° C. and then heated until the end of the polymerization to a temperature above 40 ^° C. It is assumed that the polymer has the following repeating unit: i

- CH₀ - CH₀ - CH = C-- CH ₀ - CH ₀ - CH = C-

CHOCHO

Eine Analyse aufgrund des UV- oder IR-Spektrums bestätigt das Yorliegen von konjugierten funlctionellen Aldehydgruppen im Polymez'isat, die.mit Aminogruppen-enthaltenden Molekülen, wie Proteinen, stabilere Bindungen bilden,An analysis based on the UV or IR spectrum confirms the problem of conjugated functional aldehyde groups in the polymer, die.mit molecules containing amino groups, such as proteins, form more stable bonds,

Wenn das wäßrige Medium mindestens 80 Prozent Wasser enthält, fällt das Polymerisat aus und kann abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet werden» Ein weiteres Waschen mit Lösungsmitteln, wie Aceton, scheint die Ausbeute ssu verringern* Das-Polymerisat kann in polaren Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, oder Tetrahydrofuran, und insbesondere in stark polaren Lösungsmitteln, wie Biiaethylsulf oxid oder Dimethylformamid., wieder gelöst werden. "Die Lösungspolymerisation, in Gemischen von Wasser und polaren Lösungsmitteln, die 20 bis 80 Prozent Lösungsmittel enthalten, liefern höhere Ausbeuten an Polymerisat. Die.Lösung kann zum Gießen von Folien oder 3?ilmen oder zum Überziehen von Subotraten dienen. Das Polymerisat kann aus der Lösung ausgefällt v.c:eden, Inder:: nan den Y/assergehalt auf über 80 Prozent If the aqueous medium contains at least 80 percent water, the polymer precipitates and can be filtered off, washed with water and dried. Further washing with solvents such as acetone appears to reduce the yield * The polymer can be used in polar solvents such as methanol , Ethanol, or tetrahydrofuran, and especially in strongly polar solvents such as Biiaethylsulf oxide or dimethylformamide., Are redissolved. "Solution polymerization, in mixtures of water and polar solvents containing 20 to 80 percent solvent, delivers higher yields of polymer. The solution can be used to cast films or films or to coat subotrates. The polymer can be made from Solution precipitated vc: eden, Indder :: nan the Y / water content to over 80 percent

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erhöht und dann die Teilchen gewinnt. * .increases and then the particle wins. *.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.

Beispiel 1example 1

Im Handel erhältliche wäßrige Lösungen von Glutaraldehyd werden mittels Aktivkohle gereinigt. Sie sind dann frei von Polymerisaten, wie die Abwesenheit der Absorptionsbande bei 235 nm zeigt, gemessen mittels eines Spektrophotometers "Cary 14". Eine 25-prozentige Lösung von G-lutaraldehyd wird bei 22⁰G durch Einstellen des pH-Wertes auf 11',5 mittels Natriumhydroxid polymerisiert. Fach 120 Minuten wird das Reaktionsgemisch 8 Stunden "bei 5O⁰C gerührt. Das ausgefallene polymerisat wird abfiltriert, mit Wasser und anschließend mit Aceton gewaschen und dann unter vermindertem Druck 24 Stunden getrocknet. Ausbeute: 60 Prozent. Der molare Extxnktionskoeffxzient βρ⁷5 ^ⁿ Äthanol) ist 1,53 x 10Commercially available aqueous solutions of glutaraldehyde are purified using activated charcoal. They are then free of polymers, as shown by the absence of the absorption band at 235 nm, measured by means of a "Cary 14" spectrophotometer. A 25 percent solution of G-lutaraldehyd is polymerized at 22 ⁰ G by adjusting the pH to 11 '5 by means of sodium hydroxide. Compartment 120 minutes the reaction mixture stirred 8 hours "at 5O ⁰ C. The precipitated polymer is filtered off, washed with water and then washed with acetone and then under reduced pressure for 24 hours dried. Yield:. 60 percent of the molar Extxnktionskoeffxzient βρ ⁷ 5 ^ ^n. Ethanol) is 1.53 x 10

— 1 —1
Liter χ Mol χ cm . Der molare Extinktionskoeffizient von GIutaraldehyd bei 280 nm (extrahiert aus wäßrigen Lösungen mit Äther und über Magnesiumperchlorat getrocknet) ist £ pgc ~ ^'^ -^ it er χ- 1 - 1
Liter χ mole χ cm. The molar extinction coefficient of glutaraldehyde at 280 nm (extracted from aqueous solutions with ether and dried over magnesium perchlorate) is £ pgc ~ ^ '^ - ^ it er χ

—1 —1—1 —1

Mol χ cm . Der Polyglutaraldehyd ist löslich in Dimethylsulfoxid und weist ein durchschnittliches Molekulargewicht von annähernd 20 000, das mittels Gel-Permeations-Ohromatographie bestimmt worden ist, auf.Mol χ cm. The polyglutaraldehyde is soluble in dimethyl sulfoxide and has an average molecular weight of approximately 20,000 as determined by gel permeation chromatography has been on.

Beispiel 2Example 2

Das Verfahren des Beispiels 1 wird in einem Gemisch von Wasser und Dirnethylsulfoxid im Verhältnis 1:1 wiederholt. Das Polymerisat bleibt in Lösung,The procedure of Example 1 is carried out in a mixture of water and dimethyl sulfoxide in a ratio of 1: 1 repeated. The polymer remains in solution,

Polyglutaraldehyd zeigt eine geringe iTuorescenz. Jedoch liefertPolyglutaraldehyde shows little iTuorescenz. However, it delivers

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-yf- ^η^ 29104U -yf- ^η ^ 29104U

die Umsetziing von Polyglutaraldehyd mit bestimmten Verbindungen, die selbst nicht fluorescierend sind, ein fluorescierendes Polymerisat durch Bildung von fluorescierenden Chromophoren, die an das Polymerisat gebunden sind. So reagiert Anthron mit AcröleinEinheiten unter Bildung eines Benzanthron-Fluorogens und m-Amino-phenol mit Acrolein-Einheiten unter Bildung des Fluorogens 7-Hydroxy-chinolin,. Aminofluorescin reagiert ebenfalls mit Polyglutaraldehyd unter Bildung eines fluorescierenden Polymerisats« the conversion of polyglutaraldehyde with certain compounds, which are not themselves fluorescent, a fluorescent polymer by the formation of fluorescing chromophores which are bound to the polymer. This is how anthrone reacts with acroleic units with formation of a benzanthrone fluorogen and m-aminophenol with acrolein units to form the fluorogen 7-hydroxy-quinoline ,. Aminofluorescin also reacts with Polyglutaraldehyde with formation of a fluorescent polymer "

Beispiel 3 ■ , Example 3 ■,

50 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen Polyglutaraldehyds werden in 10 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Dann fügt man 20 mg · m-Aminophenol und einen (Eropfen 10-n Chlorwasserstoff säure hinzu und erwärmt die lösung 60 Minuten auf 50 C, Die lösung fluoresciert stark, wenn sie mit einer UY-Lichtlampe bestrahlt wird. Durch Zusatz von Wasser fällt das Polymerisat aus, das mit Yvasser gewaschen und dann getrocknet wird. Das isolierte Polymerisat wird wieder in Dimethylsulfoxid gelöst und hinsichtlich der Pluorescenz untersucht. Man beobachtet ein stark fluorescierendes Polymerisat mit einem ITuoreseenz-Eralssionsmaximum-bei 470 bis 480 nm,50 mg of the polyglutaraldehyde obtained according to Example 1 are in 10 ml of dimethyl sulfoxide dissolved. Then 20 mg · m-aminophenol is added and a (drop of 10-N hydrochloric acid and heat the solution at 50 C for 60 minutes. The solution fluoresces strongly when it is irradiated with a UY light lamp. By adding water the polymer precipitates, which is washed with Yvasser and then is dried. The isolated polymer is again dissolved in dimethyl sulfoxide solved and examined with regard to the fluorescence. A strongly fluorescing polymer is observed with a ITuorescence - eralssion maximum - at 470 to 480 nm,

Beispiel 4Example 4

Etwa 0,1 g des nach Beispiel 1 hergestellten festen Polymerisats werden in 0,5-n rlatriumbicarbonat-Lösung suspendiert und mit einer wäßrigen Lösung von 2 mg. 9—Amino—acridin—hydrochlorid bei Raumtemperatur versetzt. Nach erschöpfendem Y/aschen mit 7/asser zeigen die Polyglutaraldehydteilchen unter einer geeigneten UY-Licht-Strahlenquelle eine intensive Fluorescenz. Nach mehrerenAbout 0.1 g of the solid polymer prepared according to Example 1 are suspended in 0.5 N sodium bicarbonate solution and mixed with an aqueous solution of 2 mg. 9 — Amino-acridine hydrochloride Room temperature. After exhausting Y / ashing with 7 / water, the polyglutaraldehyde particles show up under a suitable UY light source an intense fluorescence. After Several

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anschließenden V/aschungen nimmt die Fluorescenzintensität nicht ab.subsequent washing does not decrease the fluorescence intensity away.

Lösungen von Polyglutaraldehyd in stark polaren Lösungsmitteln, die im allgemeinen 0,1 bis 5 Gewichtsprozent Polyglutaraldehyd enthalten, können zu durchsichtigen Filmen oder Überzügen unterschiedlicher Dicken, gewöhnlich 0,0025 bis'0,125 mm, gegossen werden, indem man die Lösung auf die Oberfläche aufbringt und die Lösungsmittel aus dem Film oder dem Überzug verdunsten läßt. Die Oberflächen können eine planare, teilchenförmige, kugelförmige oder stabellenförmige Gestalt haben und aus anorganischen oder organischen Substanzen bestehen. Die anorganische Substanz kann ein Metall oder eine Metallverbindung, insbesondere eine magnetisierbar Substanz, wie Eisen, Nickel oder Kobalt, oder deren Oxide, wie Magnetit, ferner keramische oder Glaskügelchen oder dergleichen sein. Organische Substanzen sind gewöhnlich kleine Polymerisatkügelchen, wie die bereits vorstehend erwähnten Perlchen aus einem Methacrylsäure-hydroxyäthyle'ster-Acrylamid-Mischpolymerisat. Solutions of polyglutaraldehyde in strongly polar solvents, generally 0.1 to 5 percent by weight polyglutaraldehyde may be cast into clear films or coatings of varying thicknesses, usually 0.0025 to 0.125 mm by applying the solution to the surface and allowing the solvents to evaporate from the film or coating. The surfaces can be planar, particulate, spherical or bar-shaped and made of inorganic or organic substances. The inorganic substance can be a metal or a metal compound, in particular a magnetizable substance, such as iron, nickel or cobalt, or their oxides, such as magnetite, furthermore ceramic or glass beads or the like. Organic substances are usually small polymer beads like those already mentioned above Pearls made from a methacrylic acid-hydroxyäthyle'ster-acrylamide copolymer.

Die Überzüge aus Polyglutaraldehyd können kovalent an Substratoberflächen gekuppelt werden, die Aminogruppen enthalten, wie mit Aiainosilanverbindungen modifizierte Glaskügelchen, beispielsweise Kügelchen aus mit Trimethoxy-isopropylamino-silan vernetzten Acrylamid-Homopolymerisaten oder -Mischpolymerisaten. Die Kügelchen sind vorzugsweise sehr klein, nämlich 20 nm bis 100 um, imkllgemeinen 50 nm bis 10 pm, so daß die spezifischen Rezeptorstellen an einer Zellenoberfläche markiert werden können. Perlchen oder Kügelchen 'aus Vinylpyridin- oder Methacrylsäure-hydmxy-The polyglutaraldehyde coatings can be covalently applied to substrate surfaces which contain amino groups, such as glass beads modified with alainosilane compounds, for example Beads made from cross-linked with trimethoxy-isopropylamino-silane Acrylamide homopolymers or copolymers. The beads are preferably very small, namely 20 nm to 100 µm, generally 50 nm to 10 pm, so that the specific receptor sites can be marked on a cell surface. Pearls or beads' made of vinylpyridine or methacrylic acid-hydmxy-

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" BAD ORfGiHAL ""BAD ORfGiHAL"

äthylester-Acrylamid-Mischpolymerisaten sind in der US-PS 3 957 beschrieben und auch in der am 22. März 1977 hinterlegten US-Patentanmeldung ITr, 780 007 vorgeschlagen worden, auf deren Inhalte Bezug genommen wird. Die Mischpolymerisat-Perlchen oder -Kügelchen enthalten im allgemeinen mindestens 50 Prozent Vinylpyridin (YP), 5 bis 35 Prozent Acrylamid (AM) und 0,1 bis 30 Prozent eines damit mischpolymerisierbaren Vernetzungsmittels, wie Bis-(acrylamid) (BAM).Ethyl ester-acrylamide copolymers are described in US Pat. No. 3,957 and has also been proposed in US patent application ITr, 780 007, filed March 22, 1977, on the contents thereof Is referred to. The interpolymer beads or spheres generally contain at least 50 percent vinyl pyridine (YP), 5 to 35 percent acrylamide (AM), and 0.1 to 30 percent one crosslinking agents that are copolymerizable therewith, such as bis (acrylamide) (BAM).

Die Haftfähigkeit von Polyglutaraldehydüberzügen an die Perlchen oder Kügelclien viird weiterhin durch Umwandlung der Aminogruppen in Hydrazidgruppen gesteigert. Die Modifikation kann durch eine Umsetzung mit einem Überschuß von Hydrazin-hydrat bei einer Temperatur von mindestens 40⁰C mit anschließendem Abtrennen und Waschen bewirkt werden.The adhesion of polyglutaraldehyde coatings to the pearls or spherules is further increased by converting the amino groups into hydrazide groups. The modification can be brought about by a reaction with an excess of hydrazine hydrate at a temperature of at least 40 ^° C. with subsequent separation and washing.

Beispiels.Example.

Es wird eine 0,1-prozentige Lösung von Polyglutaraldehyd in tetrahydrofuran auf ein G-Ia s subs trat gesprüht. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhält man einen durchsichtigen I⁵IIm, der fest an die Glasoberfläche gebunden ist.A 0.1 percent solution of polyglutaraldehyde in tetrahydrofuran is sprayed onto a G-Ia s subs step. After the solvent has evaporated, a transparent I ⁵ IIm is obtained, which is firmly bonded to the glass surface.

Beispiel 6Example 6

100 mg abzentrifugierte 5 feuchte Vinylpyridin-Acrylamid-Mischpolymerisat-Kügelchen, die einen Gehalt von 20 Prozent Acrylamid und von 20 Prozent Bis-(acrylamid) aufweisen und einen Durchmesser von 0,7 um haben, werden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit 10 ml Hydrazin-hydrat verrührt und dann 120 Minuten unter Rühren auf 120⁰G erwärmt. Die Mikrokügelchen werden dann mit Wasser gewaschen. Wenn sie mit 2,4,6-ΪΎχηχΐχ-ο-^εηΕθΐ3^ίοη8Μυτβ geprüft werden,100 mg of centrifuged 5 moist vinylpyridine-acrylamide copolymer beads, which contain 20 percent acrylamide and 20 percent bis (acrylamide) and have a diameter of 0.7 μm, are mixed with 10 ml of hydrazine for 4 hours at room temperature. hydrate stirred and then heated ^{to 120 0} G with stirring for 120 minutes. The microspheres are then washed with water. If tested with 2,4,6-ΪΎχηχΐχ-ο- ^ εηΕθΐ3 ^ ίοη8Μυτβ,

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liefern sie ein gefärbtes Produkt, das Hydrazidgruppen anzeigt. Dieses Hydrazidgruppen aufweisende Mischpolymerisat wird im folgenden als "Poly-YP-AM-hydrizid" bezeichnet.they provide a colored product that indicates hydrazide groups. This copolymer containing hydrazide groups is described below referred to as "poly-YP-AM-hydricide".

Beispiel 7Example 7

Die Poly-VP-AM-hydrazid-Mikrokügelchen' nach Beispiel 6 werden mit Polyglutaraldehyd eingekapselt, indem man eine 10 ml-Suspension (25 mg/cm ) der Mikrokügelchen 240 Minuten bei Raumtemperatur mit Polyglutaraldehyd verrührt, der wie in Beispiel 1 in Dirnethylsulfoxid (25 mg in 50 ml) hergestellt worden ist. Fach 'dem Abzentrifugieren und nach gründlichem Waschen mit Dimethylsulfoxid und Wasser wird das Vorliegen von Aldehydgruppen an der "Oberfläche durch Prüfen mit Puchsin-Schiff'schem-Testreagens bestätigt.The poly-VP-AM hydrazide microspheres of Example 6 are with Polyglutaraldehyde encapsulated by making a 10 ml suspension (25 mg / cm) of the microspheres stirred for 240 minutes at room temperature with polyglutaraldehyde which, as in Example 1, was dissolved in diethyl sulfoxide (25 mg in 50 ml). Compartment 'to centrifugation and after thorough washing with dimethyl sulfoxide and Water, the presence of aldehyde groups on the "surface is confirmed by testing with Puchsin-Schiff'schem test reagent.

Die mit Polyglutaraldehyd überzogenen Mikrokügelchen sind für klinische, diagnostische Untersuchungen, die Affinitäts-Chromatographie, die Ixnmoblisierung von Enzymen, die chemische Abtrennung und Entfernung von Harnstoff und allgemein für Anwendungsgebiete anwendbar, wo eine Bindung an Aminogruppen enthaltende Verbindungen nützlich ist. Es sind zahlreiche Anwendungsgebiete in der Biochemie, der Biologie und in der klinischen Chemie aufgefunden worden.The microspheres coated with polyglutaraldehyde are suitable for clinical, diagnostic investigations, affinity chromatography, the mobilization of enzymes, the chemical separation and removal of urea and generally applicable to areas of application where a bond to amino groups Connections is useful. There are numerous areas of application found in biochemistry, biology and clinical chemistry been.

Die Reaktionsfähigkeit von Polyglutaraldehyd mit niedermolekularen Aminen wird an einem einphasigen (homogenen) System und an einem zweiphasigen (heterogenen) System untersucht. Homogene Reaktionen werden ' bei verhältnismäßig niedriger Temperatur durchgeführt, beispielsweise wird Polyglutaraldehyd mit Methylamin in flüssigem wasserfreien Ammoniak 60 Minuten bei etwa -40°C reagie- !•en gelassen, !fach dem Ansteigen der Temperatur und nach dem 7in-The reactivity of polyglutaraldehyde with low molecular weight Amines is investigated on a single-phase (homogeneous) system and on a two-phase (heterogeneous) system. Homogeneous reactions are 'carried out at a relatively low temperature, for example, polyglutaraldehyde with methylamine in liquid anhydrous ammonia for 60 minutes at about -40 ° C ! • s left,! Times the rise in temperature and after 7in-

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-X--X-

dampfen zur Trockne werden die Produkte mit Wasser gewaschen und bei 6O⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Man analysiert die Produkte spektrometrisch und bestimmt ihren Stickstoffgehalt. Das Polymerisat ist bei Raumtemperatur auch in höhersiedenden Aminen, wie Allylamin, Butylamin, iithano'lamin, Hydrazin und Äthylendiarain, löslich. Die Umsetzung mit diesen Aminen wird 60 Minuten bei 22°C durchgeführt. Die Analyse erfolgt in gleicher We ise wie Im Falle der Umsetzungen bei niedriger Temperatur«evaporate to dryness, the products are washed with water and ^{dried at 6O 0} C under reduced pressure. The products are analyzed spectrometrically and their nitrogen content is determined. The polymer is also soluble in higher-boiling amines, such as allylamine, butylamine, iithano'lamine, hydrazine and ethylenediarain, at room temperature. The reaction with these amines is carried out at 22 ° C. for 60 minutes. The analysis is carried out in the same way as in the case of the reactions at low temperature «

Die heterogene Reaktion wird in der ?/eise durchgeführt, daß man 120 mg des Polymerisats in 20 ml einer phosphatgepufferten latriumchloridlösung mit einem Gehalt von 1 g des Amins bei einem pH-Wert von 7,3 bis 7,4 suspendiert und die Suspension mindestens 30 Stunden in einem geschlossenen Behältnis rührt, Fach dem Waschen mit Y/asser und nach dem Trocknen wird der Stickstoffgehalt des Produkts bestimmt. In der nachstehenden Tabelle I sind die Ergebnisse der Elementaranalyse der hergestellten Produkte angegeben.The heterogeneous reaction is carried out by adding 120 mg of the polymer to 20 ml of a phosphate-buffered sodium chloride solution suspended with a content of 1 g of the amine at a pH of 7.3 to 7.4 and the suspension for at least 30 hours Stir in a closed container, wash compartment with Y / ater and after drying check the nitrogen content of the product certainly. The results of the elemental analysis of the products produced are given in Table I below.

Tabelle I.
Stickstoffvierte von Polyglutaraldehyd-lmin-Reaktionsprodulrten.Table I.
Nitrogen fourth of polyglutaraldehyde-imine reaction products.

AminAmine homogenehomogeneous Reaktionreaction heterogeneheterogeneous Reaktionreaction foE ber. foE ber. ^C0 gef. ^C 0 found . <f°E ber. <f ° E ber. °/οΈ gef. ° / οΈ found MethylaminMethylamine 38,138.1 5,65.6 HydrazinHydrazine 47,447.4 14,014.0 Ammoniakammonia 16,816.8 2,92.9 AllylaiiiinAllylaiiiin 48,648.6 5,65.6 ButylaminButylamine 63,163.1 6,56.5 Ithanolamin 'Ethanolamine ' 44,644.6 5,05.0 5,35.3 0,60.6 DiaminoheptanDiamino heptane 31,931.9 4,64.6 3,53.5 0,50.5 Hydroxylamin 'Hydroxylamine ' 52,152.1 7,57.5 GlycinGlycine 8,98.9 0,90.9

Durchschnittswert von 2 Bestimmungen;Average of 2 determinations;

Hydroxylaiuin-HGl wird bei pH 7,3 und- 7,4 verwendet; derHydroxylaiuin-HG1 is used at pH 7.3 and 7.4; the

y
Stickstoffgehalty
Nitrogen content

Prozent«Percent"

QZQZ

Die theoretische Menge Stickstoff wird aufgrund der Vermutung berechnet ^ daß jede Einheit -CH₂-CH₂-CH=C(GHO)- ein Molekül Amin bindet. Die spektrophotometrische Untersuchung zeigt, daß bei den meisten Produkten das der Aldehydgruppe zugeschriebene Absorptionsmaximum bei 285 um erheblich reduziert worden ist. Aufgrund der Ergebnisse mit Hydroxylamin enthält der Polyglutaraldehyd eine Aldehydgruppe je Molekulargewicht von 160.The theoretical amount of nitrogen is calculated on the assumption that every unit -CH ₂ -CH ₂ -CH = C (GHO) - binds one molecule of amine. The spectrophotometric investigation shows that for most of the products the absorption maximum ascribed to the aldehyde group has been considerably reduced at 285 µm. Based on the results with hydroxylamine, the polyglutaraldehyde contains one aldehyde group per molecular weight of 160.

Die Prüfung der Ergebnisse führt zu folgenden Schlüssen:Examination of the results leads to the following conclusions:

Polyglutaraldehyd zeigt eine hohe Reaktionsfähigkeit gegenüber niedermolekularen Aminen unter milden YerSuchsbedingungen (vgl. Tabelle I). Die bemerkenswerte Reaktionsfähigkeit von Hydroxylamin zeigt an, daß diese Verbindung ein besseres Reagens gegenüber Glycin darstellt, das bei Versuchen zur Inaktivierung von Aldehydgruppen auf mit Glutaraldehyd oder Polyglutaraldehyd aktivierte Reagentien zur Zellenmarkierung verwendet wird. Die höchsten theoretischen Ausbeuten an Reaktionsprodukten, bezogen auf die Vermutung, daß die sich wiederholende Einheit in dem Polymerisat ein substituierter Acroleinanteil ist, betragen etwa 50 bis 60 Prozent. Spektrometrische Untersuchungen zeigen das Vorhandensein von nicht-umgesetzten Aldehydgruppen bei den Reaktionsprodukten. Deshalb ist es wahrscheinlich, daß die Bildung von Schiff sehen Basen einen Gleichgewichtszustand erreicht und daß durch Änderung der Versuchsbedingungen höhere Ausbeuten als die in der Tabelle I angegebenen erwartet werden können.Polyglutaraldehyde shows a high reactivity towards low molecular weight amines under mild test conditions (cf. Table I). The remarkable reactivity of hydroxylamine indicates that this compound is a better reagent over glycine used in attempts to inactivate Aldehyde groups activated with glutaraldehyde or polyglutaraldehyde Cell labeling reagents are used. The highest theoretical yields of reaction products, based on on the assumption that the repeating unit in the polymer is a substituted acrolein, amount to about 50 to 60 percent. Spectrometric studies show this Presence of unreacted aldehyde groups in the reaction products. Therefore it is likely that education by ship see bases reached a state of equilibrium and that higher yields than those given in Table I can be expected by changing the experimental conditions.

Reaktionen mit menschlichen Immunglobulinen: Pluorescierendes menschliches Immunglobulin G und nichtmenschliches Ziegenimmunglobulin M werden an mit Diäthylaminäthyl-cellu-Reactions with human immunoglobulins: fluorescent human immunoglobulin G and non-human Goat immunoglobulin M are treated with diethylamine ethyl cellu-

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lose gefüllten Säulen gereinigt. Ihre Fluoreseenzintensität bei unterschiedliehen pH-Werten wird "bei Raumtemperatur mittels eines "Aminco-Fluorimeters", Modell SPl 125, gemessen.loosely filled columns cleaned. Your fluorescent intensity at different pH values are "at room temperature by means of a "Aminco Fluorimeter", Model SPl 125, measured.

Der Umsetzungsgrad wird nach dem Zentrifugieren der Suspensionen, die das fluorescierende Immunglobulin G und unlöslichen Polyglutaraldehyd enthalten, durch. Messen der iTuorescenz der überstehenden Lösung bestimmt. Man führt zwei Versuchsreihen durch. In der ersten Versuchsreihe viird pulverförmiger Polyglutaraldehyd unmittelbar mit fluorescierendem Immunglobulin G umgesetzt und die Abnahme der Fluorescenz nach der Umsetzung geinessen, so daß man die an das Polymerisat gebundene Menge des Immunglobulins G- erhält. MikroMigelchen aus einem Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat werden unter identischen Bedingungen iimgesetzt und dienen zu Kontroll- bzw. Vergleichszwecken.The degree of conversion is determined after centrifuging the suspensions, which contain the fluorescent immunoglobulin G and insoluble polyglutaraldehyde. Measure the iTuorescenz of the protruding Solution determined. Two series of experiments are carried out. In the first series of tests, powdered polyglutaraldehyde is used Immediately implemented with fluorescent immunoglobulin G. and eaten the decrease in fluorescence after the implementation, so that the amount of immunoglobulin G- bound to the polymer is obtained. MikroMigelchen from a methacrylic acid-hydroxyethyl ester-acrylamide copolymer are implemented under identical conditions and are used for control and comparison purposes.

Die zweite Versuchsreihe besteht aus Umsetzungen mit Polyglutaraldehyd, der an die Hydrazidgruppen an der Oberfläche der Perlchen von Poly-VP-AM-hydrazid mit einem Durchmesser von 0,7 um kovalent gebunden ist*The second series of experiments consists of reactions with polyglutaraldehyde, that of the hydrazide groups on the surface of the pearls of poly-VP-AM hydrazide with a diameter of 0.7 µm is covalently bound *

Das Ausmaß der chemischen Bindung wird auf folgende leise untersucht: 25 mg Poly-VP-AM-hydrazid-Mikrokügelchen werden mindestens 5 Stunden lang mit 50 ml einer 25 mg Polyglutaraldehyd gelöst enthaltenden Lösung von Dimethylsulfoxid gerührt. Nach dem Abzentrifugieren und Waschen mit Dimethylsulfat und Wasser werden zu 5 cm Kügelchen fluorescierende Immunglobuline gegeben (Tabellen II, III und IV). Die jeweiligen Gemische werden bei einer bestimmten Temperatur gerührt, und dann wird der Verlust an Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeit unter Verwendung der abzentrifugierten Lö-The extent of the chemical bond is quietly examined for the following: 25 mg of poly-VP-AM hydrazide microspheres are at least For 5 hours with 50 ml of a solution containing 25 mg of polyglutaraldehyde Stirred solution of dimethyl sulfoxide. After centrifugation and washing with dimethyl sulfate and water, fluorescent immunoglobulins are added to 5 cm beads (Tables II, III and IV). The respective mixtures are stirred at a certain temperature, and then the loss of fluorescence is after a certain time using the centrifuged solvent

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QkQk

sung in aliqoten Teilen "bestimmt.solution in aliquot parts ".

Umsetzung mit Hämoglobin:" Polyglutaraldehyd oder Poly-VP-AM-hydrazid-Kügelchen mit einem Polyglutaraldehydüberzug werden in zweimal umkristallisierten Hämoglobin, das in 0,01-m Phosphat-Pufferlösung gelöst ist, suspendiert. Man stellt den pH-Wert mittels Fatriumphosphat ein und verzeichnet nach einer bestimmten Zeit die optische Dichte bei 412 nm von abfiltrierten aliquoten Anteilen.Reaction with hemoglobin: "Polyglutaraldehyde or poly-VP-AM-hydrazide beads with a polyglutaraldehyde coating are in twice recrystallized hemoglobin in 0.01-M phosphate buffer solution is dissolved, suspended. The pH is adjusted using sodium phosphate and recorded after a certain one Time the optical density at 412 nm of filtered aliquots Shares.

Markierung von Lymphozyten mit Immun-Mikrokügelchen: Menschliche Lymphocyten werden von den roten Blutkörperchen mittels eines "Pieoll-Hypaque"-Gradienten ("Picoll"· =· ein polymerer Rohrzucker vom Molgewicht 400 000; "Hypaque" = Natriumsalz der 3,5-Diacetamido-2,4 >'6-trijod-benzoesäure) abgetrennt, von Monocyten mittels Eisenteilchen befreit und in einem Medium bei einem pH von 7,2 bis 7,4 suspendiert, dem 20 Prozent Serum von Kalbsföten zugegeben ist. Das Medium ("EPMl/H") besteht aus*"RPMI 1640" (der Firma G-ibco, Y.St.A.) und 0,025-m F-2-Hydroxyäthyl-piperazin-l^lI-2-athansulfonsäure-Lösung. Marking of lymphocytes with immune microspheres: Human lymphocytes are separated from the red blood cells by means of a "Pieoll-Hypaque" gradient ("Picoll" = a polymeric cane sugar with a molecular weight of 400,000; "Hypaque" = sodium salt of 3,5-diacetamido -2.4>'6-triiodo-benzoic acid), freed from monocytes by means of iron particles and suspended in a medium at a pH of 7.2 to 7.4 to which 20 percent serum from calf fetuses is added. The medium ("EPMl / H") consists of * "RPMI 1640" (from G-ibco, Y.St.A.) and 0.025-m F-2-hydroxyethyl piperazine-l ^l I-2-athanesulfonic acid Solution.

Die Mikrokügelchen, an die Immunglobuline mittels Polyglutaraldehyd (0,5 cur einer.Mikrokügelchensuspension mit einem Gehalt von 0,5 mg Mikrokügelchen in einer phosphatgepufferten ETatriumchloridlösung von pH 7,4) werden 60 Minuten bei 4°C mit 5x10 Lymphocyten in 1 enr "RPMI/H"-Pufferlösung mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Hatriumazid inkubiert. Nach der Zugabe von 1,5 cur Serum von Kalbsföten und 0,1 Prozent Hatriumazid wird die Suspension in einer Zentrifuge mit 1500 UpM (515 g) zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden wieder in einer Lösung aus 50 Prozent "RPHl/H"The microspheres attached to the immunoglobulins using polyglutaraldehyde (0.5 cur of a microsphere suspension containing 0.5 mg microspheres in phosphate buffered sodium chloride solution of pH 7.4) are 60 minutes at 4 ° C with 5x10 lymphocytes in 1 enr "RPMI / H" buffer solution with a content of 0.1 percent Incubated sodium azide. After adding 1.5 cur of serum Calf fetuses and 0.1 percent sodium azide are added to the suspension centrifuged in a centrifuge at 1500 rpm (515 g). The received Cells are again in a solution of 50 percent "RPHl / H"

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29104H29104H

und 50 Prozent Serum τοπ Kalbsföten mit einem Gehalt von 0,1 Prozent Natriumazid suspendiert und nochmals zentrifugiert. Es ist für erforderlich angesehen worden, das Reinigungsverfahren dreimal zu wiederholen, um praktisch sämtliche nicht-gebundenen·Mikrokügelehen zu entfernen. Fach der dritten Zentrifugierung
werden die Zellen wiederum in "RPMl/H" - diesmal mit einem Gehalt von 1 Prozent Rindei'serumalbumin und 0,1 Prozent Natriumazid suspendiert. Die markierten Zellen werden dann unter dem Mikroskop gezählt.and 50 percent serum τοπ calf fetuses with a content of 0.1 percent sodium azide suspended and centrifuged again. It has been found necessary to repeat the cleaning procedure three times to remove virtually all unbound microspheres. Third centrifugation compartment
the cells are again suspended in "RPMl / H" - this time with a content of 1 percent bovine egg serum albumin and 0.1 percent sodium azide. The labeled cells are then counted under the microscope.

Bei einem Vergleichsversuch werden die Lymphocyten 60 Minuten
mit aggregierten Iiamunglobulin G inkubiert. Das aggregierte Immunglobulin G- wird durch Auflösen von menschlichen Immunglobulin G (50 mg/cm ) in phosphatgepufferter ifatriumchloridlösung
bei pH 7,4 und 30-minütiges Erwärmen der Lösung auf 63°C hergestellt. Die klare überstehende Lösung wird zur Inkubierung der
Zellen vor der Markierung verwendet. ... *In a comparative experiment, the lymphocytes are 60 minutes
incubated with aggregated Iiamoglobulin G. The aggregated immunoglobulin G- is produced by dissolving human immunoglobulin G (50 mg / cm) in phosphate-buffered sodium chloride solution
at pH 7.4 and heating the solution to 63 ° C for 30 minutes. The clear supernatant solution is used to incubate the
Cells used before marking. ... *

Ergebnisse ο Results ο

Reaktion von Polyglutaraldehyd mit niedermolekularen Aminen;
Vorinformationen auf die Reaktionsfähigkeit des Polymerisats mit Aminogruppen erhält man aufgrund der Durchführung von Reaktionen mit einer Reihe von Aminen. Die Tabelle I zeigt die Ergebnisse der Eleifientaranalyse der Produkte. Die theoretische Stickstoffmenge wird aufgrund der Annahme berechnet, daß jede Einheit
-CH₂-CH₂-CH=C(CHO)- ein Molekül Amin bindet. Im lalle von Hydroxylamin-hydrochlorid, Hydrazin und Butalamin liegt der Umsetzungsgrad in eier Größenordnung von 50 bis 60 Prozent der theoretischen Menge (l'abelle I).Reaction of polyglutaraldehyde with low molecular weight amines;
Preliminary information on the reactivity of the polymer with amino groups is obtained from carrying out reactions with a number of amines. Table I shows the results of the electrical analysis of the products. The theoretical amount of nitrogen is calculated on the assumption that each unit
-CH ₂ -CH ₂ -CH = C (CHO) - binds a molecule of amine. In the case of hydroxylamine hydrochloride, hydrazine and butalamine, the degree of conversion is in the order of 50 to 60 percent of the theoretical amount (Table I).

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■ Qi■ Qi

Reaktion von Polyglutaraldehyd und Methacralsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat-Kügelchen mit einem Polyglutaraldehydüberzug mit Immunglobulinen: Die Tabelle II zeigt die Menge des an den Polyglutaraldehyd gebundenen Immunglobulins G nach 135-minütigem Rühren der Suspensionen bei Raumtemperatur. Es wird bei diesen Versuchen eine konstante Menge von fluorescierendem Immunglobulin G- verwendet.Reaction of polyglutaraldehyde and methacralic acid-hydroxyethyl ester-acrylamide copolymer beads with a polyglutaraldehyde coating with immunoglobulins: Table II shows the Amount of the immunoglobulin G bound to the polyglutaraldehyde after stirring the suspensions for 135 minutes at room temperature. A constant amount of fluorescent is used in these experiments Immunoglobulin G- used.

Tabelle II.Table II.

Reaktion von pulverförmiger)! Polyglutaraldehyd mit menschlichen Immunglobulin G (1 mg fluorescierendes Immunglobulin G in 10 ml Phosphatpufferlösung, pH 7,4).Reaction of powdery)! Polyglutaraldehyde with human immunoglobulin G (1 mg fluorescing immunoglobulin G in 10 ml phosphate buffer solution, pH 7.4).

PοIyglutar-PοIyglutar-

'Ζ'Ζ

aldehyd mg/cmaldehyde mg / cm

Methacrylsäure-hydroxyäthylester-Acrylamid-Mischpolymerisat mit Überzug von Polyglutaraldehyd mg/cm3Methacrylic acid-hydroxyethyl ester-acrylamide copolymer with a coating of polyglutaraldehyde mg / cm3

an das Polymerisat gebundenes Immunglobulin G (Gew ic ht/Ge w icht)Immunoglobulin G bound to the polymer (weight / weight)

bei pH 7,4 bei pH 6at pH 7.4 at pH 6

0,20.2

2,02.0

20,020.0

0,2 • 2,0 20,00.2 • 2.0 20.0

0,0, 160160 o,O, 200200 o,O, 030030 o,O, 040040 o,O, 004004 o,O, 006006 00 00 00 00 00 00

Aus der Tabelle II ist ersichtlich, daß steigende Mengen des Polymerisats ein niedrigeres Immunglobulin G/Polymerisat-Verhältnis liefern. Die gleichen Ergebnisse werden mit Mikrokügelchen, die sich entweder vom polymeren oder vom monomeren Glutaraldehyd ableiten, erhalten (vgl. Tabelle III).From Table II it can be seen that increasing amounts of the polymer a lower immunoglobulin G / polymer ratio deliver. The same results are obtained with microspheres derived from either polymeric or monomeric glutaraldehyde, obtained (see Table III).

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Tabelle III. 2910414 Vergleich der Reaktionsfähigkeit von Kügelchen mit Überzügen aus monomeren! oder aus polymerem Glutaraldehyd. Wirkung der Konzentration an monomerem oder polymerem Glutaraldehyd (0,5 mg fluorescierendes Immunglobulin G in 10 ml Phosphatpufferlösung, pH 7,4)· In allen Versuchen werden 25 mg Kügelchen je cm verwendet.Table III. 2910414 Comparison of the reactivity of beads with coatings made of monomeric! or from polymeric glutaraldehyde. Effect of concentration of monomeric or polymeric glutaraldehyde (0.5 mg fluorescent Immunoglobulin G in 10 ml phosphate buffer solution, pH 7.4) In all experiments 25 mg of beads per cm are used.

Vergleich
ZZ
mg/cm comparison
ZZ
mg / cm PoIyglutaraldehyd
mg/cmPolyglutaraldehyde
mg / cm Glutaraldehyd
mg/cmGlutaraldehyde
mg / cm -- Gewicht des gebun
denen Immunglobu-
linsG/Gewicht des
Polymerisats χ 10-5Weight of the bound
which immunoglobu
linsG / weight of
Polymer χ 10-5 2,52.5 11,011.0 7,57.5 4,04.0 20,020.0 1,41.4 2,52.5 6,06.0 7", 57 ", 5 2,02.0 20,020.0 0,70.7 2,5 . ■2.5. ■ • 0• 0

Tabelle IV.Table IV.

Vergleich der Realstionsfähigkeit von Kügelchen mit Überzügen aus monomerem oder aus polymerem Glutaraldehyd., Wirkung der Immunglobulin G-Konzentration. In allen Versuchen werden 25 mg Kügelchen je cm verwendet.Comparison of the realism of beads with coatings monomeric or polymeric glutaraldehyde., Effect of immunoglobulin G concentration. In all experiments 25 mg of beads per cm are used.

Vergleich
mg/cmcomparison
mg / cm Polyglu-
taraldehyd
mg/cmPolyglu-
taraldehyde
mg / cm Glutar-
aldehyd
mg/cmGlutar
aldehyde
mg / cm menschliches.
Immunglobulin
G /■■ 3
mg/cmhuman.
Immunoglobulin
G / ■■ 3
mg / cm Gewicht des gebun
denen Iimaunglobu-
lins G/Gewicht des
Polymerisats χ 10^Weight of the bound
whom Iimaunglobu-
lins G / weight of
Polymer χ 10 ^ 2,52.5 ·· 0,0250.025 5,75.7 2,52.5 0,0500.050 ■ 9,5■ 9.5 2,52.5 0,1000.100 14,014.0 ______ 2,52.5 0,0250.025 5,35.3 2,52.5 0,0500.050 4,54.5 2,52.5 0,100 .0.100. ■9,1■ 9.1 2,52.5 . 0. 0

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Die Tabelle II veranschaulicht, daß bei pH 6 größere Mengen Immunglobulin G als bei pH 7,4 an das Polymerisat gebunden v/erden. Diese Wirkung des pH-Wertes wird in den nachstehend beschriebenen Untersuchungen bestätigt. Es ist ferner ersichtlich, daß bei einer gegebenen Reaktionszeit Polyglutaraldehyd in größeren Mengen an Immunglobulin G.als an Mikroperlchen von Polyglutaraldehyd gebunden wird. Die geringere Menge an gebundenen Immunglobulin G mit steigender Konzentration des Polyglutaralfehyds beruht wahrscheinlich auf einer unvollständigen Reaktion und/oder einer ungenügenden Menge von Immunglobulinen. Die Tabellen II und III zeigen weiterhin, daß bei einem gegebenen ρH-Wert erheblich größere Mengen menschlichen Immunglobulins G von dem Polymerisat als von dem Monomeren kövalent gebunden v/erden. Die Information für die ei¹- · forderliche Reaktionszeit wird durch kinetische Untersuchungenerhalten. In Fig. 1 ist die Abnahme der Fluoreszenz der überstehenden Lösung gegen die Zeit aufgetragen. Es ist ersichtlich, daß bei pH 7,4 die Reaktion nach 135 Minuten unvollständig ist (die in den vorstehenden Untersuchungen angegebene Zeit) Weiterhin ist bei einem niedrigeren pH-Wert als 7,4 die Reaktionszeit rascher. Die Fig. 2 und 3 bestätigen die raschere Reaktionszeit des Polymerisats gegenüber dem Monomeren und zeigen weiterhin die Einwirkung der Temperatur. Gleiche Ergebnisse werden mit fluoreszierenden nicht-menschlichen Ziegenimmunglobulin M erhalten (Fig. 4).Table II illustrates that larger amounts of immunoglobulin G are bound to the polymer at pH 6 than at pH 7.4. This effect of the pH value is confirmed in the studies described below. It can also be seen that, for a given reaction time, polyglutaraldehyde is bound in larger amounts to immunoglobulin G. than to microbeads of polyglutaraldehyde. The lower amount of bound immunoglobulin G with increasing concentration of the polyglutaraldehyde is probably due to an incomplete reaction and / or an insufficient amount of immunoglobulins. Tables II and III also show that, at a given ρH value, considerably larger amounts of human immunoglobulin G are convalently bound by the polymer than by the monomer. The information for the ei ¹ - · ford variable response time is getting kinetic study. In FIG. 1, the decrease in fluorescence of the supernatant solution is plotted against time. It can be seen that at pH 7.4 the reaction is incomplete after 135 minutes (the time given in the above investigations). Furthermore, at a pH value lower than 7.4 the reaction time is faster. FIGS. 2 and 3 confirm the faster reaction time of the polymer compared to the monomer and continue to show the effect of temperature. The same results are obtained with fluorescent non-human goat immunoglobulin M (Fig. 4).

Reaktionen mit Hämoglobin: Da Hämoglobin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei'412 mn (£ „ = 125> bezogen auf einReactions with hemoglobin: Because hemoglobin has a high extinction coefficient at'412 mn (£ "= 125> based on a

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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

Molekulargewicht von 17 000) hat, stellt die Proteinimmobilisierung ein geeignetes Modell für Untersuchungen dar. Es kann aus dem Absorptionsmaximum bei ^12 nm berechnet werden, daß bei pH 6, 7j^ und 8,4 Poly glut araldehyd nach 500 minütiger Reaktionszeit 8,8, 6,6 bzw. 2,8 % Hämoglobin immobilisiert. Bei Kontroll versuchen mit Methaerylsäure-hydroxyäthylester-/Hämoglobin-Gehalt in der Größenordnung von 1 %_s bezogen auf die Stickstoffanalyse (berechneter Wert: 15>2 % N). Der Hämoglobingehalt der bei 6, 7»^ und 8,4 erhaltenen Polyglutaraldehyd-Hämoglobin-Produkte wird zu 10,4, 7,8 und 5,3 % berechnet, bezogen auf die Stickstoffanalyse, und stimmt im wesentlichen gut mit spektrophotometrischen Ergebnissen überein. Im Gegensatz zu der heterogenen Reaktion findet man, wenn PoIyglutaraldehyd mit einem Überschuß an Hämoglobin homogen in wäßrigem DimethylsuTfoxid umgesetzt wird, daß das erhaltene Pro-Molecular weight of 17,000), protein immobilization is a suitable model for studies. It can be calculated from the absorption maximum at ^ 12 nm that at pH 6, 7j ^ and 8.4 polyglutaraldehyde after a reaction time of 500 minutes is 8.8 , 6.6 and 2.8 % hemoglobin, respectively, immobilized. In control tests with hydroxyethyl methaeryl ester / hemoglobin content in the order of 1 % _s based on the nitrogen analysis (calculated value: 15> 2 % N). The hemoglobin content of the polyglutaraldehyde-hemoglobin products obtained at 6, 7 »^ and 8.4 is calculated to be 10.4, 7.8 and 5.3 % based on nitrogen analysis and is essentially in good agreement with spectrophotometric results. In contrast to the heterogeneous reaction, if polyglutaraldehyde is reacted homogeneously with an excess of hemoglobin in aqueous dimethyl sulfoxide, the product obtained is

dukt 76 % Hämoglobin enthält (Stickstoffanalyse).-Die Kinetik von an Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen" gebundenem Hämoglobin ist in B'ig. 6 gezeigt. Der Trend einer ansteigenden Reaktions-' geschwindigkeit bei pH 6 im Vergleich zu pH Ί,k ist" augenscheinlich. Duct contains 76 % hemoglobin (nitrogen analysis) .- The kinetics of hemoglobin bound to polyglutaraldehyde microspheres is shown in Figure 6. The trend of an increasing reaction rate at pH 6 compared to pH Ί, k is "evident .

Die Reaktionsfähigkeit des Polymerisats mit menschlichem Immunglobulin G ist etwa zweimal größer als die des Monomeren (TabellenII, III, IV und Fig. 2, 3, *J und 6). Die Anzahl von Immunglobulin G-Molekülen je Perlchen von 0,7 MJn Durchmesser nach 10 Stunden Reaktionszeit bei 22°C (Fig. 2) berechnet sich zu 3,8 χ 10·^ für Polyglutaraldehyd und zu 2,3 χ 10^ für Mono-"glutaraldehyd. Größere Mengen und schnellere Reaktionsge-The reactivity of the polymer with human immunoglobulin G is about twice that of the monomer (Tables II, III, IV and Figures 2, 3, * J and 6). the number of Immunoglobulin G molecules per bead 0.7 MJn in diameter after a reaction time of 10 hours at 22 ° C. (FIG. 2) the calculation is 3.8 χ 10 · ^ for polyglutaraldehyde and 2.3 χ 10 ^ for mono- "glutaraldehyde. Larger quantities and faster reaction times

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-X--X-

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schwindigkeiten werden bei Reaktionen von Irnmunglobulinen mit Polyglutaraldehyd als mit Mikroperlchen bzw. -kügelchen von Polyglutaraldehyd beobachtet (vgl.Tabellen II, III und IV und Fig. 1 und 2). Die gleichen Schlüsse gelten für die Reaktionen mit Hämoglobin (Fig. 5 und 6)..In reactions of immunoglobulins with polyglutaraldehyde than with microbeads or microspheres Polyglutaraldehyde observed (see Tables II, III and IV and Figs. 1 and 2). The same conclusions apply to the reactions with hemoglobin (Fig. 5 and 6) ..

Eine Herabsetzung des pH-Wertes von 7,4 auf 6 erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Erscheinung gilt sowohl, für menschliches Immunglobulin G (Fig. 1) wie auch für Hämoglobin (Fig. 5)· Um diese Wirkung zu interpretieren, nimmt man an, daß die Umsetzung von Polyglutaraldehyd zwischen freien Aminogruppen des Proteins, beispielsweise der Lysinreste, und Aldehydgruppen des Polymerisats unter Bildung von S chi ff'schäl Basen stattfindet. Es kann erwartet werden, daß Carbonyl-Additionsreaktionen durch Säuren ,stärker katalysiert V/erden, denn nach dem Angriff auf das Sauerstoffatom durch ein Proton wird das Kohlenstoffatom erheblich positiver und dadurch leichter reaktionsfähig mit einer nukleophilen Verbindung: Lowering the pH from 7.4 to 6 increases the rate of the reaction. This phenomenon applies both to human immunoglobulin G (Fig. 1) and to hemoglobin (Fig. 5) · To interpret this effect, it is believed that the reaction of polyglutaraldehyde between free amino groups of the protein, for example the lysine residues, and aldehyde groups of the polymer with the formation of S chi ff'schäl bases takes place. It can be expected that Carbonyl addition reactions by acids, more strongly catalyzed V / earth, because after attacking the oxygen atom by a proton becomes the carbon atom considerably more positive and thus more easily reactive with a nucleophilic compound:

F +
>C=0 φ >C -OH F +
> C = 0 φ> C -OH

Wenn die nukleophile Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel R-NHp ist, wandelt die Säure 'das Amin in den nicht-reaktionsfähigen Typ R-NH, um. Deshalb erwartet man zu finden, daß die Additionsgeschwindigkeit ein Maximum bei schwach saurem pH-Wert mit scharfem Abfall nach beiden Seiten zeigt. Dies wird in der Praxis tatsächlich beobachtet/When the nucleophilic compound is a compound of general Formula is R-NHp, the acid converts the amine to the non-reactive type R-NH. Therefore one expects to find that the addition rate is a maximum at weakly acidic pH value with a sharp drop on both sides shows. This is actually observed in practice /

Das geringe Ausmaß, einer unspezifischen Bindung von Immun-The small extent of non-specific binding of immune

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• ·' Γ '• · 'Γ'

- C. "*'* ^! ■ /;W'·· BAD ORIGINAL- C. "* '* ^! ■ /; W' ·· BAD ORIGINAL

-X--X-

globulinen und Hämoglobin (Fig. 2 und 5) an Substrate, die frei von Glutaraldehyd und Polyglutaraldehyd sind, wird einer physikalischen Adsorption zugeschrieben und kann durch Erniedrigen der Reaktionstemperatur (Fig. 3) vermindert werden.globulins and hemoglobin (Fig. 2 and 5) to substrates that are free of glutaraldehyde and polyglutaraldehyde, becomes one attributed to physical adsorption and can be reduced by lowering the reaction temperature (Fig. 3) can be reduced.

Die hohe Reaktionsfähigkeit von Polyglutaraldehyd, seine Stabilität, seine leichte Handhabung und die Retention der physiologischen Wirksamkeit von an das Polymerisat gebundenen, menschlichen Iinmun-globulinen macht das neue Reagens für die Bindung von Proteinen wünschenswert«The high reactivity of polyglutaraldehyde, its stability, its easy handling and the retention of the physiological effectiveness of bound to the polymer, human iinmun globulins makes the new reagent for that Binding of proteins desirable "

Obwohl mit Polyglutaraldehyd überzogene Mikrokügelohen reaktionsfähiger als Glutaraldehyd sind, trägt das Erfordernis der Bildung von überzogenen Kügelchen zu einer unnötigen Schwierigkeit des Überführungsverfahrens bei. Es ist weiter gefunden worden, laß eine Suspensionspolymerisation von Glutaraldehyd in Gegenwart eines Emulgiermittels wasserunlösliche Polyglutaraldebyd-Mikrokügelchen mit einem Durchmeser von 20 nm bis 10,um, gewöhnlich von 50 nm bis 1,5,um, liefert. Die Polymerisation in Gegenwart einer Suspension von magnetischen Teilchen liefert magnetische Mikrokügelchen. Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen können sich auch durch Ausfällen von Polyglutaraldehyd aus einer eine grenzflächenaktive Verbindung enthaltenden Lösung bilden. Fluoreszierende Mikrokügelchen können durch eine Nachpolymerisation mit einem Fluorοchrom oder durch Polymerisieren in Gegenwart eines Fluor ocliroms gebildet werden.Although polyglutaraldehyde coated microspheres are more reactive than glutaraldehyde, the requirement for the formation of coated beads adds to an unnecessary one Difficulty of the transfer procedure. It is on have been found, leave a suspension polymerization of glutaraldehyde in the presence of an emulsifying agent water-insoluble Polyglutaraldebyd microspheres having a diameter of 20 nm to 10 µm, usually from 50 nm to 1.5 µm. the Polymerization in the presence of a suspension of magnetic particles produces magnetic microspheres. Polyglutaraldehyde microspheres can also result from the precipitation of polyglutaraldehyde from a surface-active compound containing Form solution. Fluorescent microspheres can be polymerized by post-polymerization with a fluorochrome or by polymerization be formed in the presence of a fluorine oclirom.

-Bie GröBe der Polyglutaraldehyd-Imniunmikrokügelchen wird durch den pH - Wert, die Konzentration der grenzflächenaktiven Ver--The size of the polyglutaraldehyde immune microspheres is determined by the pH value, the concentration of the surface-active substances

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'29104U'29104U

bindung und durch die Konzentration von monomeren! Glutaraldehyd beeinflußt. Die ImmunmikrokügeIchen werden dadurch hergestellt, daß man eine Suspension mit 0,1 bis 20 Gewichtsprozent Glutaraldehyd und 0,1 bis 3 Gewichtsprozent grenzflächenaktive Verbindung in einem wäßrigen Medium herstellt, den pH-Wert auf 7 bis 13, vorzugsweise 9 bis 12, einstellt und das Reaktionsgemisch mehrere Stunden rührt. Die Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden dann abgetrennt und gewaschen. Das wäßrige Medium kann 5 bis 50 Gewichtsprozent mit Wasser nicht mischbarer organischer Flüssigkeiten, wie aromatische oder aliphatische organische Lösungsmittel, beispielsweise Benzol, Toluol, Hexanj Heptan oder Octan, oder Triglyceride, wie Bauniwollsamenöl, Maisöl oder Sojabohnenöl, enthalten.binding and by the concentration of monomers! Glutaraldehyde influenced. The immune microspheres are produced by adding a suspension with 0.1 to 20 percent by weight of glutaraldehyde and 0.1 to 3 percent by weight of the surfactant compound in an aqueous medium, the pH to 7 to 13, preferably 9 to 12, and the reaction mixture is stirred for several hours. The polyglutaraldehyde microspheres are then separated and washed. The aqueous medium may be 5 to 50 percent by weight water immiscible organic liquids, such as aromatic or aliphatic organic solvents, for example benzene, toluene, Hexane, heptane or octane, or triglycerides, such as cotton seed oil, Corn oil or soybean oil.

Mikrokügelchen mit einem Gehalt an elektroriendichten Metallen e'rgeben eine räumlich höhere Auflösung der Zelloberfläche. Polyglutaraldehyd-Immunraikrokugelchen mit einem Gehalt art elektronendichten Metallen erzeugen eine stabilere Markierung als Goldteilchen mit physikalisch absorbierten Antikörpern, die gegenwärtig zur Zellmarkierung verwendet werden. Die ein Metall enthaltenden Mikrokügelchen können in situ durch Polymerisieren von Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen in Gegenwart einer Suspension von fein verteilten Metallteilchen oder Verbindungen von Metallen, vorzugsweise mittels einer kolloidalen Dispersion des Metalls, hergestellt werden. Das Metall wird in die Mikrokügelchen in einer wirksamen Menge von 0,5 bis 20 Gewichtsprozent, gewöhnlich von 1 bis 10 Gewichtsprozent, eingearbeitet. -Microspheres containing electrodense metals They give a spatially higher resolution of the cell surface. Polyglutaraldehyde immune microspheres with a content of art electron-dense metals produce a more stable marking than gold particles with physically absorbed antibodies, currently used for cell labeling. The metal-containing microspheres can be polymerized in situ of polyglutaraldehyde microspheres in the presence of a suspension of finely divided metal particles or compounds of metals, preferably by means of a colloidal dispersion of the metal. The metal will into the microspheres in an effective amount of from 0.5 to 20 percent by weight, usually from 1 to 10 percent by weight, incorporated. -

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29104U29104U

Die Metall- oder Metallverbindungsteilchen sind vorzugsweise feinteilige, weitgehend gleich große Substanzen mit einem gleichmäßigen Durchmesser, der kleiner als derjenige der erhaltenen Mikrokügelchen ist und typischerweise unter 100 nm, gewöhnlich bei 2,5 nm bis 50 nm, liegt, Die Metalle sind vorzugsweise elektronendichte Schwermetalle mit einer Ordnungszahl oberhalb 50, vorzugsweise oberhalb 75> wie Blei, Nickel, Kobalt, Platin, Gold oder Eisen. Das Metall kann magnetisch sein, wie Eisen, Nickel, Kobalt oder deren Legierungen, oder eine anorganische magnetische Verbindung, wie ein Metalloxid. Die magnetische Substanz ist vorzugsweise magnetisches Eisenoxid der Formel Pe^O₂,. Bestimmte harte, keramische Verbindungen vom Typ des Ferrits, wie Lithiumferrite, können ebenfalls verwendet werden. Das Metall oder die Metallverbindung kann durch Suspendieren in Wasser mit einem Gehalt an einer grenzfläehenaktiven Verbindung, wie Polyäthylenimin, in eine leicht dispergierbare Form gebracht werden.The metal or metal compound particles are preferably finely divided, substantially equally large substances with a uniform diameter which is smaller than that of the microspheres obtained and is typically below 100 nm, usually 2.5 nm to 50 nm. The metals are preferably electron-dense heavy metals with an atomic number above 50, preferably above 75> such as lead, nickel, cobalt, platinum, gold or iron. The metal can be magnetic, such as iron, nickel, cobalt or their alloys, or an inorganic magnetic compound, such as a metal oxide. The magnetic substance is preferably magnetic iron oxide of the formula Pe ^ O _2,. Certain hard ferrite-type ceramic compounds, such as lithium ferrite, can also be used. The metal or metal compound can be brought into an easily dispersible form by suspending it in water containing a surface-active compound such as polyethyleneimine.

Die Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen können durch Umsetzen mit einer Verbindung fluoreszierend gemacht wer'den, die mit Acrolein-Gruppen Fluorogene bildet, wie Anfchron oder metar jlminophenol, oder mit Aldehyd-Gruppen reaktionsfähige Fluor ochrome liefert, wie Aminofluorescein, 9-Amino-acridin, Propidiuin-broniid oder Fluorescein-isothiocyanat. Stark fluoreszierende Mikroperlchen können auch durch Suspensionspolymerisation von Glutaraldehyd in Gegenwart eines Fluor οohroms mit Aminogruppen hergestellt werden.The polyglutaraldehyde microspheres can be made fluorescent by reacting them with a compound that interacts with Acrolein groups form fluorogens, such as Anfchron or metar jlminophenol, or fluorochromes reactive with aldehyde groups supplies, such as aminofluorescein, 9-amino-acridine, propidiuin-broniid or fluorescein isothiocyanate. Highly fluorescent microbeads can also be produced by suspension polymerization of glutaraldehyde in the presence of a fluoro οohrome with Amino groups are produced.

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Die grenzflächenaktiven Verbindungen sind wasserlösliche, nichtionische, kationische oder anionische Substanzen im allgemeinen organischer Art, wobei Fluorkohlenv/asserstoffe und Hydrofluorkohlenwasserstoffe sowie Silicium enthaltende Verbindungen mit eingeschlossen sind. Kationische grenzflächenaktive Verbindungenlcinnm Amine, Aminsalze, Sulfonium-, Phosphonium- oder quartäre Ammoniumverbindungen sein. Die grenzflächenaktiven Verbindungen können allein oder in Gegenwart von 1 bis 5 Gewichtsprozent eines Suspendiermittels, wie Polyäthylenoxid, Glycerin, Polyacrylamid oder Polyäthylenimin, verwendet v/erden. Ein Beispiel einer kationischen grenzflächenaktiven Verbindung ist ein kationischer Guar Sum ("Guar C13"). Wasserlösliche anionische grenzflächenaktive Verbindungen können .im Handel erhältliche Carbonsäuren, Schwefelsäureester und Alkansulfonsäuren, beispielsweise Natrium-dodecylsulfat oder ein anionischer Fluorkohlenwasserstoff ("Zonyl PSP"), sein. Nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindungen sind gewöhnlich Polyäthylenoxid- und/oder Polypropylenoxid-Derivate von Phenolen, Alkoholen oder Fettsäuren. Bevorzugte nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindungen sind wasserlösliche Mischpolymerisate »The surface-active compounds are water-soluble, nonionic, cationic or anionic substances in general organic type, with fluorocarbons and hydrofluorocarbons as well as silicon containing compounds are included. Cationic surfactant compounds Be amines, amine salts, sulfonium, phosphonium or quaternary ammonium compounds. The surface-active Compounds can be used alone or in the presence of 1 to 5 percent by weight of a suspending agent such as polyethylene oxide, Glycerin, polyacrylamide or polyethyleneimine, used v / earth. An example of a cationic surfactant Compound is a cationic guar sum ("Guar C13"). Water-soluble anionic surface-active compounds can .Commercially available carboxylic acids, sulfuric acid esters and alkanesulfonic acids, for example sodium dodecyl sulfate or an anionic fluorocarbon ("Zonyl PSP"). Non-ionic surface-active compounds are usually polyethylene oxide and / or polypropylene oxide derivatives of phenols, Alcohols or fatty acids. Preferred nonionic surfactants Compounds are water-soluble copolymers »

mit Molekulargewichten von 800 bis 10 000 von Acrylamid mit 30 bis 60 Gewichtsprozent eines Acrylsäureester oder eines Alkyl- oder Alkoxy-methyl-alkylamids, wie Isobutoxymethacrylamid gemäß der US-PS H O98 987. . . '.with molecular weights of 800 to 10,000 of acrylamide with 30 to 60 percent by weight of an acrylic acid ester or an alkyl- or alkoxymethyl-alkylamide, such as isobutoxymethacrylamide according to US Pat. No. H 098,987. . '.

Beispiel8Example8

Zu 100 cnr einer 5-gewichtsprozentigen wäßrigen Glutaraldehydlösung mit einem Gehalt von 1 Gewichtsprozent eines Mischpoly-To 100 cnr of a 5 percent by weight aqueous glutaraldehyde solution with a content of 1 percent by weight of a mixed poly

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. BADORiGiNAL. BADORiGiNAL

29104U29104U

inerisats aus 60 % Acrylamid und 4.0 % Isobutoxymethacrylamidinerisats made of 60 % acrylamide and 4.0 % isobutoxymethacrylamide

lösung/
wird 10-n Natriumhydroxid/zügetropft, bis ein pH-Wert von erreicht ist. Dann wird das Reaktionsgemisch mit Stickstoff entlüftet, der Behälter dicht verschlossen und auf einem mechanischen Schüttler 2k Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach einer Reaktionszeit von jeweils 1, 2 und h Stunden wird der pH-Wert durch Zugabe von 10-n Natriumhydroxidlösung auf 11 eingestellt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch ausgiebig gegen Wasser dialysiert und dann dreimal je 30 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Man erhält 200 mg Polyglutaraldehyd-Kügelehen mit einem mittleren Durchmesser von 200 - 20 nm aufgrund der Rasterelektronenmikroskopie. Die Kügelchen werden in 0,01-m auf pH 7^1 phosphatgepufferter Natriumchloridlösung oder in destilliertem Wasser redispergiert. Durch ein Verändern der Konzentration der grenzflächenaktiven Verbindung, des Monomerengehaltes oder des pH-Wertes kann die Größe der Mikrokügelchen in einer- voraussagbaren Weise geändert werden. . solution /
10-n sodium hydroxide / is added dropwise until a pH value of is reached. The reaction mixture is then deaerated with nitrogen, the container is tightly closed and shaken on a mechanical shaker for 2k hours at room temperature. After a reaction time of 1, 2 and h hours, the pH is adjusted to 11 by adding 10N sodium hydroxide solution. The reaction mixture is then dialyzed extensively against water and then centrifuged three times for 30 minutes each time at 2000 g. This gives 200 mg polyglutaraldehyde Kügelehen having an average diameter from 200 to 20 nm due to the scanning electron microscopy. The spheres are redispersed in 0.01 m sodium chloride solution, phosphate buffered to pH 7 ^ 1, or in distilled water. By changing the surfactant concentration, monomer content, or pH, the size of the microspheres can be changed in a predictable manner. .

Das Verfahren d&s Beispiels 8 wird durch Verändern der Konzentration der grenzflächenaktiven Verbindung, des Monomeren-" gehalts und des pH-Wertes zur Bestimmung der Wirkung auf den Mikrokügelchendurchmesser wiederholt, wie aus den Fig. 7_S 8 und 9 ersichtlich ist. Bei Abwesenheit einer grenzflächenaktiven Verbindung ist der Monoglutaraldehyd sehr langsam bei pH 7 einer Aldolkondensation ausgesetzt. Die Polymerisationsgeschv.'indigkeit erhöht sica bei pH-Vier ten oberhalb 7 und lie-Tert pulverföi'rnige Produkte, die Aldehydgruppen aufweisen.The method d & s example 8 is repeated by changing the concentration of the surfactant compound, the initial monomer "content and pH to determine the effect on the microspheres diameter, as shown in FIGS. 7, _S 8 and 9 can be seen. In the absence of a surfactant In the compound, the monoglutaraldehyde is very slowly subjected to aldol condensation at pH 7. The rate of polymerization increases at pH four above 7 and less powdery products that contain aldehyde groups.

291OfU291OfU

In Gegenwart von grenzflächenaktiven Verbindungen und bei einer basisch eingestellten wäßrigen Lösung fällt Polyglutaraldehyd in Form von kugelförmigen kolloidalen Teilchen aus. Eine Größenabnahme bei ansteigenden pH-Werten ist höchstwahrscheinlich infolge des Auftretens einer Cannizzaro'sehen Reaktion, die Carboxylgruppen entstehen läßt. Dies zeigt sich durch eine erhöhte Löslichkeit bei erhöhten pH-Werten und einem erhöhten Neutralisationsäquivalent der isolierten, Pölyglutaraldehyd-Mikrokügelchen, die bei verschiedenen pH-Werten hergestellt worden sind (Tabelle V). Die Durchmesser der Mikrokügelchen nehmen auch bei Herabsetzen der Konzentration an monomeren oder an grenzflächenaktiven Verbindungen ab.In the presence of surface-active compounds and in the case of a basic aqueous solution, polyglutaraldehyde precipitates in the form of spherical colloidal particles. A decrease in size with increasing pH values is most likely as a result of the occurrence of a Cannizzaro see reaction which Carboxyl groups can arise. This is shown by an increased solubility at increased pH values and an increased Neutralization equivalent of the isolated polyglutaraldehyde microspheres produced at various pH values have been (Table V). The diameters of the microspheres also increase when the concentration of monomers is decreased or on surface-active compounds.

Tabelle VTable V

Herstellung von Polyglutaraldehyd-'Pulver und -Mikrokügelchen (0,2,um Durchmesser) als Funktion des pH-Wertes (potentiometrische Titration mit 0,1-n Natriumhydroxidlösung in wäßrigem Dimethylformamid (1:1))Manufacture of polyglutaraldehyde 'powder and microspheres (0.2 µm diameter) as a function of the pH value (potentiometric titration with 0.1 N sodium hydroxide solution in aqueous dimethylformamide (1: 1))

PolyglutaraldehydPolyglutaraldehyde Mikrokügelchen
PH -Microspheres
PH - mSqüiviCarboxy IgT, mSqüiviCarboxy IgT, Anzaj^l der CarboxylAnzaj ^ l of carboxyl je Mikro
kügelchen
χ 10-7each micro
globules
χ 10-7 Pulver
PHpowder
PH g Polyglutaraldehydg polyglutaraldehyde gruppengroups 10,010.0 <0,03<0.03 je gxlÖ"¹⁹ each gxlÖ " ¹⁹ 11,011.0 0,050.05 <2,0<2.0 11,511.5 0,100.10 . 3,0. 3.0 12,312.3 0,130.13 6,06.0 13,5*13.5 * 10,510.5 0,950.95 7,87.8 < 1,5 < 1.5 11,511.5 <0,03<0.03 50,050.0 2*1,02 * 1.0 12,312.3 0,100.10 75,0 j75.0 j 0,300.30 $00839/0863-$ 00839 / 0863-

^X^lösliches, bei pH 6 ausgefälltes Polymerisat 2910414 ^X ^ soluble polymer 2910414 precipitated at pH 6

Das Vorhandensein von Aldehydgruppen wird mittels einer Fouriertransformierten Infrarot-Absorptionsspektrenreaktion mit Hydroxylamin-hydrochlorid und mit 2,4-Dinitrophenyl-hydrazinThe presence of aldehyde groups is determined by means of a Fourier transform Infrared absorption spectrum reaction with hydroxylamine hydrochloride and with 2,4-dinitrophenyl hydrazine

— festgestellt. Die Absorptionsbanden bei 1720, 1680 und 1635 cm sind früher schon den Schwingungen von nicht-konjugierten Aldehydgruppen, konjugierten Aldehydgruppen und Kohlenstoff-Kohlenstoff -Doppelbindungen in ct-Stellung" zur Aldehydgruppe zugeschrieben worden.- established. The absorption bands at 1720, 1680 and 1635 cm are previously the vibrations of non-conjugated aldehyde groups, conjugated aldehyde groups and carbon-carbon -Double bonds in ct-position "to the aldehyde group has been attributed.

Aus den Fourier-transformierten Infrarot-Absorptionsspektren ist ersichtlich, daß alle Absorptionsbanden, die für PoIyglutaraldehyd-Pulver charakteristisch sind, bei nicht-magnetischen' und bei magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen vorhanden sind. Eine zusätzliche Absorptionsbande bei 15^0 cm beruht wahrscheinlich auf einem-Restgehalt,an der verwendeten grenzflächenaktiven Verbindung. Die Anwesenheit von Eisenoxid-Kernen in den magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen ruft eine Verschiebung von einigen Absorptionsbanden hervor, beispielsweise der Banden von 1680, I36O und 1125 cm . Die Zu-From the Fourier transformed infrared absorption spectra it can be seen that all absorption bands for polyglutaraldehyde powder are characteristic of "non-magnetic" and magnetic polyglutaraldehyde microspheres available. An additional absorption band at 15 ^ 0 cm is probably based on a residual content of the used surfactant compound. The presence of iron oxide cores in the magnetic polyglutaraldehyde microspheres causes a shift in some absorption bands, for example the bands of 1680, 1360 and 1125 cm. The access

— 1 Ordnung der Absorptionsbande bei I68O cm zur Aldehydgruppe wird durch die Umsetzung von Polyglutaraldehyd mit Natriumbisulf it bestätigt. Das Reaktionsprodukt von Polyglutaraldehyd mit Natriumbisulfit zeigt eine Absorptionsbande bei I68O cm Ein weiterer Gesichtspunkt für Aldehydfunktionen ist die Stickstoffanalyse von Polyglutaraldehyd-Pulver, nicht-magnetischen und magnetischen Mikrokügelchen, die mit Hydroxylamin-hydrochlorid umgesetzt worden sind. Die Ergebnisse der in Tabelle VI- 1 order of the absorption band at 1680 cm to the aldehyde group is confirmed by the reaction of polyglutaraldehyde with sodium bisulfite. The reaction product of polyglutaraldehyde with sodium bisulfite shows an absorption band at 1680 cm Another consideration for aldehyde functions is nitrogen analysis of polyglutaraldehyde powder, non-magnetic and magnetic microspheres made with hydroxylamine hydrochloride have been implemented. The results of the in Table VI

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angegebenen Stickstoffanalysen zeigen, daß die Anzahl der Aldehydgruppen abnimmt, wenn.der pH-Wert, bei dem die Polymerisate The nitrogen analyzes given show that the number of aldehyde groups decreases when the pH value at which the polymers

hergestellt worden sind, erhöht wird. Er stimmt mit dem all- ^; mählichen Anstieg des Neutralisationsäquivalents (Tabelle V) überein, d.h. mit zunehmender Konzentration der Carboxylgruppen. Letztere werden bei Verbrauch der Aldehydgruppen (Tabelle V) gebildet, wie dies im Falle der Cannizzarö* sehen Reaktion zu erwarten ist. · ,are increased. He agrees with the all- ^; gradual increase in neutralization equivalent (Table V), that is, with increasing concentration of carboxyl groups. The latter are formed when the aldehyde groups (Table V) are consumed, as is to be expected in the case of the Cannizzarö * reaction. ·,

T a b e 1 1 e VI 'T a b e 1 1 e VI '

Reaktion von Pqiyglutaraldehyd-PuIver und -Mikrokügelchen (0,2 ,um Durchmesser), die mit Hydroxylamin bei verschiedenen pH-Werten hergestellt worden sind (Stickstoffanalyse der Reaktionsprodukte)Reaction of polyglutaraldehyde powder and microspheres (0.2 µm in diameter) coated with hydroxylamine have been produced at different pH values (nitrogen analysis of the reaction products)

PolyglutaraldehydPolyglutaraldehyde Mikrokügelchen
pHMicrospheres
pH % N im Reaktions
produkte % N in the reaction
Products -Anzahl der Aldehyd-Number of aldehydes je Mikrokügel
chen xl0~7per microsphere
chen xl0 ~ 7 ³ul.vei
PH ³ ul.vei
PH ■·."■ ·. " 7,8
7,3
2,27.8
7.3
2.2 je gxlO'"²-¹ each gxlO '" ² - ¹ 10,0
11,5
12,3
13,510.0
11.5
12.3
13.5 10,5
11,2
11,2^XX 10.5
11.2
11.2 ^XX 6,7
6,1 .
6,76.7
6.1.
6.7 3,1
1,8
0,93.1
1.8
0.9 1,2
1,01.2
1.0

^x berichtigt (der prozentuale Stickstoffwert beträgt vor der Umsetzung beim Pulver 0,05 % und bei den Mikrokügelchen 1,8 %) ^x corrected (the percentage nitrogen value before the reaction is 0.05 % for the powder and 1.8% for the microspheres)

nagnetisehe Mikrokügelchen (Eisengehalt lh %, mittels atomarer Absorption)Magnetic microspheres (iron content lh%, by means of atomic absorption)

909839/0863909839/0863

Qualitativ kann das Vorliegen von Aldehydgruppen mittels 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin gezeigt werden, wobei man gelb-orange gefärbte Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen erhält, wenn man die Umsetzung hetei'Ogen in wäßriger Suspension bei pH 2 durchführt. Die zum Vergleich verwendeten Poly-VP-AM-hydrazid-MikrOkügelchen ergeben einen negativen Färbtest. Es wurde beobachtet, daß bei saurem pH-Wert und bei einer hohen Salzkonzentration, Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen aggregieren. Da während einer Zellenmarkierung eine Mikrokugelchenaggregation vermieden werden muß, ist es im Falle von magnetischen >Polyglutaräldehyd-Mikrokügelchen erforderlich, den 0,15-m Natriumchloridgehält in der Phosphatpufferlösung durch einaa2,5--m Saccharosegehalt zu ersetzen. Jedoch die nicht-magnetischen Polyglütaraldehyd-Mikrokügelchen können sicher als Suspension in phosphatgepufferter Natriumchloridlösung verwendet werden. ' 'Qualitatively, the presence of aldehyde groups can be determined by means of 2,4-dinitrophenylhydrazine yellow-orange colored polyglutaraldehyde microspheres are obtained when the Implementation of hetei'Ogen in aqueous suspension at pH 2. The poly-VP-AM-hydrazide microspheres used for comparison give a negative color test. It was observed that at acidic pH and high salt concentration, polyglutaraldehyde microspheres aggregate. Since during a Cell marking microsphere aggregation must be avoided, it is in the case of magnetic ones > Requires polyglutaraldehyde microspheres containing 0.15 m sodium chloride in the phosphate buffer solution by aaa2.5 - m sucrose content to replace. However, the non-magnetic polyglutaraldehyde microspheres can be safely used as a suspension in phosphate-buffered sodium chloride solution. ''

Beispiel 9.Example 9.

Das Verfahren des Beispiels 8 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß die grenzflächenaktive Verbindung "durch 1 Gewichts prozent einer anionischen grenzflächenaktiven Verbindung auf Basis eines Fluorkohlenwasserstoffs ersetzt wird.'Der mittlere Teilehendurchmesser der PolyglutaraXdehyd-Mikrokügelchen liegt bei 0,1,um. ■ ·The procedure of Example 8 is repeated, but with the Provided that the surfactant compound is "by 1 weight percent of an anionic surfactant compound Basis of a fluorocarbon is replaced. The mean part diameter of the Polyglutaraxdehyde microspheres is at 0.1 µm. ■ ·

Beispiel 10Example 10

Das Verfahren des Beispiels 8 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß die grenzflächenaktive Verbindung durch ein Gemisch aus 1 Gewichtsprozent einer kationischen grenzflächen-The procedure of Example 8 is repeated, but with the proviso that the surface-active compound is formed by a mixture from 1 percent by weight of a cationic interfacial

909839/0863909839/0863

aktiven Verbindung auf Basis von Guar Gum und 5 Gewichtsprozent eines Suspendiermittels auf Basis eines Polyäthylenoxids mitactive compound based on guar gum and 5 percent by weight a suspending agent based on a polyethylene oxide with

ersetzt wird,/is replaced /

einem Molekulargewicht von 100 000/ Der mittlere Teilchendurchmesser der Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen beträgt 0,2,um.a molecular weight of 100,000 / the mean particle diameter the polyglutaraldehyde microsphere is 0.2 µm.

Beispiel. 11Example. 11

Stark fluoreszierende Polyglutaraldehy'd-Mikrokügelchen erhält man durch Zugabe von 10-n Natriumhydroxidlösung zu-einer, wäßrigen Suspension mit 1 Gewichtsprozent eines Mischpolymerisats von 60 % Acrylamid und ^O % Isobutoxymethacrylamid als grenzflächenaktive Verbindung mit einem Gehalt von 0,05 % 9~Aminoacridin als Fluorοchrom bis zum Erreichen von pH 11. Anschließend fügt man eine wäßrige Glutar dehydlösung bis- zur Endkonzentratiön von 5 Gewichtsprozent hinzu und stellt den pH-Wert wiederum auf 11 ein. Die Mikrokügelchen werden wie in Beispiel 8 beschrieben gereinigt. Es werden stark grün fluoreszierende Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,15.um erhalten.Highly fluorescent polyglutaraldehyde microspheres are obtained by adding 10N sodium hydroxide solution to an aqueous suspension with 1 percent by weight of a copolymer of 60 % acrylamide and 10% isobutoxymethacrylamide as a surface-active compound with a content of 0.05 % 9-aminoacridine as fluorochromium until pH 11 is reached. An aqueous glutaraldehyde solution is then added up to a final concentration of 5 percent by weight and the pH is again adjusted to 11. The microspheres are purified as described in Example 8. Strongly green fluorescent polyglutaraldehyde microspheres with a mean diameter of 0.15 µm are obtained.

Das Verfahren des Beispiels 11 wird mit 0,05 Gewichtsprozent verschiedener Fluoroch.romq,tfiederholt. Man erhält die in der nachstehenden Tabelle angegebenen Ergebnisse.The procedure of Example 11 is repeated with 0.05 percent by weight of various Fluoroch.romq, tf. You get the in the results given in the table below.

909839/0863909839/0863

29104H29104H

Tabelle VIITable VII

PluorochromPluorochrome

Propidium-bromidPropidium bromide

Amino-fluorescein (Isomer 1)Amino fluorescein (isomer 1)

o-Phthalaldehydo-phthalaldehyde

5-Dimethy!amino-1-naphthalinsu]fonyl-hydrazid 5-dimethylamino-1-naphthalene sulfonyl hydrazide

Fluorescein-isothioeyanat (gelöst in überschüssigem Äthylendiamin)Fluorescein isothioeyanate (dissolved in excess ethylenediamine)

Fluoreszenzfluorescence

rotRed

grün grüngreen green

grün grüngreen green

, B e i s ρ 1 e 1 12, B e i s ρ 1 e 1 12

Stark fluoreszierende Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen erhält man durch 24-stündiges Schütteln bei 25°C von 20 mg der nach Beispiel 8 hergestellten Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit 1 mg einer 0,01-prosentigen Fluorescein-isqthiocyanat-LösungPreserves highly fluorescent polyglutaraldehyde microspheres by shaking for 24 hours at 25 ° C of 20 mg of the after Example 8 polyglutaraldehyde microspheres prepared with 1 mg of a 0.01 prosentigen fluorescein isqthiocyanate solution

in Äthylendiamin. Die fluoreszierenden Mikrokugelehen werden wie in Beispiel 8 gereinigt und in Wasse'r oder phosphatgepufferter Natriumchloridlösung redispergiert.in ethylenediamine. The fluorescent microspheres will become Purified as in Example 8 and buffered in water or phosphate Sodium chloride solution redispersed.

Beispiel 13Example 13

Der Zusatz von 2,4-Dinitrophenyl-hydrazin zu Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen des Beispiels 8 bei pH 2 eigi"bt eine bleibende gelbe Farbe.The addition of 2,4-dinitrophenyl hydrazine to polyglutaraldehyde microspheres of Example 8 at pH 2 has a lasting effect yellow COLOUR.

Beispiel Ik Example Ik

Das Verfahren des Beispiels 8 wird in Gegenwart einer 1-gewichtsprosentigen wäßrigen Dispersion von Fe-,O^ mit einem . Gehalt von 5 Gev/ichtsprozent Eisen wiederholt. Man erhältThe procedure of Example 8 is carried out in the presence of a 1 weight rosin aqueous dispersion of Fe, O ^ with a. Repeated content of 5 weight percent iron. You get

909839/0863909839/0863

magnetische Kügelchen mit einem mittleren-Durchmeser von'0,1,um. Die Reinigung der Eisen enthaltenden Mikrokügelchen besteht·in einer Dialyse gegen V/asser und Abtrennen von diamagnet.ischen Verunreinigungen mittels eines permanenten Magneten. Die Substanz wird schließlich in 0,5-m phosphatgepufferter Saccharoselösung dispergiert. Die Konzentration der Teilchen in der Lösung beruht auf der Trockengewichtsanalyse. Ein bekanntes Volumen· der Lösung wird bei HO⁰C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. . "magnetic beads with a mean diameter of 0.1 µm. The purification of the iron-containing microspheres consists in dialysis against water and separation of diamagnetic impurities by means of a permanent magnet. The substance is finally dispersed in 0.5 M phosphate-buffered sucrose solution. The concentration of the particles in the solution is based on the dry weight analysis. A known volume of the solution is dried to constant weight ^{at HO 0 C.} . "

.Beispiel 15Example 15

Dispergierbares Eisenoxid wird durch Auflösen von 10 Gramm Eisen(II)-chlorid und 13,5 Gramm Eisen(III)-chlorid in 210 ml einer .l-'gewichtsprozentigen wäßrigen Lösung von Polyäthylenimin (Molgewicht' 1800) erhalten. Dann gibt man 50-prozentige Natriumhydroxidlösung bis- zum pH* 7 hinzu. Qas Reaktionsgemisch wird 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt, gründlich gegen Wasser dialysiert und dreimal magnetisch von nicht-magnetischen Teilchen' getrennt. Die magnetischen Polyäthylenimin-Eisenoxid-Teilchen werden in Wasser redispergiert und dann 10 Minuten mit einem'klinischen Sonikator beschallt. Es bilden sich magnetische Teilchen mit einem Durchmesser von 30 nm mit Aminogruppen an der Oberfläche.Dispersible iron oxide is made by dissolving 10 grams of ferric chloride and 13.5 grams of ferric chloride in 210 ml a .l-'weight percent aqueous solution of polyethyleneimine (Molecular weight '1800). Then you give 50 percent Add sodium hydroxide solution up to pH * 7. Qas reaction mixture is refluxed for 3 hours, dialyzed thoroughly against water and three times magnetic from non-magnetic Particles' separated. The magnetic polyethyleneimine iron oxide particles are redispersed in water and then sonicated with a'klinischen sonicator for 10 minutes. Make it up magnetic particles with a diameter of 30 nm with amino groups on the surface.

Beispiel 16 "Example 16 "

Es wird eine 1-prozentige Polyäthylenimin-Eisenoxid-Lösung wie in Beispiel 15 zu einer Suspension gemäß Beispiel 8 zugegeben. Man erhält magnetische Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen.It becomes a 1 percent polyethyleneimine iron oxide solution as in Example 15, added to a suspension according to Example 8. Magnetic polyglutaraldehyde microspheres are obtained.

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Beispiel 17Example 17

Bei der Zugabe einer 0,01-prozentigen Fluorescein-isothiocyanat-Lösung in Äthylendiamin zu einer Suspension gemäß Beispiel Ik erhält man fluoreszierende magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelohen mit einem mittleren Teilchendürchmesser von 0,1.um.When a 0.01 percent fluorescein isothiocyanate solution in ethylenediamine is added to a suspension according to Example Ik , fluorescent magnetic polyglutaraldehyde microspheres with an average particle diameter of 0.1 μm are obtained.

Beispiel 18'Example 18 '

20 mg der magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen von Beispiel Ik -werden 2k Stunden bei 25°C mit 1 mg Fluoresceinisothiocyanat, das in 0,02 ml destilliertem Äthylendiamin gelöst ist, geschüttelt. Die stark fluoreszierenden magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden gründlich gegen Wasser dialysiert und dann dreimal magnetisch getrennt. Die gereinigt.en Fikrokügelchen werden in Wässer oder in 0,5-m phosphatgepufferter Saccharoselösung redispergiert.20 mg of the magnetic polyglutaraldehyde microspheres from Example Ik are shaken for 2k hours at 25 ° C. with 1 mg of fluorescein isothiocyanate dissolved in 0.02 ml of distilled ethylenediamine. The highly fluorescent magnetic polyglutaraldehyde microspheres are dialyzed thoroughly against water and then magnetically separated three times. The purified microspheres are redispersed in water or in 0.5 m phosphate-buffered sucrose solution.

Beispiel- 19Example- 19

Es werden in einer wäßrigen Suspension mit einem Gehalt an einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel -Pölyglutaraldehyd-Mikrokügelchen gebildet. Zu einer gerührten wäßrigen Lösung von 5 Gewichtsprozent Glutaraldehyd, 10 % Toluol und/ 2 % eines im Handel erhältlichen Alkyl-polyäthoxyäthanols ("Triton X-100") wird bei 25°C lö-n Natriumhydroxidlösung zugegeben, bis pH 11 erreicht ist. Die Lösung wird 3 Stunden gerührt und dann dreimal bei 2000 g zentrifugiert. Es bilden, sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,5_/um, die nach dem in Beispiel 8 ge- 'Polyglutaraldehyde microspheres are formed in an aqueous suspension containing a water-immiscible solvent. Sodium hydroxide solution is added at 25 ° C. to a stirred aqueous solution of 5 percent by weight glutaraldehyde, 10 % toluene and / 2 % of a commercially available alkyl polyethoxyethanol ("Triton X-100") until pH 11 is reached. The solution is stirred for 3 hours and then centrifuged three times at 2000 g. There form, is polyglutaraldehyde microspheres The total to in Example 8 having an average diameter of about 0.5 _/ um, '

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-jf- ~:-jf- ~:

reinigten Verfahren abgetrennt und gewaschen werden.cleaned processes are separated and washed.

. B e i s ρ i e 1 20 ■ ' . B is ρ ie 1 20 ■ '

Magnetische Folyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden durch Zugabe einer 1-gewichtsprozentigen wäßrigen Dispersion von Fe-zOjj mit einem Gehalt von 5 Gewichtsprozent Eisen zu einer Suspension gemäß Beispiel 18 gebildet ,'■ dann dreimal magnetisch abgetrennt, gewaschen und dialysiert.Magnetic folyglutaraldehyde microspheres are made by adding a 1 weight percent aqueous dispersion of Fe-zOjj with a content of 5 weight percent iron to one Formed suspension according to Example 18, '■ then separated three times magnetically, washed and dialyzed.

Beispiel 21 ,Example 21,

Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen werden durch Auflösen von 125 mg Polyglutaraldehyd-Pulver gemäß Beispiel 1 in 2,5 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid gebildet. Die Lösung wird lebhaft gerührt. Dann fügt man 50 ml einer 2-prozentigen wäßrigen Lösung eines Polyäthylenoxids vom Molgewicht 100 000 hinzu und rührt die Lösung eine weitere Stunde. Es bilden sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem mittleren Durchmesser von. 0,1,um, die durch dreimaliges Zentrifugieren bei 2000 g gereinigt und dann in Wasser redispergiert werden.Polyglutaraldehyde microspheres are prepared by dissolving 125 mg of polyglutaraldehyde powder according to Example 1 in 2.5 ml anhydrous dimethyl sulfoxide formed. The solution becomes vivid touched. Then 50 ml of a 2 percent aqueous solution of a polyethylene oxide with a molecular weight of 100,000 are added and stir the solution for an additional hour. Polyglutaraldehyde microspheres with a mean diameter are formed from. 0.1 µm, which are purified by centrifuging three times at 2000 g and then redispersed in water.

•Beispiel 22.• Example 22.

Das Verfahren des Beispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß man als grenzflächenaktive Verbindung eine 4-gewichtsprozentige wäßrige Lösung eines anionisch substituiertenThe procedure of Example 21 is repeated, but with the proviso that the surface-active compound is a 4 percent by weight aqueous solution of an anionically substituted

Pluorkohlenwasserstoffs verwendet. Es bilden sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen. ; ■ \Fluorocarbon used. Polyglutaraldehyde microspheres are formed. ; ■ \

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-Jtf--Jtf-

Beispiel 23Example 23

Das Verfahren des Beispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß man als grenzflächenaktive Verbindung eine 4-prozentige wäßrige Lösung eines kationisch substituierten Fluorkohlenwasserstoffs verwendet. Es bilden sich Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen. The procedure of Example 21 is repeated, but with the proviso that the surface-active compound is a 4 percent aqueous solution of a cationically substituted fluorocarbon used. Polyglutaraldehyde microspheres are formed.

Beispiel 2k' Example 2k '

Fluoreszierende Mikrokügelchen werden durch Auflösen von 125 Polyglutaraldehyd-Pulver und 12 mg Aminofluorescein unter leb haftem Rühren in 205 ml wasserfreiem Dimethylsiifoxid hergestellt. Bei der Zugabe einer 2-prozentigen wäßrigen Poly- . äthylenoxidlösung erhält man fluoreszierende Polyglutaraldehyd-Perlchen mit einem mittleren Durchmeser von 0,1,um.Fluorescent microspheres are made by dissolving 125 polyglutaraldehyde powder and 12 mg aminofluorescein under living conditions vigorous stirring in 205 ml of anhydrous dimethylsiifoxid. When adding a 2 percent aqueous poly. ethylene oxide solution gives fluorescent polyglutaraldehyde beads with an average diameter of 0.1 μm.

Beispiel 25Example 25

Das Verfahren des Beispiels 21 wird wiederholt, jedoch mit der Maßgabe, daß zu der Dimethylsulfoxid-Lösüng eine 6-prozentige Polyäthylenimin-Eisenoxid-Lösung gemäß Beispiel 15 zugegeben wird. Man erhält fluoreszierende, magnetische Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen. _ .The procedure of Example 21 is repeated, but with the proviso that the dimethyl sulfoxide solution is 6 percent Polyethyleneimine iron oxide solution according to Example 15 is added. Fluorescent, magnetic polyglutaraldehyde microspheres are obtained. _.

Beispiel 26Example 26

Das Verfahren des Beispiels 8 wird wiederholt, indem man 50 mg des wasserlöslichen Polyacrylamide, anstelle des in Beispiel 8 genannten Mischpolymerisats als grensflächenaktive Verbindung verwendet. Man erhält P.olyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit 'The procedure of Example 8 is repeated using 50 mg of the water-soluble polyacrylamide instead of that in Example 8 named copolymer as a surface-active compound used. Polyglutaraldehyde microspheres are obtained with '

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einem mittleren Durchmesser von 0,2,Um.a mean diameter of 0.2 µm.

Beispiel 27Example 27

Wenn man das Verfahren des Beispiels 26 in Gegenwart einer 1-gewichtsprozentigen wäßrigen Dispersion von Ρβ,Ο. mit einem Gehalt von 5 Gewichtsprozent Eisen wiederholt, erhält man magnetische Perlchen. * .Following the procedure of Example 26 in the presence of a 1 percent by weight aqueous dispersion of Ρβ, Ο. with a Repeated iron content of 5 percent by weight gives magnetic ones Pearls. *.

Reaktionen der Polyglutaraldehyd-Mikroperlehen mit menschlichem Immunglobulin G:Reactions of polyglutaraldehyde microbeads with human Immunoglobulin G:

Um die erforderliche Reaktionszeit zur Konjugation von Antikörpern an Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen zu bestimmen, wird die Reaktionsgeschwindigkeit unter Verwendung von fluoreszierendem menschlichem Immunglobulin G als Modellfall untersucht. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität mit der Zeit ist ein Maß für die Bildungsgeschwindigkeit der kovalenten Bindung. Die anfänglich rasche Reaktion wird bei nicht-magnetischen und bei magnetischen Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen sowie bei pulverförmigem Polyglutaraldehyd zusammen mit einem Vergleichsversuch untersucht, bei.dem Poly-VP-AM-hydrazid-Mikrokügelchen verwendet werden, die frei von Aldehydgruppen sind. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität bei dem Vergleichsversuch zeigt eine physikalische Adsorption an menschlichem Immunglobulin G.an. Der pulverförmige Polyglutaraldehyd besteht aus Teilchen von 20 bis 80 ,um im Durchmesser und hat demzufolge einen viel kleineren Bereich als Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen von 200 nm Durchmesser» dies ist wahrscheinlich der Hauptgrund für dieTo get the reaction time required to conjugate antibodies on polyglutaraldehyde microspheres is used to determine the rate of reaction using fluorescent human immunoglobulin G examined as a model case. The decrease in fluorescence intensity over time is a measure for the rate of formation of the covalent bond. The initially rapid response is with non-magnetic and with magnetic polyglutaraldehyde microspheres as well as powdered Polyglutaraldehyde investigated together with a comparative experiment, bei.dem Poly-VP-AM-hydrazide microspheres which are free of aldehyde groups can be used. The decrease in fluorescence intensity in the comparative experiment shows one physical adsorption on human immunoglobulin G.an. The powdery polyglutaraldehyde consists of particles of 20 to 80 µm in diameter and consequently has a much smaller one Area as polyglutaraldehyde microspheres of 200 nm diameter »this is probably the main reason for the

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29104U29104U

niedrigere Reaktionsgeschwindigkeit.. " " - ~"slower reaction speed .. "" - ~ "

Markierte Zellen und magnetische Abtrennung:Marked cells and magnetic separation:

Es wurde gefunden, daß die Markierung von Zelloberflächenrezeptoren mittels fluoreszierender oder nicht-fluoreszierender oder fluoreszierender magnetischer Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen einfach und· wirksam ist, wie durch zählreiche Untersuchungen unter Verwendung von fixierten roten Blutkörperchen vom Mensch oder Truthahn als Modellsubstanzen ersichtlich ist. Vorversuche mit lebenden menschlichen Lymphocyten zur Kennzeichnung von Immunglobulin G-Molekülen an B-Zellenverliefen ebenfalls erfolgreich.It has been found that the labeling of cell surface receptors by means of fluorescent or non-fluorescent or fluorescent magnetic polyglutaraldehyde microspheres is simple and effective, as demonstrated by numerous examinations using fixed red blood cells can be seen from humans or turkey as model substances. Preliminary experiments with living human lymphocytes for labeling immunoglobulin G molecules B cells were also successful.

Beispiel 28Example 28

Markierung von menschlichen roten Blutkörperchen: Eine wäßrige Suspension von Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen (0,2 cm^j 2 mg Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 200 nm) wird mit 0,6 ml einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung von gereinigten Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin M (0,2 mg in 0,2 ml phosphatgepufferter Natriumchloridlösung) verdünnt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 4°C schwach gerührt. Dann fügt man 20 mg Rinderserumalbumin hinzu und setzt das Rühren eineHuman Red Blood Cell Labeling: An aqueous suspension of polyglutaraldehyde microspheres (0.2 cm ^ j 2 mg microspheres with a diameter of 200 nm) is mixed with 0.6 ml of a phosphate-buffered sodium chloride solution of purified goat anti-rabbit immunoglobulin M (0.2 mg in 0.2 ml of phosphate-buffered sodium chloride solution). The mixture is gently stirred at 4 ° C. for 3 hours. Then adds 20 mg of bovine serum albumin are added and stirring is continued

> ■ ■ ■> ■ ■ ■

weitere Stunde fort. Nicht-gebundene Antikörper werden dadurch abgetrennt, daß man die Suspension durch eine Säule mit einer Füllung von dreidimensional vernetzter Agarose durchlaufen läßt. Die Trennung wird spektrometrisch bei λ = 280 nm überwacht. another hour away. Unbound antibodies are separated by passing the suspension through a column with a Filling of three-dimensionally crosslinked agarose can run through. The separation is monitored spectrometrically at λ = 280 nm.

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. 291Q4H. 291Q4H

Menschliche rote Blutkörperchen von einem normalen Spender und mit Glutaraldehyd fixiert werden mit Kaninchen-Antihumanroten Blutkörperchen sensibilisiert. Die roten Blutkörperchen (10'), die in 0,5 ml einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung mit einem Gehalt von 0,2 mg Antiserum suspendiert sind, werden 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dann werden die Zellen abgetrennt und dreimal durch Rotierenlassen der phosphatgepufferten Natriumchloridsuspension in einer internationalen Zentrifuge bei 500 g gewaschen. Die Ziegen-Antikaninchen-Mikrokügelchen werden dann zu den Pellets der sensibilisierten menschlichen roten Blutkörperchen gegeben« Das Gemisch wird 1 Stunde bei.^⁰C langsam gerührt. Die roten Blutkörperchen werden dann von nicht-reagierten konjugierten Mikrokügelchen durch dreimaliges Zentrifugieren bei 500 g abgetrennt. Die markierten Zellen werden in 0,4 ml phosphatgepufferter Natriumchloridlösung resuspendiert und im Licht eines Rasterelektronenmikroskops untersucht.Human red blood cells from a normal donor and fixed with glutaraldehyde are sensitized with rabbit anti-human red blood cells. The red blood cells (10 '), which are suspended in 0.5 ml of a phosphate-buffered sodium chloride solution containing 0.2 mg of antiserum, are stirred for 30 minutes at room temperature. The cells are then separated and washed three times by rotating the phosphate buffered sodium chloride suspension in an international centrifuge at 500 g. The goat anti-rabbit microspheres are then added to the pellets of sensitized human red blood cells, "the mixture in 1 hour. ^ ⁰ C stirred slowly. The red blood cells are then separated from unreacted conjugated microspheres by centrifuging three times at 500 g. The marked cells are resuspended in 0.4 ml of phosphate-buffered sodium chloride solution and examined in the light of a scanning electron microscope.

Bei jedem Versuch werden zwei Kontrollversuche durchgeführt:Two control tests are carried out for each test:

1. Mikrokügelchen werden mit menschlichem Immunglobulin G konjugiert und auf sensibilisierte rote Blutkörperchen einwirken gelassen; und1. Microspheres are conjugated with human immunoglobulin G. and exposed to sensitized red blood cells; and

2. Mikrokügelchen, die mit Ziegen-Antikaninchen-Imniunglobulin G konjugiert sind, werden auf nicht-sensibilisierte rote Blutkörperchen einwirken gelassen.2. Microspheres infected with goat anti-rabbit immunoglobulin G are conjugated to non-sensitized red blood cells allowed to act.

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2910.4 U2910.4 U

Markierung von menschlichen Lymphozyten:Marking of human lymphocytes:

Es wird die Markierung von lebenden menschlichen Lymphocyten mittels Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen untersucht.The labeling of living human lymphocytes using polyglutaraldehyde microspheres is examined.

Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 200 nm werden mit menschlichem Immunglobulin G, das mit Pluoresceinisothiocyanat markiert ist, wie in Beispiel 28 beschrieben, konjugiert. Die Anzahl der markierten Rezeptoren werden unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Sie stimmen mit den zuvor erhaltenen Vierten innerhalb einer Fehlergrenze von ί 10 % überein.Polyglutaraldehyde microspheres 200 nm in diameter are conjugated with human immunoglobulin G labeled with pluorescein isothiocyanate as described in Example 28. The number of labeled receptors are counted under the fluorescence microscope. They agree with the fourth received previously within an error limit of ί 10 % .

Die Abtrennung der magnetisch markierten menschlichen roten Blutkörperchen wird auf folgendem Weg erreicht:The separation of the magnetically marked human red blood cells is achieved in the following way:

Es werden Gemische von menschlichen roten Blutkörperchen mit den nachstehenden Verhältnissen von unmarkierten zu markierten Zellen hergestellt: 1:1, 7:1 und 9:1. Jeweils 10 ml der Gemische werden in einem Glasgefäß, das mit einem Hufeisenmagneten (0,03 T) ausgerüstet ist, langsam gerührt. Mach 2 Stunden werden die Zellen, die nicht an die Gefäßwandungen angezogen sind, isoliert. Die durch den Magneten angezogenen Zellen werden mit 10 ml einer phosphatgepufferten Natriumchloridlösung verdünnt, und die magnetische Abtrennung wird wiederholt. Die Untersuchung unter einem Rasterelektronenmikroskop zeigt, daß 95 % der unmarkierten Zellen aus allen drei synthetischen Gemischen dadurch abgetrennt werden konnten.Mixtures of human red blood cells are prepared with the following ratios of unlabeled to labeled cells: 1: 1, 7: 1 and 9: 1. 10 ml each of the mixtures are slowly stirred in a glass vessel equipped with a horseshoe magnet (0.03 T). After 2 hours, the cells that are not attracted to the vessel walls are isolated. The cells attracted by the magnet are diluted with 10 ml of a phosphate buffered sodium chloride solution and the magnetic separation is repeated. Examination under a scanning electron microscope shows that 95 % of the unlabeled cells from all three synthetic mixtures could be separated off in this way.

Der Grad der unspezifischen Reaktion mit lebenden menschlichen Lymphocyten sowie die Wirksamkeit der magnetischen AbtrennungThe degree of non-specific reaction with living human lymphocytes and the effectiveness of magnetic separation

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~4~~ 4 ~

der Zellensubpopulationen mittels eines magnetischen Trenners werden gegenwärtig untersucht.of the cell subpopulations by means of a magnetic separator are currently being investigated.

Das neue, einfach zu handhabende Immunreagens in Form von Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen ist in einer Vielzahl von Größen und mit einer verhältnismäßig engen Größenverteilung hergestellt worden. Den Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen kann während ihrer Herstellung eine hohe Fluoreszenzintensität zugeteilt werden, die dennoch eine hohe Konzentration von Aldehydgruppen auf der Oberfläche belassen. Die funktioneilen Aldehydgruppen gestatten eine kovalente Bindung mit Antikörpern, Enzymen und anderen Proteinen in einer einzigen Stufe. Aus diesem Grunde vermeidet dieses Imrnunreagens die früher angewendeten Zwischenstufen, bei denen eine Cyanbromid- und Carbodiimid-Reaktion angewendet worden ist. Der weite Bereich einer Ionenbeständigkeit und des pH-Werts ohne Auftreten von Aggregationen und die hohe Spezifität der Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen - zumindest soweit es menschliche rote Blutkörperchen betrifft - sind ebenfalls erwünschte Eigenschaften.The new, easy-to-use immune reagent in the form of polyglutaraldehyde microspheres is available in a variety of Sizes and with a relatively narrow size distribution. The polyglutaraldehyde microspheres can During their preparation a high fluorescence intensity can be assigned, which nevertheless has a high concentration of aldehyde groups left on the surface. The functional aldehyde groups allow a covalent bond with antibodies, Enzymes and other proteins in a single step. For this reason, this immune reagent avoids those previously used Intermediate stages using a cyanobromide and carbodiimide reaction. The wide area an ion resistance and pH without the occurrence of Aggregations and the high specificity of the polyglutaraldehyde microspheres - at least as far as human red blood cells are concerned - are also desirable properties.

Eine geringe Modifikation bei der Herstellung liefert fluoreszierende magnetische Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen für eine große Anzahl von Anwendungsgebieten.A small modification in the manufacturing process gives fluorescent ones magnetic polyglutaraldehyde microspheres for a wide variety of uses.

Die Verwendung von magnetischen Teilen hat ein sehr großes Interesse in der biochemischen Forschung und der klinischen Medizin hervorgerufen, wenn sie als Trägermaterialien für immobilisierte Enzyme verwendet werden. Ihre leichte WiedergewinnungThe use of magnetic parts is of great interest evoked in biochemical research and clinical medicine when used as support materials for immobilized Enzymes are used. Your easy recovery

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. i . i

' 291QAH ' 291QAH

aus Flüssigkeiten, die kolloide und gelöste Peststoffe enthalten, sollte von praktischem Wert sein. Die Abtrennung von Proteinen und chemischen Verbindungen mittels Affinitätschromatographie kann durch Ausschalten langv/ieriger Zentrifugierverfahren und Säulenchromatographiestufen vereinfacht werden. Die magnetischen Teilchen sind auch kürzlich bei Radioimmunoassay-Techniken,bei'der Hyperthermiebehandlung von Krebs und bei der Leitung von magnetischen leuchen zu einer, vasculären Mißbildung, wie zerebralem Aneurysma, mit der Absicht untersucht worden, den Schaden durch Induzieren einer Thrombose zu verschließen.from liquids that contain colloidal and dissolved pesticides, should be of practical value. The separation of proteins and chemical compounds using affinity chromatography can be done by switching off lengthy centrifugation processes and column chromatography steps can be simplified. The magnetic particles are also recently used in radioimmunoassay techniques Hyperthermia treatment of cancer and the conduction of magnetic glow to one, vascular Malformation, such as cerebral aneurysm, has been studied with the intention of reducing the damage by inducing thrombosis to close.

Andere vorgeschlagene Anwendungsgebiete sind Spurensucher im Blutstrom oder in Vehikeln zur Drogenentwöhnung. Die erste erfolgreiche Anwendung von magnetischen Immun-Mikrokügelehen ist bei der Abtrennung von B- und T-Zellen gezeigt worden. Die Ergebnisse sind später durch Verwendung von C-1300-Neuroblastom-Zellen bestätigt worden. Es besteht ein geringer Zweifel, daß eine physikalische Sonderung von Zeilsubpopulationen notwendig wird. Zahlreiche Trennmethoden, obwohl sie brauchbar sind, sind durch beschränkte .Parametersätze begrenzt, auf die die Trennung basieren kann, und außerdem durch die Tatsache, daß sie absatzweise betrieben werden.Other suggested areas of application are in search of traces Bloodstream or in drug cessation vehicles. The first successful application of magnetic immune microspheres has been shown in the separation of B and T cells. The results are later using C-1300 neuroblastoma cells has been confirmed. There is little doubt that a physical segregation of cell subpopulations becomes necessary. Numerous separation methods, while useful, are limited by restricted parameter sets to which the separation can be based, and also by the fact that they are operated batchwise.

Neue Geräte zur Blutkörperchenzählung im Blut und neue Sortierer gestatten ein quantitatives Messen zahlreicher* Parameter und ein Sortieren aufgrund dieser Messungen, doch sind sie inso-New devices for counting blood cells in the blood and new sorters allow a quantitative measurement of numerous * parameters and sorting on the basis of these measurements, but they are inso-

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weit auf die Anzahl der Zellen beschränkt, die in einer gegebenen Zeit abgetrennt werden können. Magnetische Zellensortierer besitzen das Potential einer Zelltrennung in einem kontinuierlichen Verfahren. Die bei den gegenwärtigen Untersuchungen unter Verwendung des Modellzellsysteras erhaltene Klarheit zeigt an, daß magnetische Polyglutaraldehyd-Immun-Mikrokügelchen von gewünschten Größen mit Proteinen in einfacher und leicht zu handhabender Weise konjugiert werden können und deshalb ein Potential für eine breite Staffelung immunologischer Zellsortierung sowie anderer Anwendungsgebiete darstellen.far limited to the number of cells that can be separated in a given time. Magnetic cell sorters have the potential of a cell separation in a continuous Procedure. The clarity obtained in the current investigations using the model cell syste indicates polyglutaraldehyde magnetic immune microspheres of desired sizes can be conjugated with proteins in a simple and easy-to-use manner and therefore represent a potential for a broad grading of immunological cell sorting as well as other areas of application.

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Claims (45)

•29104U Patentans prü'che• 29104U patent pending 1) Verfahren zur Herstellung von Polyglutaraldehyd, dadurch gekennzeichnet, daß man.monomeren Glutaraldehyd in einem wäßrigen organischen Lösungsmittelmedium mit einem Gehalt von 5 "bis 80 Gewichtsprozent an organischen Lösungsmittel löst, den pH-Wert der Lösung auf über 7 erhöht und · den Glutaraldehyd polymerisiert.1) Process for the preparation of polyglutaraldehyde, thereby characterized that one.monomers Glutaraldehyde in an aqueous organic solvent medium containing from 5 "to 80 percent by weight of organic solvent dissolves, increases the pH of the solution to over 7 and polymerizes the glutaraldehyde. 2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Polymerisation den Wassergehalt des Mediums auf über 80 Prozent erhöht und den Polyglutaraldehyd ausfällt,2) Method according to claim 1, characterized in that after the polymerization, the water content of the medium is increased to over 80 percent increased and the polyglutaraldehyde precipitates, 3) Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel ein stark polares Losungsreittel in einer Menge von 20 bis 80 Gewichtsprozent verwendet, 3) Method according to claims 1 or 2, characterized in that that the organic solvent is a strongly polar solvent used in an amount of 20 to 80 percent by weight, 4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid verwendet,4) Method according to claim 3, characterized in that one as the organic solvent, dimethyl sulfoxide or dimethylformamide used, 5) Verfahren nach .mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Lösung auf 9 bis 12 einstellt. *5) Method according to .at least one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the pH of the solution is adjusted to 9 to 12. * 6) Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß man,eine 0,1- bis 50-gewichtsprozentige Lösung von Glutaraldehyd verwendet,6) Method according to at least one of claims 1 to 5 »thereby characterized in that one, a 0.1 to 50 percent by weight Solution of glutaraldehyde used, 7} Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, da-7} Method according to at least one of claims 1 to 6, since 90983^/086390983 ^ / 0863 ... 2310414... 2310414 durch gekennzeichnet, daß man bei der Polymerisation die Temperatur der Lösung zuerst 30 bis 180 Minuten auf 15 bis 30⁰C hält und dann die Temperatur der Lösung auf über 40 C erhöht.characterized in that the temperature of the solution is first kept at 15 to 30 ^° C. for 30 to 180 minutes and then the temperature of the solution is increased to above 40 ° C. during the polymerization. 8) Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1, 2 und 5 bis 7j dadurch gekennzeichnet, daß man in dem wäßrigen organischen Lösungsmittelmedium ein mit Wasser nicht-mischbares organisches Lösungsmittel in einer Menge von 5 bis 50 Gewichtsprozent als organisches Lösungsmittel und zusätzlich eine grenzflächenaktive Verbindung in einer Menge von 0,1 bis 3 Gewichtsprozent verwendet und daß man die Lösung rührt und_t den Polyglutaraldehyd in Form von Mikrokügelchen· gewinnt und ausfällt.8) Method according to at least one of claims 1, 2 and 5 to 7j, characterized in that a water-immiscible organic solvent in an amount of 5 to 50 percent by weight as the organic solvent and additionally a surface-active compound in the aqueous organic solvent medium an amount of 0.1 to 3 weight percent is used, and that the solution is stirred and _t the polyglutaraldehyde in the form of microspheres · wins and fails. 9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als grenzflächenaktive Verbindung eine nicht-ionische grenzflächenaktive Verbindung verwendet.9) Method according to claim 8, characterized in that a non-ionic surface-active compound is used as the surface-active compound Connection used. 10) Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Lösung des Polyglutaraldehyds 0,1 bis 3 Gewichts-'prozent einer grenzflächenaktiven Verbindung zugibt, die erhaltene Lösung rührt und den Polyglutaraldehyd in Form von Miki-okügelchen ausfällt.10) Method according to claims 1 and 6, characterized in that that 0.1 to 3 percent by weight of a surface-active compound is added to the solution of the polyglutaraldehyde, the resulting Stir the solution and the polyglutaraldehyde in the form of Miki-o-beads fails. 11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man der gerührten Lösung zusätzlich eine Suspension eines feinteiligen Metalls zugibt und metallhaltige Polyglutaraldehyd-Mikrokügelchen ausfällt.11) Method according to claim 10, characterized in that the stirred solution is additionally a suspension of a finely divided Metal adds and metal-containing polyglutaraldehyde microspheres fails. 12). Verfahren zur Herstellung von fluorescierendem Polyglutaraldehyd nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch ge-12). Process for the production of fluorescent polyglutaraldehyde according to at least one of claims 1 to 11, characterized 909333/0363909333/0363 kennzeichnet, daß man den erhaltenen Polyglutaraldehyd mit> einer nicht-fluorescierenden Verbindung umsetzt und dabei fluorogene-Gruppen bildet.indicates that the polyglutaraldehyde obtained is> a non-fluorescing compound converts and doing fluorogenic groups forms. 13) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die nicht-fluorescierende Verbindung mit den Acroleingruppen dea Polyglutaraldehyds umsetzt.13) Method according to claim 12, characterized in that the non-fluorescent compound is reacted with the acrolein groups of the polyglutaraldehyde. 14) Verfahren nach den Ansprüchen 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-fluorescierende Verbindungen Anthron, m-Amino-phenol oder Aminofluorescein verwendet..14) Method according to claims 12 or 13 »characterized in that that anthrone is used as a non-fluorescent compound, m-Amino-phenol or aminofluorescein used. 15) Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichenPolyglutaraldehyd-ilikrokügelchen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14j dadurch gekennzeichnet, daß man zu einem wäßrigen Medium 0,1 bis 20 Gewichtsprozent Glutaraldehyd und 0,1 bis 3 Gewichtsprozent einer organischen wasserlöslichen grenzflächenaktiven Verbindung zusetzt, den pE-\7ert des Mediums auf 7 bis 13 einstellt,15) Method of making water-insoluble polyglutaraldehyde microspheres according to at least one of claims 1 to 14j, characterized in that an aqueous medium 0.1 up to 20 percent by weight glutaraldehyde and 0.1 to 3 percent by weight of an organic water-soluble surfactant compound adds, sets the pE- \ 7ert of the medium to 7 to 13, und/
das Gemisch rührt aus/cTem Reaktionsgemische Polyglutaraldehyd-Mikrokügolchen geviinnt.and/
the mixture is stirred from the reaction mixtures of polyglutaraldehyde microspheres, convoluted. 16) Verfahren nach Anspruch 15, dadurch-gekennzeichnet, daß man ein Lied ium nit einem" Gehalt von 5 bis 50 Prozent eines organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel verwendet.16) Method according to claim 15, characterized in that one a song with a "content of 5 to 50 percent of an organic, Solvents immiscible with water are used. 17) Verfahren nach den Ansprüchen 15 oder .16, dadurch gekennzeichnet, daß man dera Keaktionsgemisch eine Suspension eines feinteiligen i.Ictalls mit Teilchendurchmessern unter 100 nm zusetzt,17) Method according to claims 15 or .16, characterized in that that one dera reaction mixture is a suspension of a finely divided i.Ictalls with particle diameters below 100 nm are added, 18) Verfahren nach "Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als iietall ein solches mit einer Ordnungszahl über 50 verwendete18) Method according to "claim 17, characterized in that one when iietall used one with an ordinal number above 50 BAD ORiGiNALBAD ORiGiNAL 19) Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ifetall Blei, Nickel, Kobalt, Platin, Gold oder Eisen verwendet. "-· ■19) Method according to claim 18, characterized in that there is used as Ifetal lead, nickel, cobalt, platinum, gold or iron. "- · ■ 20) Verfahren nach den Ansprüchen 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das Metall in Form eines Oxids verwendet. 20) Process according to claims 17 or 18, characterized in that the metal is used in the form of an oxide. 21) Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Metalloxid Fe^O, verwendet.21) Method according to claim 20, characterized in that Fe ^ O is used as the metal oxide. 22) Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 17 "bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich ein Suspendiermittel in einer Menge von 1 bis 5 Gewichtsprozent mitverwendet.22) Method according to at least one of claims 17 "to 21, characterized in that a suspending agent is additionally used in an amount of 1 to 5 percent by weight. 23) Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß.man •als Suspendiermittel ein Polyäthy^enoxid verwendet.23) Method according to claim 22, characterized in that dass.man • A polyethylene oxide is used as a suspending agent. 24) Verfahren nach den Ansprüchen 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaral— dehyd in Form von Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 20 nm bis 10 um gewinnt.24) Method according to claims 15 to 23, characterized in that that the practically water-insoluble polyglutaraldehyde in the form of microspheres with a diameter of 20 nm to 10 to win. ■25) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von Hikrokügelchen mit einem Durchmesser von unter 10 nm und mit einem Gehalt von 0,5 bis 40 Prozent Metall gewinnt.■ 25) Method according to claim 24, characterized in that one the practically water-insoluble polyglutaraldehyde in the form of microspheres with a diameter of less than 10 nm and with a content of 0.5 to 40 percent metal wins. 26) Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von magnetisch anziehbaren Mikrokügelchen gewinnt.26) Method according to claim 25, characterized in that one the practically water-insoluble polyglutaraldehyde in the form of magnetically attractable microsphere wins. 27) Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 26, dadurch gekenn-27) Method according to claims 12 to 26, characterized 909839/4B63909839 / 4B63 BAD ORIGINALBATH ORIGINAL zeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form τοη Mikrokügelchen mit fluorogenen Gruppen gewinnt,draws that the practically water-insoluble polyglutaraldehyde in the form of τοη microspheres with fluorogenic groups, 28) Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von Mikrokügelchen mit fluorogenen Gruppen als Fluorοchrom gewinnt.28) Process according to claim 27, characterized in that the practically water-insoluble polyglutaraldehyde is in the form of microspheres with fluorogenic groups as fluorochrome wins. 29) Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß man den Polyglutaraldehyd mit einer mit Aldehydgruppen reaktionsfähigen fluorochromen Verbindung umsetzt.29) The method of claims 12 to 28, characterized in that reacting the polyglutaraldehyde with a reactive aldehyde groups with fluorochrome compound. JO) Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man als fluorochrome Verbindung Aminofluorescein, 9-Amino-phenol,
Propidium-broinid oder Fluorescein-isothioeyanat verwendet.JO) Process according to claim 29, characterized in that the fluorochromic compound is aminofluorescein, 9-aminophenol,
Propidium broinid or fluorescein isothioeyanate is used. 31) Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von. Mikrokügelchen an ein Protein gebunden gewinnt.31) Method according to claim 24, characterized in that the practically water-insoluble polyglutaraldehyde in the form of. Microspheres bound to a protein wins. 32) Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man den praktisch wasserunlöslichen Polyglutaraldehyd in Form von Mikrokügelchen an Antikörper, Antigene, Immunglobuline, Lymphocyteη und/oder Hämoglobin gebunden.gewinnt.32) Method according to claim 31, characterized in that one the practically water-insoluble polyglutaraldehyde in the form of microspheres of antibodies, antigens, immunoglobulins, lymphocytes and / or hemoglobin bound. wins. 33) Verwendung des nach den Ansprüchen 1 bis 32 hergestellten
Polyglutaraldehyds als Überzug auf einer Substratoberfläche.33) Use of the prepared according to claims 1 to 32
Polyglutaraldehyde as a coating on a substrate surface. 34) Ver?iendung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke des Überzugs 0,0025 bis 0,125 mm beträgt.34) Ver? Iendung according to claim 33, characterized in that the The thickness of the coating is 0.0025 to 0.125 mm. 35) Verwendung nach den Ansprüchen 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat teilchenförmig ist.35) Use according to claims 33 or 34, characterized in that that the substrate is particulate. 909839/0863909839/0863 BAD ORIGINALBATH ORIGINAL •29104 H• 29104 H. 36) Verwendung nach den Ansprüchen 33 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat mit Aldehydgruppen^ reaktionsfähige funkfionelle Gruppen auf v/eist.36) Use according to claims 33 to 35, characterized in that that the substrate is reactive with aldehyde groups functional groups on v / eist. 37) Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Hydroxyl-, Amino- oder Hydrazidgruppen als funkticnelle Gruppen aufweist.37) Use according to claim 36, characterized in that the substrate hydroxyl, amino or hydrazide groups as functional Has groups. 38) Verwendung nach den Ansprüchen 33 ^i*³ 37» dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Mikrokügelchen' oder -perlchen eines synthetischen organischen Polymerisats mit einem-Durchmesser von 20 nm bis 100 um sind.38) Use according to claims 33 ^ i * ³ 37 »characterized in that the substrate are microspheres or beads of a synthetic organic polymer with a diameter of 20 nm to 100 μm. 39) Verwendung nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ein Acrylamid-Mischpolymerisat ist.39) Use according to claim 38, characterized in that the polymer is an acrylamide copolymer. 40) Verwendung nach Anspruph 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerisat ein Mischpolymerisat -aus-mindestens 50 Prozent Vinylpyridin oder Methacrylsäure-hydroxyäthylester, 5 bis 35 Prozent Acrylamid und 0,1 bis 30 Prozent eines damit mischpolymerisierbaren. Vernetzungsmittels ist.40) Use according to Claim 39, characterized in that the polymer is a copolymer of at least 50 percent Vinyl pyridine or hydroxyethyl methacrylate, 5 to 35 percent Acrylamide and 0.1 to 30 percent of one copolymerizable therewith. Is crosslinking agent. 41) Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischpolymerisate Hydrazidgruppen aufweisen.41) Use according to claim 40, characterized in that the copolymers have hydrazide groups. 42) Verwendung nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyglutaraldehydübersug außen an ein Amin gebunden ist.42) Use according to claim 35, characterized in that the Polyglutaraldehydübersug is externally bound to an amine. 43) Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Amin ein Protein ist.43) Use according to claim 42, characterized in that the amine is a protein. 44) Verwendung nach Anspruch 43> dadurch gekennzeichnet, daß44) Use according to claim 43> characterized in that 909839/0863909839/0863 BAD ORIGINALBATH ORIGINAL das Protein Antikörper, Antigene, Iffinrunglobuline, Lymphocyten und/oder Hämoglobin sind.the protein antibodies, antigens, lymphocytes, lymphocytes and / or hemoglobin. 45) Verwendung nach den Ansprüchen 33 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die überzüge fluorescierend sind.45) Use according to claims 33 to 44, characterized in that that the coatings are fluorescent. 909839/G8S3909839 / G8S3