DE2812988C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung der Thalassämie, insbesondere der Beta-Thalassämie minor bei Reihenuntersuchungen, sowie auch eine Anordnung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die vorveröffentlichte DE-AS 16 73 146 beschreibt eine Erfassungseinrichtung für Blutteilchen, mit der getrennt das mittlere Teilchenvolumen (MCV) der roten Blutkörperchen sowie der mittlere Teilchen-Hämoglobingehalt (MCH) einer Blutprobe bestimmt werden kann. Die diesen Meßgrößen proportionalen Meßsignale wurden jeweils für sich erfaßt und auch verarbeitet. Diese Meßgrößen erlauben keine Diagnostizierung der Thalassämie.

Es sind verschiedene Methoden zur Diagnostizierung der Thalassämie bekannt. U. a. erfolgt hier die Messung und Auswertung der osmotischen Resistenz des fetalen Hämoglobins, des freien Porpyrins der roten Blutkörperchen, der Blutausstriche und des Hämoglobins A₂. Dies Methoden erfordern einen hohen Zeitaufwand und eine erhöhte Sorgfalt, der die Messung und Auswertung durchführenden Person. Sie eignen sich insbesondere nicht ohne weiteres für Reihenuntersuchungen.

Mit der Entwicklung und Durchsetzung der elektronischen Rechner ging man dazu über, die Index-Werte der roten Blutkörperchen zu berechnen und kombiniert oder einzeln für sich zur Erkennung von Heterozygotie einzusetzen. Drei bekannte Nachweismethoden wurden an 25 302 Proben getestet, aber mit keiner konnten vorliegende, bekannte heterozygote Typen erfaßt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Anordnung zu schaffen, die auf einfachste Weise, ohne unnötig großen Zeitaufwand und ohne große Anforderungen an die Sorgfalt der Bedienungsperson, die Diagnostizierung der Thalassämie, insbesondere der Beta-Thalassämie minor auch bei Reihenuntersuchungen ermöglicht.

Die Erfindung löst diese Aufgabe mit den die Erfindung kennzeichnenden Merkmalen nach den Patentansprüchen 1 und 3.

Aus den Unteransprüchen ergeben sich vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines in den Zeichnungen veranschaulichten, bevorzugten Ausführungsbeispiels erläutert.

In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 im Diagramm die drei Verfahrensschritte nach der Erfindung und die erhaltenen Testergebnisse;

Fig. 2 zwei Verlaufsformen der Verteilungskurven für (MCV)² × MCH, in welchen Beta-Thalassämie minor mit normalen und anämischen Fällen verglichen wird;

Fig. 3 die Wahrscheinlichkeitskurve, wobei die thalassämischen Index-Werte (MCV)² × MCH auf der Abszisse und die Wahrscheinlich­ keitswerte für Beta-Thalassämie minor auf der Ordinate aufgetragen sind;

Fig. 4 ein Blockschaltbild einer Anordnung zur Bildung der thalassämischen Indexwerte; und

Fig. 5 ein elektrisches Schaltbild eines Teils der Anordnung nach Fig. 4.

Das Nachweisverfahren wird bevorzugt in drei Verfahrensschritten durchgeführt, nämlich 1) Hämoglobin- Elektrophorese, 2) Ermittlung des Produkts aus der zweiten Potenz des mittleren Teilchenvolumens der roten Blut- Körperchen (MCV)² und dem mittleren Teilchenhämoglobingehalt (MCH) in Einheiten von 100 gemessen, und 3) A₂ - Bestimmung aller Proben des Genotyps AA mit einem Wert (MCV)² × MCH < 1530 sowie aller Proben der mit Thalassämie zu vereinbarenden Varianten.

Verfahren und Anordnungen zur Durchführung der Verfahrensschritte 1) und 3) sind allgemein bekannt, aber der Verfahrensschritt 2), d. h. (MCV)² × MCH ist sowohl als Bestandteil einer Nachweismethode für Thalassämie, insbesondere der Beta-Thalassämie minor als auch in alleiniger Anwendung als Indikator bzw. Untersuchungsindex für Thalassämien, insbesondere der Beta-Thalassämie-minor, neu. Die Verwendung des Produktes (MCV) × MCH statt (MCV)² × MCH hat sich zwar im Verfahrensschritt 2) und auch für sich allein als brauchbarer Index erwiesen, liefert aber nicht so exakte Ergebnisse wie (MCV)² × MCH.

Es sind ebenfalls Verfahren und Anordnungen zur Messung der einzelnen Parameter MCV und MCH bekannt. Die Erfindung sieht eine Anordnung vor, mit der sich ein an sich bekanntes Gerät, das sog. Coulter-Teilchenanalysiergerät, Model S, auf selbsttätige Ermittlung des Werts (MCV)² × MCH umstellen läßt.

Nachstehend werden alle drei Verfahrensschritte dieses bevorzugten Nachweisverfahrens für Beta-Thalassämie minor ausgehend von dem Diagramm nach Fig. 1 beschrieben. Die im Verfahren nach der Erfindung gewonnenen Ergebnisse schnitten im Vergleich mit allen bekannten Verfahren ausgezeichnet ab, wie aus den Daten der Tabelle 1 ersichtlich. Diese Nachweismethode bietet ein seit langem gesuchtes Kriterium zur Erfassung der Thalassämie, nämlich den sog. Thalassämie-Index, der sich durch Bestimmung der Parameter MCV (mittleres Zell- oder Teilchenvolumen) und MCH (mittleres Teilchenhämoglobin) der roten Blutkörperchen und Bildung deren mathematischen Produktes ergibt, vorzugsweise unter Verwendung von MCV in zweiter Potenz, also (MCV)² × MCH.

Fig. 3 zeigt die Wahrscheinlichkeitskurve für Thalassämie- Träger, wobei die Wahrscheinlichkeit zunimmt, je weiter der Thalassämie-Index unter einem vorbestimmten Schwellenwert liegt, wie noch beschrieben wird.

Wie aus Fig. 1 ersichtlich, wurden in aufeinanderfolgender Reihe 25 302 gesunde Erwachsene ambulant auf hereditäre Anämien untersucht. 70,3% waren Schwarze, 9,7% waren Weiße, die von gemischt nordeuropäischen Vorfahren mit geringem mediterranen Einschlag abstammten. 5 ml Venenblut jeder Testperson wurden in ein 7 mg EDTA enthaltendes Vakuumröhrchen eingesaugt. Der Hämoglobin-Typus wurde in bekannter Weise durch Zellulose-Acetat-Elektrophorese mit "Tris-"EDTA Boratpuffer, pH=8,4 und dann mit Zitratagar-Elektrophorese in Zitratpuffer, pH=6,2, im Verfahren nach Schneider bestimmt. Bei jeder Bandwanderung F wurde eine quantitative Bestimmung nach dem bekannten Betke-Verfahren vorgenommen. Da die Proben oft ein oder zwei Tage alt waren, wurden rote Blutkörperchen nicht auf fetales Hämoglobin gefärbt. Hämoglobin A₂ wurde bei allen möglicherweise thalassämischen Proben zweifach gemessen, d. h. bei allen Proben mit einem mittleren Teilchenvolumen von unter 80µ³ und bei allen des Genotypus AF, FA oder SA. Außerdem wurde A₂ so vieler im Normalbereich liegender Proben gemessen wie täglich arbeitsmäßig zu bewältigen war. Hämoglobin A₂ wurde vom Gesamtblut in einer DEAE Zellulose Minisäule in Glycinpuffer abgesondert und mit einem Spektrofotometer bei 415 nm gemessen. Die Messung von A₂ war mit Ausnahme von Hämoglobin S enthaltenden Proben reproduzierbar. Der Ungenauigkeitsgrad wurde an einer Sammelprobe von 50 Personen mit Sichelzellen- Charakteristik gemessen; der gesammelte Hämoglobin A₂-Anteil wurde durch Dialyse konzentriert und in einer langen Säule in 85,7% A₂ und 14,3% S getrennt. Mit einem täglich gegen normale und anormale Einflüsse geeichten Coulter- Gerät Model S wurden die Index-Werte MCV, Hb, RBC und MCH der roten Blutkörperchen ermittelt und der Berechnung des Diskriminanten nach England Fraser (MCV - RBC - 5Hb - 3,4<1), der Erfassung des Schwellenwerts von MCV unter 79 µ³ nach Pearson und der Berechnung des von Mentzer versuchsweise vorgeschlagenen Verhältnisses (MCV/RBC<13) zugrunde gelegt.

Das bevorzugte Verfahren nach der Erfindung wurde durch methodische Erprobung entwickelt, um die Anzahl falscher positiver und falscher negativer Ergebnisse, die sich bei Anwendung der anderen Methoden zeigten, zu reduzieren. Das Produkt aus (MCV)² × MCH gemessen in Einheiten von 100 wurde für jede Probe errechnet. Da der Genotypus AS bekanntlich mit der Diagnose von Beta-Thalassämie minor nicht vereinbar und die Genotypen nicht willkürlich auf die Indexwerte der roten Blutkörperchen verteilt sind, brauchte dieses Produkt lediglich für die Proben des Genotypus AA, wie die 23 075 Proben in Fig. 1 zeigen, berechnet zu werden. Da bei Männern die Werte um 6,2% höher liegen als bei Frauen, wurden alle von Männern hergeleiteten Werte um 6,2% reduziert, um eine einheitliche Trennlinie zu schaffen. Aus der Gesamtanzahl von 25 302 untersuchten Individuen wurden 138 mit Hämoglobin A₂<4,5% identifiziert. Vier Methoden zur Erfassung dieser 138 Individuen wurden verglichen, wie Tabelle 1 zeigt.

Die Werte des Thalassämie-Index (MCV)² × MCH ergaben einen breiten Abstand zwischen thalassämischen und normalen Fällen, wie die thalassämische Kurve 6 und die normale Kurve 7 in der unteren Hälfte in Fig. 2 zeigen. Der Mittelwert für die thalassämischen Fälle lag bei 1094±259, und der Mittelwert für die AA nicht thalassämischen Fälle bei 2218±386. Diese Differenz war sehr bezeichnend, t=205, p<0,0001. Die einzige nicht erfaßte Person hatte im Normalbereich liegende hämatologische Werte und wäre jeglicher Erfassung mit auf den Index-Werten der roten Blutkörperchen beruhenden Methoden entgangen. Derartige Thalassämie-Träger mit normalen hämatologischen Werten dürften äußerst selten sein, da die Messung von A₂ bei 1761 Personen mit Mikrozytose keinen und bei 1973 Personen ohne Mikrozytose nur einen Träger ergab. Die Thalassämie- Indexwerte ergaben auch einen deutlichen Abstand zwischen den Mittelwerten der heterozygoten 1094±259 und der anämischen Personen 1814±601, wie die Kurven 8 bzw. 9 in der oberen Hälfte in Fig. 2 zeigen, wobei Anämie als eine Hämoglobinkonzentration definiert wird, die bei Männern unter 12 g/dl und bei Frauen unter 11 g/dl liegt, t=7,7, p<0,0001.

Versuche mit den Indexwerten MCV und MCH der roten Blutkörperchen haben gezeigt, daß deren Produkt zwar einen aufschlußreichen Thalassämie-Index liefert (Daten hierfür sind hier nicht angegeben), daß aber bei Zugrundelegung von (MCV)² sehr viel genauere, aussagereichere Ergebnisse gewährleistet sind, da Heterozygoten bei Hämoglobin S und C zu thalassämischen roten Blutkörperchen neigen und sich der Wert (MCV)² × MCH in Gegenwart von SA oder bei Erhöhung von F in Verbindung mit Thalassämie minor in den Normalbereich verschob. Das bevorzugte Verfahren nach der Erfindung verfehlte nur einen einzigen heterozygoten Typ und ermittelte lediglich 4,4% falsche positive Ergebnisse.

Die Daten umfangreicherer Populations-Untersuchungen könnten ergeben, daß der Exponentialwert für MCV bestenfalls mindestens etwas von zwei abweicht. Die Potenz "zwei" ist daher insbesondere hinsichtlich der Ansprüche nicht zu eng auszulegen.

Die Messung von Hämoglobin A₂ wird als verläßlichster Indikator für Beta-Thalassämie minor zugrundegelegt, obwohl zwischen einzelnen Laboratorien und Verfahren Abweichungen bestehen. 3,5% A₂ gilt zwar als üblicher Schwellenwert zwischen Beta-Thalassämie minor und Normal, aber bei Beurteilung der Wirksamkeit des Verfahrens nach der Erfindung wurde der Schwellenwert auf 4,5% gesetzt, da der Zwischenbereich einige Fälle umfaßte, für die die Diagnose weder klinisch noch genetisch belegbar war. Da es Zweck dieser Untersuchung war, die einzelnen Nachweismethoden für Heterozygoten vergleichend zu beurteilen, hat man sich entschlossen, diesen Zwischenbereich bis zum Abschluß genetischer Untersuchungen an jedermann unberücksichtigt zu lassen.

Der Wert des Thalassämie-Index (MCV)² × MCH liefert auch einen Anhaltspunkt für die Wahrscheinlichkeit, ob ein Individuum heterozygot ist, da sich die Häufigkeit der Heterozygotie im wesentlichen umgekehrt proportional zu diesem Wert verhält. Die Wahrscheinlichkeitskurve in Fig. 3 gibt als Schwellenwert 1530 an, unterhalb welchem eine Bestimmung des Hämoglobin A₂ angezeigt ist. Unter dem Wert von 1530 liegen 99% der thalassämischen heterozygoten Population, und dieser Bereich <1530 läßt sich in Untergruppen je nach den unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten dieser Anomalie einteilen.

Fig. 4 zeigt ein Blockschaltbild eines Geräts 10, mit welchem sich der Thalassämie-Index ermitteln läßt. Die für MCV, MCH und A/D stehenden Blöcke 12, 14 und 16 sind beim Coulter-Teilchenanalysiergerät vorhanden, aber nicht auf dieses Gerät beschränkt. Lediglich die zwischen den gestrichelten Linien 18 und 20 liegenden Blöcke sind zusätzlich erforderlich, um das Model S auf Ermittlung des Thalassämie-Index umzustellen. Die analogen Ausgänge von MCV und MCH werden dem Funktionsblock 22 zugeführt, der den analogen Wert von (MCV)₂ × MCH liefert. Um diesen analogen Wert des Thalassämie-Index in einen digitalen Wert mittels eines bereits vorhandenen Analog-Digital Umsetzers umwandeln zu können, ist ein Verstärker 24 vorgesehen, der einen Maßstabfaktor liefert.

Fig. 5 zeigt schematisch die einzelnen Schalt- und Bauelemente der Blöcke 22 und 24. Wichtigstes Element des Funktionsblockes 22 ist der Funktionsumsetzer 26 (handelsübliche Ausführung von Burr-Brown Research Corp., Tucson, Arizona, Artikel No. 4302). Die gesuchte Funktion (MCV)² × MCH ist natürlich auch mit einer entsprechend ausgelegten anderen Schaltungsanordnung erhältlich. Der V _x Eingang ist ein Maßstabänderungs-Eingang und wird als +5 V gewählt, um die Berechnung der analogen Funktion in den Operationsbereich des Model-S zu bringen. Der Widerstand 50K ist mit dem Ausgang E _o verbunden und liefert einen Eichfaktor für den Analog-Digital-Umsetzer 24. Ein mit den in Fig. 4 und 5 gezeigten Schaltverbindungen ausgestattetes Coulter Model S ermöglicht die Darstellung und das Ausdrucken des digitalen Werts des Thalassämie-Index.

Der Aufbau und die Funktionsweise des Teilchenanalysiergeräts Model S sind aus der US-PS 34 59 994 bekannt. Wie in dieser Patentschrift beschrieben, läßt sich MCV als Quotient des Hämatokrit-Werts und der Anzahl roter Blutkörperchen, d. h. MCV=HCT/RBC und MCH als Quotient von Hämoglobin und Anzahl roter Blutkörperchen, d. h. MCH=Hb/RBC ableiten. All diese Parameter sind mit einem Model S erhältlich. Natürlich brauchen weder die analogen noch die numerischen Werte von MCV und MCH ermittelt zu werden, lediglich deren Äquivalente, HCT/RBC und Hb/RBC sind erforderlich und lassen sich entweder in analoger oder digitaler Form darstellen, je nachdem, für welche der bekannten Verfahren und Anordnungen man sich entscheidet.

Tabelle I

Claims (5)

1. Verfahren zur Diagnostizierung der Thalassämie, insbesondere der Beta-Thalassämie minor bei Reihenuntersuchungen, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung einer Erfassungseinrichtung für Blutteilchen dem mittleren Teilchenvolumen (MCV) der roten Blutkörperchen sowie dem mittleren Teilchenhämoglobingehalt (MCH) einer Blutprobe proportionale Meßsignale erzeugt werden und ein dem Produkt dieser beiden Meßsignale proportionales Meßsignal mit einem als Thalassämie-Index dienenden, vorbestimmten Schwellenwert verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutproben einer Hämoglobin-Elektrophorese unterzogen werden und daß der Thalassämie-Index nur für die Proben des Genotypus AA abgeleitet und verglichen wird.

3. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Einrichtung (12, 14) zur Messung der Parameter "mittleres Teilchenvolumen (MCV)" und "mittlerer Teil­ chenhämoglobingehalt (MCH)" der roten Blutkörperchen einer Blutprobe, eine Einrichtung (22) zur Bildung eines Produktes aus diesen zwei gemessenen Parametern und eine Vergleichseinrichtung (16, 24) zum Vergleich dieses Produktes mit mindestens einem vorbestimmten Standard-Index umfaßt.

4. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (22) zur Bildung des Produktes so ausgelegt ist, daß sie den Wert (MCV)² × MCH bildet.

5. Anordnung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Teil eines selbsttätigen Blutkörperchen-Analysiergerätes ist.