JPS5917997A - ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法 - Google Patents
ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法Info
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- JPS5917997A JPS5917997A JP57128420A JP12842082A JPS5917997A JP S5917997 A JPS5917997 A JP S5917997A JP 57128420 A JP57128420 A JP 57128420A JP 12842082 A JP12842082 A JP 12842082A JP S5917997 A JPS5917997 A JP S5917997A
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- phenylalanine
- benzyloxycarbonyl
- acid
- aqueous solution
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
- C07K5/06121—Asp- or Asn-amino acid the second amino acid being aromatic or cycloaliphatic
- C07K5/0613—Aspartame
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- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
パラギン酸及び塩化ベンジルオキシカルボニル並びにフ
ェニルアラニン及びメタノールから酵素反応を利用して
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスバルチル
ーＬ−フェニルアラニンメチルエステルとフェニルアラ
ニンメチルエステルとの付加化合物を製造する方法に関
するものであるＯアミノ基を保護したモノ了ミノジカル
ボン酸とカルボキシル＆ｉｔ−低級アルコキシ基等で保
護してエステルとしたモノアミノモノカＡ／ボン酸とを
蛋白分解酵素の存在下で反応させ更に反応生成物と、こ
のカルボキシル４ｔ−エステル化シタモノアミノモノカ
ルポン酸との付加１に合物を形成させて、ジ・ペプチド
°工とは公知である（特開昭Ｆ）３−９２７２９号）。
ェニルアラニン及びメタノールから酵素反応を利用して
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスバルチル
ーＬ−フェニルアラニンメチルエステルとフェニルアラ
ニンメチルエステルとの付加化合物を製造する方法に関
するものであるＯアミノ基を保護したモノ了ミノジカル
ボン酸とカルボキシル＆ｉｔ−低級アルコキシ基等で保
護してエステルとしたモノアミノモノカＡ／ボン酸とを
蛋白分解酵素の存在下で反応させ更に反応生成物と、こ
のカルボキシル４ｔ−エステル化シタモノアミノモノカ
ルポン酸との付加１に合物を形成させて、ジ・ペプチド
°工とは公知である（特開昭Ｆ）３−９２７２９号）。
こうして得られる付加化合物は食品、医薬品等の中間体
として重要なものであるが、そのうちでもＮ−ベンジル
オキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステルとフェニルアラニンメチルエ
ステルとの付加化合物（以下ＺＡＰＭ−ＰＭと略記する
）は容易に低カロ１１−甘味剤であるアスパルテームに
誘導できることから時に重要である。
として重要なものであるが、そのうちでもＮ−ベンジル
オキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステルとフェニルアラニンメチルエ
ステルとの付加化合物（以下ＺＡＰＭ−ＰＭと略記する
）は容易に低カロ１１−甘味剤であるアスパルテームに
誘導できることから時に重要である。
上述した公知の方法では、ＺＡＰＭ−ＰＭはいずれ％、
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（以下Ｚ
Ａと略記する）又はその塩及びフェニルアラニンメチル
エステル（以下ＰＭと略記する）又はその塩を出発原料
として製造されている。そのｉ合これらの出発原料はい
ずれも純度の＾い状態に単離（結晶化）したものを用い
ている。Ｒ素を用いる反応では反応系に夾雑成分がある
と場合によっては酵素の阻害、失活が起る恐れがあるの
で、これらの共存を避けて反応を行うのが一般的である
。
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸（以下Ｚ
Ａと略記する）又はその塩及びフェニルアラニンメチル
エステル（以下ＰＭと略記する）又はその塩を出発原料
として製造されている。そのｉ合これらの出発原料はい
ずれも純度の＾い状態に単離（結晶化）したものを用い
ている。Ｒ素を用いる反応では反応系に夾雑成分がある
と場合によっては酵素の阻害、失活が起る恐れがあるの
で、これらの共存を避けて反応を行うのが一般的である
。
結晶ＺＡは通常アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカ
ルボニルを塩基の存在下水溶液中で反応させたのち、酸
を加えて反応液のｐｋｌを酸性側にしてＺＡを結晶化さ
せ、単離、乾燥させることにより得られる。一方の原料
であるＰＭ（塩陳塩）はフェニルアラニンを塩化水素の
存在下メタノール中でメタノールと反応させたのち、メ
タノールを留去し生成したＰＭの塩酸頃の結晶を単離し
、乾燥させることにより得られる。
ルボニルを塩基の存在下水溶液中で反応させたのち、酸
を加えて反応液のｐｋｌを酸性側にしてＺＡを結晶化さ
せ、単離、乾燥させることにより得られる。一方の原料
であるＰＭ（塩陳塩）はフェニルアラニンを塩化水素の
存在下メタノール中でメタノールと反応させたのち、メ
タノールを留去し生成したＰＭの塩酸頃の結晶を単離し
、乾燥させることにより得られる。
本発明者らはこれらの原料の製造工程と酵素反応とを有
機的に結合させることによって、用いる酵素を失活させ
ることなしに製造工程数と用いる副原料の使用量を減少
させることを目的として研究を行って本発明に到達した
◎ 即ち本発明はアスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカル
ボニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させてＺＡを含
む水溶液を祠製し、別にフェニルアラニンを酸の存在下
でメタノールと反応させてＰＭを生成させ、過剰のメタ
ノールを水で置換してＰＭの水溶液とし、先に１製した
ＺＡを含む水溶液と混合し、これに蛋白分解酵素をその
失活が実質的に起きない条件下で添加し、蛋白分解酵素
が酵素活性を示す条件下でＺＡとＰＭとを反応させてＺ
ＡＰＭ＠ＰＭを析出させこれを回収することを特徴とす
るジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合
物の製造方法を提供するものである。
機的に結合させることによって、用いる酵素を失活させ
ることなしに製造工程数と用いる副原料の使用量を減少
させることを目的として研究を行って本発明に到達した
◎ 即ち本発明はアスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカル
ボニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させてＺＡを含
む水溶液を祠製し、別にフェニルアラニンを酸の存在下
でメタノールと反応させてＰＭを生成させ、過剰のメタ
ノールを水で置換してＰＭの水溶液とし、先に１製した
ＺＡを含む水溶液と混合し、これに蛋白分解酵素をその
失活が実質的に起きない条件下で添加し、蛋白分解酵素
が酵素活性を示す条件下でＺＡとＰＭとを反応させてＺ
ＡＰＭ＠ＰＭを析出させこれを回収することを特徴とす
るジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合
物の製造方法を提供するものである。
本発明で用いるアスパラギン酸及びフェニルアラニンは
それぞれのも一体又１ｒｉＬ体とＤ一体の混合物を用い
る◎ 本発明の第一段の工程の一方の反応でめるＺＡの水溶液
の調製反応はアミノ酸のアミノ基の保護基でＩるＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル基導入の一般的な方法（ショツ
テン−バウマン法）に従って行うことができる。即ち約
５ないし約５０％のアスパラギン酸とアスパラギン酸に
対してモル比で１ないし約３倍量の塩基を含む水溶液中
にアスパラギン酸〈対シテモル比で１ないし約２倍量の
塩化ベンジルオキシカルボニルを加えさらに同じ〈約１
ないし約３倍量の塩基を反応液の温度が０ないし３０℃
の間で添加する。アスパラギン酸（及び塩基の一部）に
代えテアスパラギン酸の塩を用いてもよい。ここで使用
する塩基性物質はアンモニア、１級および２級アミン以
外のものであれば有機および無機のいずれの塩基も使用
することができる。これらのうちでも水酸化ナトリウム
や水酸化カリウムのような水酸化アルカリ金属ノ＾、お
よび炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウムのようなアルカ１７金属類の炭酸
塩を工業的見地力１ら特に好適な例として挙げることが
できる。このようにして製造したＺＡ水溶液はそのまま
次工程へまわすことができるかベンジルアルコール、未
反応の塩化ベンジルオキシカルボニル等を含んでいるの
で、トルエン、エチレンジクロリド、石油エーテル、メ
チルイソブチルケトン等の水と二相を形成することので
きる有機溶媒で洗浄しｆｃ：ｆ＆使用することが望まし
いｏ″ｉたこれらの溶媒の存在下でＮ−ベンジルオキシ
カルボニル化反応を行い反応後二相を分離してＺＡを含
む水溶液をｔｉ＋４製してもよい□ 本発明の第一段の工程の他方の反応であるＰＭ水溶液調
製の反応は酸の存在下、アミノ酸のメメノール中におけ
るエステル化の一般的な方法（フィッシャー法等）によ
りフェニルアラニンとメタノールを反応させ次のち、メ
タノールを水とｔｔＳするものである。
それぞれのも一体又１ｒｉＬ体とＤ一体の混合物を用い
る◎ 本発明の第一段の工程の一方の反応でめるＺＡの水溶液
の調製反応はアミノ酸のアミノ基の保護基でＩるＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル基導入の一般的な方法（ショツ
テン−バウマン法）に従って行うことができる。即ち約
５ないし約５０％のアスパラギン酸とアスパラギン酸に
対してモル比で１ないし約３倍量の塩基を含む水溶液中
にアスパラギン酸〈対シテモル比で１ないし約２倍量の
塩化ベンジルオキシカルボニルを加えさらに同じ〈約１
ないし約３倍量の塩基を反応液の温度が０ないし３０℃
の間で添加する。アスパラギン酸（及び塩基の一部）に
代えテアスパラギン酸の塩を用いてもよい。ここで使用
する塩基性物質はアンモニア、１級および２級アミン以
外のものであれば有機および無機のいずれの塩基も使用
することができる。これらのうちでも水酸化ナトリウム
や水酸化カリウムのような水酸化アルカリ金属ノ＾、お
よび炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウ
ム、炭酸水素カリウムのようなアルカ１７金属類の炭酸
塩を工業的見地力１ら特に好適な例として挙げることが
できる。このようにして製造したＺＡ水溶液はそのまま
次工程へまわすことができるかベンジルアルコール、未
反応の塩化ベンジルオキシカルボニル等を含んでいるの
で、トルエン、エチレンジクロリド、石油エーテル、メ
チルイソブチルケトン等の水と二相を形成することので
きる有機溶媒で洗浄しｆｃ：ｆ＆使用することが望まし
いｏ″ｉたこれらの溶媒の存在下でＮ−ベンジルオキシ
カルボニル化反応を行い反応後二相を分離してＺＡを含
む水溶液をｔｉ＋４製してもよい□ 本発明の第一段の工程の他方の反応であるＰＭ水溶液調
製の反応は酸の存在下、アミノ酸のメメノール中におけ
るエステル化の一般的な方法（フィッシャー法等）によ
りフェニルアラニンとメタノールを反応させ次のち、メ
タノールを水とｔｔＳするものである。
ここで使用される酸の種類としては、無機酸、有機酸と
を問わない。例えば無水の塩化水素、臭化水素、硫酸、
トルエンスルホン酸等を使尾できるが、工業的見地から
は塩ＩＦ″、水素、硫酸が特に好適である。エステル化
はフェニルアラニンに対して少な（とも当量以上一般的
には当論比で約１．５ないし約２０倍量の酸の存在下メ
メノール中約１０℃から還流温度の範囲内において一般
的に行われる。Ｌカ・しながらあまり多量の酸を用いる
と中才口の際に多量の塩が生成するため塩の析出がその
後の工程で起りやすい。従って好ましくはフェニルアラ
ニンに対して約１．５倍ナイし約５倍量である。メタノ
ールは通常フェニルアラニンに対して大過剰量用いる。
を問わない。例えば無水の塩化水素、臭化水素、硫酸、
トルエンスルホン酸等を使尾できるが、工業的見地から
は塩ＩＦ″、水素、硫酸が特に好適である。エステル化
はフェニルアラニンに対して少な（とも当量以上一般的
には当論比で約１．５ないし約２０倍量の酸の存在下メ
メノール中約１０℃から還流温度の範囲内において一般
的に行われる。Ｌカ・しながらあまり多量の酸を用いる
と中才口の際に多量の塩が生成するため塩の析出がその
後の工程で起りやすい。従って好ましくはフェニルアラ
ニンに対して約１．５倍ナイし約５倍量である。メタノ
ールは通常フェニルアラニンに対して大過剰量用いる。
反応液からは反応終了後これに水を加えたのち又は水を
加えながらメタノールを留去する等の方法によりメタノ
ールを水と置換することができる。しかしながら、メタ
ノール留去中ＶＣ酸によるＰＭの加水分解か生起しやす
いので、過剰の酸をあらかじめ塩基により中和すると、
メタノール留に中の加水分解を効果的に抑制することが
できる。このようにして得られたＰＭを含む水溶液はそ
のまま又は含有するＰＭの１１糧度により、濃縮又は水
で希釈したのち、前述の様にして調製したＺＡの水溶液
と混合する、また塩肩をカロえてＰＭを遊離の形とした
のち、適当な有機溶媒を用いで抽出し、さらに分液後有
機相２酸性水溶液と混合接触させ、再びＰＭを水相側に
抽出しＰＭの水溶液としてよい。
加えながらメタノールを留去する等の方法によりメタノ
ールを水と置換することができる。しかしながら、メタ
ノール留去中ＶＣ酸によるＰＭの加水分解か生起しやす
いので、過剰の酸をあらかじめ塩基により中和すると、
メタノール留に中の加水分解を効果的に抑制することが
できる。このようにして得られたＰＭを含む水溶液はそ
のまま又は含有するＰＭの１１糧度により、濃縮又は水
で希釈したのち、前述の様にして調製したＺＡの水溶液
と混合する、また塩肩をカロえてＰＭを遊離の形とした
のち、適当な有機溶媒を用いで抽出し、さらに分液後有
機相２酸性水溶液と混合接触させ、再びＰＭを水相側に
抽出しＰＭの水溶液としてよい。
このように１〜で得られｆ？：、ＺＡを含む水溶液とＰ
Ｍを含む水溶液を６シ合しＺＡとＰＭを含む水溶液とす
る。混合割合は混合水溶液中のＺＡとＰＭの堂が後述す
る酵素反応によるＺＡＰＭ、、ＰＭのＭ造条注として適
当な範囲となる様に行う。この範囲を多少はずれ之割合
となる場合でも、他の方法で得たＺＡやＰＭを追加して
この範囲内となる様にしてもよいことは当然である。
Ｍを含む水溶液を６シ合しＺＡとＰＭを含む水溶液とす
る。混合割合は混合水溶液中のＺＡとＰＭの堂が後述す
る酵素反応によるＺＡＰＭ、、ＰＭのＭ造条注として適
当な範囲となる様に行う。この範囲を多少はずれ之割合
となる場合でも、他の方法で得たＺＡやＰＭを追加して
この範囲内となる様にしてもよいことは当然である。
本発明はこのようにしてＭｙ製１．たＺＡとＰＭの混合
水溶液に蛋白分解酵素を添加し、第二段の反応である酵
素反応によるＺＡＰＭ、ＰＭの生成析出を行わせるもの
である６蛋白分解酵素の添加は混合水溶液の液性がその
失活を起さない様な状態で行う必要があるが、混合前の
ＺＡ及びＰＭの水溶液の液性ガそれぞれ塩基性及び酸性
であり、混合によって中和が起るので中性近傍への液性
の調節は容易である。
水溶液に蛋白分解酵素を添加し、第二段の反応である酵
素反応によるＺＡＰＭ、ＰＭの生成析出を行わせるもの
である６蛋白分解酵素の添加は混合水溶液の液性がその
失活を起さない様な状態で行う必要があるが、混合前の
ＺＡ及びＰＭの水溶液の液性ガそれぞれ塩基性及び酸性
であり、混合によって中和が起るので中性近傍への液性
の調節は容易である。
本発明の方法で用いる蛋白分解酵素と１−では、チオー
ルブロテイナーゼ、セリンプロテイサーモ、酸性ブロテ
イナーゼ等も使用できるが、活性中心に金属イオンを有
する酵素、即ち金属ブロテイナーゼが最も好ましい。そ
の例としては微生物起源のもの、例えばメシナーゼＮ等
の放線菌起源のブロテイナーゼ、プロリシン、サーモラ
イシン、ＰＳ−プロテアーゼ等の細菌起源のもの、コラ
ゲナーゼ、クロタルスアトロックスブロテアーゼ等を挙
げることができる。粗製の酵素例えばサーモアーゼ等も
使用できる◎粗製の酵素が夾雑するエステラーゼ作用等
を有する場合には、ポテトインヒビターなどの阻害剤を
併用してもよい。パパイン等のチオールプロテイサーモ
又はトリプシン等のセリンプロテイナーゼ類を用いる場
合には、エステラーゼ作用を痒うのでエステル加水分解
反応による副反応が起きないよう注意して反応を行う必
要がある。
ルブロテイナーゼ、セリンプロテイサーモ、酸性ブロテ
イナーゼ等も使用できるが、活性中心に金属イオンを有
する酵素、即ち金属ブロテイナーゼが最も好ましい。そ
の例としては微生物起源のもの、例えばメシナーゼＮ等
の放線菌起源のブロテイナーゼ、プロリシン、サーモラ
イシン、ＰＳ−プロテアーゼ等の細菌起源のもの、コラ
ゲナーゼ、クロタルスアトロックスブロテアーゼ等を挙
げることができる。粗製の酵素例えばサーモアーゼ等も
使用できる◎粗製の酵素が夾雑するエステラーゼ作用等
を有する場合には、ポテトインヒビターなどの阻害剤を
併用してもよい。パパイン等のチオールプロテイサーモ
又はトリプシン等のセリンプロテイナーゼ類を用いる場
合には、エステラーゼ作用を痒うのでエステル加水分解
反応による副反応が起きないよう注意して反応を行う必
要がある。
本発１１１１のＺＡＰＭ生成反応は上述のようにして調
製したＺＡとＰＭとの混合水溶液中添加した蛋白分解酵
素が酵素活性を示すｐＨ条件のもとで反応させるもので
ある。本発明のＺＡＰＭ （！：ＰＭとの付加化合物形
成反応もｐＨ依存性があり、したがって本発明の第二段
の反応はｐＨ約４乃至約９の範囲内で行うことができる
。しかしながらアルカリ側ではＰＭの加水分解反応が平
行して起こるため、ＰＨ８以下で行うのが最も好ましい
。本反応において使用されるＺＡおよびＰＭは前述した
ようにそれぞれＬ一体であってもよいしＤ一体を含むＬ
一体であってもよい・ペプチド結合形成反応にＦｉＬ一
体のみが関与する。ＺＡのＤ一体は共存しても反応を妨
害しない、ＰＭがＬ一体とＤ一体の混合物の場合にはペ
プチド結合形成反応により生成したＺＡＰＭはＤ一体の
ＰＭと優先的にＺＡＰＭ、ＰＭを形成し糸外に析出して
（る・従つてＺＡＰＭ生成反応はＬ一体のＺＡに対して
Ｌ一体ＰＭが少くとも当モル以上であればよいが、生成
したＺＡＰＭはＰＭと水に＠溶性のＺＡＰＭ−ＰＭを形
成するので、Ｌ一体のＺＡ１モルに対してＰΔ４は少く
とも１モルのＬ体を含み、全体＠か２モル以上あること
が必要である。従ってＬ体のＺＡ１モルに対してＩ）Ｍ
は少なぐとも約１モル乃至約５モルのＬ一体を含み全量
が約２モル乃至約５モルあることが望ましい。
製したＺＡとＰＭとの混合水溶液中添加した蛋白分解酵
素が酵素活性を示すｐＨ条件のもとで反応させるもので
ある。本発明のＺＡＰＭ （！：ＰＭとの付加化合物形
成反応もｐＨ依存性があり、したがって本発明の第二段
の反応はｐＨ約４乃至約９の範囲内で行うことができる
。しかしながらアルカリ側ではＰＭの加水分解反応が平
行して起こるため、ＰＨ８以下で行うのが最も好ましい
。本反応において使用されるＺＡおよびＰＭは前述した
ようにそれぞれＬ一体であってもよいしＤ一体を含むＬ
一体であってもよい・ペプチド結合形成反応にＦｉＬ一
体のみが関与する。ＺＡのＤ一体は共存しても反応を妨
害しない、ＰＭがＬ一体とＤ一体の混合物の場合にはペ
プチド結合形成反応により生成したＺＡＰＭはＤ一体の
ＰＭと優先的にＺＡＰＭ、ＰＭを形成し糸外に析出して
（る・従つてＺＡＰＭ生成反応はＬ一体のＺＡに対して
Ｌ一体ＰＭが少くとも当モル以上であればよいが、生成
したＺＡＰＭはＰＭと水に＠溶性のＺＡＰＭ−ＰＭを形
成するので、Ｌ一体のＺＡ１モルに対してＰΔ４は少く
とも１モルのＬ体を含み、全体＠か２モル以上あること
が必要である。従ってＬ体のＺＡ１モルに対してＩ）Ｍ
は少なぐとも約１モル乃至約５モルのＬ一体を含み全量
が約２モル乃至約５モルあることが望ましい。
本発明の方法においてペプチド結合形成反応が平衡反応
であることから、酵素反応液中の基質の９１１はなるべ
く高い方が、即ち基質に対する水性媒体の縦はなるべく
少ない方が好ましい。しかしながら少なすぎると反応終
了時の反応液が高度の粘度を有する懸濁状態となシ反応
液の後処理が困難になる□従って反応液中の水分量はＬ
一体のＺＡの１重量部に対して５乃至２５重量部が好ま
しい。従って反応に際して反応液中の水分量がこれらの
下限以下の場合には希釈を、上限以上の場合には両基質
の混合液もしくはそれぞれの製造工程からの水溶液をこ
のｆｔｒｎ囲内に収まるように濃縮することが望ましい
。
であることから、酵素反応液中の基質の９１１はなるべ
く高い方が、即ち基質に対する水性媒体の縦はなるべく
少ない方が好ましい。しかしながら少なすぎると反応終
了時の反応液が高度の粘度を有する懸濁状態となシ反応
液の後処理が困難になる□従って反応液中の水分量はＬ
一体のＺＡの１重量部に対して５乃至２５重量部が好ま
しい。従って反応に際して反応液中の水分量がこれらの
下限以下の場合には希釈を、上限以上の場合には両基質
の混合液もしくはそれぞれの製造工程からの水溶液をこ
のｆｔｒｎ囲内に収まるように濃縮することが望ましい
。
本発明の方法で使用する酵素の畦は限定的でない。
使用ｄｌ＆が高ければ反応は単時間で完ｒするが（節度
が低いとそれだけ反応時間が長くなる。しかし一般的に
は両川シｉ〕物質（基質） １ ミＩＩモルに対して２
乃至４００〜（５Ｘ １０’−’乃至Ｉ Ｘ １ （１
−２ミリモル）程度好ましくｔよ５乃至１０ （１ツ（
ＩＸＩＯ−４乃至３ Ｘ １０−”４１１モル）程度で
ある。反応時間は反応？Ｍ ＩＢｉおよび触媒である酵
素の使用量によって一義的に限定することはできないが
、通常３０分ないし５０時間ｔ’４Ｊｊｌ［が望ましい
。
が低いとそれだけ反応時間が長くなる。しかし一般的に
は両川シｉ〕物質（基質） １ ミＩＩモルに対して２
乃至４００〜（５Ｘ １０’−’乃至Ｉ Ｘ １ （１
−２ミリモル）程度好ましくｔよ５乃至１０ （１ツ（
ＩＸＩＯ−４乃至３ Ｘ １０−”４１１モル）程度で
ある。反応時間は反応？Ｍ ＩＢｉおよび触媒である酵
素の使用量によって一義的に限定することはできないが
、通常３０分ないし５０時間ｔ’４Ｊｊｌ［が望ましい
。
本発明の第二段の工程の反応は温度約１０℃ないし約９
０℃、酵素活性を維持する観点から好ましくは約２０℃
ないし約５０℃で行うものである。
０℃、酵素活性を維持する観点から好ましくは約２０℃
ないし約５０℃で行うものである。
析出したＺ Ａ Ｐ Ｉ！］−Ｐ Ｍ ｉｔ：涙過、溶
媒抽出等の１は用の手段で容易に回収することができる
。本発明の方法では第一段の工程の副反応によって得７
Ｚ Ａ及びＰＭの水浴液を混合して調製した混合水溶
液ｔまＺＡとＰＭとの酵素反応及び引続＜ＺＡＰＭ、Ｐ
Ｍの生成反応を阻害せずこれらの反ＬＬ）は極めて円滑
に進行する・燻添損Ｑし枳びよ妓烈費えわム光湯雇烈糸
＆ゾ丸戎余自口述したＺＡ製造工程では、ノ用濱ＩＮ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−７スパルテルーＬ−ア
スパラギン酸（以ＦＺＡＡと略記［る）の副生がノ軽け
られない、１酵素反応によらない方法でＺＡＡを含むＺ
ＡをＰＭと反応させると１通帛無視できない鑞のＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以上
ＺＡＡ）’Ｍと略記するフが副生Ｔる。Ｚ ＡＡＰＭは
ＺＡＰＭからの分離が容易でな（、また後工程へ残ると
ＺＡＰＭ同様或２化されてｈ−７’スパルチルーも一ア
スパルチルーも一７エエルアラニンメチルエステルゞと
なり、これもまた、目的＠ＣＪＳるα−Ｌ−７’スパル
テルーＬ−゛ｙヱニルアラニンメチルエステルとの分離
が困難であるので極めて好ましからざる副生物である。
媒抽出等の１は用の手段で容易に回収することができる
。本発明の方法では第一段の工程の副反応によって得７
Ｚ Ａ及びＰＭの水浴液を混合して調製した混合水溶
液ｔまＺＡとＰＭとの酵素反応及び引続＜ＺＡＰＭ、Ｐ
Ｍの生成反応を阻害せずこれらの反ＬＬ）は極めて円滑
に進行する・燻添損Ｑし枳びよ妓烈費えわム光湯雇烈糸
＆ゾ丸戎余自口述したＺＡ製造工程では、ノ用濱ＩＮ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−７スパルテルーＬ−ア
スパラギン酸（以ＦＺＡＡと略記［る）の副生がノ軽け
られない、１酵素反応によらない方法でＺＡＡを含むＺ
ＡをＰＭと反応させると１通帛無視できない鑞のＮ−ベ
ンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（以上
ＺＡＡ）’Ｍと略記するフが副生Ｔる。Ｚ ＡＡＰＭは
ＺＡＰＭからの分離が容易でな（、また後工程へ残ると
ＺＡＰＭ同様或２化されてｈ−７’スパルチルーも一ア
スパルチルーも一７エエルアラニンメチルエステルゞと
なり、これもまた、目的＠ＣＪＳるα−Ｌ−７’スパル
テルーＬ−゛ｙヱニルアラニンメチルエステルとの分離
が困難であるので極めて好ましからざる副生物である。
酵素法によるＺＡとＰＭとの反応においてもＺＡＡが共
存丁ればＺＡＡ ｐＭ又はそのＰＭとの付加化合物が副
生することが予想される。ところが本発明の方法１？は
意外ｃｉｌらｔｌＺＡＰＭ−ＰＭ（：ＺＡＡＰＭ又はそ
のＰＭと０月・１加化合制による汚染はほとんどｌよい
６本発明の方法ではま之ＺＡ及びＰＭＪａ：単離ｆる必
要がないので全体としての工程数を大きく減らすことが
Ｃき、それによってそれらのイ略さｉｔｚ［程ＣＵ月京
科、中間体などの損失を避け◇ことがＣさる。Ｚ化およ
びエステル化の反応で、未反応で残っタフェニルアラニ
ン及びアスパラギン酸は、調合工程で生成したｚＡＰＭ
−ＰｐＪｌ ？分離した残欣力為ら、イイ１１合上程
Ｃ未尺ｂ６＠として残っているＰＮｉ及びＺＡ、さりＣ
二は副反応でＰＭ７Ｊ旬ｌ水分解されて副生ｆることの
あるフェニルアラニンとともに後工程で回収ｆ／；３こ
とかでさるので１京科の損失が少ない。
存丁ればＺＡＡ ｐＭ又はそのＰＭとの付加化合物が副
生することが予想される。ところが本発明の方法１？は
意外ｃｉｌらｔｌＺＡＰＭ−ＰＭ（：ＺＡＡＰＭ又はそ
のＰＭと０月・１加化合制による汚染はほとんどｌよい
６本発明の方法ではま之ＺＡ及びＰＭＪａ：単離ｆる必
要がないので全体としての工程数を大きく減らすことが
Ｃき、それによってそれらのイ略さｉｔｚ［程ＣＵ月京
科、中間体などの損失を避け◇ことがＣさる。Ｚ化およ
びエステル化の反応で、未反応で残っタフェニルアラニ
ン及びアスパラギン酸は、調合工程で生成したｚＡＰＭ
−ＰｐＪｌ ？分離した残欣力為ら、イイ１１合上程
Ｃ未尺ｂ６＠として残っているＰＮｉ及びＺＡ、さりＣ
二は副反応でＰＭ７Ｊ旬ｌ水分解されて副生ｆることの
あるフェニルアラニンとともに後工程で回収ｆ／；３こ
とかでさるので１京科の損失が少ない。
史≦二また弔−没の工程Ｑ月ｉ１＋ｊ反応−ご用いる塩
基及び醒に山互の中相用に有効４・す用できるのＣ１醒
及びｒルカリの１更月Ｊ１遁も顯らｆことができる。
基及び醒に山互の中相用に有効４・す用できるのＣ１醒
及びｒルカリの１更月Ｊ１遁も顯らｆことができる。
以上、本発明を実施１７すについて更に計４：（ｌに説
明１勺。
明１勺。
実施例Ｉ
ＺＡ水浴液の調製
Ｌ−アスパラギン酸３１９．４＆ （２，４モル）を水
３ ｔｉ ０１７１１に忌ず濁させ、伏にｌＱＩ’Ｊ水
順化ナトリウム水浴液４８（ｂ＋＋７ （４，８セル）
？加えて兄′せに浴解した。この液に激しく撹拌しなが
ら−１が０〜ｉｚに；ＰＨが９．５〜１２．０の軸回Ｉ
／１ＣＪｊｌｉ化ベンジルオキシカルボニル４８０＃（
４度９３％２．６２モルフと、１ＯＮ水順化ナトリワム
水＋ｄ液３３（Ｍｌ（３，３七りを６＃＃間かけて同時
に滴トした。滴Ｆ終ｒ後約２時間蚕蟲で撹拌したのら、
トルエンＩＪを加えて混合攪拌し、氷山とトルエン１利
な分へ直した。水相の全体ｉｔは２１１１，５．５ Ｎ
であり丙連ｔｆｆｔ体クロマドグ５７ 分析力６ ＺＡ
カ６０７．０１ （収率９４．７％ン生成していること
を認めた。また２２Ｊ＃のＺＡＡが副生した。
３ ｔｉ ０１７１１に忌ず濁させ、伏にｌＱＩ’Ｊ水
順化ナトリウム水浴液４８（ｂ＋＋７ （４，８セル）
？加えて兄′せに浴解した。この液に激しく撹拌しなが
ら−１が０〜ｉｚに；ＰＨが９．５〜１２．０の軸回Ｉ
／１ＣＪｊｌｉ化ベンジルオキシカルボニル４８０＃（
４度９３％２．６２モルフと、１ＯＮ水順化ナトリワム
水＋ｄ液３３（Ｍｌ（３，３七りを６＃＃間かけて同時
に滴トした。滴Ｆ終ｒ後約２時間蚕蟲で撹拌したのら、
トルエンＩＪを加えて混合攪拌し、氷山とトルエン１利
な分へ直した。水相の全体ｉｔは２１１１，５．５ Ｎ
であり丙連ｔｆｆｔ体クロマドグ５７ 分析力６ ＺＡ
カ６０７．０１ （収率９４．７％ン生成していること
を認めた。また２２Ｊ＃のＺＡＡが副生した。
ＰＭ水浴液の調製
１）Ｌａ−１エニルアラニン９９１．５ ＃ （６モル
）を塩化水素４３７．４ｉ１２．０モル）を跨むメタノ
ール３３２０Ｊ’中に加え、３時１…油浴中でＪＡ熱還
流した。
）を塩化水素４３７．４ｉ１２．０モル）を跨むメタノ
ール３３２０Ｊ’中に加え、３時１…油浴中でＪＡ熱還
流した。
冷却後反応液のホルへルト法による分析から塩素イオン
が９．２３モル存在していることｔ／認めた。
が９．２３モル存在していることｔ／認めた。
この溶液に１１の＃１１１Ｉ水および４８鳴の水績化ナ
トリクム水嬉歇２５９．０ ＃ （３，２２モル）（ｌ
／加えて仕込４のフェニルアラニンに対するＳ刺の塩化
水素を中和したのち蒸留ボ１．！Ｍを加えｔがら（Ｊ−
タリーヱパボレーダーでメタノールな完生≦二貿表した
。
トリクム水嬉歇２５９．０ ＃ （３，２２モル）（ｌ
／加えて仕込４のフェニルアラニンに対するＳ刺の塩化
水素を中和したのち蒸留ボ１．！Ｍを加えｔがら（Ｊ−
タリーヱパボレーダーでメタノールな完生≦二貿表した
。
４浦液の仝俸４は２８２１．０＃Ｃ”あり、閥連−故体
りロマトグラフ分析カらＩＪｉ、−′フェニルアラニン
）ｆル工ｘｆル（Ｄｈ−に’Ｍ） がＩＵＯ７，ＩＡｌ
（［４９３，７％）生成していることを認めた。
りロマトグラフ分析カらＩＪｉ、−′フェニルアラニン
）ｆル工ｘｆル（Ｄｈ−に’Ｍ） がＩＵＯ７，ＩＡｌ
（［４９３，７％）生成していることを認めた。
ＺＡ と１’Ｍ（１）ｊｇ 応Ｃ−ＣるＺＡＰＭ ＠Ｐ
Ｍ（ＩＪＪ４こうして調製Ｌ タＺａ水ｔｄ ａ １９
２．４３１ Ｌ ＺＡｏ、２モル常呵ン及びυＬ−ＰＭ
水省藏２５０．９８ｉＤ］□−Ｐ Ｍ ０．５モル旧０
を混合し、さらに論留水２ｔｉ５．ａｌン加えたのら５
Ｎ−九一化ナトリウム水Ｉ谷故により１’Ｈｔ’６．３
に調製した。この液にチー七！−ゼ１’１Ｍ−１６０（
大州化成映、１６０万に’Ｕ／ｌ ） ７．２１９と非
酸カルシツムー＊偏１．３ ＩＩｋｊＡｌｌえ、４ＵＣ
ｅ４１伴しながら反応Ｙ（ｊなつＩこ。８時間僕生成し
た愁濁漱をグラスフィルターでｔｐｓし結晶ｔ’５００
ｍ１の冷水で洗浄しに。この結晶はＮ−ペンジルオ千ノ
カルボニルーα−ｂ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルと）：を二り一体の７エニルアラニ
ンメテルエステルとの付υｌ化舎−ｍｔｚ−ＡＰＭ・ｌ
）−ＰＭ）’Ｃあり、１鴇逮漱俸クロマトグラフ分析か
ら収率は８５．６％Ｃあった。このｄｆｉ’＃ｉ、ｉ！
、−ＡＰＭと土にＤ一体ＰＭのｌ＝ｌの１１加化合蜀で
あＱことは咋醒エチルーｎ−ヘキナン混合Ｍ媒刀ｉら（
す結晶して慢だもののＮＭＲ及びｌｌ（スペクトル。
Ｍ（ＩＪＪ４こうして調製Ｌ タＺａ水ｔｄ ａ １９
２．４３１ Ｌ ＺＡｏ、２モル常呵ン及びυＬ−ＰＭ
水省藏２５０．９８ｉＤ］□−Ｐ Ｍ ０．５モル旧０
を混合し、さらに論留水２ｔｉ５．ａｌン加えたのら５
Ｎ−九一化ナトリウム水Ｉ谷故により１’Ｈｔ’６．３
に調製した。この液にチー七！−ゼ１’１Ｍ−１６０（
大州化成映、１６０万に’Ｕ／ｌ ） ７．２１９と非
酸カルシツムー＊偏１．３ ＩＩｋｊＡｌｌえ、４ＵＣ
ｅ４１伴しながら反応Ｙ（ｊなつＩこ。８時間僕生成し
た愁濁漱をグラスフィルターでｔｐｓし結晶ｔ’５００
ｍ１の冷水で洗浄しに。この結晶はＮ−ペンジルオ千ノ
カルボニルーα−ｂ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルと）：を二り一体の７エニルアラニ
ンメテルエステルとの付υｌ化舎−ｍｔｚ−ＡＰＭ・ｌ
）−ＰＭ）’Ｃあり、１鴇逮漱俸クロマトグラフ分析か
ら収率は８５．６％Ｃあった。このｄｆｉ’＃ｉ、ｉ！
、−ＡＰＭと土にＤ一体ＰＭのｌ＝ｌの１１加化合蜀で
あＱことは咋醒エチルーｎ−ヘキナン混合Ｍ媒刀ｉら（
す結晶して慢だもののＮＭＲ及びｌｌ（スペクトル。
九素分析値ならびに施ＩＫが特開昭：５３−９２７２９
号ｌ＝開示され℃いるデーターと＃＠的に一致すること
から確認した。ＺＡＡｉ’Ｍ欠びそのＰＭ １；↑加化
合彷は検出されな７Ｊ為つｌ（。
号ｌ＝開示され℃いるデーターと＃＠的に一致すること
から確認した。ＺＡＡｉ’Ｍ欠びそのＰＭ １；↑加化
合彷は検出されな７Ｊ為つｌ（。
実施例２
ＰＭ水溶鏝の調製
実施例１のに’ＭＩＫ浴液の調製で得られた１）１．−
ＰＭをよむ水溶液２５Ｉにメチルイノブチフレケトン５
０ｉｔ９を加え１両液を撹拌混合しなから１ｔ）Ｎ−水
酸化ナトリクム水溶ｇ６ｄを胸ドし之。撹拌を停止した
のちル成された二相を分、弛した。メチルイソプチルク
トン相には６ＩＩのａ４−と１５ ｔｕｇの水？加え撹
拌混合し、燻袢浄止鏡ル成された三田を分層し水相３０
．０．ｆＹ＃た。丞相中には尚運１反庫クロマトグラフ
分析から１）Ｌａ−ＰｎＶｉ ／Ｊｅ ８． Ａ １１
旨まれていにとｔ’［＋認した。
ＰＭをよむ水溶液２５Ｉにメチルイノブチフレケトン５
０ｉｔ９を加え１両液を撹拌混合しなから１ｔ）Ｎ−水
酸化ナトリクム水溶ｇ６ｄを胸ドし之。撹拌を停止した
のちル成された二相を分、弛した。メチルイソプチルク
トン相には６ＩＩのａ４−と１５ ｔｕｇの水？加え撹
拌混合し、燻袢浄止鏡ル成された三田を分層し水相３０
．０．ｆＹ＃た。丞相中には尚運１反庫クロマトグラフ
分析から１）Ｌａ−ＰｎＶｉ ／Ｊｅ ８． Ａ １１
旨まれていにとｔ’［＋認した。
ＺＡトに’ｌＶｉ ）反応Ｊ： 、、Ｃ６ＺＡＰＭ−Ｐ
ＭｔＪ） 、ｌｉｌ製こうして得たＩＨ，−に’Ｍの水
ｄ液３．２４０ｉ１）Ｌ−１’Ｍ５ ミリモル含有）を
実施例１の２＋Ａ水溶液の調製で優られたＺＡ水浴液１
．９２４１ＺＡ ２ ｊ ！Ｊモル陰有）、ＩＮ水酸１
ζカトリウム０．６ｄ及び蒸留水２ｒｎｔ’ｆｔｌ属合
した（この時のＰＨは６．２）。この股にナーモライν
ンｊｌＪ”Ｐと師萌カルシクムーボＡ＆ｌｌ５ｑ乞加え
、イン千ユベーター中４０Ｃで８時１！１ノ又応乞イ了
なつ心。Ｊ又応漱を一過し、残った結晶を冷水１１０１
１Ｉで洸伊したのら珠奴し、ＺＡＰＭとＥとし℃υ−俸
のＰＭとの１・ｒ加ｔＣφ蜀（尚連故捧りａマドグラフ
ィによる牧羊８６，２％）を慢た。
ＭｔＪ） 、ｌｉｌ製こうして得たＩＨ，−に’Ｍの水
ｄ液３．２４０ｉ１）Ｌ−１’Ｍ５ ミリモル含有）を
実施例１の２＋Ａ水溶液の調製で優られたＺＡ水浴液１
．９２４１ＺＡ ２ ｊ ！Ｊモル陰有）、ＩＮ水酸１
ζカトリウム０．６ｄ及び蒸留水２ｒｎｔ’ｆｔｌ属合
した（この時のＰＨは６．２）。この股にナーモライν
ンｊｌＪ”Ｐと師萌カルシクムーボＡ＆ｌｌ５ｑ乞加え
、イン千ユベーター中４０Ｃで８時１！１ノ又応乞イ了
なつ心。Ｊ又応漱を一過し、残った結晶を冷水１１０１
１Ｉで洸伊したのら珠奴し、ＺＡＰＭとＥとし℃υ−俸
のＰＭとの１・ｒ加ｔＣφ蜀（尚連故捧りａマドグラフ
ィによる牧羊８６，２％）を慢た。
Ｚ ＡＡ ｌ’ Ｍ及びそυｒｒｉ４付卯＋Ｌ合・１Δ
は検出されはか一′）Ｒ：、。
は検出されはか一′）Ｒ：、。
実施例３
に’ Ｍ ／Ｊ（ｒΔ液の調製
ｂ−フェニルアラニン１９８．２３ＪＦ Ｌ １．２モ
ルＪ。
ルＪ。
塩化水素８７．４８ ＃ （２，４そルノＪｄよびメタ
ノール５７６Ｉの鳩舎１反？３ ＋１＃聞加黒還流した
。冷却後反４液のホルハルト法による分析から４素イオ
ンが１．８９３モル存在することを認めた。このｔ８液
に２００−の蒸留水を加え、さらに４８％の水酸１６ナ
トリクム水ＩＷ［４０，４８１Ｃ０，６９３−ｅ Ｒｔ
）５ｔｍＬでｉｋ。
ノール５７６Ｉの鳩舎１反？３ ＋１＃聞加黒還流した
。冷却後反４液のホルハルト法による分析から４素イオ
ンが１．８９３モル存在することを認めた。このｔ８液
に２００−の蒸留水を加え、さらに４８％の水酸１６ナ
トリクム水ＩＷ［４０，４８１Ｃ０，６９３−ｅ Ｒｔ
）５ｔｍＬでｉｋ。
込みのフェニルアラニンに対して過料の墳ＩｔＳ水素ヲ
中和し、蒸留水３００１１を加えながらロータリーエバ
ポレーターでメタノールを先金に留去した。禰媚液の至
俸礒は５４３．ｉであり、尚速液体グロ、トグラフィ労
析からも一フェニルアラニンメチルニスｆＡｔ（Ｌ−Ｐ
Ｍ ）カ２０６．６ｇ（収率９６．１％）′：Ｅ戚して
い金こと？認めた。
中和し、蒸留水３００１１を加えながらロータリーエバ
ポレーターでメタノールを先金に留去した。禰媚液の至
俸礒は５４３．ｉであり、尚速液体グロ、トグラフィ労
析からも一フェニルアラニンメチルニスｆＡｔ（Ｌ−Ｐ
Ｍ ）カ２０６．６ｇ（収率９６．１％）′：Ｅ戚して
い金こと？認めた。
ＺＡとＰＭＯ）１５Ｚ、ｋｐｉ：Ｊ、 るＺＡＰＭ−Ｐ
Ｍ（ＪＪ４ｄこうして慢たＬ−ＰＭの水ｌ谷ｌ夜１７９
．４５．ｌｉ’（１−）’Ｍ Ｏ，４モル含有）を実カ
匝例１のＺＡ水浴液の調練”ｌ！ｒｅ ＺＡＡＩ＃ｒ［
１９２，４３＃ （ＺＡｏ、２モル含４）と１１１合し
、さらに蒸留水２４０ｍ１を加えたのちＩＮ−Ｊ：ｊｊ
Ａ酸Ｃ二より１））ｉ′Ｉｋ５．７５に調製した。この
液にサーモア−（ＰＭ −１６０７，２ｇと酢漬カルシ
ウムー水ＪＪｉ１．３ｊｌを０口え、攪拌しｌｋｉら反
応を行なった。
Ｍ（ＪＪ４ｄこうして慢たＬ−ＰＭの水ｌ谷ｌ夜１７９
．４５．ｌｉ’（１−）’Ｍ Ｏ，４モル含有）を実カ
匝例１のＺＡ水浴液の調練”ｌ！ｒｅ ＺＡＡＩ＃ｒ［
１９２，４３＃ （ＺＡｏ、２モル含４）と１１１合し
、さらに蒸留水２４０ｍ１を加えたのちＩＮ−Ｊ：ｊｊ
Ａ酸Ｃ二より１））ｉ′Ｉｋ５．７５に調製した。この
液にサーモア−（ＰＭ −１６０７，２ｇと酢漬カルシ
ウムー水ＪＪｉ１．３ｊｌを０口え、攪拌しｌｋｉら反
応を行なった。
１０時間後反応を停止し実７１１ＩＩＩｆＩＪｌと同様
に後処理および沖ｆｊ丁を行なった。得られた結晶の八
ＭＲ及びｌＲスペクトル、元素分析値ｌよらびに施ｔｔ
＋建は特開昭６３−９２７２９号に量水されＣいるＩＮ
−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−７スバルテル
ーも一フェニルアラニンメチルエステルとＬ−゛フェニ
ルｒラニンメテルエステルとの寸」１化合物（ｚＡＰ
Ｍ−Ｌ−ＰＭ ） ｃｚ） ソｔｔ ｂ ト４ ＠’Ｊ
ニｌｔ−Ｌ Ｚ＠ＺＡＰＭ−ｈ−１’Ｍ （／Ｊ 収
率に１８３．２％ｔ” Ｊ５ ッＺ 、ＺＡＡＰＭ及び
そのＰＭとの付加化合吻は検出されなかった。
に後処理および沖ｆｊ丁を行なった。得られた結晶の八
ＭＲ及びｌＲスペクトル、元素分析値ｌよらびに施ｔｔ
＋建は特開昭６３−９２７２９号に量水されＣいるＩＮ
−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−７スバルテル
ーも一フェニルアラニンメチルエステルとＬ−゛フェニ
ルｒラニンメテルエステルとの寸」１化合物（ｚＡＰ
Ｍ−Ｌ−ＰＭ ） ｃｚ） ソｔｔ ｂ ト４ ＠’Ｊ
ニｌｔ−Ｌ Ｚ＠ＺＡＰＭ−ｈ−１’Ｍ （／Ｊ 収
率に１８３．２％ｔ” Ｊ５ ッＺ 、ＺＡＡＰＭ及び
そのＰＭとの付加化合吻は検出されなかった。
実施例４
ＺＡ水Ｉ谷液のＭ１製
Ｌ−’７’スパラギンｄｉ５３．２４１（０，４七ノリ
と炭峡ナトリウム７０．２６Ｉｉ（０，ｈ６３モｌｋ）
＆／％ １６５ Ｎ ｔ＝、ｆｉ−させた故にｒａｔ
、、＜攪拌しながら、を品（が０−１２にの１田で塩化
ベンジルオキシカルボニル８０ Ｎ（純度９３％、０．
４３ｓｉモル）を６時間かけて摘ドした。
と炭峡ナトリウム７０．２６Ｉｉ（０，ｈ６３モｌｋ）
＆／％ １６５ Ｎ ｔ＝、ｆｉ−させた故にｒａｔ
、、＜攪拌しながら、を品（が０−１２にの１田で塩化
ベンジルオキシカルボニル８０ Ｎ（純度９３％、０．
４３ｓｉモル）を６時間かけて摘ドした。
さらｉ”−ＭｔｍＣ−佼１圓撹拌したのち、トルエン２
００ｍ１？加えて混合撹拌し、水す目とトルエン相を分
罐した。水相の全体４は３２５１０あり、尚速液体りロ
マトグラフ分析力為らＺＡが９７．３ｊＩ（収率９１．
０％）生成していることを認めｒｔ、 ｆ、たＺＡＡ４
．ｔｉ＃か副生した。
００ｍ１？加えて混合撹拌し、水す目とトルエン相を分
罐した。水相の全体４は３２５１０あり、尚速液体りロ
マトグラフ分析力為らＺＡが９７．３ｊＩ（収率９１．
０％）生成していることを認めｒｔ、 ｆ、たＺＡＡ４
．ｔｉ＃か副生した。
ＺＡとＰＭの反応によるｌ、ＡＰｔす・Ｐｍの調製こう
して調ｉ Ｌ Ｎ ＺＡ水／ＪＧ ｔｉｌ＜ １７８．
） ２ ｊ’ （Ｚ Ａｏ、２モル含有ンと実施例１
のＰＭ水浴ｌ決の調製−で慢たＤＬ−ＰＭ水？８液２５
０．９８ＪＩ（１）ｈ−Ｐｒｄ Ｏ，５モル含有を混合
し、さらに蒸留水２８ｕｍｌｋｏ口え之す】６．５Ｎｚ
Ｋｄ１ヒナトリウム水ｔｄ液によりｐ）１を６．１１−
ニ調製した。この、・夜にナーモアーゼＰＭ−１６０２
２Ｎとａド酸カルシクムー水墳１．３Ｉ乞υＵえて４０
Ｃで撹拌しながら１０時間反応をイｉなつ１ζ。実腫例
１と同様に後処理を行ないＺＡＰＩＶと五にＤ一体のＰ
Ｍ実施例５ ＺＡ水ｔ’ａ液の調製 Ｌ−アスパラギンＩ１１３１．９４１ （（７，２４モ
ル）２５ Ｎ−水酸化カリウム水／＃液９６ｍｊ（６，
４Ｈモルハニｌ谷解した液に漱しく撹拌しなからｌ謀反
が０．〜１２Ｃ，ｐＨＩＪ″ｍ９．５〜１２．０の軸囲
円で壜１しベンジルオキシカルボニル４８ｇ（序屯を建
９３％、０．２６２モルフと５八−水酸化カリ９ムロ６
ｓｊ（０，３３モル）を６時１ｍかけて同時−二滴ドし
た。滴ト経ｒ後約２時間蚕ｌ晶で撹拌したのら、トルエ
ン２００−をリロえて混合１竜拌し。
して調ｉ Ｌ Ｎ ＺＡ水／ＪＧ ｔｉｌ＜ １７８．
） ２ ｊ’ （Ｚ Ａｏ、２モル含有ンと実施例１
のＰＭ水浴ｌ決の調製−で慢たＤＬ−ＰＭ水？８液２５
０．９８ＪＩ（１）ｈ−Ｐｒｄ Ｏ，５モル含有を混合
し、さらに蒸留水２８ｕｍｌｋｏ口え之す】６．５Ｎｚ
Ｋｄ１ヒナトリウム水ｔｄ液によりｐ）１を６．１１−
ニ調製した。この、・夜にナーモアーゼＰＭ−１６０２
２Ｎとａド酸カルシクムー水墳１．３Ｉ乞υＵえて４０
Ｃで撹拌しながら１０時間反応をイｉなつ１ζ。実腫例
１と同様に後処理を行ないＺＡＰＩＶと五にＤ一体のＰ
Ｍ実施例５ ＺＡ水ｔ’ａ液の調製 Ｌ−アスパラギンＩ１１３１．９４１ （（７，２４モ
ル）２５ Ｎ−水酸化カリウム水／＃液９６ｍｊ（６，
４Ｈモルハニｌ谷解した液に漱しく撹拌しなからｌ謀反
が０．〜１２Ｃ，ｐＨＩＪ″ｍ９．５〜１２．０の軸囲
円で壜１しベンジルオキシカルボニル４８ｇ（序屯を建
９３％、０．２６２モルフと５八−水酸化カリ９ムロ６
ｓｊ（０，３３モル）を６時１ｍかけて同時−二滴ドし
た。滴ト経ｒ後約２時間蚕ｌ晶で撹拌したのら、トルエ
ン２００−をリロえて混合１竜拌し。
水１目とトルエン１目を分１雁し７こ。水＜’ｄの全体
噴は２５９ｇであり、商運液体クロマトグラフ分析から
ＺＡが５８．４１収率９１．０％）生成してい金ことを
認めた。またＺＡＡも３．２ν生戎していた。
噴は２５９ｇであり、商運液体クロマトグラフ分析から
ＺＡが５８．４１収率９１．０％）生成してい金ことを
認めた。またＺＡＡも３．２ν生戎していた。
ＺＡトＰＭＵ） 反ｌｌ： 、Ａ ６ ＺＡｉ’Ｍ＠Ｑ
４０Ｊ調ｆＪコウＬ ’ＣＪ製Ｌｚ ＺＡｚ％ｒ谷ｆｆ
２３７．１９１ （ＺＡｏ、２モル含有２と実施列ｌ
のに’Ｍボ溶１便の調製により得たＤＩ、−ＰＭ水＋４
孜２５０．９８Ｉ（ＤＬ−）’ＭＯ，５モル含有）を川
合し、さらに蒸留水３５０１１１１’に：１１１えにの
ら、５１Ｎ−水酸化カリ９ムボｔａ液によＩＪ ｐｉ（
セロ、３にＡ袈した。この故にナーモアーービＰ８−１
６０ ４．１１と咋改力ルシクムー水４０．８Ｎを９口
えて４０Ｇで撹拌しながら１８時！禮反応を行なった。
４０Ｊ調ｆＪコウＬ ’ＣＪ製Ｌｚ ＺＡｚ％ｒ谷ｆｆ
２３７．１９１ （ＺＡｏ、２モル含有２と実施列ｌ
のに’Ｍボ溶１便の調製により得たＤＩ、−ＰＭ水＋４
孜２５０．９８Ｉ（ＤＬ−）’ＭＯ，５モル含有）を川
合し、さらに蒸留水３５０１１１１’に：１１１えにの
ら、５１Ｎ−水酸化カリ９ムボｔａ液によＩＪ ｐｉ（
セロ、３にＡ袈した。この故にナーモアーービＰ８−１
６０ ４．１１と咋改力ルシクムー水４０．８Ｎを９口
えて４０Ｇで撹拌しながら１８時！禮反応を行なった。
゛＃施例１と同様に鏡処理を行ないＺＡＰＭと土に１３
−ＰｉＶｉとの付加化合物を慢心。収率は８３．５鴨で
あった。ＺＡＡｉ’ｉＶ１及び七のＰＭｐｆ加１ヒ合物
は検出されな〃）つた。
−ＰｉＶｉとの付加化合物を慢心。収率は８３．５鴨で
あった。ＺＡＡｉ’ｉＶ１及び七のＰＭｐｆ加１ヒ合物
は検出されな〃）つた。
実方匝ｔｆｌＪ ６
ＰＭ水１８液の調製
１）Ｌ−フェニルアラニン９９．１．９ （０，６モル
）とメタノール２８８ｇの混合液中にａ硫酸１１５．４
．９を加え３時間油浴中で刀０＠Ｊ／ＪｆＥＬ心。
）とメタノール２８８ｇの混合液中にａ硫酸１１５．４
．９を加え３時間油浴中で刀０＠Ｊ／ＪｆＥＬ心。
冷却後、蒸留水１００＃ｊおよび４８％７ム砿化カトリ
ウム水浴液を５３．１ ｍｌ １７０えたのら、蒸留水
を１００ＩＪノ１０えなからａ−タリーエバポレーター
ＣメタノールｔｖＭ大した。ｍ補後の全体嵯は４１１．
１ ／であり。
ウム水浴液を５３．１ ｍｌ １７０えたのら、蒸留水
を１００ＩＪノ１０えなからａ−タリーエバポレーター
ＣメタノールｔｖＭ大した。ｍ補後の全体嵯は４１１．
１ ／であり。
尚速欣俸クロマトグラフ分析かしυｂ−ＰＭがｉｏｌ、
ｈｙ（収＄９４．５％）！＋：、成していることを認め
た。
ｈｙ（収＄９４．５％）！＋：、成していることを認め
た。
ＺＡ、！：ＰＭ とのｉ＆＋ｓ（：！６Ｚ＋ＡＰｔｄ−
ｐＭｕＪＨ４こうして得たＤＬ−ＰＭ水浴液１８１．２
６ｉ１）１．−）’Ｍ０．２５モル含有フｊａ／実弛例
１ （／Ｊ ’１ＡＩＫ １ｇ液の調製Ｃ慢ｚＺ人水溶
ｆｉ９６．ｆｉ８＆（ＺＡｏ、１モノリド混合しｚｏさ
らに蒸留水を２４．ｄ加え之のち５１Ｓ４−水酸化ナト
リウム水ｌ容液によりｐムｌを６．３に調製した。
ｐＭｕＪＨ４こうして得たＤＬ−ＰＭ水浴液１８１．２
６ｉ１）１．−）’Ｍ０．２５モル含有フｊａ／実弛例
１ （／Ｊ ’１ＡＩＫ １ｇ液の調製Ｃ慢ｚＺ人水溶
ｆｉ９６．ｆｉ８＆（ＺＡｏ、１モノリド混合しｚｏさ
らに蒸留水を２４．ｄ加え之のち５１Ｓ４−水酸化ナト
リウム水ｌ容液によりｐムｌを６．３に調製した。
この故１：ナーモアーゼＰＳ−１ｆｉυ ３ｇと酢酸力
ルンクムー水塩０．６５ＪｉｌＹ加え、４０−Ｃで１２
時間攪拌しながら反応を行／よった。実施例１と同様に
１＆匹理乞行ないＺＡ Ｐｍと上にＤ一体のＰＭとの１
引加１６合ｌ３ＪＹ ｔ’ｉ４７＋：：。収帯１ｚ８４
．９％’Ｃ、％ −’） ／、１：。ＺＡＡＰＩＶ及び
そのＰ Ｍ ｌｉｊυ旧乙舎愕は検出されなかった。
ルンクムー水塩０．６５ＪｉｌＹ加え、４０−Ｃで１２
時間攪拌しながら反応を行／よった。実施例１と同様に
１＆匹理乞行ないＺＡ Ｐｍと上にＤ一体のＰＭとの１
引加１６合ｌ３ＪＹ ｔ’ｉ４７＋：：。収帯１ｚ８４
．９％’Ｃ、％ −’） ／、１：。ＺＡＡＰＩＶ及び
そのＰ Ｍ ｌｉｊυ旧乙舎愕は検出されなかった。
−５５）
Claims (12)
- （１） アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボ
ニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させてＮ−ベンジ
ルオキシカルボニルアスパラギン酸を含む水溶液を調製
し、別にフェニルアラニンを酸の存在下テメタノールと
反応させてフェニルアラニンメチルエステルを生成させ
、過剰のメタノールヲ水で置換してフェニルアラニンメ
チルエステルの水溶液とシ、先に真裏したＮ−ベンジル
オキシカルボニルアスパラギン酸を含む水溶液と混合し
、得られた混合液に蛋白分解酵素をその失活が実質的忙
起きない条件下で添加し、蛋白分解酵素が酵素活性を示
す条件下でＮ−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン
酸とフェニルアラニンメチルエステルとを反応させて、
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル
−し一フェニルアラニンメチルエステルとフェニルアラ
ニンメチルエステルとの付加化合物を析出させ、これを
回収することを特徴とするジペプチドエステルとアミノ
酸エステルとの付加化合物の製造方法。 - （２） アスパラギン酸及びフェニルアラニンのそれ
ぞれＬ一体又はＬ一体とＤ一体の混合物金柑い、Ｎ−ベ
ンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチル−し一
フェニルアラニンメチルニステルトＬ−モＩ、＜ａＤ−
−ｙエニルアラニンメチルエステル又ハこの両者の混合
型のフェニルアラニンメチルエステルとの付カロ化合物
を回収する特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法・ - （３）酵素反応を行う際のＮ−ベンジルオキシカルボニ
ルアスパラギン酸のＬ一体に対するフェニルアラニンメ
チルエステルの量比が、モル比で前者１に対して後者の
Ｌ一体で少なくとも約１であり、Ｌ一体とＤ一体の合量
で約２ないし約５である特許請求の範囲第（１）項また
は第（２）項記載の製造方法。 - （４）塩基としてアルカリ金属の水酸化物、炭酸塩又は
炭酸水素塩を用い、酸として無機の強酸を用いる特許請
求の範囲第（１）項なｈし第（３）項のいずれか１項記
載の製造方法。 - （５） ！自分解酵素として金属プａテイナーゼを用
いる特許請求の範囲第（１）項ないし第（４）項のいず
れか１項記載の製造方法。 - （６） アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボ
ニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させたのち、反応
液を水と二相を形成することのできる有機溶媒で洗浄し
てＮ−、ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸を含
む水溶液を調製する特許請求の範囲第Ｕ）項ないし第（
５）項のいずれか１項記載の製造方法。 - （７） アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボ
ニルを水溶液中、塩基の存在下で反応させてＮ−ベンジ
ルオキシカルボニルアスパラギン酸を含ム水溶液を調製
し、別にフェニルアラニンを酸の存在下でメタノールと
反応させてフェニルアラニンメチルエステルを生成させ
、これに塩基を加えてフェニルアラニンメチルニスデル
を遊離させ、水と二相を形成することのできる有機溶媒
を加えて混合ｌ触させてフェニルアラニンメチルエステ
ルを有機溶媒相に抽出し、分相して有機溶媒相に酸性水
溶液を加えて混合接触させてフェニルアラニンメチルエ
ステルを水相に逆抽出し５、分相ｌ、て水相ヲ先に調製
したＮ−ベンジルオキシカルボニルアスパラギンＭ／、
を含む水溶液と混合し、得られた混合液に蛋白分解酵素
をその失活か実質的に起きない条件下で添加し、蛋白分
解酵素が酵素活性を示ｆｌ牛下でＮ−ベンジルオキシカ
ルボニルアスパラキン酸トフェニルアラニンメチルエス
テルトヲ１５− 応ｆｉ セて、Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−α・−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラ
ニンメチルエステルとフェニルアラニンメチルエステル
との付加化合物を析出させ、これを回収することを特徴
とするジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加
化合物の製造方法。 - （８） アスパラギン酸及びフェニルアラニンのそれ
ぞれし一体又はＬ一体とＤ一体の混合物を用い、Ｎ−ベ
ンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチルーＬ−
フェニルアラニンメチルニステルトＬ−モｌ、＜１−Ｉ
Ｄ−フェニルアラニンメチルエステル又はこの両者の混
合型のフェニルアラニンメチルエステルど付加化合物上
回収する特許請求の範囲第（７）項記載の製造方法０− - （９） ？Ｉ＃素反応を行う際のＮ−ベンジルオキシ
カルボニルアスパラギン酸のＬ一体に対するフェニルア
ラニンメチルエステルのｆ比がモル比で前者１に対して
後者のし一体で少なくとも約１であり、Ｌ一体とＤ一体
の合量で約２ないし約５である・特許請求の範囲第ｃ１
）項ｔたは第（８）項のいずれか１項記載の製造方法。 - （１０）塩基としてアルカリ金属の水酸化物、炭酸塩又
は炭酸水累塩を用い、酸として無機の強酸を用りる特許
請求の範囲第（７）項ない［７第（９）項のいずれか１
項記載の製造方法。 - （１１）蛋白分解酵素とし２て金属プロテイナーゼを用
いる特許請求の範囲第（７）項ないし＠ （１０）項の
いずれか１項記載の製造方法。 - （１２）アスパラギン酸と塩化ベンジルオキシカルボニ
ルを水溶液中、塩基の存在下で反応させたのち、反応液
を水と二相を形成することのできる有機溶媒で洗浄して
Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアスパラギン酸を含む水
溶躾を調製する特許請求の範囲第（７）項１．いし第（
１ｌ ）Ｖのいずれ刀・１項記載の製造方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57128420A JPS5917997A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法 |
| DE198383107165T DE99585T1 (de) | 1982-07-23 | 1983-07-21 | Verfahren zur herstellung von additionsverbindung von dipeptiden-ester und aminosaeure-ester. |
| AU17169/83A AU562486B2 (en) | 1982-07-23 | 1983-07-21 | Addition compound of a dipeptide ester and an aminoacid ester |
| DE8383107165T DE3374318D1 (en) | 1982-07-23 | 1983-07-21 | Process for producing an addition compound of a dipeptide ester and an amino acid ester |
| EP83107165A EP0099585B1 (en) | 1982-07-23 | 1983-07-21 | Process for producing an addition compound of a dipeptide ester and an amino acid ester |
| US06/516,344 US4521514A (en) | 1982-07-23 | 1983-07-22 | Process for producing an addition compound of a dipeptide ester and an amino acid ester |
| CA000433018A CA1209942A (en) | 1982-07-23 | 1983-07-22 | Process for producing an addition compound of a dipeptide ester and an amino acid ester |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57128420A JPS5917997A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5917997A true JPS5917997A (ja) | 1984-01-30 |
| JPH052317B2 JPH052317B2 (ja) | 1993-01-12 |
Family
ID=14984317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57128420A Granted JPS5917997A (ja) | 1982-07-23 | 1982-07-23 | ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4521514A (ja) |
| EP (1) | EP0099585B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5917997A (ja) |
| AU (1) | AU562486B2 (ja) |
| CA (1) | CA1209942A (ja) |
| DE (2) | DE3374318D1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3532027A1 (de) * | 1985-09-09 | 1987-03-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von aspartam und mittel zu seiner durchfuehrung |
| FR2589480B1 (fr) * | 1985-11-05 | 1988-09-16 | Hoechst France | Procede biologique de preparation de n-(n-benzyloxycarbonyl l-aspartyl-1) l-phenylalaninate de methyle |
| FR2609376B1 (fr) * | 1987-01-14 | 1990-12-07 | Hoechst France | Procede de preparation de l'aspartame par voie enzymatique |
| DK72587D0 (da) * | 1987-02-13 | 1987-02-13 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider |
| DK15888D0 (da) * | 1988-01-14 | 1988-01-14 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Enzymatisk fremgangsmaade til fremstilling af immunmodulerende pentapeptider samt mellemprodukter til brug ved fremgangsmaaden |
| EP0344803B1 (en) * | 1988-06-03 | 1995-09-13 | Sharp Kabushiki Kaisha | Electronic device with calendar function |
| US5002872A (en) * | 1989-05-10 | 1991-03-26 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Enzyme mediated coupling reactions |
| US5366862A (en) * | 1990-02-14 | 1994-11-22 | Receptor Laboratories, Inc. | Method for generating and screening useful peptides |
| KR930002966B1 (ko) * | 1990-11-24 | 1993-04-16 | 주식회사 미 원 | 디펩티드의 제조방법 |
| TW306932B (ja) * | 1993-08-27 | 1997-06-01 | Holland Sweetener Co | |
| DE69613305T2 (de) * | 1995-10-11 | 2002-05-02 | Holland Sweetener Co | Verbesserte enzymatische Kupplungsreaktion von N-geschützte L-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4119493A (en) * | 1975-10-23 | 1978-10-10 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center | Process for producing a peptide |
| DE2801238C2 (de) * | 1977-01-27 | 1986-06-05 | (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo | Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern |
| JPS5411293A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
| JPS5411294A (en) * | 1977-05-23 | 1979-01-27 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Recovery of protease |
| JPS55135595A (en) * | 1979-04-03 | 1980-10-22 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Preparation of dipeptide |
| IE52242B1 (en) * | 1981-02-02 | 1987-08-19 | Searle & Co | Preparation of amino protected-l-aspartyl-l-phenylalanine alkyl ester |
| DE3274985D1 (en) * | 1981-09-21 | 1987-02-12 | Toyo Soda Mfg Co Ltd | Process for recovering a dipeptide derivative |
-
1982
- 1982-07-23 JP JP57128420A patent/JPS5917997A/ja active Granted
-
1983
- 1983-07-21 AU AU17169/83A patent/AU562486B2/en not_active Ceased
- 1983-07-21 EP EP83107165A patent/EP0099585B1/en not_active Expired
- 1983-07-21 DE DE8383107165T patent/DE3374318D1/de not_active Expired
- 1983-07-21 DE DE198383107165T patent/DE99585T1/de active Pending
- 1983-07-22 CA CA000433018A patent/CA1209942A/en not_active Expired
- 1983-07-22 US US06/516,344 patent/US4521514A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE99585T1 (de) | 1984-06-20 |
| US4521514A (en) | 1985-06-04 |
| AU562486B2 (en) | 1987-06-11 |
| DE3374318D1 (en) | 1987-12-10 |
| CA1209942A (en) | 1986-08-19 |
| EP0099585B1 (en) | 1987-11-04 |
| AU1716983A (en) | 1984-01-26 |
| JPH052317B2 (ja) | 1993-01-12 |
| EP0099585A1 (en) | 1984-02-01 |
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