DE2537499A1

DE2537499A1 - Farbiger vergleichsstandard zur diagnostischen bestimmung von enzymatischen reaktionen und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2537499A1
Application number: DE19752537499
Authority: DE
Inventors: Paul K Adolf; James J Carroll
Original assignee: Warner Lambert Co LLC
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1974-10-04
Filing date: 1975-08-22
Publication date: 1976-04-15
Also published as: CH617268A5; CA1043677A; FR2287036B1; SE7511133L; JPS557239B2; IT1043092B; SE408232B; DK442775A; NO753268L; GB1468494A; FR2287036A1; JPS5162091A

Description

PATENTANWÄLTE

HENKEL, KERN, FEILER & HÄNZEL

BAYERISCHE HYPOTHEKEN- UND

telex: 05 29 802 HNKi. D EDUARD-SCHMID-STRASSE 2 2£££^£κ°ΜωΑ3»ί?

TELEFON: (0 89) 66 31 97, 66 30 91 - 92 D-8000 MÜNCHEN 90 POSTSCHECK: MÜNCHEN 1621 47 - TELEGRAMME: ELLIPSOID MÜNCHEN

Warner-Lambert Company
Morris Plains, N.J.,
V.St.A.

Dr. F/rm mcnchen. den 2 2. AUG. 1975

Farbiger Vergleichsstandard zur diagnostischen Bestimmung von enzymatischen Reaktionen und Verfahren zu seiner Herstellung

Verfahren zur quantitativen Bestimmung bestimmter Enzyme beruhen auf der Bildung von NADA (reduziertem Nikotinsäureamidadenindinucleotid) oder NADPH (reduziertem Nikotinsäureamidadenindinucleotidphosphat) als Ergebnis der enzymatischen Reaktion auf einem Substrat. Das NADH oder NADPH seinerseits reduziert das allgemein als INT bekannte farblose 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid in Gegenwart eines Elektronenträgers, wie Phenazinmethosulfat, zu dem leuchtend roten und spektralphotometrisch bestimmbaren, als INT-Formazan bekannten 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan. Die Enzymkonzentrationen werden durch gleichzeitiges Mitlaufenlassen der Testreaktion in einer bekannte Enzymkonzentrationen enthaltenden Vergleichsprobe und Vergleich der spektralphotometrischen Ablesung der unbekannten Probe gegen die spektralphotometrischen Ablesungen der Vergleichsprobe bestimmt.

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Beispiele für enzymatische Bestimmungen, die in der geschilderten allgemeinen Weise durchgeführt werden, sind von A.L. Babson und G.E. Phillips in "A Rapid Colorimetric Assay for Serum Lactic Dehydrogenase" in "Clin. Chirn. Acta», Band 12, Seiten 210 bis 215 (1965), von Van Der Veen und Mitarbeitern in "Isoenzymes of Creatine Phosphokinase in Tissue Extracts and in Normal and Pathological Sera» in »Clin. Chim. Acta", Band 13, Seiten 312 bis 316 (1966), und von M.M. Nachlas und Mitarbeitern in "The Determination of Lactic Dehydrogenase with a Tetrasodium Salt" in "Anal. Biochem.", Band 1, Seiten 317 bis 326 (1960), beschrieben.

Die Genauigkeit der nach den geschilderten Verfahren zur Bestimmung enzymatischer Aktivitäten ermittelten Ergebnisse hängt in großem Maße von der Zubereitung und Stabilität der die bekannte Enzymmenge enthaltenden Vergleichsprobe, mit deren Ergebnissen die zu testende Probe verglichen wird, ab. Weiterhin ist bei diesen enzymatischen Testverfahren eine Doppelarbeit erforderlich, da der Test als solcher in jedem Falle sowohl mit der Vergleichsprobe als auch mit der unbekannten Probe durchgeführt werden muß. Eine solche Doppelarbeit erfordert eine äußerst genaue Überwachung, damit sich keine Ungenauigkeiten einschleichen. Somit liegen also der Bedarf und die Vorteile eines stabilen, farbigen Vergleichsstandards zur Verwendung bei enzymatischen Bestimmungen ohne gleichzeitiges Mitlaufenlassen eines Kontrollversuchs auf der Hand. Unglücklicherweise gibt es ein derartiges Produkt bis heute noch nicht.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein farbiger Vergleichsstandard zur Verwendung bei diagnostischen Bestimmungen

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von enzymatischen Reaktionen, "bei denen i-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-PlIe^If ormazan gebildet wird, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß er aus einer wäßrigen Lösung mit, bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, G,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,01 bis 0,10 Gew.-% Serumalbumin, 2 bis 10 Gew.-% eines Lösungsmittels, wie N,N'-Dimethylformamid oder Dirnethylsulfoxid, und 2 bis 10 Gew.-% Isopropanol besteht.

Der wäßrigen farbigen Vergleichsstandardlösung können 5 bis 20 Gew.-% eines inerten Füllstoffs einverleibt werden. Nach ihrer Zubereitung kann die wäßrige farbige Vergleichsstandardlösung lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet und in dieser Form ohne weiteres mit Wasser wieder aufbereitet werden. Die wäßrige farbige VergleichsStandardlösung besitzt ein Absorptionsmaximum bei 500 nm und eignet sich zur Bestimmung bestimmter Enzymaktivitäten, z.B. von Serumlactatdehydrogenase, Kreatinphosphokinase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase und dergleichen.

Erfindungsgemäß hat es sich gezeigt, daß ein farbiger Vergleichsstandard zur Verwendung bei der Bestimmung bestimmter Enzymaktivitäten mit, in einer wäßrigen Lösung, bezogen auf ihr Gesamtgewicht, 0,001 bis 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,01 bis 0,10 Gew.-% Serumalbumin, 2 bis 10 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxid und 2 bis 10 Gew.-% Isopropanol ein Absorptionsmaximum bei 500 nm aufweist. Nach Zugabe von 5 bis 20 Gevr,-% eines inerten Füllmittels erhält man eine lyophilisierbare Lösung. In lyophilisierter Form ist der farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfin-

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dung bei Temperaturen von 4 und 24 C mindesten:-, 6 ITonate lang stabil. Die lyophi]isierte Form des erfindungsgemäßen Vergleichsstandards läßt sich mit V/asser ohne weiteres zu einer klaren Lösung wieder aufbereiten. Diese kann dann ohne Schwierigkeiten als Vergleichsstandard bei enzymatischen Bestimmungen verwendet werden.

Das allgemein als INT-Formazan bekannte und in dem farbigen Vergleichsstandard gemäß der Erfindung enthaltene 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan ist im Handel erhältlich und besitzt folgende Formel:

-N=N-C=N-NH-

ff

NO,

Dem INT-Formazan begegnet man häufig bei mikrobiologischen Identifizierungsmaßnahmen, insbesondere bei der Bestimmung von Nahrungsmittelproben oder pathologischen Proben, bei denen Bakterien, falls vorhanden, das farblose 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid (als INT bekannt) der Formel:

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zu dem leuchtend gefärbten INT-Formazan reduzieren. Weiterhin kommt es bei bestimmten enzymatisehen Reaktionen zu einer Reduktion von INT zu INT-Formazan. Der farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfindung gelangt dann bei der Bestimmung dieser Enzyme zum Einsatz.

Lösungsmittel, die die Löslichkeitseigenschaften des INT-Formazans verbessern und eine einfache Wiederaufbereitung des lyophilisierten Vergleichsstandards mit Wasser gestatten, sind N,N'-Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Weiterhin begünstigt auch der Zusatz des Isopropanols das Loslichkeitsverhalten des INT-Formazans. Es ist von wesentlicher Bedeutung, daß diese Lösungsmittel das Absorptionsmaximum des wäßrigen farbigen Vergleichsstandards nicht stören.

Der stabile, farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfindung enthält ferner Serumalbumin. Bevorzugt enthält er Rinderserumalbumin. Dieses Material trägt vermutlich zur Stabilisierung sowohl der lyophilisierten als auch der wäßrigen Form des Vergleichsstandards bei.

Geeignete inerte Füllstoffe zur Verwendung in dem Referenzstandard gemäß der Erfindung sind natürliche und synthetische Gummis, wie Gummi arabikum, Natriumalginat, Irisch-Moos-Extrakt, Carboxymethylzellulose, Polyvinylpyrrolidinon und dergleichen, Zucker, wie Sorbit, Mannit, Rohrzucker und dergleichen, sowie Kohlehydrate, wie Stärke, Dextran und dergleichen. Der bevorzugte Füllstoff ist ein Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 10000.

Ein bevorzugter farbiger Vergleichsstandard läßt sich erfindungsgemäß durch Zubereiten einer lyophilisierbaren

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wäßrigen Lösung mit, bezogen auf ihr Gesamtgewicht, 0,005 bis 0,015 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,02 bis 0,075 Gew.-% Rinderserumalbumin, 8 bis 14 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000, 2 bis 10 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und 2 bis 10 Gew.-% Isopropanol herstellen.

Ein besonders bevorzugter farbiger Vergleichsstandard gemäß der Erfindung enthält in wäßriger Lösung, bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, 0,0123 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan, 0,563 Gew.-% Rinderserumalbumin, 9 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000, 2,5 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und 7,5 Gew.-% Isopropanol. Die Absorption des wäßrigen farbigen Vergleichsstandards gemäß der Erfindung bei 500 nm beträgt etwa 1,34.

Es hat sich gezeigt, daß der farbige Vergleichsstandard gemäß der Erfindung in lyophilisierter Form bei Temperaturen von 4° und 24°C mindestens 6 Monate lang stabil ist. Der lyophilisierte Standard läßt sich nach Wiederaufbereitung mit Wasser oder 0,1n-Chlorwasserstoffsäure ohne weiteres so weit verdünnen, wie es zur Aufstellung von Eichkurven für kolorimetrische enzymatische Festpunktbestimmungen erforderlich ist. Wieder aufbereitete farbige Vergleichsstandardlösungen sind bei Raumtemperatur 8 h lang, bei einer Temperatur von 4°C mindestens 48 h lang stabil.

Bei der Zubereitung eines stabilen farbigen Vergleichsstandards gemäß der Erfindung müssen die genannten verschiedenen Bestandteile in bestimmter Weise miteinander

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vermischt werden, damit man ein zur Wiederaufbereitung nach der Gefriertrocknung "bzw. Lyophilisierung fähiges Produkt der erforderlichen Stabilität und Löslichkeit erhält. Diese Eigenschaften erreicht man, indem man zunächst das INT-Formazan vollständig in dem gewählten Lösungsmittel löst, dann unter gründlichem Vermischen Isopropanol zusetzt, das Serumalbumin in Wasser löst und die erhaltene Serumalbuminlösung unter Rühren langsam mit der INT-Formazanlösung versetzt. Vorzugsweise wird im Falle, daß der Vergleichsstandard lyophilisiert werden soll, der inerte Füllstoff zusammen mit dem SerumaTbumin in Wasser gelöst. Die fertige Lösung wird in aliquote Teile geteilt und nach einem üblichen Verfahren gefriergetrocknet oder lyophilisiert.

Zur Verwendung bei enzymatisehen Bestimmungen wird der lyophilisierte farbige Vergleichsstandard mit Wasser oder Ο,ΐη-Chlorwasserstoffsäure wieder aufbereitet. Die farbige Vergleichsstandardlösung dient als Standard bekannter Aktivität, gegen den die unbekannten Testproben zur Bestimmung der Enzymaktivität in der jeweiligen unbekannten Testprobe abgelesen v/erden. Wie bereits erwähnt, kann die farbige Vergleichsstandardlösung gemäß der Erfindung zur Aufstellung von Kurven für kolorimetrische enzymatische Festpunktbestimmungen verdünnt werden.

Ein farbiger Vergleichsstandard gemäß der Erfindung ist insbesondere in lyophilisierter Form hervorragend stabil und läßt sich nach seiner Wiederaufbereitung in höchst einfacher Weise bei den derzeit üblichen enzymatischen Bestimmungen zum Einsatz bringen.

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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Zubereitung der stabilen farbigen Vergleichsstandardlösung:

A. 12,3 mg INT-Formazan werden in 2,5 ml N,N'-Dimethylformamid gelöst, worauf die erhaltene Lösung unter gründlichem Vermischen mit 7,5 ml analysenreinen Isopropanols versetzt wird.

B. 9,0 g Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000 und 56,3mg Rinderserumalbumin werden in 90 ml reinen Wassers gelöst.

C. Die Lösung A wird langsam unter Rühren zu der Lösung B zugegeben. Die hierbei erhaltene Lösung wird in aliquoten Teilen von 4,0 ml in 10 ml fassende IfaLolen abgefüllt, gefroren und 36 h lang mit einem Stockpunkt von 30⁰C lyophilisiert. Dann werden die Phiolen unter trockenem Stickstoff zugeschmolzen. Der Inhalt jeder Phiole wird mit 10 ml 0,1n-Chlorwasserstoffsäure wieder aufbereitet. Die Absorption bei 500 nm beträgt 1,340 - 0,010 entsprechend 540 IE Lactatdehydrogenaseaktivität bei 37⁰C oder 420 IE Creatinphosphokinaseaktivität bei 30⁰C.

Beispiel 2.

Kolorimetrische Bestimmung der Serumlactatdehydrogenase:

Die für die Bestimmung erforderlichen Reagentien wurden wie folgt zubereitet:

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Farbreagens: 50 mg INT wurden in etwa 15 ml Wasser gelöst, wobei solange gerührt wurde, bis eine vollständige Lösung des INT sichergestellt war. Nach Zugabe und Auflösung von 125 mg Nikotinsäureamidadenindinucleotid wurden 12,5 mg Phenazinmethosulfat zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde zusammen mit der verwendeten Waschflüssigkeit sofort in einen niedrigaktinischen 25 ml fassenden Meßkolben überführt und mit Wasser bis zur Marke aufgefüllt.

Pufferreagens: 1,0 g eines handelsüblichen äthoxylierten Oleylalkohols wurde in 10 ml Wasser unter Erhitzen auf eine Temperatur von etwa 95°C gelöst. Nach Verdünnen der Lösung mit Wasser auf 50 ml wurden 12,1 g Tris zugesetzt. Hierauf wurde der pH-Wert mit 3n-HCl auf 8,2 eingestellt und das Ganze auf 100 ml verdünnt.

Substratreagens: (0,1m L(+)Lactat) 5,0 ml einer 20%igen Lösung von L(+)-Milchsäure wurden in etwa 50 ml Wasser eingetragen. Nach Einstellen des pH-Werts auf 5,5 mit 1n-NaOH wurde mit Wasser auf 120 ml verdünnt. Hierauf wurde die Lösung mit einigen wenigen Tropfen Chloroform gesättigt.

Vergleichsreagens: 0,2 g Kaliumoxalat und 0,2 g'Äthylendiamintetraessigsäure, Dinatriumdihydrat, wurden in 100 ml Wasser gelöst. Vgl. Babson und Mitarbeiter in "Clin. Chim. Acta», Band 12, Seiten 210 bis 215 (1965).

Verfahren:

In zwei Röhrchen wurden 0,1 ml Serum und 0,2 ml Pufferreagens pipettiert. In ein Röhrchen wurde 0,5 ml Substrat, in das andere Röhrchen 0,5 ml Vergleichsreagens eingetragen,

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Dann wurde der Inhalt der beiden Röhrchen durchgemischt und auf eine Temperatur von 37⁰C erwärmt. Nach genau bestimmten Zeitintervallen wurde in beide Röhrchen 0,2 ml Farbreagens eingetragen, worauf der Röhrcheninhalt gemischt und die Röhrchen sofort wieder in das Wasserbad zurückgestellt wurden. Genau 5 min nach Zugabe des Farbreagenses wurden in beide Röhrchen 5 ml 0,In-HCl zugegeben, worauf der Röhrcheninhalt gemischt wurde. Der Unterschied in der Absorption zwischen dem Vergleichsröhrchen und dem die Serumprobe enthaltenden Röhrchen, bestimmt bei 500 nm innerhalb von 20 min, betrug 0,67. Diese Absorption wurde mit dem farbigen Vergleichsstandard von Beispiel 1, dessen Absorption von 1,340 - 0,010 540 IE Lactatdehydrogenaseaktivitäteinheiten äquivalent war, verglichen. Daraus ergab sich, daß die Lactatdehydrogenaseaktivität in dem getesteten Serum bei 37°C 270 IE betrug.

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Claims

Patentansprüche

rl.) Farbiger Vergleichsstandard zur Verwendung bei diagnostischen Bestimmungen von enzymatischen Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer wäßrigen Lösung aus:

A. bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, etwa 0,001 bis etwa 0,020 Gew.-tf 1-(p-Jodphenyl)-5-(pnitrophenyl)-3-phenylformazan,

B. etwa 0,01 bis etwa 0,10 Gew.~% Serumalbumin,

C. etwa 2 bis etwa 10 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid und/oder Dimethylsulfoxid und

D. etwa 2 bis etwa 10 Gew.-% Isopropanol

besteht und ein Absorptionsmaximum bei 500 nm aufweist.
2. Vergleichsstandard nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich etwa 5 bis etwa 20 Gew.-% eines inerten Füllstoffs enthält und in füllstoffhaltiger Form lyophilisiert ist.
3. Vergleichsstandard nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer wäßrigen Lösung aus:

A. bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, etwa 0,005 bis etwa 0,015 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(pnitrophenyl)-3-phenylformazan,

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B. etwa 0,02 bis etwa 0,075 Gew.-% Serumalbumin,

C. etwa 2 bis etwa 10 Gew.-% N,N'-Dimethylformamid,

D. etwa 2 bis etwa 10 Gew.-% Isopropanol und zusätzlich

E. etwa 8 bis etwa 14 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000

besteht.
4. Farbiger Vergleichsstandard nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er lyophilisiert ist.
5. Farbiger Vergleichsstandard nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer wäßrigen Lösung aus:

A. bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, etwa 0,0123 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan,

B. etwa 0,0563 Gew.-% Rinderserumalbumin,

C. etwa 2,5 Gew.-% N,N¹-Dimethylformamid,

D. etwa 7,5 Gew.-% Isopropanol und

E. etwa 9 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000

besteht und eine Absorption bei 500 mn von etwa 1,34 aufweist.

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6. Farbiger Vergleichsstandard nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er lyophilisiert ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines farbigen Vergleichsstandards zur Verwendung bei diagnostischen Bestimmungen von enzymatisehen Reaktionen, bei denen 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan gebildet
wird, dadurch gekennzeichnet, daß man

A. bezogen auf das Gewicht der gesamten Lösung, etwa 0,001 bis etwa 0,020 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(pnitrophenyl)-3-phenylformazan in einer etwa 2 bis etwa 10 Gew.-# N,N'-Dimethylformamid und/oder Dirne thylsulf oxid enthaltenden wäßrigen Lösung vollständig löst,

B. die gemäß A erhaltene Lösung langsam unter gründlichem Vermischen mit etwa 2 bis etwa 10 Gew.-?o Isopropanol versetzt,

C. etwa 0,01 bis etwa 0,10 Gew.-% Serumalbumin in etwa 80 bis etwa 95 Gew.-% Wasser löst und

D. die unter B erhaltene Lösung langsam unter Rühren zu der unter C erhaltenen Lösung zugibt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe C in dem Wasser zusätzlich zu dem Serumalbumin etwa 5 bis etwa 20 Gew,-?6 eines inerten Füllstoffs löst, in Stufe D die in Stufe B erhaltene Lösung langsam unter Rühren zu der in Stufe C erhaltenen und den Füllstoff und das Serumalbumin enthaltenden Lösung zugibt und zusätzlich die in Stufe D erhaltene Lösung lyophilisiert.

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9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe A etwa 0,005 bis etwa 0,015 Gew.-?S 1-(p-Jodphenyl)-5-(p-nitrophenyl)-3-phenylformazan in einer etwa 2 bis etwa 10 Gew.-?o N,N«-Dimethylformamid enthaltenden wäßrigen Lösung löst und in Stufe C etwa 0,02 bis etwa 0,075 Gew.-% Serumalbumin und zusätzlich etwa 3 bis etwa 14 Gew.-% Dextran-Füllstoff eines Molekulargewichts von etwa 10000 verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich die fertige Lösung lyophilisiert.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe A etwa 0,0123 Gew.-% 1-(p-Jodphenyl)-5-(pnitrophenyl)-3-phenylformazan in einer 2,5 Gew.-$! N,N¹-Dimethylformamid enthaltenden wäßrigen Lösung löst, in Stufe B etwa 7,5 Gew.-% Isopropanol zusetzt und in Stufe C 9 Gew.-% Dextran eines Molekulargewichts von etwa 10000 und 0,0563 Gew.-% Rinderserumalbumin in 90 Gew.-% Wasser löst.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet^ daß man die fertige Lösung zusätzlich lyophilisiert.

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