DE2857145T1

DE2857145T1 - Enzyme assays

Info

Publication number: DE2857145T1
Application number: DE782857145T
Authority: DE
Inventors: P Praill; A Richardson; R Price
Original assignee: National Research Development Corp UK; National Research Development Corp of India
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1977-11-01
Filing date: 1978-10-31
Publication date: 1980-12-11
Also published as: CH651068A5; NL7810846A; BE871717A; DE2857145C2; JPH0238199B2; DE2858733C2; JPS54500072A; CH651319A5; IT1109621B; GB2079450B; GB2079450A; CA1181331A; CA1190223A; DK484278A; GB2008103B; WO1979000255A1; IT7869517A0; EP0007372A1; GB2008103A; US4318986A

Description

-*·- 2857ΊΑ5

Beschreibung;

Die Erfindung betrifft Enzymassays und insbesondere Reagentien zur Erfassung und Bestimmung bzw. zum Nachweis von Enzymen.

Das Vorhandensein oder die Abwesenheit von bestimmten Enzymen in physiologischen Proben, z.B. Urin-oder Serumproben von menschlichen Eatienten, ist ein wertvoller Indikator für Krankheiten oder Unregelmäßigkeiten in dem betreffenden Organismus, z.B. für Organfehlfunktionen bei Menschen. So sind z.B. erhöhte Gehalte des Enzyms N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAG), das im Urin von Nierenübertragungspatienten ausgeschieden wird, ein frühes Anzeichen für eine bevorstehende Zurückstoßung der transplantierten Niere. Daneben sind die erhöhten Werte eine allgemeine Anzeige für Nieren- und andere Krankheiten. Derzeit geht man beim üblichen klinischen NAG-Assay so vor, daß man eine Urinprobe mit dem 4-Methylumbelliferylglycosid-Substrat des Enzyms, das sich unter Freisetzung des entsprechenden Umbelliferons umsetzt, inkubiert, und daß man das gebildete Umbelliferon fluorimetrisch überwacht. Alternativ kann man ein Nitrophenylglycosidsubstrat, p-Nitrophenyl-Z-acetamido-Z-deoxy-ß-D-glucopyranosid, verwenden, das sich mit dem Enzym unter Freisetzung von p-Nitrophenol umsetzt, welches kolorimetrisch überwacht wird. Diese Assaymethoden erfordern jedoch die Verwendung von komplizierten spektrophotometrischen Vorrichtungen und sie sind nur dann für den Gebrauch geeignet, wenn der Zugang zu gut eingerichteten Laboratorien besteht.

Es wurden nun neue Enzymassayreagentien entwickelt, die in manchen Fällen eingesetzt werden können, ohne daß die Verwendung einer komplizierten Überwachungsvorrichtung erforderlich ist.

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Gegenstand der Erfindung ist daher ein Reagenz für einen Enzymassay, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Substanz enthält, die dazu imstande ist, mit dem Enzym unter Bildung einer Verbindung der Formel X-A-Y-NOp eine Wechselwirkung bzw. Umsetzung einzugehen, wobei A für einen aromatischen Kern steht, X eine auxochrome Gruppe bedeutet und Y für eine ungesättigte Gruppe, die dazu imstande ist, eine Elektronenresonanz zwischen dem aromatischen Kern und dem Nitrosubstituenten zu übertragen, steht und wobei die genannte Verbindung per se dazu imstande ist, ein visuelles Signal zu erzeugen, das leicht durch das Auge wahrnehmbar ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Enzymassay, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Probe, die das Enzym enthält, mit einem erfindungsgemäßen Reagenz inkubiert, um die Bildung einer Verbindung der Formel X-A-Y-NO₂ zu bewirken, und daß man erforderlichenfalls die Verbindung einer weiteren Behandlung unterwirft, um ein visuelles Signal zu entwickeln, das durch das Auge leicht wahrnehmbar ist.

Das Reagenz enthält typischerweise einen Enzymsubstratteil und einen weiteren Teil, der zur Bildung der Verbindung der Formel X-A-Y führt. Das erfindungsgemäße Reagenz enthält gewöhnlich die Verbindung X-A-Y-NO₂ oder einen einfachen Vorläufer davon in Kombination mit dem Substratteil. Bei der Umsetzung bzw. Wechselwirkung mit dem Enzym setzt die Substanz die Verbindung oder einen einfachen Vorläufer frei. So ist die Verbindung oder ihr Vorläufer gewöhnlich an den Substratteil an oder angrenzend an die Seite bzw. Stelle innerhalb der Substanz angefügt, an der die Enzymaktivität stattfindet. Bei einer Ausführungsform sind der

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Enzymsubstratteil und der weitere Teil des Reagenzes zweckmäßig durch die auxochrome Gruppe X verknüpft und die Substanz hat die allgemeine Formel S-X-A-Y-NO₂, wobei S den Enzymsubstratteil der Substanz bedeutet und X, A und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben. Solche Reagentien setzen die Verbindung bei der Umsetzung mit dem Enzym frei.

Die erfindungsgemäßen Reagentien, Substanzen und das erfindungsgemäße Verfahren sind allgemein für die Bestimmung von Enzymen weit anwendbar. Der Enzymsubstratteil der Substanz kann dabei entsprechend dem jeweiligen Enzym, das bestimmt werden soll, variiert werden. Typischerweise sind jedoch die Enzyme, die durch die Erfindung erfaßt werden sollen, katabolische Enzyme, z.B. diejenigen, die beim Abbau von Makromolekülen in den Zellgeweben eine wichtige Rolle spielen. Erfaßbare Enzyme sind z.B. Carboxylatesterasen und

Lipasen, saure und alkalische Phosphatasen, Phosphodiesterasen und Sulfatasen. Die entsprechenden Reagentien können daher entsprechende Carboxylat-, Phosphat-, Diphosphat- und Sulfatester enthalten. Die Erfindung ist weiterhin insbesondere auch auf die Erfassung von Glycosidasen anwendbar, in welchem Falle der Substratteil S des Reagenzes. charakteristischerweise einen entsprechenden Glycosidkohlenhydratsubstituenten, z.B. einen α- oder ß-Glucopyranosyl-, -Galactopyranosyl- oder -Mannopyranosylsubstituenten, enthält. So hat sich beispielsweise die Erfindung besonders gut für die Erfassung von N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAG) als geeignet erwiesen.

Die Erfindung kann allgemein für Assays, die auf das Vorhandensein von Enzymen und die Überwachung ihrer Konzentrationsgehalte gerichtet sind, angewendet werden. So kann sie beispielsweise zur Diagnose von entsprechenden Defek-

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ten oder Krankheiten angewendet werden. Beispielsweise kann der NAG-Gehalt von Urin zur frühen Feststellung von Nierenerkrankungen untersucht werden. Im speziellen Fall kann die Erfindung als frühe Anzeige einer Nierenabstoßung bei Nierenübertragungspatienten angewendet werden. Alternativ kann die Erfindung auch dazu verwendet werden, die Abwesenheit von Enzymen zu bestimmen, die beispielsweise bestimmte genetische Störungen anzeigen kann. Im allgemeinen können die erfindungsgemäßen Reagentien und Methoden auch geeignete Werkzeuge zur Verwendung in der biochemischen und der medizinischen Forschung ergeben.

Vorzugsweise ist die Verbindung X-A-Y-NOp dazu imstande, eine Farbveränderung, die durch das Auge leicht wahrnehmbar ist, zu ergeben. Im letzteren Falle unterscheidet sich die erzeugte Färbung erheblich von der Hintergrundfärbung der Probe. So setzen beispielsweise diejenigen erfindungsgemäßen Reagentien, die bei Urinproben eingesetzt werden sollen, wie Reagentien für NAG-Assays, typischerweise Substanzen frei, die dazu imstande sind, Färbungen zu erzeugen, die sich erheblich von der Hintergrundfarbe des Urins unterscheiden. Die erfindungsgemäßen Reagentien setzen vorzugsweise Verbindungen frei, die dazu imstande sind, unterscheidbare Farben, vorzugsweise rot oder blau, zu erzeugen. Somit haben geeignete freigesetzte Verbindungen gewöhnlich eine λ max bei alkalischen Bedingungen im Bereich von etwa 450 bis etwa 700, vorzugsweise von etwa 500 bis etwa 600, insbesondere in Kombination mit einem hohen Extinktionskoeffizienten, z.B. einem ε-Wert von mehr als etwa 20000.

Innerhalb der allgemeinen Formel der Verbindung X-A-Y-NO₂ können naturgemäß viele typisch gefärbte und Farbstoff-

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verbindungen existieren. Geeignete Verbindungen zum Erhalt eines leicht wahrnehmbaren visuellen Signals liegen für den Fachmann auf der Hand. Vorzugsweise ist jedoch die Gruppe A ein monocyclischer aromatischer Kern, insbesondere ein Benzolkern.

Die Gruppe Y kann auch irgendeine geeignete ungesättigte Gruppe sein, welche dazu imstande ist, eine Elektronenresonanz zwischen A und dem N0₂-Substituenten zu Übertragen. Sie kann Systeme, die Heteroatome und/oder annulierte bzw. ringförmige Systeme enthalten, einschließen. So kann z.B. die Gruppe A einen Benzolring, der ein Ring eines Naphthylkerns ist, wobei der andere Ring des Naphthylkerns die Gruppe Y ergibt, umfassen.Die Gruppe Y kann auch eine acetylenische Unsättigung sein. Es wird jedoch mehr bevorzugt, daß die Gruppe Y eine äthylenische Unsättigung ist, die bezüglich des aromatischen Kerns A konjugiert ist, z.B. ein Äthenyl-, Butadienyl- oder Hexatrienylsubstituent. Somit ist bei einer bevorzugten Ausführungsform das erfindungsgemäße Reagenz dazu imstande, sich mit dem Enzym unter Bildung einer Verbindung der Formel:

in der X die obige Definition hat, η den Wert 1, 2 oder 3 hat und R¹, R², R³ und R = H, OMe, NO₂, CH₃, -CH = CR'R"

₂, CH₃ oder CO₂H, umzusetzen. Die Gruppen R' und R" des Substi-

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tuenten -CH = CR'R« können ähnliche Gruppen wie R¹, R², R- und R , vorzugsweise H, NO₂ oder eine weitere konjugierte ungesättigte Substitution, z.B. -CH = CR^xR^y, sein.

Die auxochrome Gruppe X kann jede beliebige geeignete auxochrome Gruppe, z.B. eine Aminogruppe (NH₂) oder vorzugsweise eine Hydroxylgruppe (-0H), sein.

Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen steht X für eine Hydroxylgruppe und A für eine Styrylgruppe. Somit sind besonders bevorzugte Reagentien gemäß der Erfindung solche, bei denen bei Umsetzung mit dem Enzym eine 4-Hydroxy-ü-nitrostyrolverbindung, d.h. eine Verbindung der Formel:

II

12 3 4
worin R , R , R und R die oben angegebenen Bedeutungen haben, gebildet wird. Die Verbindungen der Formel II zeigen im allgemeinen überraschende und hocherwünschte Farbeigenschaften, die sich zur Verwendung als eine Komponente des erfindungsgemäßen Reagenzes besonders geeignet machen. Es ist festgestellt worden, daß die Verbindungen der Formel II bei alkalischen Bedingungen typischerweise eine stark rote Farbe haben, was im Gegensatz zu der schwach orange-gelben Färbung von p-Nitrophenol steht. Weiterhin haben sie Absorptionsmaxima (λmax), die in unerwarteter

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Weise signifikant höher sind als diejenigen von p-Nitrophenol (~400 unter alkalischen Bedingungen). Diese erhöhten Farbeigenschaften sind vermutlich auf die Bildung eines Radikalions zurückzuführen, das nach dem untenstehenden Schema als Ergebnis eines Oxidationsprozesses erhalten wird.

R¹

Das Vorliegen von elektronenabgebenden Substituenten, z.B, von Alkoxygruppen, wie Methoxygruppen, angrenzend an den Hydroxylsubstituenten scheint die Bildung dieses Radikalions zu stabilisieren. Dies zeigt sich durch die Farbeigenschaften der 3-Methoxy- und insbesondere der 3,5-Dimethoxyanalogen der untenstehenden Formeln III und IV, auf denen besonders bevorzugte Reagentien aufgebaut sind.

III

IV

MeO

OMe

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Somit haben die Monomethoxyverbindung III und die Dimethoxyverbindung IV Absorptionsmaxima (Amax) von 506 und 530 mit Extinktionskoeffizienten (ε) von 24600 und 22300 in einem Puffer bei pH 8,8. Sie zeigen bei diesen Bedingungen zufriedenstellende scharlachrote Färbungen.

Zweckmäßigerweise kann die auxochrome Gruppe X, z.B. -OH, die Verknüpfung zwischen der Verbindung X-A-Y-NO₂ und dem Substratteil des Reagenzes ergeben, daß die Verbindung durch Umsetzung mit dem Enzym freigesetzt wird. Somit werden Beispiele für erfindungsgemäße Reagentien nachfolgend durch die Formeln A bis E angegeben. Der Einfachheit halber beziehen sich diese nur auf Reagentien, die einen einfachen 4-Hydroxy-w-nitrostyrylsubstituenten enthalten; dieser letztgenannte Substituent kann jedoch durch einen Substituenten ersetzt werden, der allgemein mit den Verbindungen X-A-Y-NO₂ im Zusammenhang steht.

Die Verbindungen

CH₃-C

A.

B.

NIqO-P

C.

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AO- 2857H5

sind Reagentien, die zum Assay von (α) Esterasen oder Lipasen, (B) sauren oder alkalischen Fhosphatasen, (C) Phosphodiesterasen, (D) Arylsulfatasen und (E) Glycosidasen

Z
geeignet sind. R in der Formel E bedeutet einen Kohlenhydratsubstituenten, z.B. einen α- oder ß-Glucopyranosyl-, -Galactopyranosyl- oder -Mannopyranosylrest.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die bevorzugten, mit Nitrostyryl substituierten Reagentien aus Vanillin oder ähnlichen Materialien auf Hydroxybenzaldehydbasis, z.B. p-Hydroxybenzaldehyd oder Salicylaldehyd, durch Nitromethylierung des entsprechenden Addukts aus Substrat und Vanillin oder aus Substrat und einer ähnlichen Verbindung hergestellt werden können. Vorzugsweise werden bei der Nitromethylierung mild-alkalische Bedingungen angewendet. Es wird angenommen, daß ähnliche Reagentien durch entsprechend ähnliche Wege hergestellt werden können.

Die zu untersuchenden Proben liegen zweckmäßig in fließfähiger Form vor und sie schließen Proben, die physiologische Flüssigkeiten, wie Serum oder Urin,enthalten, ein.

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Es können auch andere geeignete Proben untersucht werden, beispielsweise Proben, die sich von Zellhomogenaten ableiten, beispielsweise Proben, wie sie üblicherweise bei der Untersuchung von genetischen Störungen verwendet werden.

Das Reagenz und die Probe werden miteinander inkubiert. So werden beispielsweise die Probe und die das Reagenz enthaltende Lösung miteinander vermischt und bei geeigneten Bedingungen über einen geeigneten Zeitraum umsetzen gelassen. Vorzugsweise ist die Inkubationstemperatur höher als etwa 30°C und sie beträgt z.B. etwa 30 bis etwa 40⁰C. Bei diesen Bedingungen ist gewöhnlich eine Inkubationszeit von bie zu etwa 30 min, z.B. von etwa 10 bis 15 bis zu etwa 30 min, zufriedenstellend. Als Alternativmöglichkeit zu der Verwendung des Reagenzes in Lösung kann das Reagenz auch in Verbindung bzw. Vergesellschaftung mit einem geeigneten Material in fester Phase, z.B. Celluloseteilchen, wie mikrokristalliner Cellulose, beispielsweise darin absorbiert, verwendet werden. Hierdurch können mit Vorteil Probleme überwunden werden, die von einer Unlöslichkeit oder schlechten Löslichkeit des Reagenzes herrühren. Das Reagenz kann auch in Verbindung bzw. Vergesellschaftung mit einem porösen festen Trägermaterial, beispielsweise Papier, verwendet werden, um ein geeignetes Testpapier oder Eintauchstäbchen für einen einfachen Tauchtest zu ergeben. Solche Produkte, die das erfindungsgemäße Reagenz zusammen mit einem geeigneten inerten festen Material oder einem porösen festen Trägermaterial enthalten, fallen ebenfalls unter den Rahmen dieser Erfindung.

Bei der Inkubation setzt das Reagenz eine Verbindung frei oder, allgemeiner gesprochen, es bewirkt deren Bildung,

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■τ⁵

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welche ohne weitere Behandlung ein visuelles Signal, beispielsweise eine Farbe, ergeben kann, die das Vorhandensein des Enzyms in der Probe anzeigt. Oftmals kann die Verbindung jedoch eine weitere Behandlung benötigen, um das visuelle Signal zu entwickeln. Eine derartige Behandlung ist typischerweise eine Aktivierung, um das inhärente visuelle Signal der Verbindung zu entwickeln. Diese weitere Behandlung schließt keine Stufen der synthetischen oder präparativen Chemie, wie beispielsweise die Diazoniumkupplungsverfahren, die bei einigen bekannten Enzymassayreagentien verwendet werden, ein. üblicherweise ist die Behandlung eine alkalische Behandlung, die zu einer Salzbildung führen kann, die die Delokalisierung der Elektronenladung gestattet. Diese Behandlung ist beispielsweise eine alkalische Behandlung der bevorzugten konjugierten ungesättigten chromophoren Substanzen, die vorteilhafterweise zu der Entwicklung von gefärbten visuellen Signalen führt. Die alkalische Behandlung kann die Zugabe von Alkali zu der Lösung, die die freigesetzte Verbindung enthält, sein. Vorzugsweise kann sie darin bestehen, daß die Lösung, die die Verbindung enthält, mit einem Reagenz in fester Phase, z.B. einem Absorptionsmittel, in Kontakt gebracht wird, welches gleichzeitig eine alkalische Umgebung für die Verbindung schafft. So wird beispielsweise die Lösung, die die Verbindung enthält, mit einem anionischen Austauschermaterial, das vorzugsweise eine neutrale Farbe hat, z.B. weiß, oder nur leicht gefärbt ist und das in seiner freien Basenform, z.B. in der Hydroxyl- (OH"")-Form vorliegt, kontaktiert. So kann z.B. das anionische Austauschermaterial DEAE-Cellulose oder ein ähnliches leicht gefärbtes anionisches Austauschermaterial in freier Basenform sein. Die Verwendung eines absorbierenden anionischen Austauschermaterials kann von besonderem Vorteil sein und die Absorption und Konzentrierung der

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freigesetzten Substanz erfolgt in ein enges Band, wodurch die Überwachungsleichtigkeit erhöht wird. Die Verwendung von DEAE-Cellulose und von ähnlichen Materialien in dieser Hinsicht wird als neu angesehen. Daher soll die Verwendung dieser Materialien in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen.

Bei einer bevorzugten Ausf uhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens geht man daher so vor, daß man eine Probe, die das Enzym und das Reagenz, das mit dem Material der festen Phase, z.B. einem inerten Absorptionsmittel oder einem porösen Trägermateriau, verbunden ist, enthält, inkubiert, wodurch eine Verbindung X-A-Y-NOp gebildet wird, und daß man die Lösung, die diese Verbindung enthält, mit einem Reagenz in der festen Phase, welches eine alkalische Umgebung für die Substanz schafft, kontaktiert, wodurch eine Farbveränderung oder ein anderes visuelles Signal erzeugt wird, das für das Auge leicht wahrnehmbar ist.

Durch die Erfindung wird auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung gestellt, welche gewöhnlich in Form einer Durchflußvorrichtung vorliegt. Diese Vorrichtung enthält normalerweise zwei Abteile, nämlich ein Inkubationsabteil, das das Reagenz, das mit dem Material in der festen Phase, z.B. mikrokristalliner Cellulose, verbunden ist, enthält, und ein Sichtbarmachungsabteil, das ein Reagenz in der festen Phase, welches eine alkalische Umgebung für die Substanz schafft, z.B. DEAE-Celluiose oder eine ähnliche Substanz, enthält. Die Abteile sind in typischer Weise miteinander verbindbar, beispielsweise durch einen geeigneten verbindenden Durchtritt, um einen Strom der Flüssigkeit, die die

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freigesetzte Verbindung enthält, von dem Inkubations- zu dem Sichtbarmachungsabteil zu gestatten. Die zwei Abteile sind jedoch vorzugsweise dazu imstande, daß sie voneinander isoliert bzw. abgeschlossen werden können, um beispielsweise die Retention der Probe in dem Inkubationsabteil über die erforderliche Inkubationsperiode zu gestatten. Der Durchtritt zwischen den zwei Abteilen kann mit einem geeigneten Hahn oder einer anderen Schranke versehen sein, der bzw. die nach der erforderlichen Inkubationszeit geöffnet bzw. entfernt werden kann, damit die Flüssigkeit in das Sichtbarmachungsabteil einströmen kann, beispielsweise durch das bevorzugte DEAE-Cellulose-Absorptionsmittel hindurchströmen kann.

So kann z.B. die Durchflußvorrichtung aus zwei Abteilen bestehen, die an ihren Grenzoberflächen mittels eines Zapfens zusammengefügt sind. Beide Oberflächen sind mit Auslassen mit einem fixierten Radius von dem Zapfen versehen, so daß eine gegenseitige Drehung der Abteile die Auslässe mit anderen in Übereinstimmung bringt, wodurch ein Durchtritt zwischen den Abteilen erhalten wird. Alternativ kann der Durchtritt zwischen den Abteilen durch eine lockere Schranke blockiert sein, die in gewünschter Weise aufgebrochen werden kann, beispielsweise dadurch, daß man die zwei Abteile z.B. durch eine Schrauben/Gewinde-Einwirkung zueinander bringt.

Die Konzentration des verwendeten Reagenzes, das beispielsweise in Verbindung mit dem inerten Material in fester Phase vorhanden ist, kann in gewünschter Weise variiert werden, beispielsweise entsprechend der Schwellenkonzentration des Enzyms, das überwacht werden soll. Eine Erhöhung der Konzentration des Reagenzes gestattet im allgemeinen

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die Erfassung von niedrigeren Schwellenkonzentrationen des Enzyms. Weiterhin gestattet die Verwendung eines Reagenzes in fester Phase, z.B. von DEAE-Cellulose, um die freigesetzte Substanz sichtbar zu machen, die Erfassung von sehr kleinen Mengen der freigesetzten Substanz, was auf die Konzentration der Farbe, die in einem engen Absorptionsband erzeugt wird, zurückzuführen ist. In dieser Hinsicht hat es sich als möglich erwiesen, das Vorhandensein der Substanz 2-Methoxy-4-(ß-nitroäthenyl)-phenol bei molaren Konzentrationen von 1 bis 2 χ 10 durch Kontakt der Lösung mit DEAE-Cellulose nachzuweisen. Weiterhin wurde beispielsweise festgestellt, daß die Verwendung von 3% des entsprechenden NAG-Erfassungsglycosids (E) auf einer inerten festen Cellulosephase in Kombination mit einer Sichtbarmachung mit DEAE-Cellulose dazu imstande ist, eine Schwellenkonzentration von NAG im Urin von etwa 40 bis 50 η Mol/ml nach 20-minütiger Inkubation bei 37°C zu erfassen. Dagegen ergibt die Verwendung einer Cellulose, die 8% Glycosid in dem gleichen System enthält, eine Erfassungsschwelle von etwa 20 bis η Mol/ml. Beide Systeme ergeben breite intensive Bänder für abnormale Urinwerte, die leicht von denjenigen von normalen Urinen unterschieden werden können. Es wird daher im Hinblick auf den Effekt der Substratkonzentration und der Leichtigkeit der Sichtbarmachung ersichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren durch die Patienten selbst zu Hause durchgeführt werden kann, wobei eine in geeigneter Weise hergestellte Durchflußvorrichtung verwendet wird und eine minimale analytische Geschicklichkeit erforderlich ist. So kann beispielsweise der Patient einfacherweise eine feste Menge von frischem Urin in das Inkubationsabteil, beispielsweise bis zu einem festen Niveau, das auf der Seite des Abteils angegeben wird, eingeben. Nach einer Standardinkubationszeit, die gewöhnlich von der Umgebungs-

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temperatur abhängt, verbindet er das Inkubations- mit dem Sichtbarmachungsabteil und der inkubierte Urin kann durch das Sichtbarmachungsreagenz in fester Phase hindurchfließen.

Das visuelle Signal, beispielsweise die Farbveränderung, die durch die freigesetzte Substanz erzeugt wird, schafft in vorteilhafter Weise ein rasches und einfaches Mittel zum Nachweis des Vorhandenseins des Enzyms in der Probe im Vergleich zu bislang verwendeten Methoden, bei denen komplizierte Überwachungsvorrichtungen erforderlich sind. Weiterhin kann die Intensität des erzeugten visuellen Signals, z.B. der Farbe, als grobe visuelle Anzeige der Konzentration des in der Probe vorhandenen Enzyms genommen werden. Wenn jedoch genauere Messungen erforderlich sind, können die erfindungsgemäßen Reagentien spektrophotometrlsch, beispielsweise in herkömmlicher Weise, überwacht werden. So kann beispielsweise die erzeugte Farbe unter Verwendung eines Kolorimeters, gewöhnlich nach Einstellung des pH-Werts auf 8,5 bis 9,5 mit einem geeigneten Puffer, bestimmt werden. Bei solchen Methoden können die erfindungsgemäßen Reagentien geeigneter sein als entsprechende bekannte Reagentien, z.B. p-Nitrophenol- und o-Nitrophenolsubsträte.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Diese Ausführungen beziehen sich auf die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymassavreagentien und ihrer Komponenten sowie auf die Verwendung dieser Reagentien bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Es wird auch auf die beigefügten Zeichnungen Bezug benommen, in denen

Fig. 1 eine Form einer erfindungsgemäßen Durchflußvorrichtung und .

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Fig. 2 eine Alternativform einer erfindvmgsgemäßen Durchflußeinrichtung

darstellen.
Beispiel 1

Herstellung von Nitrostyrylglvcosiden zum Nachweis und zur Bestimmung von entsprechenden Glycosidasen

I. Herstellung der Hydroxybenzaldehydglycoside

Als erste Stufe der Herstellung der erfindungsgemäßen Nitrostyrylglycosidenzymsubstrate werden die entsprechenden Hydroxybenzaldehydglycoside hergestellt.

Eine Lösung des entsprechenden Glycopyranosylhalogenids (70 mMol) in Aceton (200 ml) wurde mit einer Lösung des Phenols (100 mMol) in M-Natriumhydroxidlösung behandelt. Das resultierende Gemisch wurde 16 h lang bei Raumtemperatur unter Rühren gehalten. Hierauf wurde das Reaktionsgemisch mit Wasser verdünnt, bis sich das Produkt abschied. Kristalline Glycosidprodukte wurden direkt abfiltriert und nicht-kristalline Produkte wurden durch Chloroformextraktion in üblicher Weise isoliert.

Nach dem Abfiltrieren der kristallinen Produkte kann ein weiteres Produkt aus den Mutterlaugen durch Extraktion mit Chloroform oder Dichlormethan gewonnen werden.

Nachstehend werden die Ergebnisse angegeben, die bei der Herstellung eines Bereiches von Hydroxybenzaldehydglycosiden erhalten wurden:

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(a) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde in 55%iger Ausbeute aus 2-Acetamido-3,4,6-tri~0-acetyl-2-deoxy-a-D-glucopyranosylchlorid erhalten. Das Produkt hatte einen Fp von 220 bis 221°C (Äthanol) und einen [a]_D von -13,5° (c 1, DMSO).

(b) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-ß-D-glucopyranosyloxy)-benzaldehyd wurde in ähnlicher Weise in 47?6iger Ausbeute erhalten. [α]_β -19° (c 1, CHCl,).

(c) 4-(2-Acetamido-3,4,6-tri-0-acetyl-2-deoxy-ß-D-glycopyranosyloxy)-3,5-dimethoxybenzaldehyd wurde in ähnlicher Weise in 15%iger Ausbeute erhalten. Fp 239 bis 240°C (Methanol), [a]_D +3,8° (C₁2 DMSO).

(d) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-ß-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde aus 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-glucopyranosylbromid in 62%iger Ausbeute erhalten. Fp 135 bis 136°C (Äthanol), [a]_D -24,2° (c 1,1, CHCl₃).

(e) 4-0-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde aus 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-galactopyranosylbromid anfänglich als Sirup (4796) erhalten, der kristallisierte und mit Schwierigkeiten aus Äthanol/Äther/Leichtpetroleum umkristallisiert wurde. Fp 148 bis 149⁰C, [a]_D -4,4° (c 1,1, CHCl₃).

(f) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-mannopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde als Sirup in I4%iger Ausbeute aus 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosylbromid (15) erhalten. [a]_D +15,9° (c 1,4, CHCl₃).

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II. O-Deacetylierung von Hydroxybenzaldehydglycosiden

In der nächstenStufe der Herstellung der Nitrostyrylenzymsubstrate wurden bestimmte der Hydroxybenzaldehydglycoside durch Behandlung mit methanolischem Natriummethoxid O-deacetyliert. Lösungen der acetylierten Glycoside (15 mMol) in Methanol (50 bis 500 ml) wurden mit M-methanoliseher Natriummethoxidlösung (0,5 bis 2 ml) behandelt und die Lösungen wurden 20 bis 30 min lang bei Raumtemperatür oder solange, bis die Reaktion beendigt war, stehen gelassen. Letzteres wurde durch TLC-Analyse festgestellt. Die Lösungen wurden sodann durch Kissen mit Silicagel geleitet, um Natriumionen zu entfernen, und sodann zur Trockene eingedampft.

Nachstehend werden die für verschiedene Glycoside erhaltenen Ergebnisse angegeben:

(a) 4-(2-Acetamido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd kristallisierte direkt aus dem Reaktionsgemisch in 90%iger Ausbeute. Fp 199 bis 200⁰C (Zers.), Ca]_n -20° (c 1, DMSO).

(b) 4-(ß-D-Glucopyranosyl)-3-methoxybenzaldehyd wurde in 85%iger Ausbeute als weißes Pulver erhalten. Fp 188 bis 190⁰C, Ca]_D +2,2° (c 0,7, DMSO).

(c) 4-(a-D-Galactopyranosyloxy)-3-methoxybenzaldehyd wurde als weißes Pulver in 92%iger Ausbeute erhalten.,Fp 204 bis 206⁰C, Ca]_n +4,8° (c 1,1, DMSO).

(d) 4-(a-D-Mannopyranosyi)-3-methoxybenzaldehyd wurde in kristalliner Form in 64%iger Ausbeute erhalten. Fp 196 bis 197°C (Äthanol), Ca]_n +119,6° (c 1, DMSO).

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^e 1 TIi ^ ^TO-tromethylloiTOHl-'der Ilydroxybenzaldehydftlycoside

Als nächstes wurden sowohl acetylierte^Ls auch, deacetylierte Hydroxybenzaldehydglycoside, die wie oben"hergestellt

,._..„_ft efg §iö§i§yA ..· .

^lt ?⁸aÄi^1I^i^ä#^saure (4 ml) wurden zu einer gerlihrien "Lösung oder Suspension des

^aIi₁Ol d^bis 200

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mit^88^ durch er kri-

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osoo\soaoeö

stalliner Feststoff erhalten. Fp 239 bis 240⁰C, [aJ₀ -6,9° (c 1,15, DMSO).

(b) 4- (ä-Acetatoidp-S-deo^-ß-^ ) -3-me-

thoxy-w-nitrostjrrol wurde durch Iflethodei (B) mit 87#iger , Ausbeute als hellgelber Feststoff'erhalten; Fp 200 bis 201,5⁰C (Zers.), [ä]_D -1,4° (c Ö;9/ J

(c) 4-(2-Acetamido-3,4, e-tri-Ö-äcetyl-ä-deoxy-ß-D-glucopyranosyloxy)-ü>-nitröstyrol wurd^ durcfc Methode (B) als sehr hellgelber Feststoff erhalten. Fp 258 bis 259°C, CaJ₀ -14,3° (c 1,1, CHCl₃).

(d) 4- (2,3,4, e-Tetra-O-ace-tyl-ß-D-glucopyranosyloxy ) -3-methoxy-k3-nitrostyrol wurde durch Methode (A) als cremiger gelber Feststoff in 9öliger Ausbeute erhalten. Fp 192 bis 194°C, CaJ₀ -12,4° (el,2, CHCl₃).

(e) 4-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-ß-D-galactopyranosyloxy)-3-methoxy-w-nitrostyrol wurde durch Methode (A) in 25?6iger Ausbeute nach Extraktion aus dem Reaktionsgemisch mit Dichlormethan und Chromatographie auf einer Kieselgelsäule unter Verwendung von Äther/Leichtpetroleum als ELutionsmittel erhalten. Fp 148 bis 149°C, CaJ₀ -4,4° (c 1,1, CHCl₃),

(f) 4-ß-D-Galactopyranosyloxy-3-methoxy--^t*i-nitrostyrol wurde durch Methode (A) in Form von hellgelben Kristallen in 69?6iger Ausbeute erhalten. Fp 212 bis 214⁰C, CaJ₀ +1,3° (c 1,5, DMSO).

(g) 4-(2,3,4,5-Tetra-0-acetyl-a-D-manriopyranosyloxy)-3-methoxy-onitrostyrol wurde durch Methode (A) als hellgelb ber amorpher Feststoff erhalten. Fp 131 bis 132°C, -15,7° (c 0,8, CHCl₃).

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IV. O-Deacetylierung von Nitrostyrvlglycosiden

Schließlich wurden O-acetylierte Nitrostyrylglycoside, die auf die obige Weise hergestellt worden waren, deacetyliert.

Eine gerührte Lösung oder Suspension des entsprechenden 0-acetylierten Nitrostyrylglycosids (2 mMol) in Methanol (150 ml) wurde mit M-methanolischer Na tr iumme thoxidlösung (2,5 ml) behandelt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 bis 20 min lang gerührt und sodann durch ein Kissen aus Silicagel geleitet, um Natriumionen zu entfernen. Das Silicagel wurde gut mit Methanol gewaschen und das mit den Waschwässern kombinierte Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde unter Zuhilfenahme von etwas Äthanol abfiltriert. Untenstehend werden die Ergebnisse angegeben, die für verschiedene hergestellte Nitrostyrylglycoside erhalten worden waren:

(a) 4-(2-Acetamido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxy-LO-nitrostyrol wurde als hellgelbes amorphes Pulver in quantitativer Ausbeute erhalten. Das Produkte konnte nicht zufriedenstellend umkristallisiert werden, ohne daß eine gewisse Zersetzung bewirkt wurde. Fp 198 bis 199°C (Zers.), O]_D -7,8° (c 1,4, DMSO).

(b) 4-ß-D-Glucopyranosyloxy-3-methoxy-6o-nitrostyrol wurde in 77%iger Ausbeute in Form von gelben Kristallen hergestellt. Fp 140 bis 141⁰C, [a]_D -8,7° (c 1, DMSO).

(c) 4-a-D-Mannopyranosyloxy-3-methoxy-i^-nitrostyrol (23) wurde als amorpher hydroskopiseher oranger Feststoff erhalten. [<x]_D +80,1° (c 0,8, DMSO).

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yf -

0.3- 2857U5

Die auf die obige Weise hergestellten Glycoside sind zur Verwendung für den Nachweis und die Bestimmung der entsprechenden Glycosidasen geeignet. Reagentien, die diese Glycoside enthalten, fallen unter den Rahmen dieser Erfindung und diese Reagentien können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Typischerweise setzen die Glycoside die entsprechende Hydroxynitrostyrylverbindung durch Umsetzung mit dem entsprechenden Enzym frei, wodurch ein leicht wahrnehmbares visuelles Signal, beispielsweise eine Rotfärbung, erhalten wird.

Ein inertes Material in fester Phase kann mit den auf die obige Weise hergestellten Glycosiden oder anderen Enzymsubstraten gemäß der Erfindung imprägniert werden. So wird z.B. die erforderliche Menge von mikrokristalliner Cellulose (Avicell) zu dem Eluat von dem auf die obige Weise hergestellten Silicagel gegeben. In einem Drehverdampfer wird zur Trockene eingedampft und der resultierende Feststoff wird mit einem Mörser und einem Pistill zu einem feinen Pulver vermählen.

Beispiel 2

Herstellung der Esterderivate von 4-Hydroxy-^-nitrostyrolen zum Nachweis und zur Bestimmung der entsprechenden Esterasen

Ein Bereich von Esterderivaten von 4-Hydroxy-^-nitrostyrolen wurde zur Verwendung in erfindungsgemäßen Reagentien zum Nachweis und zur Bestimmung der entsprechenden Esterasen hergestellt.

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(1) 4-Acetoxv-3-methoxv-'^-nlti'O3tyrol

Vanillylacetat (19,4 g, 100 mMol) wurde mit Nitromethan, Ammoniumacetat und Essigsäure, wie bei Methode (A), Teil III des Beispiels 1, über einen Zeitraum von 2 bis 3 Tagen umgesetzt. Das rotgefärbte Reaktionsgemisch wurde"sodann mit Wasser verdünnt und die resultierende Ölschicht wurde mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wur de getrocknet (MgSO^) und zur Trockene eingedampft. Der resultierende Feststoff wurde aus Chloroform/Äthanol umkristallisiert, wodurch das Acetat erhalten wurde. Fp bis 162,2°C (20 g,

Alternativ wurde das 3-Methoxy-w-nitrostyrylacetat aus dem entsprechenden Hydroxynitrostyrol hergestellt. 4-Hydroxy-3-methoxy-l^-nitrostyrol (15 g, 0,77 mMol) wurde zu Essigsäureanhydrid (15 ml) gegeben und das Gemisch wurde 1,5 h lang am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde sodann in Eiswasser gegossen und der ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert und aus Chloroform/Äthanol umkristallisiert, wodurch das Acetat (1,7 g, 93%), Fp 163 bis 165°C, erhalten wurde, das mit dem oben hergestellten Produkt identisch war.

Das obengenannte to-Nitrostyrylacetat ist für die erfindungsgemäßen Reagentien und das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Acetatesterasen geeignet. Bei der Umsetzung mit solchen Enzymen wird 4-Hydroxy-3-methoxy-Cv>-nitrostyrol freigesetzt, das bei alkalischen Bedingungen eine starke Rotfärbung zeigt.

(2) 4-Propvloxy-3-methoxv-6J-nitrostyrol 4-Hydroxy-3-methoxy-^-nitrostyrol (3,9 g, 20 mMol) wurde

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in trockenem Pyridin (15 ml) aufgelöst, und das Gemisch wurde mit PropionylChlorid (2,8 g, c 30 mMol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde warm und es bildete sich ein dunkelroter Niederschlag. Nach ca. 5 min wurde das Gemisch in Eiswasser gegossen und der resultierende gelbe Niederschlag wurde abfiltriert, gut mit Äthanol gewaschen und aus Chloroform/Äthanol umkristallisiert, wodurch das Propionat (4,8 g, 95%)_t Fp 101 bis 104,5°C, erhalten wurde. Das Propionat ist für den Nachweis von Propionatesterasen geeignet. Es führt zu der Bildung von 4-Hydroxy-3-methoxy-t»^:'-nitrostyrol durch Reaktion bzw. Wechselwirkung mit dem Enzym.

(3) 4-(ß-Nitroäthenyl)-3-methoxyphenylpalmltat

4-Hydroxy-3-methoxy-o-nitrostyrol (5,2 g, 25 mMol) wurde in Pyridin (20 ml) aufgelöst und das Gemisch wurde mit Palmitoylchlorid (8 g, 29 mMol) versetzt. Es bildete sich sofort ein gelber Niederschlag, worauf das Reaktionsgemisch ca. 5 min lang am Rückfluß erhitzt wurde. Dann wurde das Reaktionsgemisch in Eiswasser gegossen und der resultierende gelbe Feststoff wurde abfiltriert. Das Produkt wurde mit verdünnter (10~ molarer) Natriumhydroxidlösung verrührt, um freies Phenol zu entfernen. Es wurde filtriert, und der Rückstand wurde gut mit Wasser und Äthanol gewaschen und sodann aus Chloroform/Äthanol umkristallisiert. Fp 96 bis 99°C (9,1 g, 84%). Das Produkt ist zum Nachweis und zur Bestimmung von Palmitatesterasen geeignet und es setzt durch Wechselwirkung mit dem Enzym 4-Hydroxy-3-methoxynitrostyrol frei.

(4) 4-(ß-Nitroäthenvl)-phenylpalmitat Palmitoylchlorid (3_t6 g) wurde zu trockenem Pyridin (20 ml)

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■Λ<°- . 2857Η5

gegeben. Es erfolgte eine sofortige Ausfällung. Zu diesem Gemisch wurde 4-Hydroxy-t^-nitrostyrol (1,65 g, 10 mMol) gegeben und das Gemisch wurde 1 bis 2 min lang am Rückfluß erhitzt. Hierauf wurde das Gemisch in Eiswasser gegossen und der gelbe amorphe Niederschlag wurde abfiltriert. Eine Lösung des Niederschlags in einem Gemisch aus Chloroform und DMSO lieferte Impfkristalle des Esters. Die Hauptmenge wurde in der Weise kristallisiert, daß das Produkt in siedendem Methylenchlorid aufgelöst wurde und daß Äthanol zugesetzt wurde. Nachdem das gesamte Methylenchlorid abgedampft worden war, wurde die äthanolische Lösung beimpft und sie lieferte das Palmitat in Form von hellrehbraunen Kristallen, Fp 83 bis 84° C (2 g, 50%).

Dieses Produkt ist in ähnlicher Weise zum Nachweis und zur Bestimmung von Palmitatesterasen geeignet, wobei durch Reaktion mit dem Enzym 4-Hydroxy-^-nitrostyrol freigesetzt wird.

(5) 4-(ß-Nitroäthenyl)-3-methoxypheny!phosphat (als Mononatriumsalz-monohydrat)

Zu einer heftig gerührten eisgekühlten Lösung von Phosphorylchlorid (6,2 g, 40 mMol) in Pyridin (40 ml) wurde tropfenweise im Verlauf von 45 min eine Lösung von 4-Hydroxy-3-methoxy-^nitrostyrol (7,8 g, 40 mMol) in Pyridin (20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde sodann durch tropfenweise Zugabe von wäßrigem Pyridin (50 ml, enthaltend 10% Wasser) zersetzt. Während dieser Zeit schied sich etwas Feststoff ab. Die tropfenweise Zugabe von 2M-Natriumhydroxidlösung (20 ml, 40 mMol) führte am Anfang zu einer klaren Lösung, woran sich die Abscheidung eines amorphen Mononatriumsalzes als Hydrat (7,1 g, 59%), Fp >250°C, anschloß.

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Das Salz hatte eine niedrige Wasserlöslichkeit und es ist zum Nachweis und zur Bestimmung von Phosphatasen geeignet.

(6) 4-(ß-Nitroäthenyl)-3-methoxyphenylphosphat (als Di-Qatriumsalz)

Die obige Reaktion (5) wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß das zersetzte Reaktionsgemisch in eine konzentrierte Lösung von Natriumhydroxid (6 g) in Wasser gegossen wurde. Das Produkt schied sich am Anfang als Öl ab, das sich zu einem amorphen Feststoff (11 g, 86%), Fp >250°C, verfestigte. Es war in Wasser stärker löslich als das Mononatriumsalz und es löste sich leicht in siedendem Wasser unter geringer Zersetzung auf. Beim Abkühlen wurde es wieder ausgefällt, wodurch ein hellgelber Feststoff erhalten wurde. Eine 2m-molare Lösung des Dinatriumsalzes konnte leicht hergestellt werden.

Beispiel 3

Es wurde ebenfalls ein Bereich von Hydroxy-^nitrostyrolen hergestellt, um die Farbeigenschaften dieser Verbindungen zu bestimmen und zu vergleichen. Es handelt sich um Beispiele für Verbindungen, die unter die allgemeine Formel X-A-Y-NO₂ fallen, d.h. für Verbindungen, die als Ergebnis der Umsetzung des erfindungsgemäßen Reagenzes mit dem entsprechenden Enzym gebildet werden können.

Es wurde folgende allgemeine präparat!ve Methode angewendet: Der entsprechende Hydroxybenzaldehyd (40 mMol) wurde in Äthanol (200 ml) aufgelöst und die Lösung wurde mit Ammoniumacetat (12 g), Nitromethan (32 ml) und Essigsäure

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versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde entweder über Nacht bei Raumtemperatur gerührt oder 15 bis 60 min am Rückfluß erhitzt. In einigen Fällen kristallisierte das ω-Nitrqstyrol aus dem abgekühlten Reaktionsgemisch oder es kristallisierte, als Wasser zu dem abgekühlten Reaktionsgemisch zugesetzt wurde. In Fällen, wo kein kristallines Produkt durch diese Methoden isoliert werden konnte, wurde das Produkt mit Äther extrahiert und der Extrakt wurde mit Wasser gut gewaschen, getrocknet (MgS(V) und zur Trockene eingedampft. Die Ausbeuten, die Schmelzpunkte und die Spektraleigenschaften der verschiedenen Hydroxy-W-nitrostyrolprodukte wurden durch herkömmliche Methoden bestimmt. Die entsprechenden Werte sind nachstehend angegeben, wobei die Spektraleigenschaften als Absorption (/Lmax) in Äthanol und TRIS-Puffer mit pH 8,8 und als Extinktionskoeffizient (ε) bei pH 8,8 angegeben sind.

(1) A-Hydroxy^-methoxy-i^nitrostyrol, Fp 164 bis 166°C (Äthanol), wurde in 75%iger Ausbeute erhalten. Das Produkt hatte einen Λ-max-Wert (Äthanol) von 380 und einen Λ max-Wert (TRIS 8,8) von 506 mit einem ε-Wert von 20900.

(2) 4-Hydroxy-^-nitrostyrol, Fp I85 bis 186⁰C (wäßriges Äthanol), wurde mit 52?6iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen Amax-Wert (Äthanol) von 358 und einen λ max-Wert (TRIS 8,8) von 460 mit einem ε-Wert von 24627.

(3) 4-Hydroxy-3,5-dimethoxy-i^-nitrostyrol, Fp 184 bis 186°C (Äthanol), wurde in 72%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λmax-Wert (Äthanol) von 385 und einen Amax-Wert (TRIS 8,8) von 530 mit einem ε-Wert von 22330.

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- ΟΛ- 2857Η5

(4) A-Hydroxy^-nitro-UKnitrostyrol, Fp 132 bis 133°C, wurde in 57%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen /\ max-Wert (Äthanol) von 320 und einen λ max-Wert (TRIS 8,8) von 405 mit einem ε-Wert von 7400.

(5) ^-Hydroxy^-methoxy^-nitro-Onitrostyrol, Fp 188 bis 189⁰C (wäßrige Essigsäure), wurde in 42%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen λmax-Wert (Äthanol) von 400 und einen λmax-Wert (TRIS 8,8) von 436 mit einem ε-Wert von 14000.

(6) 4-Hydroxy-3-methoxy-5-nitro-"-nitrostyrol, Fp 170 bis 171°C (wäßrige Essigsäure), wurde in 67%iger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen ^max-Wert (Äthanol) von 334 und einen Amax-Wert (TRIS 8,8) von 415 mit einem ε-Wert von 5200.

(7) 2-Hydroxy-3-methoxy-^-nitrostyrol, Fp I38 bis 139°C (wäßriger Äthanol), wurde in 38?iiger Ausbeute erhalten. Die Substanz hatte einen Λmax-Wert (Äthanol) von 322 und einen Λmax-Wert (TRIS 8,8) von 492 mit einem Extinktionskoeffizienten ε von 7380.

2-Methoxy-4-(a-methyl-ß-nitroäthenyl)-phenol wurde auch durch eine Abwandlung der obigen Verfahrensweise hergestellt, bei der Vanillin mit Nitroäthan anstelle von Nitromethan behandelt wurde. Die bei dieser Reaktion angewendeten Bedingungen waren jedoch im wesentlichen die gleichen, wie sie oben für die Nitromethylierung beschrieben wurden. Das α-Methyl-ß-nitroäthenylphenylprodukt wurde in 80%iger Ausbeute mit Fp 110 bis 112°C erhalten. Die Substanz hatte einen /Nmax-Wert (Äthanol) von 368 und einen Λ max-Wert (TRIS 8,8) von 475 mit einem ε-Wert von 13100.

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Die auf die obige Weise hergestellten Hydroxy-U-nitrostyrole sind typischerweise gefärbte Verbindungen, die das leicht wahrnehmbare visuelle Signal der erfindungsgemäßen Reagentien liefern können. Besonders bevorzugte Verbindungen sind die 3-Mei;hoxy- und 3,5-Dimethoxyverbindungen 1 und 3» die unterscheidbare tief rote Färbungen bei alkalischen Bedingungen liefern. Im allgemeinen haben die U)-Nitrostyrölverbindungen ausgeprägt verbesserte Farbeigenschaften gegenüber der hellorange-gelben Färbung von p-Nitrophenol (\ max Äthanol 320, λ max TRIS 8,8 400 mit ε = 15000). Dies ist vermutlich auf die Bildung von Radikalionen mit den Nitrostyrylverbindungen zurückzuführen. Die Existenz von solchen Radikalionen wird durch die ESR-Spektren der Nitrostyrylverbindungen gestützt. So gab z.B. die 3,5-Dimethoxyverbindung (3) in Lösung in DMSO, zu der ein Tropfen einer M-Natriummethoxidlösung zugesetzt worden war, ein starkes ESR-Spektrum, das 7 Signale für die sechs Methoxyprotonen im Verhältnis von 1:6:15:20:15:6:1 mit einem kalkulierten Splitting von 0,680 Gauss und 3 Signale für die zwei aromatischen Protonen im Verhältnis 1:2:1 mit einem kalkulierten Splitting von 1,74 Gauss enthielt. Für die Äthylprotonen wurden keine Signale beobachtet.

Beispiel 4 Assay für N-Acetylglucosaminidase (NAG) in Urin

100 mg mikrokristalline Cellulose, enthaltend etwa 3% 4-(2-Acetamido-2-deoxy-ß-D-glucopyranosyloxy)-3-methoxy-^ti5-nitrostyrol, des Substrats für NAG, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden in einem kleinen Kunststoffproberöhrchen mit frischem Urin (1 ml) von Körpertemperatur oder von gelagertem Urin, der auf 35 bis 38⁰C vorerwärmt worden

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war, behandelt. Der Röhrcheninhalt wurde 15 bis 30 min lang bei 30 bis 35°C, z.B. 20 min bei 37°C, inkubiert und sodann durch eine kurze Säule (etwa 3 χ 0,6 cm) von faseriger DEAE-Cellulose (Whatman DE22), die in einer Pasteur-Pipette war, welche am Boden mit Baumwollwolle verschlossen war, hindurchperkulieren gelassen. Das Vorhandensein von NAG in der Urinprobe zeigte sich durch Entwicklung eines karminroten Bandes etwa 0,5 cm unterhalb der Spitze der DEAE-Cellulosesäule an. Manchmal bildete sich ein breites hellbraunes Band oberhalb des karminroten Bandes, das auf Urochrom zurückzuführen war, welches in dem Urin enthalten war. Bei einigen wenigen Patienten, die Nierentransplantate hatten, wurde ein sich schnell bewegendes braun-malvenfarbiges Band beobachtet, das vermutlich auf die Medikation des Patienten zurückzuführen war. Weiterhin bildete sich bei Diabetikern oder bei Kindern, die niedrige Elektrolytkonzentrationen im Urin haben, das rote Band an der oberen Oberflächengrenzfläche der DEAE-Cellulose und es war in seiner Natur stärker dispergiert. Der letztgenannte Effekt kann durch Einarbeitung von entsprechenden Mengen von Elektrolyten in das Reagenz überwunden werden. In allen Fällen ist jedoch die Breite und die Intensität des roten Bandes ungefähr proportional zu der Konzentration von NAG in dem Urin.

Unter Verwendung von 3% Glycosid auf Cellulose ergab normaler Urin (etwa 40 bis 75 η Mol/ml NAG) ein enges schwach kompaktes rotes Band, jedoch lieferten abnormale Urine C>2Ö0 η Mol/ml. NAG) intensiv breitere Bänder, die sich mit steigenden NAG-Konzentrationen intensivierten. Bei den gleichen Testbedingungen ergaben Wasser und Urin, der zur Zerstörung von NAG gekocht worden war, negative Ergebnisse.

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Bei einer Abwandlung des Grundassays wurden Q% Glycosid auf Cellulose anstelle des 3%-Glycosid-Materials verwendet. Die Untersuchung ergab, daß das Material eine NAG-Erfassungsschwelle von etwa 20 bis 30 η Mol/ml hatte. Bei der abgewandelten Verfahrensweise lieferte normaler Urin intensivere Bänder, als auf die obige Weise beobachtet wurden. Dies zeigt den Weg an, auf dem es möglich ist, eine Erfassungsschwelle durch Variierung der Menge des verwendeten Glycosidsubstrats auszuwählen, wobei gleichzeitig auch die Temperatur und die Inkubationszeit beachtet werden.

Nachstehend wird die erfindungsgemäße Durchflußeinrichtung anhand der Figuren 1 und 2 näher erläutert.

Die ttf-Nitrostyrylglycoside, hergestellt gemäß Beispiel 1, können in die erfindungsgemäßen Durchflußvorrichtung eingearbeitet werden. Beide Vorrichtungen enthalten ein zylindrisches oberes Inkubationsabteil 1 und ein unteres Sichtbarmachungsabteil 2. In beiden Fällen enthält das untere Sichtbarmachungsabteil 2 eine Menge von faseriger DEAE-Cellulose (Whatman DE 22) 3» die zwischen eine obere Schicht 4 und eine untere Schicht 5 aus Baumwolle oder einer ähnlichen Substanz zwischengelegt ist. Die unteren Enden des Sichtbarmachungsabteils 2 haben einen Auslaß 6 zum Ablaufenlassen der Flüssigkeit. Die Vorrichtung hat einen Rand oder Füße 7» damit die Vorrichtung in vertikaler Orientierung freistehen kann. Die Wände des unteren Sichtbarmachungsabteils 2 sind aus einem klaren Material, z.B. klarem Kunststoff, um eine Beobachtung der DEAE-Cellulose und eines darauf absorbierten gefärbten Bandes zu gestatten.

Das obere Inkubationsabteil 1 enthält eine geeignete Menge der Glycosidsubstanz (nicht gezeigt) entweder in einem ge-

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eigneten Lösungsmittel oder in Cellulose oder einem anderen geeigneten Absorptionsmittel, z.B. 100 mg mikrokristalliner Cellulose (Avicell), enthaltend 3% Glycosid, absorbiert. Das Inkubationsabteil 1 1st mit Schraubenkappen ausgestattet und es hat dicke PVC- oder Polystyrolwände 9, um den Urin während der Inkubation zu isolieren. Die Wände; 9 sind mit einer Linie 10 markiert, um die Urinmenge anzuzeigen, die zur Inkubation eingeführt werden soll.

In den Figuren 1 und 2 sind die oberen und unteren Abteile 1 und 2 ohne einen dazwischenliegenden Verbindungsdurchtritt dargestellt.

i ·

Bei der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform sind die Abteile 1 und 2 an ihren Grenzoberflächen durch einen Stiftzapfen 11 zusammengehalten. Die Basis des Inkubationsabteils 1 hat einen exzentrisch angeordneten Auslaß 12. Die Spitze des Sichtbarmachungsabteils hat einen Einlaß 13» der exzentrisch am gleichen Radius von dem Zapfen 11 wie der Auslaß 12 angeordnet ist. Die gegenseitige Drehung des oberen Abteils 1 und des unteren Abteils 2 bringt den Auslaß 12 und den Einlaß 13 miteinander in Übereinstimmung, wodurch ein Durchtritt geschaffen wird, der die Abteile verbindet und durch den der inkubierte Urin strömen kann. Beim Gebrauch wird frischer Urin in das Abteil 1 bis zu dem Niveau der Marke 10 eingeführt, wobei der Auslaß 12 und der Einlaß 13 nicht miteinander in Übereinstimmung stehen. Die Schraubenkappe 8 wird eingeschraubt und der Urin wird über einen Zeitraum inkubiert, der von der Temperatur abhängt, gewöhnlich aber etwa 15 bis 20 min beträgt. Die Abteile werden sodann gegenseitig gedreht, bis der Auslaß 12 und der Einlaß 13 miteinander in Übereinstimmung stehen, und der inkubierte Urin läuft von dem Inkubationsab-

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teil 1 in das Sichtbarmachungsabteil 2. 2-Methoxy-4-(2-nltro· (E)-äthenyl)-phenol, das durch das Glycosidsubstrat als Ergebnis des in dem Urin vorhandenen NAG freigesetzt wird, führt zu der Bildung eines glänzend scharlachroten Bandes etwa 0,5 cm unterhalb der Spitze der DEAE-Cellulosesäule

Bei der in Figur 2 dargestellten Vorrichtung sind die Abteile 1 und 2 miteinander durch einSchraubengewinde 16 um den Boden des Abteils 1 herum und ein Schraubengewinde 17 um die Innenseite eines rohrförmigen Verlängerungsstücks 18, das von der Oberseite des Abteils 2 vorspringt, verschraubt. Ein Durchtritt zwischen den Abteilen 1 und 2 ist durch ein rohrförmiges Verlängerungsstück 14 vorgesehen, welches vom Boden des Abteils 1 vorspringt. Vor dem Gebrauch wird der Durchtritt 14 durch Angrenzung an den abgeschwächten Abschnitt 15 in der Spitze des Abteils 2 geschlossen. Beim Gebrauch wird Urin in das Abteil 1 eingeführt und wie in der Vorrichtung der Figur 1 inkubiert. Nach beendigter Inkubation werden Jedoch die Abteile 1 und 2 miteinander verschraubt und das rohrförmige Verlängerungsstück 14 bricht durch den abgeschwächten Abschnitt 15, wodurch inkubierter Urin in das Abteil 2 hineinfließen kann. Die Sichtbarmachung des durch das Substrat freigesetzten Phenols erfolgt wie bei der Vorrichtung gemäß Figur 1.

Beide Vorrichtungen stellen einfache Einrichtungen dar, durch die Nierentransplantationspatienten sich selbst zu Hause testen können. Weiterhin können allgemeine Screeningtests leicht durchgeführt werden, ohne daß Zugang zu komplizierten Überwachungsvorrichtungen bestehen muß. Auch andere Enzyme als NAG können unter Anwendung von ähnlichen Techniken und Vorrichtungen analysiert werden.

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Claims

KRAUS & WEISERT PATENTANWÄLTE Z O O / 14b DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/79 7077-79 7078 · TELEX O5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2375 WK/rm NATIONAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION London / England Reagenz für einen Enzymassay Patentansprüche

1. Reagenz für einen Enzymassay, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Substanz enthält, die dazu imstande ist, mit dem Enzym unter Bildung einer Verbindung der Formel X-A-Y-NOp eine Wechselwirkung bzw. Umsetzung einzugehen, wobei A für einen aromatischen Kern steht, X eine auxochrome Gruppe bedeutet und Y für eine ungesättigte Gruppe, die dazu imstande ist, eine Elektronenresonanz zwischen dem aromatischen Kern und dem Ni tro subs ti tuenten zu übertragen, steht und wobei die genannte Verbindung per se dazu imstande ist, ein visuelles Signal zu erzeugen, das leicht durch das Auge wahrnehmbar ist.

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2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Substanz der Formel S-X-A-Y-NO₂ enthält, wobei S für den Eazymsubstratteil des Reagenzes steht.

3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennzeichnet, daß es einen geeigneten Carboxylat-, Phosphat-, Diphosphat- oder Sulfatester zum Assay bzw. für die Erfassung der entsprechenden Carboxylatesterasen und rOLipasen» sauren und alkalischen Phosphatasen, Phosphodiesterasen oder Sulfatasen enthält.

4. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Glycosid zum Assay bzw. für die Erfassung der entsprechenden Glycosidase enthält.

5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es ein α- oder ß-Glucopyranosyl-, -Galactopyranosyl- oder -Mannopyranosylglycosid zum Assay bzw. für die Erfassung der entsprechenden Glycosidase enthält.

6. Reagenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zum Assay bzw. zur Erfassung der N-Acetyl-ß-D-glucosaminidase das entsprechende Glucopyranosylglycosid enthält.

7. Reagenz nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe A für einen Benzolkern steht.

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8. Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Substrat für das Enzym enthält, welches durch Wechselwirkung bzw. Umsetzung mit dem Enzym zu der Bildung einer Verbindung der Formel:

NO.

in der X die vorstehende Definition hat, η den Wert 1, 2

^l1 °², R⁵ und R⁴ = H, OMe, NO₂, CH,,

oder 3 hat, und R ,

CH = CR¹R" oder CO₂H, führt

9. Reagenz nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die auxochrome Gruppe X der Substanz eine Amino- oder Hydroxylgruppe enthält oder daraus besteht.

10. Reagenz nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung bei der Wechselwirkung bzw. Reaktion mit dem Enzym die Verbindung 4-Hydroxy-3-methoxy-w-nitrostyrol oder 4-Hydroxy-3,5-dimethoxy-C<>-nitrostyrol freisetzt.

11. Verfahren zur Herstellung eines Enzymsubstrats zur Verwendung in einem Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Enzymsubstrat aus Vanillin oder einem ähnlichen Ausgangsmaterial auf Hydroxybenzaldehydbasis durch Nitrome-

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thylierung, vorzugsweise unter mild-alkalischen Bedingungen, des entsprechenden Enzymsubstrat/Vanillin-Addukts oder des Addukts aus einem Enzymsubstrat und einer ähnlichen Verbindung herstellt.

12. Enzymassay, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man eine Probe, die das Enzym enthält, mit einem Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 inkubiert, um die Bildung einer Verbindung der Formel X-A-Y-NOg zu bewirken, und daß man erforderlichenfalls die Verbindung einer weiteren Behandlung unterwirft, um ein visuelles Signal zu entwickeln, das durch das Auge leicht wahrnehmbar ist.

13. Enzymassay nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probe und ein Reagenz miteinander bei einer Temperatur von mindestens etwa 30⁰C über einen Zeitraum von bis zu etwa 30 min inkubiert.

14. Enzymassay nach Anspruch 12 oder 13» dadurch gekennzeichnet , daß man das Reagenz zusammen mit einem geeigneten Material in fester Phase verwendet.

15. Enzymassay nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Behandlung zur Entwicklung eines visuellen Signals eine Alkalibehandlung ist.

16. Enzymassay nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die freigesetzte Verbindung der Formel X-A-Y-NO₂ mit einem Reagenz in der festen Phase in Kontakt bringt, das gleichzeitig für die Verbindung eine alkalische Umgebung mit sich bringt.

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17. Produkt zur Verwendung bei dem Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zusammen mit einem geeigneten Material in fester Hiase enthält.

18. Produkt nach Anspruch 17, dadurch g.e k e n.n ~ zeichne t , daß das Material in fester Phase ein poröses festes Trägermaterial ist.

19. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 12 in Form einer Durchflußvorrichtung, gekennzeichnet durch zwei miteinander verbindbare Abteile, ein Inkubierungsabteil, das das mit dem Material in der festen Phase vergesellschaftete Reagenz enthält, und ein Sichtbarmachungsabteil, das ein Reagenz in der festen Phase enthält, welches für die Verbindung der Formel X-A-Y-NO₂ eine alkalische Umgebung mit sich bringt.

030603/0020