DE3224484A1 - Polymere mikrokuegelchen und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Polymere mikrokuegelchen und verfahren zu ihrer herstellung

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DE3224484A1
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Uzi Rehovot Beitler
Shlomo Margel
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen durch Polymerisation von Verbindungen des . Acrolein-Typs, d.h. «,^-olefinisch ungesättigten Carbonylverbindungen, sowie diese polymeren Mikrokügelchen. Die Mikrokügelchen können fluoreszierend oder magnetisch sein, und es können Hybrid-Mikrokügelchen hergestellt werden. Die Mikrokügelchen sind für die verschiedensten Zwecke brauchbar, z.B. zum Markieren von Zellen,zur Trennung von Zellen, zur Rezeptor-Abtrennung, zur Affinitätschromatographie, für diagnostische Zwecke, zur Immobilisierung von Enzymen und zur Verabfolgung von Arzneistoffen. Die Mikrokügelchen können an die verschiedensten Verbindungen mit Aminogruppen gebunden werden, z.B. Arzneistoffe, Enzyme, Antikörper» oder Antigene, die ihre Aktivität beibehalten. Die Mikrokügelchen lassen sich hin sieht lieh. Durchmesser und anderer -Eigen- schäften nach verschiedenen Verfahren entsprechend dem gewünschten Produkt herstellen.
Es besteht ein Bedarf an der Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Isolierung von Zeiloberflächenrezeptoren
und zur Abtrennung von Zellen der verschiedensten Typen. Die Markierung von spezifischen Rezeptoren an Zelloberflächen hat eine große Bedeutung zum Verständnis verschiedener biologischer Erscheinungen, z.B. der Ausbildung des Erkennungsmechanismus von Zellen während der Entwicklung, der Zellkommunikation und Unterschieden zwischen normalen Zelloberflächen und Tumorzelloberflachen. Der Nachweis von Antigenen und Kohlenhydratresten an der Oberfläche von Zellen wurde mit verschiedenen Methoden intensiv untersucht, z.B. mit fluoreszierenden oder radioaktiven Antikörpern oder Lectinen oder durch Bindung biologischer Makromoleküle, wie Ferritin, Hemocyanin, Viren oder Peroxidase an Antikörper oder Lectine. Die bio-
L -J
■"* S —
logischen Makromoleküle wurden als Marker für die Transmissionselektronenmikroskopie oder für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) verwendet. Polymere Mikrokügelchen wurden "auch als Marker zur Zellmarkierung eingesetzt. Polystyrol-Latexteilchen wurden als immunologische Marker in der SEM-Technik verwendet.· Derartige Teilchen sind hydrophob und kleben deshalb unspezifisch an zahlreichen Oberflächen und Molekülen. Deshalb sind sie in ihrer Anwendungsbreite beschränkt. Es wurden zahlreiche andere polymere Mikrokügelchen hydrophilen Charakters hergestellt und zum Markieren von Zeiloberflächenrezeptoren benutzt| vgl. Tabelle I.
Tabelle I
Hydrophile vernetzte Mikrokügelchen
1. Em-Klasse: Methylmethacrylat (MMA) 2-Hydroxyäthylmethacrylat (HEMA), Methacrylsäure (MA) und Athylenglykoldimethacrylat (EGMA) &' ' 2. L-Klasse: HEMA, MA und Bisacrylamid (BAM)*5'
3. BAH-Klasse: HEMA, Acrylamid (AA), MA und BAM b^
4. DMA-Klasse: HEMA, 2-Dimethyläminoäthylmethacrylat (DMA) und BAM b^
5· PVP-Klasse: ^-Vinylpyridin allein oder mit HEMA und/ oder AA ' '
al
Anm.: ' = Emulsionspolymerisation
' = Polymerisation unter Bestrahlung mit Kobalt-Gammastrahlen
30
Das Markierungsverfahren wurde entweder nach der direkten oder der indirekten Methode durchgeführtj vgl. Pig. I.
In beiden Methoden wird in der ersten Stufe ein gereinigter Antikörper an ein Mikrokügelchen über dessen funktioneile Gruppen an seiner Oberfläche kovalent gebunden. Bei der
L J
direkten Methode fangen die Immun -Mikrokügelchen, d.h. Mikrokügelchen, an die ein spezifischer Antikörper kovalent gebunden ist, die Zellantigene ab und binden sie. Bei der · indirekten Methode wird noch ein zweiter Antikörper angewendet.
Die Mikrokügelchen haben je nach den eingesetzten Monomeren entweder Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen, Amid- und/oder Pyridingruppen auf ihrer Oberfläche. Die funktionellen Gruppen werden zur kovalenten Bindung von Antikörpern und anderen Proteinen an die Mikrokügelchen entweder mittels Brom-
cyan, einem Carbodiimid' oder" Glutardialdehyd gebunden}' vgl. 3.
Die letzte Stufe der Herstellung von Derivaten aus den Mikro kügelchen besteht vor der Bindung des Proteins aus einer Umsetzung mit Glutardialdehyd, um in der Oberfläche der Mikrokügelchen reaktionsfähige Aldehydgruppen einzuführen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von polymeren Mikrokügelchen aus Verbindungen vom Acrolein-Typ, d.h* aus cx,ß-olefinisch ungesättigten Carbonylverbindungen, zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Her-
stellung dieser Mikrokügelchen zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Hybrid -Mikrokügelchen zu schaffen. Weitere Aufgaben ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.
Polyacrolein-Mikrokügelchen werden auf zwei Wegen hergestellt:
a) Durch Polymerisation von Acrolein unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart geeigneter Tenside werden anionisehe
Mikrokügelchen erhalten;
b) durch radikalische Polymerisation von Acrolein in Gegen-L J
wart geeigneter Tenside und gegebenenfalls in Gegenwart weiterer Acryl-Monomere* werden "radikalische" Mikrokügelchen erhalten.
Bei der Polymerisation von Acrolein in wäßrigem Medium und unter alkalischen Bedingungen bildet sich ein wasserunlösliches Acrolein-Polymerisat. Die Polymerisation ist von erster Ordnung hinsichtlich der Acrolein-Konzentration und die Polymerisationsgeschwindigkeit hängt vom pH-Wert des Polymerisationsmediums abj vgl. Fig. 4. Je höher der pH-Wert, desto höher ist die"Polymerisationsgeschwindigkeit. Die Analyse durch IR-Spektroskopie bestätigt die Gegenwart von Aldehydgruppen'sowie Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, Äthergruppen und Doppelbindungen. Bei sehr hohem pH-Wert, d.h. oberhalb 15,5, erfolgtauch Cannizzaro-Reaktion (zwei Aldehydgruppen setzen sich unter Bildung einer Hydroxylgruppe und einer Carboxylgruppe um), und es bildet sich ein wasserlösliches Polyacrolein. "
Die Polymerisation von Acrolein in wäßrigem Medium unter . alkalischen Bedingungen und in Gegenwart geeigneter Tenside (nichtioniseh, anionisch oder kationisch) liefert Polyac'rolein-Mikrokügelchen; vgl. Fig. 5. Die' Größe der Mikrokügelchen läßt sich durch Änderung der Acrolein-Konzentration (vgl. Fig. 6), der Tensidkonzentration (vgl.
Fig. 7) oder des pH-Werts des Polymerisationsmediums (vgl. Fig. 8) steuern. Durch Zusatz von Dimethylformamid zum wäßrigen Medium (oder anderen entsprechenden Lösungsmitteln, wie Dimethylsulfoxid) wird die Löslichkeit des Acroleins erhöht. Dies führt zur Bildung gleichmäßig großer Polyacrolein-Perlen.
Fluoreszierende oder magnetische Mikrokügelchen werden erhalten, wenn die Polymerisation des Acroleins in Gegenwart
entsprechender fluorochromer Verbindungen, wie Fluoresceinisothiocyanat, Aminofluoresceini oder Tetramethylrhodamin-
L J
-δι isothioeyanat, oder in Gegenwart von ferrofluiden Verbindungen durchgeführt wird.
Das Acrolein kann in wäßrigem Medium auch in Gegenwart von Redox-Initiatoren, wie Ammoniumpersulfat-Silbernitrat, oder durch Bestrahlung mit Kobalt-Gammastrahlen, polymerisiert, werden. Das Polyacrolein hat folgende Struktur:
CHOi
η hat einen Wert von 100 bis 10 000. Der Polymerisationsgrad ist verschieden von dem, der bei der Polymerisation: in alkalischem Medium erhalten wird. Die hydrophilen Eigenschaften und damit die Spezifität gegenüber Zellen des durch radikalische Polymerisation erhaltenen Polyacroleins lassen, sich entweder durch Rühren des Polymers bei hohem pH-Wert (etwa
in
pH 12)/einer wäßrigen Lösung (es erfolgt Cannizzaro-Reaktion) oder durch Copolymerisation von Acrolein mit hydrophilen Monomeren, wie Hydroxymethylmethacrylat, erhöhen.
Die radikalische Polymerisation von Acrolein in Gegenwart geeigneter Tenside führt zur Bildung von radikalischen Mikrokügelchen, die eine andere Struktur haben als die Mikrokügelchen, die bei der Polymerisation in alkalischem Medium erhalten werden. Bei zunehmendem pH-Wert von 11,5 bis 13 nehmen die hydrophilen Eigenschaften der Mikrokügelchen zu. Die Copolymerisation von Acrolein mit hydrophilen Monomeren in Gegenwart geeigneter Tenside liefert ebenfalls Mikrokügelchen mit stark hydrophilen Eigenschaften.
Die anionischen Polyacrolein-Mikrokügelchen können mit radikalischen Mikrokügelchen beschichtet werden; vgl. Fig. 9.
Die verhältnismäßig großen anionischen Mikrokügelchen sind
von den kleineren radikalischen Mikrokügelchen vollständig bedeckt. Beispielsweise sind anionische Mikrokügelchen mit
einem Durchmesser von 2,0 u mit radikalischen Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 u bedeckt. Eine Steigerung der Größe der radikalischen Mikrokügelchen auf 0,5 u hat zur Folge, daß die radikalischen Mikrokügelchen sich von der Oberfläche der anionischen Mikrokügelchen ablösen. Das Beschichtungsverfahren beruht auf der radikalischen Polymerisation.von Acrolein in Gegenwart der anionischen Mikrokügelchen. Bei dieser Beschichtung werden die radikalischen Mikrokügelchen auf die Oberfläche der anionischen Mikrokügelchen über ihre Doppelbindungen aufgepfropft.
Mittels dieser Pfropfcopolymerisation können die anionischen Polyacrolein-Mikrokügelchen mit zahlreichen anderen polymeren Mikrokügelchen beschichtet werden. Beispielsweise können Polyvinylpyridin-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 fc^auf die Oberfläche von anionischen PoIy-
• " ■ Wt
acrolein-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 2 u durch radikalische Polymerisation von 4-Vinylpyridin in Gegenwart der anionischen Polyacrolein-Mikrokügelchen aufgepfropft
werden.
In gleicher Weise können andere oc,ß-olefinisch ungesättigte Carbon^lverbindungen polymerisiert werden.
Die Erfindung wird anhand der Figuren weiter erläutert. Fig. 1 zeigt schematisch die direkte (a) und die indirekte
(b) Markierung von lebenden Zellen mittels Immun-
Mikrokügelchen.
Fig. 2 zeigt ein Reaktionsschema für das Bromcyan- und
Carbodiimid-Verfahren.
Fig. J5 zeigt das Reaktionsschema für das Glutardialdehyd-
Verfahren.
Fig. 4 zeigt Reaktionsgeschwindigkeiten erster Ordnung bei verschiedenen pH-Werten für die Polymerisation von Acrolein in wäßrigen Medien (Temperatur 2J0C;
Acroleinkonzentration 2 #).
35
Fig. 5 zeigt Rasterelektronenmikroskop-Photographien von Polyacrolein-Mikrokügelchen verschiedener Größe.
L J
Pig. β zeigt die Größe von Polyacrolein-Mikrokügelchen als Funktion der Acroleinkonzentration (Temperatur 23°C; pH-Wert 10; Tensid PGL-NaHSO^ 0,5 Gew.-# pro Volumen).
Fig. 7 zeigt die Größe von Polyacrolein-Mikrokügelchen als
Funktion der Tensidkonzentration (PGL-NaHSO,) • . (-Temperatur 2jj°C; pH-Wert 10; .AcroTeinkonzentration
15 Gew.-^ pro Volumen).
Fig. 8 zeigt die Größe von Polyacrolein-Mikrokügelchen als Funktion des pH-Werts bei der Polymerisation (Temperatur 230Ci Acroleinkonzentration I5 Gew.-% pro Volumen; Tensid PGL-NaHSO^) 0,5 Gew.-% pro Volumen. Fig. 9 zeigt Rasterelektronenmikroskop-Photographien von Hybrid -Polyacrolein-Mikrokügelchen.
Fig. 9A zeigt anionische Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße von 2,0 pm, die mit radikalischen. Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 ^/beschichtet worden sind
(x 4600). ■
Fig. 9B zeigt anionische Polyacrolein-Mikrokügelchen mit
(x 12 000).
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 '
Herstellung des Tensids PGL-NaHSO5
Das Tensid wird durch Umsetzung von Polyglutaraldehyd-(PGL) mit Natriumbisulfit folgendermaßen hergestellt:
12,5 g Natriumbisulf it werden in J50 ml Wasser gelöst. Dann werden 5 S PGL zugegeben, und die Lösung wird gerührt, bis
alles in Lösung gegangen ist. Danach wird die Lösung extensiv gegen Wasser dialysiert. Die Ausschlußgrenze des
L J
- .11 - Π
Dialyseschlauchs beträgt 3500 Molmasse. Sodann wird gefriergetrocknet.
Beispiel 2
Herstellung von Polyacrolein-Mikrokügelchen unter alkalischen •Bedingungen
Eine 8 Gew.-^ Acrolein in 0,5 % PGL-NaHSO, enthaltende Lösung wird tropfenweise mit 0,2N Natronlauge versetzt, bis ein pH-Wert von 10,5 erreicht ist. Die Umsetzung wird 2 Stunden fortgesetzt. Danach werden die erhaltenen Mikrokügelchen (Durchmesser 0,1 pm)4mal durch 20minütiges Zentrifugieren bei 2000 χ g gewaschen. Durch Änderung der Tensidkonzentration und/oder der Acroleinkonzentration, des pH-Werts des - . . ■ ■ -
Polymerisationsmediums oder des Lösungsmittels läßt sich die Größe der Mikrokügelchen zuverlässig steuern.
Beispiel ■ 3 Herstellung von magnetisierbaren Mikrokügelchen
Beispiel 2 wird in Gegenwart von 5 Volumprozent einer ferrofluiden Lösung (wäßrige Dispersion von Pe^O^J hergestellt von Ferrofluidics, Burlington, MA, Nr. AOl 5 Gew.-^ pro Vo-
o_ lumen) wiederholt. Es werden magnetisierbare Polyäcrolein-Mikrow
kügelchen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,04 u erhalten. Die magnetisierbaren Mikrokügelchen werden durch Dialyse gewaschen und sodann von diamagnetischen Verunreinigungen mittels eines Permanentmagneten getrennt.
Beispiel 4
Herstellung von fluoreszierenden Mikrokügelchen
Beispiel 2 wird in Gegenwart von 0,008 Gew.-% pro Volumen Tetramethylrhodaminisothiocyanat wiederholt. Es werden fluoreszierende Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 ρ erhalten.
L J
B e i s ρ i e 1 5 Beispiel 2 wird mit Methacrolein anstelle von Acrolein wiederholt. Es werden.Mikrokügelchen mit einer durchschnittlichen Größe von 0,1 ρ/erhalten.
Beispiel 6
Beispiel 2.wird mit Crotonaldehyd anstelle von Acrolein wiederholt. Es werden Mikrokügelchen einer durchschnittIi-
chen Größe von 0,2 u/erhalten.
10
Beispiel 7
Beispiel 2 wird mit den anionischen Tensiden Dowfax 2Al bzw. Dowfax 3B2 anstelle von PGL-NaHSO^ wiederholt. Es werden Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße von 0,1 ρ erhalten.
Beispiel 8 Beispiel 2 wird mit dem nichtionischen Tensid Polysurf IO-56B, einem Copolymerisat von Acrylamid und Isobutoxy-
acrylamid, anstelle von PGL-NaHSO, wiederholt. Es werden Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße
von 0,1 u" erhalten. . · ' ·
Beispiel 9 .
Eine wäßrige Lösung, die 10 Gew.-% Dimethylformamid, 25
Gew.-^ Acrolein und Ο,θ8 Gew.-^ PGL-NaHSO, enthält, wird tropfenweise mit 0,2N Natronlauge versetzt, bis ein pH-Wert von 11,5 erreicht ist. Die Umsetzung wird eine weitere Stunde fortgesetzt. Sodann werden die erhaltenen 30
Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 3 ρ 4mal durch lOminütiges Zentrifugieren bei 500 χ g gewaschen.
Beispiel 10
10 ml einer wäßrigen Lösung, die 10 Gew.-% Dimethylformamid und 0,3 Gew.-^ PGL-NaHSO^, enthält, werden mit 0,2N Natronlauge auf einen pH-Wert von 11,2 eingestellt. Die Lösung
L J
wird gelinde gerührt und mit 5 ml Acrolein versetzt. Die Um setzung wird weitere 15 Minuten fortgesetzt. Danach werden die erhaltenen Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße von 8o u /mehrmals durch Dekantieren gewaschen.
B e i s ρ i e 1 1 1
Herstellung von Polyacrolein-Mikrokügelchen durch strahlungsinduzierte Polymerisation
100 ml einer wäßrigen Lösung, die 9 Gew. -Jo Acrolein und 0,5 Gew.-^ Polyäthylenoxid vom Molekulargewicht 100 000 enthält, werden mit Argon entlüftet und danach mit einer Kobaltquelle (1 Mega rad) bestrahlt. Die erhaltenen Mikrokügelchen mit'einem Durchmesser von 0,15 u/werden 4mal
durch JOininütiges Zentrifugieren bei 2000 χ g gewaschen.
Beispiel 12 Beispiel 11 wird in Gegenwart von 5 Gew.-% Hydroxymethylmethacrylat wiederholt. Es werden Mikrokügelchen mit einer m. '
Durchschnittsgröße von 0,2 u erhalten.
B e i s ρ i el 1· 5 " . Beispiel 11 wird in Gegenwart von 1 Gew.-% N,N'-Methylenbis-(acrylamid) als Vernetzungsmittel wiederholt. Es werden
»■«·
Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße von 0,15 u erhalten.
Beispiel Ik
Beispiel 11 wird in Gegenwart von Methacrolein wiederholt. 30
Es werden Mikrokügelchen einer Durchschnittsgröße von
m. -0,2 u/erhalten.
Beispiel 15
Beispiel lh wird in Gegenwart von 0,008 Gew.-% Fluoresceinisothiocyanat wiederholt. Es werden fluoreszierende PoIymethacrolein-Mikrokügelchen mit einer Größe von 0,2 u^erhalten.
L J
Γ 3224Α84
Beispiel 1β Beispiel 11 wird in Gegenwart von Methylvinylketon wiederholt. Es werden Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße
von 0,2 u/erhalten.
5
Beispiel '17
Die in Beispiel 11 hergestellten Mikrokügelchen werden 12 Stunden in einer wäßrigen Lösung vom pH-Wert 12,0 behandelt und danach durch 4maliges Zentrifugieren während ^O Minuten bei 2000 χ g gewaschen. Es werden hydrophile Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße von 0,15 u/erhalten.
Beispiel 18 120 ml einer wäßrigen Lösung, die 9 Gew.-^ Acrolein, 0,5-Gew. # Polyäthylenoxid vom Molekulargewicht 100 000 und 1,0 mMol Ammoniumpersulfat enthält, werden mit Argon entlüftet. Sodann wird die Lösung unter Rühren mit 1,0 mMol Silbernitrat ■ versetzt. Die Umsetzung wird 12 Stunden fortgesetzt. Danach werden die erhaltenen Mikrokügelchen.mit einer Durchschnittsgröße von 0,1 pTdurch 4maliges Zentrifugieren während 20 Minuten bei 2000 χ g gewaschen.
·■
Beispiel 19 Beispiel 18 wird in Gegenwart von 5 Gew.-% Perrofluidlösung
wiederholt. Es werden magnetisierbare Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einer Durchschnittsgröße von 0,05 u/erhalten. Die Mikrokügelchen werden durch Dialyse gewaschen und danach von diamagnatisehen Verunreinigungen mittels eines Permanentmagneten abgetrennt.
Beispiel 20 Herstellung von Hybrid-Mikrokügelchen
4 ml einer wäßrigen Lösung mit 9 Gew.-% Acrolein, 0,5 Gew.-^ Polyäthylenoxid vom Molekulargewicht 100 000 und 100 mg anionischen Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einer Größe
γ ι
-15. -
von 2,0 μ/werden mit Argon entlüftet. Danach wird die Lösung unter Rühren mit einer Kobaltquelle (1 Mega rad) bestrahlt. Die gepfropften Mikrokügelchen (vgl. 'Pig. 9) werden von den überschüssigen 0,1 ii/radikalischen Mikrokügelchen durch 4-maliges Zentrifugieren während 10 Minuten bei 500 χ g befreit.
Beispiel 21 4 ml einer wäßrigen Lösung mit einem Gehalt von 8 Gew. -$> Acrolein, 0,5 Gew.-%'Polyäthylenoxid vom Molekulargewicht 100 000, O,o6 mMol Ammoniumpersulfat und 100 mg anionischen Polyacrolein-Mikrokügelchen mit einer Größe von 2,0 um werden mit Argon entlüftet. Sodann wird die Lösung unter Rühren mit Ο,Οβ mMol Silbernitrat versetzt. Die Umsetzung wird weitere 12 Stunden fortgesetzt« Danach werden die gepfropften Mikrokügelchen durch 4maliges Zentrifugieren während 10 Minuten bei 500 χ g gewaschen.
Beispiel 22
Beispiel 20 wird mit 1 Gew.-% 4-Vinylpyridin anstelle von Acrolein wiederholt.
Beispiel 23
Beispiel 21 wird mit 1 Gew.-^ .4-Vinylpyridin anstelle von Acrolein wiederholt.
Beispiel 24 Markierung von roten Blutkörperchen mit Mikrokügelchen
gemäß Beispiel 4-Durch alkalische PolymerisationVerhaltene Polyacrolein-Mikrokügelchen werden 2 Stunden bei 4 C mit gereinigtem Ziegen-Antikaninchen IgG (GxRIgG) geschüttelt (1 mg Mikrokügelchen, 0,1 mg GxRIgG in einem Gesamtvolumen von 0,15 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung PBS). Danach
wird nichtgebundener Antikörper durch Hindurchleiten der Mikrokugelchensuspension durch eine Sepharose 4B Säule
L J
abgetrennt. Die Abtrennung wird spektrophotometrisch bei 28o nm kontrolliert. Die freien Aldehydgruppen des Mikrokügelchen-Antikörper-Konjugats werden mehrere Stunden bei H-0C mit 2gew.~$iger Rinderserumalbuminlösung behandelt.
■ Frische humane rote Blutkörperchen von einem gesunden Spender werden 50 Minuten bei 4°G mit Kaninchen-Antihuman-rote Blutkörperchenserum (Cappel Lab. Inc.) (10 humane rote Blutkörperchen mit 0,8yug Kaninchen-Antihuman-rote Blutkör- ■ perchenserum in 0,1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung geschüttelt. Die erhaltenen sensibilisierten Blutkörperchen werden abgetrennt und durch 4-maliges Zentrifugieren bei 5OO g . gewaschen. Sodann werden die Mkrokügelchen, die Ziegen-Anti-
kaninchen IgG gebunden enthalten (derivatisierte Mikrokügel- - chen), zu den sensibilisierten menschlichen roten Blutkörperchen gegeben, und das Gemisch wird 1 Stunde bei 4°G geschüttelt. Hierauf werden die roten Blutkörperchen von den : ' 'nichtumgesetzten derivatisierten Mikrokügelchen durch Jimalxges Zentrifugieren bei 5OO χ g abgetrennt. Die markierten Zellen werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und durch Fluoreszenzlichtmikroskopie und mit einem fluoreszenzaktivierten Zelltreriner'(FACS-11; Becton-Dickinson, Photovervielfacher 600Y, 2 Filter - 550 nm) untersucht'. ' " ...
Beispiel25
Abtrennung von roten Blutkörperchen des Truthahns von humanen roten Blutkörperchen
Ein Gemisch von 10 humanen roten Blutkörperchen und 10 rö-30
ten Blutkörperchen des Truthahns werden mit magnetisierbaren Mikrokügelchen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Markierungsmethode behandelt. Sodann wird ein kleiner Magnet an der Außenwand eines Gefäßes befestigt, die eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung des Zellengemisches enthält. Nach 10 Minuten werden die Zellen, die nicht vom Magnet
L J
vom Magnet 1 an die Gefäßwand angezogen werden., isoliert. Die/angezogenen
Zellen werden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, und die magnetische Abtrennung'wird 2mal wiederholt. Die Untersuchung unter dem Lichtmikroskop zeigt, daß mehr 5 als 90 % der vom Magnet angezogenen Zellen menschliclie rote Blutkörperchen sind.
Die Polyacrolein-Mikrokügelchen können zur Zellmarkierung und Abtrennung von Zellen anderer Systeme verwendet werden, 10 z.B. zur Markierung und Abtrennung von B- und T-Zellen, sowie für andere Zwecke, wie Verabfolgung von Arzneistoffen, den Enzym-Immuntest und die Enzymimmobilisierung.
L J

Claims (14)

VOSSIU S -VOSS IUS -TAUCH N ER H EUNEMANN- RA UH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4 · 8000 MÜNCHEN 86 · PHONE: (OB9) 47 4O75 CABLE: BENZOLPATENT MDNCHEN · TELEX 5-29 453 VOPAT D U.Z.: R 83I (VoAo) " June 30, 1982 Case: T/470 YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY, LTD. Rehovot, Israel ■ " Polymere Mikrokügelchen und Verfahren zu ihrer Herstellung " Priorität: .I.7.I98I, Israel, Nr. 63 220 Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von polymeren Mikrokügelchen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung vom Acrolein-Typ bei einem pH-Wert von 8 bis 13,7 in Gegenwart eines Tensids polymerisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation mittels einer freie Radikale liefernden Quelle durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung vom Acrolein-Typ Acrolein, Methacrolein, Crotonaldehyd oder Methylvinylketon einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von hydrophilen Mikrokügelchen die PoIy-
merisation in Gegenwart eines hydrophilen Monomers durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von fluoreszierenden Mikrokügelchen die Polymerisation in Gegenwart eines Fluoreszenzfarbstoffes durchführt.
6. . Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von magnetischen Mikrokügelchen die Polymerisation in Gegenwart eines ferrofluiden Materials durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation in Gegenwart von Magnetit-Teilchen (Fe^O2.) durchführt.
8. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Mikrokügelchen, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Anspruch 1 hergestellte Mikrokügelchen mit gemäß Anspruch 2 durch radikali~ sehe Polymerisation hergestellten Mikrokügelchen auf der Basis von Monomeren des Acrolein-Typs pfropfcopolymerisiert.
9. Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Mikrokügelchen dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Anspruch 1 hergestellte Mikrokügelchen mit anderen, durch radikalische Polymerisation hergestellten Mikrokügelchen pfropfcopolymerisiert.
10. Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen, die an Verbindungen mit primären Aminogruppen gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man gemäß Anspruch 1 oder 2 hergestellte Mikrokügelchen an primäre Aminogruppen enthaltende Verbindungen bindet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindungen mit primären Aminogruppen Arzneistoffe, Enzyme, Antikörper oder Antigene einsetzt.
L- J
12. Mikrokügelchen, erhältlich, durch Polymerisation einer Verbindung vom Acrolein-Typ bei einem pH-Wert von 8 bis 13»7 in Gegenwart eines Tensids und gegebenenfalls in Gegenwart eines ITuoreszenzfarbstoffes oder eines ferrofluiden Materials.
13. Mikrokügelchen, erhältlich durch Pfropfcopolymerisation von gemäß Anspruch 1 hergestellten Mikrokügelchen mit gemäß Anspruch 2 durch radikalische Polymerisation hergestellten Mikrokügelchen auf der Basis von Monomeren des Acrolein-Typs.
14. Mikrokügelchen, erhältlich durch Bindung von gemäß Anspruch 1 oder 2 hergestellten Mikrokügelchen an primäre Aminogruppen enthaltende Verbindungen.
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