DE2510633B2 - Diagnostisches mittel zum nachweis von eiweiss in koerperfluessigkeiten und dafuer geeignete indikatorfarbstoffe - Google Patents

Description

Der Nachweis von Eiweiß in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Urin, nimmt eine hervorragende Stelle in der Diagnostik von Nierenerkrankungen ein. Schnelldiagnostica zum Nachweis und zur Bestimmung von Eiweißstoffen im Urin sind daher schon vor längerer Zeit entwickelt worden. Es handelt sich dabei zumeist um Testpapiere, die mit einer Puffersubstanz und einem sog. Eiweißfehler-Indikator getränkt sind. Eiweißfehler-Indikatoren sind pH-Indikatoren, deren pK-Wert bei Anwesenheit von Eiweiß verschoben wird. Je nachdem, in welcher Richtung der pK-Wert durch Eiweiß verschoben wird, muß der Puffer einen pH-Wert einstellen, der oberhalb oder unterhalb des pK-Wertes, vorzugsweise gerade außerhalb des Farbumschlagsbereichs des Indikators liegt. Bevorzugt sind diejenigen Indikatoren, die beim Eintauchen in eiweißfreiem Urin in der weniger gefärbten Form vorliegen, so daß die Anwesenheit von Eiweiß zu einem mehr oder weniger vollständigen Übergang des Indikators in die stärker gefärbte Form und damit zu einem empfindlichen Farbumschlag führt. Die bekanntesten dieser Eiweißfehler-Indikatoren sind Tetrabromphenolphthaleinäthylester und Tetrabromphenolblau (Octabromphenolsulfophthalein). In der Literatur sind eine ganze Reihe solcher Eiweiß-Testpapiere beschrieben, die sich meist nur in der Verwendung von Zusatzstoffen, wie anionischen Netzmitteln, Farbstoffen und anorganischen Sulfaten unterscheiden und im allgemeinen einem empfindlichen Eiweiß-Nachweis gestatten.

Alle bekannten Testpapiere haben jedoch den schwerwiegenden Nachteil, daß sie mit den Metabolitcn ^von häufig im Urin vorkommenden Arzneimitteln wie z. B. Chinin, Chinidin, Resochin und anderen stickstoffhaltigen Verbindungen in gleicher Weise reagieren wie mit Eiweiß.

Es war deshalb die Aufgabe dieser Erfindung, Testpapiere herzustellen, bei denen die Störung durch diese stickstoffhaltigen Verbindungen nicht vorhanden oder vernachiässigbar klein ist, ohne daß die Nachweisempfindlichkeit für Eiweiß im Vergleich zu bekannten Testpapieren verringert ist.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Eiweiß in Körperflüssigkeiten bestehend au: einem saugfähigen Träger, der mit einem pH-Indikator mit Eiweißfehler und einer geeigneten Puffersubstanz imprägniert ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator aus der Gruppe der Octahalogensulfophthaleine ausgewählt ist und mindestens ein mit Wasser nicht mischbares, lineares oder verzweigtes Polypropylenglykol, das auch noch andere niedere Oxyalkylengruppen enthalten kann, enthalten ist.

Als saugfähige Träger kommen insbesondere Filterpapier, jedoch auch Faserfliese, Asbest oder ähnliches in Frage.

Polypropylenglykole der beanspruchten Art sind vor allem die linearen Polypropylenglykole, ferner Blockpolymerisate aus Propylenoxyd und Äthylenoxyd sowie verzweigte Verbindungen, bei denen Propylenoxyd an mehrwertige Alkohole, wie z. B. Trimethylolpropan, Glycerin oder Pentaerythrit anpolymerisiert ist und die gegebenenfalls noch mit Äthylenoxyd modifiziert sind. Diese Polypropylenglykole müssen ein Molekulargewicht von ca. 500—10 000 besitzen.

Polypropylenglykole dieser Art sind an sich bekannt und werden auf die verschiedenartigste Weise in der Technik genutzt, z. B. als Schmiermittel, hydraulische Flüssigkeiten, Lösungsmittel, Rohstoffe für Polyurethane und Netzmittel.

Ihre erfindun£sgemäße Wirkung war nicht voraussehbar und ist auch höchst überraschend, denn die wasserlöslichen Vertreter dieser Gruppe, wie z. B. Polypropylenglykol vom Molgewicht ca. 400 oder reine Polyäthylenglykole wirken nicht im gewünschten Sinne.

Bemerkenswerterweise lassen sich Testpapiere mit den gewünschten Eigenschaften mit Hilfe der erfindungsgemäßen Polypropylenglykole nur mit Eiweißfehler-Indikatoren aus der Klasse der Octahalogensulfophthaleine durchführen. Mit anderen sonst brauchbaren Eiweißfehler-Indikatoren, z. B. mit Tetrabromphenolphthaleinäthylester, werden Testpapiere erhalten, die zwar nicht mit Stickstoffbasen reagieren, bei denen aber die Reaktion mit Eiweiß ebenfalls stark abgeschwächt ist. Als Indikator kommen die folgenden in Frage:

Octabromphenolsulfophthalein (Tetrabromphenolblau), Octachlorphenolsulfophthalein (Tetrachlorphenolblau) sowie die gemischt halogenierten Vertreter, z.B.

3',3",5',5"-Tetrabromphenol-3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein,

3',3",5',5"-Tetrachlorphenol-3,4,5,6-tetrabromsulfophthalein und
3',3"-Dichlor-5',5"-dibromphenol-3,4,5,6-tetrachIorsulfoph thalein.

Während die ersten drei Verbindungen literaturbekannt sind, sind die übrigen Indikatoren neu; sie können jedoch nach bekannten Methoden z. B. durch Umsetzen der bekannten Tetrahalogenbenzolsulfocarbonanhydride mit Phenol oder 2-Halogenphenolen in Gegenwart von Lewis-Säuren, beispielsweise Zinn-iV-chlorid, und Chlorierung oder Bromierung der entstandenen Phenolsull'ophthaleine in inerten Lösungsmitteln, beispielsweise mit Chlor bzw. Brom in Eisessig, hergestellt werden.

Besonders bevorzugt sind die Indikatoren, die in 3',3",5',5"-Stellung vier Chloratome tragen, weil bei ihnen die Störung durch Stickstoffbasen noch schwächer ist, als bei den entsprechenden bromierten Vertretern. ■-,

Eiweißtestpapiere benötigen einen starken Puuer, der den pH auch beim Eintauchen in die Körperflüssigkeit, die möglicherweise einen anderen pH-Wert hat, konstant hält, so daß ein Umschlag des Indikators eindeutig auf einer pK-Wert-Verschiebung durch :o Eiweiß und nicht auf einer pH-Wert-Änderung beruht. Gemeinhin wird bei Sulfophthalein-Indikatoren der Puffer auf einen pH-Wert eingestellt, der etwa unterhalb des pH-Umschlagsbereiches des Indikators liegt, damit der Indikator vollständig in der weniger farbigen sauren Form vorliegt. Bessere Empfindlichkeit gegenüber sehr kleinen Eiweißkonzentrationen erhält man aber, wenn man den pH-Wert des Puffers in den Umschlagsbereich des Indikators legt. Dies führt aber dazu, daß nach dem Eintauchen in Urin ein Teil des Indikators schon umgeschlagen ist und die Negativ-Färbung schwerer von einer geringen Eiweiß-Färbung zu unterscheiden ist.

Es ist nun eine weitere unerwartete Eigenschaft der erfindungsgemäßen Polypropylenglykole, daß sie diesen beginnenden Indikatorumschlag zurückdrängen, ohne daß die Empfindlichkeit gegenüber Eiweiß wesentlich beeinflußt wird.

Unter dem »Umschlagsbereich« eines Indikators versteht man im allgemeinen den pH-Bereich von je einer Einheit ober- und unterhalb des pK-Wertes in reinem Wasser. Für die erfindungsgemäßen Eiweiß-Testpapiere wählt man zweckmäßigerweise pH-Werte, die ca. 1,0 Einheiten unterhalb bis ca. 0,5 Einheiten oberhalb der pK-Werte der verwendeten Indikatoren y, liegen. Da diese in der Gegend von 3,5 bis 4,0 liegen, reicht das brauchbare pH-Gebiet von ca. pH 2,5 bis ca. pH 4,5. Bei niedrigeren Werten tritt im allgemeinen eine Schwächung der Eiweißreaktion auf, bei höheren eine Verstärkung der Reaktion mit den Stickstoffbasen und mit Normalurin. Der bevorzugte pH-Wert hängt außer vom Indikator von der Art der erfindungsgemäßen Polypropylenglykole und den sonstigen Reagenzien ab und ist durch einfache Reihenversuche leicht zu ermitteln, bei denen pH-Wert und Menge des Puffers so variiert wird, daß der Indikator nach Eintauchen in eiweißfreien Urin gerade noch die reine »saure« Farbe aufzeigt.

Als Puffer kommen alle die in Frage, die im genannten Gebiet eine gute Pufferkapazität besitzen, also z. B. Mischungen aus Zitronensäure, Apfelsäure, Weinsäure u. a. mit deren Alkali- bzw. Ammoniumsalzen.

Obwohl die erfindungsgemäßen Polypropylenglykole z. T. oberflächenaktive Eigenschaften besitzen, kann es doch zweckmäßig sein, wegen der besseren Verteilung noch herkömmliche Tenside zuzusetzen. In Frage kommen hier vor allem nichtionogene Netzmittel, insbesondere äthoxylierte Fettalkohole und Phenole mit 1 —4 Oxyäthylen-Gruppen. Anionische Netzmittel verstärken die Reaktion mit den Stickstoffbasen, während kationische Tenside eine starke falsch positive Indikatorreaktion bewirken, falls nicht mehr sehr sauren Puffern gearbeitet wird, die die Eiweißreaktion hemmen. Diese beiden Tensidklassen sind daher ungeeignet.

Man kann natürlich auch noch Quellstoffe oder Verdickungsmittel zufügen, die ein Ausbluten der Reaeenzien aus dem benetzten Testpapier verzögern können, wobei man gegebenenfalls prüfen muß, ob diese mit den Puffersubstanzen verträglich sind. Bewährt haben sich z. B. Hydroxyäthyl- und Hydroxypropylcellulose.

Weiterhin können den Reagienzien noch Komplexbildner, insbesondere Magnesiumsulfat zugesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Polypropylenglykole sowie die übrigen Bestandteile werden in folgenden Mengen, bezogen auf 100 ml Imprägnierlösung, eingesetzt:

erfindungsgemäße Polypropylenglykole 0,5 —5 g,
vorzugsweise 1 —2 g;
Puffer 10—30 g, vorzugsweise 15—20 g;
Indikator 0,02—0,2 g, vorzugsweise 0,05—0,1 g;
oberflächenaktives Hilfsmittel 0,0—1,0 g,
vorzugsweise 0,2—0,5 g.

Als Lösungsmittel für die Bestandteile kommen Mischungen aus Wasser und niederen Alkoholen in Frage, in denen alle Bestandteile löslich sind. Man kann aber auch zunächst den Puffer aus Wasser vorimprägnieren und danach die übrigen Bestandteile aus organischer Lösung nachimprägnieren.

Die fertigen Testpapiere können als solche verwendet werden oder in an sich bekannter Weise an Griffen angeklebt oder vorzugsweise zwischen Kunststoffen und feinmaschigen Netzwerken eingesiegelt werden. Die Erfindung soll in folgenden Beispielen näher erläutert werden, wobei die Effektivität gegenüber dem Einfluß von Stickstoffbasen dadurch illustriert wird, daß die Menge Chinin angegeben wird, deren Färbung einen Gehalt von 5 mg-% Albumin (obere Grenze der normalen Ausscheidung) vortäuscht. Je größer also diese Menge ist, desto weniger wird der Test durch Chinin gestört. Die Störung durch die anderen Stickstoffbasen, wie z. B. Chinidin, Resochin und Benzydamin, liegt in der gleichen Größenordnung wie die von Chinin.

Beispiel 1

Filterpapier (Schleicher & Schüll 2316) wird nacheinander mit den folgenden 2 Lösungen imprägniert und jeweils bei 60⁰C getrocknet:

Lösung 1

Citronensäure, Monohydrat 20 g

Ammoniak, 25%ige wäßrige Lösung ca. 10 ml

Wasser, dest, ad. 100 ml

Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 4,1 eingestellt.

Lösung 2

3',3",5',5"-Tetrachlorphenol-

3,4,5,6-tetrabrom-sulfophth.ilein

(pK = 3,9) 50 mg

Polypropylenglykol,

mittleres Molgew. 1200 2 g

Methanol, ad. 100 ml

Das Testpapier reagiert mit Normalurin gelb und mit albuminhaltigen Urinen mit grünen bis blaugrünen Färbungen wachsender Intensität.

Urine mit einem Chiningehalt von ca. 100 mg-% geben die gleiche Grünfärbung wie Urine mit 5 mg-% Albumin.

Ein Testpapier mit der gleichen Zusammensetzung,

Die Lösung
eingestellt.

wird auf einen pH-Wert von 3,1

Beispiel 3

Filterpapier (Schleicher & Schüll 2316) wird mit einer 15%igen wäßrigen Lösung von Natriumdihydrogencitrat (pH 3,5) vorimprägniert und bei 60⁰C getrocknet. Nachimprägniert wird es mit Lösungen der folgenden Zusammensetzung, wonach jeweils bei 60° C getrocknet wird:

a) 3',3",5',5",3,4,5,6-Octachlorphenolsulfophthalein

Lineares Polypropylenglykol
(mittl. Molgewicht 4000)

50 mg
5mg-°

Ig

aber ohne Polypropylenglykol, reagiert mit Normalurin grün. Die Grünfärbung von 5 mg-% Albumin ist von dieser Negativfärbung nicht sicher unterscheidbar. Deshalb wird mit der Reaktion von 25 mg-% Albumin verglichen: Schon ca. 25 mg-% Chinin täuschen diese Eiweißmenge vor.

Bei handelsüblichen Schnelltesten täuschen 2—5 mg-% Chinin bereits die Anwesenheit von 5 mg-% Albumin vor.

Beispiel 2

Filterpapier (Schleicher & Schüll 2316) wird nacheinander mit den folgenden zwei Lösungen getränkt und bei 60⁰C getrocknet.

Lösung .1

Citronensäure, Monohydrat 20 g

Ammoniak, 25%ige wäßrige Lösung ca. 6 ml

Wasser, dest., ad. 100 ml

Mittleres Molgewicht

Hydroxylzahl

Id

2(1

30

Lösung 2

3',3",5',5",3,4,5,6-Octabromphenol-

sulfophthalein

(Tetrabromphenolblau, pK = 3,6) 50 mg

Polypropylenglykol,

mittleres Molgew. 2000 1 g

Nonylphenol, verethert mit

1 — 2 Oxyäthylenresten 0,4 g

Methanol, ad. 100 ml

Man kann diese beiden Lösungen auch mit der halben Menge Lösungsmittel ansetzen und vor der Imprägna- js tion vereinigen.

Das Testpapier reagiert mit Normalurin gelb und mit albuminhaltigen drinen mit grünen Färbungen wachsender Intensität.

Urine mit einem Chiningehalt von ca. 50 mg-% geben die gleiche grünliche Färbung wie Urine mit 5 mg-% Albumin.

Ein Testpapier mit der gleichen Zusammensetzung, aber ohne Polypropylenglykol, reagiert mit Normalurin schwachgrünlich.

Ca. 10 mg % Chinin täuschen bei diesem Testpapier 5 mg-% Albumin vor.

Verwendet man anstelle von »Nonylphenol, veräthert mit 1—2 Oxyäthylenresten« 0,4 g Cocosalkohol, veräthert mit 2 Oxyäthylenresten oder 0,2 g Tributylphenol, veräthert mit 4 Oxyäthylenresten, so erhält man praktisch identische Testpapiere.

65 Verzweigtes Polypropylenglykol mit Äthylenoxyd modifiziert

Verzweigtes Polypropylenglykol mit Äthylenoxyd modifiziert

Teilverzweigtes Polypropylenglykol
Verzweigtes Polypropylenglykol mit Äthylenoxyd modifiziert

Verzweigtes Polypropylenglykol auf Basis Trimethylolpropan mit Äthylenoxyd modifiziert

Verzweigtes Polypropylenglykol auf Basis Trimethylolpropan

Verzweigtes Polypropylenglykol auf Basis Glycerin Verzweigtes Polypropylenglykol auf Basis Trimethylolpropan

Lineares Polypropylenglykol, zu 10% mit Äthylenoxyd modifiziert
Methanol ad. 100 ml

(3800	ca.	42)
(3100	ca.	49)
(3500	ca.	46)
(3000	ca.	56)

(6300 ca. 27)

(2600 ca. 64)

(3800 (4500

(3800)

ca. 29) ca. 37)

b) 3',3"-Dibrom-5',5"-dichlorphenol-3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein Verzweigtes Polypropylenglykol mit Äthylenoxyd modifiziert (mittl. Molgewicht 3800, Hydroxylzahl ca. 42) Methanol, ad.

50 mg

Ig 100 ml

Die Eigenschaften dieser Testpapiere entsprechen im wesentlichen denen von Beispiel

c) 3',3",5',5"-Tetrabromphenol-

3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein 50 mg

Verzweigtes Polypropylenglykol mit Äthylenoxyd modifiziert (mittl. Molgewicht 3800,

Hydroxylzahl ca. 42) 1 g

Methanol, ad. 100 ml

55 Die Eigenschaften dieser Testpapiere entsprechen im wesentlichen denen von Beispiel

Beispiel

Filterpapier (Schleicher & Schüll 23 i 6) wird mit den folgenden 2 Lösungen nacheinander imprägniert und bei 60° C getrocknet:

60 Lösung 1

Apfelsäure

N-Natronlauge,

Hydroxyäthylcellulose Wasser, dest., ad.

15g ca. 16 ml

2g 100 ml

oder eines der folgenden Polypropylenglykole Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt.

Lösung 2

Tctrabroniphenolblau
Poly propylcngly keil
(mittleres Molgewicht 2000)
Chloroform, ad.

0.6 g
100ml Kristall-Essigsäure
(Molgewicht: CHH

■iS ■ CH₄O₂ = 710,05).

Die Eigenschaften dieses Testpapiers entsprechen im wesentlichen denen von Beispiel 2.

Beispiel 5

3\3"-Dichlorphenol-3,4,5,b-tetrach]orsulfophthalcin

25,7 g (0,2 mol) O-Chlorphcnol werden mit 45 g (0,14 mol) Tetrachlor-o-sulfobenzoesäurcanhydrid gemischt, 9 ml = 20,4 g Zinn-IV-chlorid zugegeben und 12 Stunden unter Rühren auf dem ölbad auf 120—130°C erwärmt. Danach wird das überschüssige Chlorphenol mit Wasserdampf entfernt und der Rückstand durch mehrmaliges Lösen in 4 N-Natriumcarbonatlösung und Ausfällen mit Salzsäure gereinigt und schließlich aus Eisessig umkristallisiert. Man erhält 5,3 g = 47% rosagefärbtes S'X-Dichlorphenol-SAS.b-tetrachlorsulfophthalein, das 1 Mol Essigsäure enthält, Schmp. 244-245⁰C
(Molgewicht:CmHaCIoO₁S ■ C₂H₄O₂ = 62I,13).

In gleicher Weise erhält man bei Verwendung von o-Bromphenol 3',3"-Dibromphenol-3,4,5,6-tctrachlorsulfophthalein, das nach Umkristallisieren aus Eisessig ebenfalls mit 1 Mol Essigsäure kristallisiert, Schmp. 172-173° C.

Beispiel 6

3'.3"-Dibromphenol-3,4.5,6-tetrachlorsulfophthalein

4,9 g (0,01 mol) Phenol-SAS.ö-tetrachlorsulfophthalein werden in 50 ml Eisessig gelöst und bei 20°C unter Rühren einer Lösung von 1,1 ml = 3,37 g Brom (0,04 g Atom) in 50 ml Eisessig zugetropft. Es wird 3 Stunden nachgerührt, die gebildeten Kristalle abgesaugt und aus Eisessig umkristallisiert. Man erhält 3,9 g = 55%

3',3"-Dibromphenol-3,4₁5,6-tetΓachloΓsulfophthalein,
Schmp. 173-174°C. Die Verbindung enthält 1 Mol

Beispiel 7

3',3"-Dibrom-5',5"-dichlorphenol-3,4,5,b-tctrachlorsulfophthalein

3,55 g (0,005 mol) 3',3"-Dibromphcnol-3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein werden in 50 ml Eisessig suspendiert. Dazu gibt man langsam unter Rühren eine Lösung von 0,94 g (0,025 g Atom) Chlor in 50 ml Eisessig. Nach mehrstündigem Rühren erhält man 3,8 g = 90,5% farblose Kristalle von 3',3"-Dibrom-5',5"-dichlorphcnol-3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein, Schmp.

2b5-268°C. Die Verbindung kristallisiert mit 2 Mol Essigsäure
(Molgewicht: CmHbBr₂CIbO₅S · 2 C₂H₄O₂ = 839,01).

Die gleiche Substanz läßt sich auch durch Bromieren von3',3"-üichlorphenol-3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein (erhalten durch Chlorieren von Phenol-3,4,5,6-tetrachlorsulfophthalein, Ausbeute 60%) herstellen.

Beispiel 8

3',3",5',5"-Tetrachlorphenol-3,4,5,b-tetrabromsulfoph thalein

13,8 g (0,02 mol) Phenol-aAS.e-tetrabromsulfophthalein werden in 100 ml Eisessig suspendiert und unter Rühren eine Lösung von 3,6 g Chlor (~0,1 g Atom) in 30 ml Eisessig bei Zimmertemperatur zugetropft. Es wird mehrere Stunden nachgerührt und die gebildeter beigefarbenen Kristalle abgesaugt. Nach Umkristallisieren aus Essigsäure/Wasser 9: 1 erhält mar Hg = 58,3% 3',3",5',5"-Tetrachlorphenol-3,4,5,6-tetra bromsulfophthalein, farblose Kristalle, Schmp 203-204°C(Zers.).

Die Verbindung kristallisiert mit 2 Mol Essigsäun und 1 Mol H₂O (Molgewicht:
CmH₆Br₄Cl₄O₅S ■ 2CH₃COOH ■ H₂O = 945,9).

In analoger Weise wird aus Phenol-3,4,5,6-tetrachlor sulfophthalein durch Chlorierung in Eisessig 3',3",5',5"

Tetrachlorphenol-SAS.ö-tetrachlorsulfophthalein, Schmp. 277-278°C erhalten. Die Verbindung kristall! siert mit 1 Mol Essigsäure
(Molgewicht: C₁₉HbCl₈O₅S · C₂H₄O₂ = 690).

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Eiweiß in Körperflüssigkeiten bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit einem pH-Indikator mit Eiweißfehler und einer geeigneter. Puffersubstanz imprägniert ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator aus der Gruppe der Octahalogensulfophthaleine ausgewählt ist und mindestens ein mit Wasser nicht mischbares, lineares oder verzweigtes Polypropylenglykol, das auch noch andere niedere Oxyalkylengruppen enthalten kann, enthalten ist.

2. Diagnostisches Mittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich nichtionogene Netzmittel, Komplexbildner, Quellstoffe und/ oder Verdickungsmittel enthalten sind.

3. Verfahren zur Herstellung von diagnostischen Mitteln gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der saugfähige Träger zunächst mit der Puffersubstanz aus Wasser vorimprägniert und dann mit den übrigen Substanzen aus einem organischen Lösungsmittel nachimprägniert wird.

4.3',3",5',5"-Tetrachlorphenol-3,4,5,6-tetrabromsulfophthalein.

5.3',3"-Dibrom-5',5"-dichlorphenol-3,4,5,6-tetrachlorsulfoph thalein.