SE445076B - Forfarande vid immunanalys der partikelaggregat pavisas med en resistiv-pulsmetod - Google Patents

Description

7á1o77s-1- _2 de procedurer som användes för framställning av partiklarna med antikropp vidhäftade på deras ytor; detta innebär att agglomerationer av antikroppsbelagda partiklar i suspension uppkommer när suspensionen bildas.

Det har visat sig att den resistiva pulsmetoden för partikel- pâvisning har speciell förmåga att på ett noggrant sätt upp- mäta partikelstorleksfördelningar, medan man undviker stör- ningar i analysen från mätning av multipletterna i_icke om- satta partikelsuspensioner. För att utföra dessa~noggranna mätningar framställes två partikelsuspensioner, varvid partik- larna i vardera belägges med samma antikropp, men de individuella partiklarna i den ena suspensionen har större volym än de indi- viduella partiklarna i den andra suspensionen enligt en förut- bestämt faktor. I frånvaro av antigen specifikt mot antikroppa- beläggningarna kommer en blandning av två partikelsuspensioner att innehålla multipletter av den ena och av den andra typen av partiklar, men icke några kombinationer av de båda typerna av partiklar. Man använder således exempelvis ett individuellt partikelvolymförhållande av l,5 : l för de två olika partikel- suspensionerna, varvid man kunde förvänta sig att finna en blandning av sådana suspensionspartiklar och partikelmulti- pletter med volymer av l, 2, 3, 4 etc. och 1,5, 3, 4,5 etc., när volymerna föreligger i enheter av den mindre individuella partikelvolymen använd i utgângspartikelsuspensionerna. Det har emellertid visat sig att i närvaro av antigen uppkommer en avsevärd koppling mellan en stor partikel och en liten par- tikel i blandningen, Detta medför en förmåga att erhålla en resistiv pulssignal vid en partikelmultiplettvolym av 2,5, som är en partikelmultiplettvolym (såväl som partikelvolym) som icke skulle kunna vara närvarande i frånvaro av antigen.

De resistiva pulssignalerna erhållna från partikehnultiplett- volymerna av 2,5 utgör således en indikation på en ömsesidig inverkan mellan antikropp och antigen och är lika fria från en bakgrundsstörning som om testet utfördes med en enda 4 partikelstorlek och utan ursprungliga multipletter. Uppfinningen gör det således möjligt.att signifikant förbättra känsligheten av den resistiva pulsmetoden för påvisning av imunologiska 7810773-7 elektriskt ledande på grund av salt- och proteinhalt, Den första suspensionen framställes genom att man avsätter anti- kroppen på latexsfärer, vanligen med en diameter av 175 nano- meter, och dialyseras för eliminering av ytaktiva substanser och andra föroreningar. Detta kan åstadkommas genom omröring av partiklarna exempelvis i en glycerollösning som kan inne- hålla en immunglobulin-G-antikropp. Den andra suspensionen framställes genom avsättning av antikroppen på lateàsfärer, vanligen med en diameter av 200 nanometer, och dialyseras även för eliminering av ytaktiva substanser och andra föroreningar genom omröring av partiklarna i en lösning med samma samman- sättning. De båda suspensionerna blandas därefter med en lös- ning avsedd att testas med avseende på närvaron av antigeni och den bildade elektriskt ledande blandningen testas sedan på det i det följande angivna sättet. V ' I 7 Val av latexpartikelstorlek är kritiskt för korrekt praktisk tillämpning av uppfinningen. Ett partikelvolymförhållande mellan l och 2 till l, företrädesvis l,5:l för de båda olika partikelsuspensionerna är tillfredsställande, ehuru.andra kombinationer av partikelstorlekar likaväl kan användas, I frånvaro av antigen i lösningen, specifik mot antikroppen, bildas multipletter av den ena och av den andra typen av partiklar, men nâgra kombinationer avšde båda typerna uppkommer icke. Lösningen innehåller således endast partiklar och partikel- multipletter med de individuella volymerna l, 2, 3, 4, etc. och 1,5, 3, 4,5, etc. Vid närvaro av antigen uppkommer emellertid en koppling mellan stora och små partiklar. En resistiv puls- signal kan sedan påvisas vid en multiplettvolym av 2,5, som indikerar en ömsesidig inverkan mellan antikropp och antigen, med användning av den i fig. l visade-apparaten. _ Enligt fig. l är en cell 10, exempelvis av ett hartsmaterial, såsom plexiglas, uppdelad i två kammare, vilka vardera har en volym av ungefär l cm3, med ett icke~ledande membran, omfattande en skiva av gjutet polykarbonat ll uppvisande en enda por 12, typiskt , flera tiondelar av en mikrometer i diameter och flera mikrometer lång. Tillverkning av en polykarbonatskiva innehållande en sådan por beskrives av R.L. Fleischer et al i 7810773-7 reaktioner.

Helt kortfattat innebär en särskilt lämpliga utföringsform av uppfinningen en metod för påvisning av förekomst av ena antigen-antikroppsreaktion,.varvid man framställer en första suspension av partiklar av en första förutbestämd storlek, varvid varje partikel i den första suspensionen_belägges med ett skikt av ett första protein, och en andra suspension av partiklar av_en annan förutbestämd storlek, varvid varje par- tikel i den andra suspensionen belägges med ett skikt_av det första proteinet. Den andra förutbestämda storleken är större än en och mindre än två gånger volymen av den första förut- bestämda storleken. De första och andra suspensionerna kombi- neras därefter till en blandning i kombination med en lösning för testning av närvaron-av ett andra protein specifikt mot det första proteinet. Multipletter av partiklar eftersökes för påvisning, varvid varje multiplett bildas genom aggrega- tion av en partikel av den.första förutbestämda storleken med en partikel av den andra förutbestämda storleken. Om det första proteinet är en antíkropp, är det andra proteinet ett antigen och tvärtom. f Uppfinningens kännetecken synes vara nya. Själva uppfinningen åskådliggöres emellertid med hänsyn till organisation och driftsmetod bäst genom hänvisning till följande beskrivning i kombination med de bifogade ritningarna, vari _ fig. l är ett schematiskt diagram av den apparat som användes för pâvisning av en antigen-antikroppsreaktion enligt den resi- stiva pulsmetoden, varvid reaktionen ger partikelaggregation på det häri beskrivna sättet; och fig. 2 är en grafisk presentation av spänningspulser alstrade genom passage av partiklar av olika storlek, och genom passage av tre partikelaggregationer genom en enda por i det membran som användes i apparaten enligt fig. l.

Vid praktisk tillämpning av uppfinningen framställes två sepa- rata partikelsuspensioner, varvid partiklarna i vardera belägges med samma antikropp. De således erhållna suspensionerna är 1810773-vad G1 “Novel Filter for Biologlcal Materials", Science, låà, 249-250, januari 1904. Por l2 har en tillräcklig storlek, typiskt mellan ungefär 0,3 och 10 mikrometer i diameter för att_möjlig- göra att mwltipletter av latexpartiklarna individuellt passerar i lösningen. Lösningen avsedd för analys bringas flyta igenom por l2 genom att man påför ett tryck på den ena av kamrarna genom ett av pâfyllningsrören 13 och l4. Silver-silverklorid- elektroder 15 och l6 är inneslutna i cellen på vardera sidan om membranet _l._ En spänning från en likströmskälla l7, såsom ett batteri, pålägges över elektroderna 15 och l6 via en potentialdelare- l9, sammansatt av en reostat l8 och en strömbegränsande resistans 20 anslutna i serie med likströmskällan. En belastningsresistans Zl i serie med elektroden l5 väljes med tillräcklig storlek (såsom från en upp till några få gigaohm) för att apparaten skall utgöra ett nästan konstant strömsystem, såsom indikeras av en nanometer 22 ansluten i serie med elektroden l6. Således induceras ett flöde av i huvudsak konstant ström i lösningen mellan elektroderna l5 och l6, vilken passerar longitudinellt genom poren 12.

Partiklar, antingen enkla eller aggregerade, drives vanligen genom poren 12 av de kombinerade effekterna av pålagt tryck, elektroosmos och elektrofores. En partikel eller multiplett 23 som når poren l2 undantränger en viss mängd av den ledande vätskan i poren. Eftersom latexpartikeln är relativt icke- ledande, genom passerande longitudinellt genom poren 12 höjer denna partikel den elektriska resistansen i poren och spänningen över poren, uppmätt längs passageriktníngen genom poren. Den erhållna spänningspulsen över poren påvisas av elektroden l5 och förstärkes av en högimpedansförstärkare 24, dvs. högre än lOll ohm, såsom en model MPA-6, tillhandahållen av Transidyne General Corporation, Ann Arbor, Michigan, A.f.s., som möjliggör att cellspänningen kan avläsas från en voltmeter 25 ansluten i förstärkarkretsen.

De över poren alstrade spänningspulserna övervakas på en minnesskärmoscilloskop 26, såsom en 5103/Dll, med SAZON- och 781Û7"73-7' i O SALSN-förstärkare och 5BlO-tidsbas, tillhandahållen av Tektronix, Inc., Beavcrton, Oregon, A.f.s. De båda l2 millivoltpulserna alstras, sannolikt motsvarande passagen av två dimeter av partiklar med en diameter av 570 nanometer (ehuru den ena eller båda pulserna kan motsvara passagen av trimerer av par- tiklarna med en diameter av 500 nanometer), och en 8 millivolt- puls alstras, motsvarande passagen av en dimer av partiklarna med en diameter av 500 nanometer. I närvaro av en immunologisk reaktion skulle dimerer av kombinerade 500- och 570-nanometer- partiklar bildas och uppvisa pulser med en amplitud nära 10 millivolt (såsom indikeras av den streckade linjen). I detta fall skulle antalet pulser uppkommandc nära 10 millivolt till amplituden på ett pulshöjdshistogram utgöra ett mått på styrkan av den immunologiska reaktionen.

På grund av avsikten att kortfattat beskriva uppfinningen i denna besk ivning, som specifikt hänvisar till användningen av -antikroppshelngda latexparliklar för påvisninq av närvaron av antigener, inser fackmannen att uppfinningen likaledes är till- lämplig på användningen av antigenbelaqda latexpartiklar för pâvisning av närvaron av antikroppar.

Denna beskrivning hänför sig till ett förfarande och apparat för påvisning med hög känslighet av förekomsten av en immuno- logisk reaktion. Uppfinningen har till uppgift att förbättra känsligheten vid den resistiva pulsmetoden för_påvisning av immunologiska reaktioner och omfattar en enkell klinisk teknik för pâvisning av sådana reaktioner.

Claims (6)

7810773-7 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för påvisning av förekomsten av en_antigen-' antikroppsreaktion, k ä n n e t e c k n a t därav, att man framställer en första suspension av partiklar med en första_ förutbestämd storlek, varvid varje partikel i nämnda första suspension är belagd med ett skikt av ett första protein, framställer en andra suspension av partiklar av en andra förutbestämd storlek, varvid varje partikel i den andra suspen- sionen är belagd med ett skikt av nämnda första protein,” varvid den andra förutbestämda storleken är större än en och mindre än två gånger volymen av den första förutbestämda storleken, kombinerar i en blandning nämnda första och andra suspension tillsammans med en lösning avsedd för påvisning av ett andra protein specifikt mot det första proteinet och påvisar multipletter av partiklar för identifiering av multi- pletter med en storlek bildad enbart genom aggregation av en partikel mod nämnda första förutbestämda storlek till en par- tikel med nämnda andra förutbestämda storlek. i

2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t.e c k n a t därav, att det första proteinet utgör en antikropp och det andra proteinet ett antigen specifikt mot nämnda antikropp.

3. Förfarande enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att man påvisar nämnda multipletter av partiklar genom att man inducerar ett flöde av en i huvudsak, konstant ström longítudinellt genom en zon, innehållande en ringa mängd av nämnda blandning, bringar blandningen att flyta longitudinellt genom nämnda zon och övervakar spänningen longi- tudinellt över nämnda zon, när blandningen flyter därigenom, för pâvisning av spänningspulser av förutbestämd amplitud såsom en indikation på närvaron av nämnda multipletter bildade genom aggregation av en partikel av nämnda första förutbestämda storlek och en partikel av nämnda andra förutbestämda storlek. 7810773-7'

4. ; Förfarande enligt något av patcntkraven l-3, k ä n n e - t'e c k n a t därav, att nämnda partiklar av den andra förut- bestämda storleken vardera är i huvudsak l,5 gånger volymen av partiklarna av den första förutbestämda storleken. 7

5. Förfarande enligt patentkravet 3 eller Ä, k ä n n e - t e c k n a t därav, att man uppdelar nämnda zon i två delar anslutna via en passage av mellan 0,3 och 10 mikrométer i diameter.

6. Förfarande enligt något av patentkraven l-5, k ä n n e - t e c k n a t därav, att nämnda första protein utgör ett anti- gen och nämnda andra protein utgör en antikropp specifik mot antiqenet.