DE2844879A1

DE2844879A1 - Verfahren zum nachweisen einer antigen/antikoerper-reaktion

Info

Publication number: DE2844879A1
Application number: DE19782844879
Authority: DE
Inventors: Ralph Walter De Blois; Egidijus Edward Uzgiris
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1977-10-17
Filing date: 1978-10-14
Publication date: 1979-04-19
Also published as: JPS5480411A; SE445076B; GB2009410B; NL7810199A; FR2439402A1; GB2009410A; FR2439402B1; SE7810773L; US4191739A

Description

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Verfahren zum Nachweisen einer Antigen/Antikörper-Reaktion

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen einer stattgefundenen Antigen/Antikörper-Reaktion und mehr im besonderen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen solcher Reaktionen durch Peststellen von Aggregationen proteinüberzogener Teilchen unter Verwendung einer Widerstandsimpulsmethode. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Ein solches Verfahren' zum Nachweisen einer stattgefundenen Antigen/Antikörper-Reaktion, auch Antigen/Antikörper-Assay genannt, das auf der Widerstandsimpulsmethode beruht, kann von deutlichem klinischen Interesse sein, wegen seines Potentials, kleine Mengen eines Antigens im Serum eines Patienten nachzuweisen. Mit dieser Widerstandsimpulsmethode kann eine Empfindlichkeit nahe der Radioimmun-Assay-Methode erreicht werden, die derzeit Standard für die bei der klinischen Anwendung erzielbar Empfindlichkeit ist.

Bei der konventionellen Praxis des Widerstandsimpuls-Verfahrens zum Nachweisen von Antigen/Antikörper-Reaktionen werden Latexteilchen mit Antikörper überzogen und es wird die Aggregation der Teilchen in Gegenwart von Antigen beobachtet, indem man die Zunahme der relativen Zahl der Teilchenmultiplette zählt. Geringe Zunahmen in der relativen Zahl von Dimeren, Trimeren usw. ergeben ein empfindliches Maß für die Antigen/Antikörper-Reaktion und die Widerstandsimpulsmethode ist in idealer Weise für die Messung der Teilchen- und Teilchenmultiplett-Größenverteilungen geeignet. Es kann dabei eine hohe Empfindlichkeit für geringe Mengen Antigen erreicht werden.

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Eine der Hauptbegrenzungen beim empfindlichen Nachweis geringer Antigenmengen ist die falsche Anzeige, die von Multipletts herrührt, die vor der Zugabe des Antigens in der Teilchensuspension vorhanden sind. Diese Multiplette entstammen den zur Herstellung der Antikörper-überzogenen Teilchen benutzten Verfahren, d. h. es treten bei der Bildung der Suspension der Antikörperüberzogenen Teilchen Agglomerationen dieser Teilchen auf.

Es wurde festgestellt, daß mit der Widerstandsimpulsmethode des Teilchennachweises sehr genaue Teilchengrößenverteilungen festgestellt werden können, während man Interferenzen in der Analyse durch die Messung der Multiplette in unumgesetzten Teilchen-Suspensionen vermeidet. Um diese genauen Messungen zu machen, werden zwei Teilchensuspensionen zubereitet und die Teilchen jeder Suspension werden mit dem gleichen Antikörper überzogen, doch weisen die einzelnen Teilchen in einer Suspension ein um einen vorbestimmten Paktor größeres Volumen auf als die einzelnen Teilchen in der anderen Suspension. In Abwesenheit des für den Antikörperüberzug spezifischen Antigens enthält eine Mischung der beiden Teilchensuspensionen zwar Multiplette der einen und der anderen Teilchenart aber keine Kombinationen der beiden verschiedenen Teilchenarten. Wenn z. B. für die beiden verschiedenen Teilchensuspensionen ein Verhältnis der einzelnen Teilchenvolumina von von 1,5:1 benutzt wird, dann kann man in einer Mischung solcher Suspensionen Teilchen und Teilchenmultiplette

mit Volumina von 1, 2, 3, 4 und 1,5; 3j ^j5 usw.

erwarten, wenn die Volumina in Einheiten des Volumens der kleineren Teilchen in den Ausgangsteilchensuspensionen angegeben sind. Es wurde außerdem festgestellt, daß in Gegenwart von Antigen ein starkes Koppeln großer mit kleinen Teilchen in der Mischung stattfindet. Dadurch kann man ein Widerstandsimpulssignal bei einem TeilchenmultipIettvolumen von 2 1/2 erhalten, das ohne Antigen nicht vorhanden sein würde. Die von den Teilchenmultip lettVolumina von 2 1/2 erhaltenen Widerstandsimpulssignale sind daher ein Anzeichen für eine Antikörper/Antigen-Wechselwirkung und diese Signale sind so frei von Hintergrund-Interferenz, als würde der Test nur mit einer einzigen Teilchengröße und ohne anfängliche Multipletts ausgeführt werden. Die

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Erfindung macht es somit möglich, die Empfindlichkeit der Widerstandsimpulsmethode zum Nachweisen immunologischer Reaktionen deutlich zu verbessern.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Nachweisen einer stattgefundenen Antigen/Antikörper-Reaktion das Zubereiten einer ersten Suspension aus Teilchen einer ersten vorbestimmten Größe, wobei jedes dieser Teilchen mit einer Schicht eines ersten Proteins überzogen ist, sowie das Zubereiten einer zweiten Suspension von Teilchen einer zweiten vorbestimmten Größe, wobei jedes Teilchen dieser zweiten Suspension ebenfalls mit einer Schicht des ersten Proteins überzogen ist. Die zweite vorbestimmte Größe ist größer als das Volumen der ersten vorbestimmten Größe und kleiner als das doppelte Volumen der ersten vorbestimmten Größe. Die beiden Suspensionen werden zu einer Mischung kombiniert und dazu eine Lösung gegeben, die auf die Anwesenheit eines zweiten Proteins, das spezifisch zum ersten Protein ist, untersucht werden soll. Dann versucht man Teilchenmultipletts nachzuweisen, bei denen jedes MuItipIett durch Aggregation eines Teilchens der ersten vorbestimmten Größe mit einem Teilchen der zweiten vorbestimmten Größe gebildet ist. Ist das erste Protein ein Antikörper, dann ist das zweite Protein ein Antigen und umgekehrt.

Bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zwei getrennte Teilchen^suspensionen zubereitet, wobei die Teilchen jeder der beiden Suspensionen mit dem gleichen Antikörper überzogen sind. Die so erhaltenen Suspensionen sind wegen des SaIz- und Proteingehaltes elektrisch leitend. Die erste Suspension wird zubereitet durch Aufbringen eines Antikörpers auf Latexkugeln von üblicherweise 175 Nanometern Durchmesser und Dialysieren zur Entfernung von oberflächeru-aktiven Mitteln und anderen Verunreinigungen» Dies kann dadurch bewerkstelligt werden, daß man z. B. die Teilchen in einer Glyzerinlösung rührt, die einen Immunoglobolin-G-Antikörper enthält. Die zweite Suspension wird zubereitet durch Aufbringen des Antikörpers auf Latexkugeln von

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geeigneterweise 200 Nanometern Durchmesser und ebenfalls Dialysieren zur Entfernung von oberflächen-aktiven Mitteln und anderen Verunreinigungen. Auch diese zweite Suspension kann durch Einrühren der Teilchen in eine Lösung der gleichen Zusammensetzung wie für die erste Suspension erhalten werden. Dann werden die beiden Suspensionen miteinander und mit einer Lösung vermischt, die auf die Anwesenheit von Antigen untersucht werden soll und danach testet man die erhaltene leitende Mischung in der angegebenen Weise auf die Anwesenheit von Antigen.

Die Auswahl der Latexteilchengröße ist für die richtige Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kritisch. Ein Teilchenvolumenverhältnis zwischen 1 und 2 : 1 und vorteilhafterweise von 1,5:1 für die beiden verschiedenen Teilchengrößen ist befriedigend, obwohl auch andere Kombinationen von Teilchengrößen ebenso gut benutzt werden können. Ist in der zu untersuchenden Lösung kein für den Antikörper spezifisches Antigen vorhanden, dann werden Multipletts der einen Teilchenart und Multipletts der anderen Teilchenart gebildet, aber es treten keine Kombinationen aus den beiden verschiedenen Teilchenarten auf. Ohne das Antigen enthält die Lösung daher nur Teilchen und Teilchenmultipletts mit individuellen Volumina von 1, 2, 3> ^ usw. sowie 1j5; 3; ^j 5; usw. Ist ein solches für den Antikörper spezifisches Antigen dagegen in der Lösung vorhanden, dann tritt ein Koppeln großer mit kleinen Teilchen- auf. Dadurch kann ein Widerstandsiinpulssignal bei einem Multip le tt volumen von 2,5 nachgewiesen werden, das eine Antikörper/Antigen-Wechselwirkung anzeigt.

Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 ein schematisches Diagramm der Vorrichtung, die zum Nachweisen einer Antigen/Antikörper-Reaktion mit der Widerstandsimpulsmethode benutzt wird und

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Figur 2 eine graphische Darstellung von Spannungsimpulsen, die erzeugt werden durch den Durchgang von Teilchen verschiedener Größen und von drei Teilchenaggregationen durch eine einzelne Pore in der in der Vorrichtung der Figur 1 benutzten Membran.

In der in Figur dargestellten Vorrichtung ist eine aus einem harzartigen Material, wie Plexiglas, bestehende Zelle 10 in zwei Kammern unterteilt, von denen jede etwa ein Volumen von 1 cm aufweist, wobei die Trennung in die beiden Kammern mittels einer nicht-leitenden Membran erfolgt ist, die aus einer Folie 11 gegossenen Polycarbonats besteht, die eine einzelne Pore 12 aufweist mit einem Durchmesser von einigen Zehntel um und einer Länge von mehreren um. Die Herstellung einer Polycarbonat-Folie, die eine solche Pore enthält, ist in dem Artikel von R.L. Fleischer et al "Novel Filter for Biological Materials" in Science 143 249-250, (Januar, 1964) beschrieben. Die Pore hat eine ausreichende Größe, typischerweise zwischen etwa 0,3 und 10 um Durchmesser, um einzelne Multipletts von Latexteilchen der Lösung eindringen zu lassen. Die zu untersuchende Lösung läßt man durch Anwenden von Druck auf eine der Kammern über eines der Füllrohre 13 oder 14 durch die Pore 12 strömen. Auf jeder Seite der Membran 11 sind in der Zelle Silber/Silberchlorid-Elektroden 15 bzw. l6 enthalten.

Von der Spannungsquelle 17, wie einer Batterie, wird eine Gleichspannung mittels eines Spannungsteilers 19, der aus einem Rheostaten 18 und einem strombegrenzenden Widerstand 20 besteht, der in Reihe geschaltet ist mit der Spannungsquelle, an die Elektroden 15 und 16 gelegt. Ein Lastwiderstand 21 in Reihe mit der Elektrode 15 wird groß genug ausgewählt (z. B. von einem bis zu mehreren Gigaohm),um die Vorrichtung zu einem System mit einem fast konstanten Strom zu machen, wie durch ein Nanometer 22 angezeigt, daß in Reihe mit der Elektrode 16 geschaltet ist. Es wird daher ein im wesentlichen konstanter Strom in die Lösung zwischen den Elektroden 15 und 16 geschickt, der longitudinal durch die Pore 12 verläuft.

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Die entweder einzeln oder als Aggregate vorhandenen Teilchen werden im allgemeinen durch die kombinierten Wirkungen des angewandten Druckes, der Elektroosmose und der Elektrophorese durch die Pore 12 getrieben. Ein Teilchen oder Multiplett 23, das in die Pore 12 eintritt, verdangt etwas von der leitenden Flüssigkeit in der Pore. Das das Latexteilchen relativ nichtleitend ist, erhöht sich während seines Durchganges längs durch die Pore 12 der elektrische Widerstand der Pore und somit die Spannung über die Pore, gemessen längs der Durchgangsrichtung durch die Pore. Der resultierende Spannungsimpuls durch die Pore wird durch die Elektrode 15 angezeigt und dann mittels eines

11 HochimpedanzVerstärkers 24 (z. B. einem mit mehr als 10 Ohm) verstärkt, wie dem von Transidyne General Corporation vertriebenen Modell MPA-6, mit dem man auch die Zellspannung von einem in dem Verstärkerstromkreis verbundenen Voltmeter 25 ablesen kann.

Die über der Pore erzeugten Spannungsimpulse werden auf einem Speicherschirm-Oszilloskopen 26 überwacht, wie einem von Tektronix Incorporated, Beaverton Oregon vertriebenen Modell 5IO3/DII mit 5A2ON-und 5A15N-Verstärkern und einer 5B10-Zeitbasis. Die beiden 12 Millivoltimpulse erscheinen, die wahrscheinlich dem Durchgang zweier Dimerer von Teilchen mit 570 Nanometern Durchmesser entsprechen (obwohl einer oder beide Impulse möglicherweise auch dem Durchgang von Trimeren von Teilchen mit 5OO Nanometer Durchmesser entsprechen können) und es tritt ein 8 Millivoltimpuls auf, der dem Durchgang eines Dimers von Teilchen mit einem 500 Nanometer Durchmesser entspricht. Hat eine immunologische Reaktion stattgefunden, dann bilden Teilchen mit 500 und 570 Nanometer Durchmesser Dimere und diese zeigen Spannungsimpulse mit einer Amplitude nahe 10 Millivolt (wie durch die punktierte Linie angedeutet) In diesem Falle wäre die Zahl der Impulse mit einer Amplitude von nahe 10 Millivolt auf einem Impulshöhenhistogramm ein Maß für die Stärke der immunologischen Reaktion.

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Ebenso wie Antikörper-überzogene Latexteilchen zum Nachweis von Antigenen benutzt werden können, kann man Antigen-überzogene Latexteilchen zum Nachweisen von Antikörpern verwenden.

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Leerseite

Claims

Patent ansprüche

Verfahren zum Nachweisen einer Antigen/Antikörper-Reaktion gekennzeichnet durch folgende Stufen;

Zubereiten einer ersten Teilchensuspension einer ersten vorbestimmten Größe, bei der jedes Teilchen mit einer Schicht eines ersten Proteins überzogen ist, Zubereiten einer zweiten Teilchensuspension einer zweiten vorbestimmten Größe, wobei jedes Teilchen mit einer Schicht des ersten Proteins überzogen ist und die zweite vorbestimmte Größe größer ist als das Volumen der ersten vorbestimmten Größe und kleiner als das doppelte des Volumens der ersten vorbestimmten Größe,

Kombinieren der ersten und zweiten Suspension zusammen mit einer auf die Anwesenheit eines zweiten Proteins, das spezifisch für das erste Protein ist_; zu testenden Lösung und

Nachweisen von Teilchenmultipletten, um die durch Aggregation eines Teilchens der ersten vorbestimmten Größe mit einem Teilchen der zweiten vorbestimmten Größe gebildeten Multiplette zu identifizieren.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Protein ein Antikörper und das zweite Protein ein Antigen ist, das spezifisch ist für den Antikörper.

3· Verfahren nach Anspruch 1 .oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe des Machweisens der Teilchenmultiplette die folgenden Schritte umfaßt:

Einführen eines im wesentlichen konstanten Stromflusses längs durch einen,einen kleinen Teil der genannten Mischung enthaltenden Bereich,

die Mischung längs durch den genannten Bereich fließen lassen und

Überwachen der Spannung längs über den genannten Bereich, während die Mischung hindurchströmt, um Spannungsimpulse ■ vorbestimmter Amplitude als Anzeichen der Anwesenheit von Multipletts nachzuweisen, die durch Aggregation eines Teilchens der ersten vorbestimmten Größe mit einem Teilchen der zweiten vorbestimmten Größe gebildet sind.

Ί. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - J>, dadurch gekennzeichnet , daß die Teilchen der zweiten-vorbestimmten Größe je im wesentlichen das 1 1/2-faehe Volumen der Teilchen der ersten vorbestimmten Größe haben.

b. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet , daß der genannte Bereich in zwei Teile unterteilt wird, die durch einen Durchgang miteinander verbunden sind, der einen Durchmesser im Bereich von 0,3 ~ 10 um aufweist.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 - 5 , dadurch ge kennzeichnet, daß das erste Protein ein Antigen und das zweite Protein ein Antikörper spezifisch zu dem Antigen ist.

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