DE2461811A1

DE2461811A1 - Immunologisches bestimmungsverfahren

Info

Publication number: DE2461811A1
Application number: DE19742461811
Authority: DE
Inventors: Martin Ralphs Redshaw
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1974-01-02
Filing date: 1974-12-30
Publication date: 1975-07-31
Also published as: FR2256413B1; US3985867A; SE7416367L; JPS50116630A; GB1451669A; FR2256413A1

Description

Immunologisches Bestimmungsverfahren

Die Erfindung· betrifft ein immunologisches Bestimmungsverfahren bei dem eine unbekannte Menge eines zu bestimmenden Antigens und eine Standardmenge einer markierten Form des Antigens um die Reaktion mit einer Standardmenge eines Antikörpers in Konkurrenz treten. Dieses Verfahren wird weitgehend angewandt auf dem Gebiet der Medizin zur Bestimmung von Hormonen und anderen Substanzen«

In der Praxis wird als markierte Form des zu bestimmenden ■ Antigens meist eine radioaktiv markierte Verbindung verwendet. Es besteht im Prinzip jedoch kein Grund,worum andere Formen der Markierung nicht angewandt werden könnten.

509831/0530

Das Prinzip dieser Technik kann dargestellt werden durca das folgende Schema:

C + G* + R ===ί CE + C*R ,

wobei C das zu bestimmende Antigen, C* die markierte Form des Antigens und R der Antikörper ist.

Die Menge von R wird so gewählt, daß sie nicht ausreicht, mit der Gesamtmenge C + C* zu reagieren. Da die Reaktion zumindest in gewissem Maße reversibel ist wird ein Gleichgewicht erreicht, bei dem das Verhältnis von £~G*J I ßi*_7+ £~^G*~^R-7 bestimmt wird durch die Menge an vorhandenem nicht-markiertem Antigen C· Wenn C* von C*-R abgetrennt wird und die Aktivität jedes abgetrennten Teils gemessen wird, kann der Wert dieses Verhältnisses leicht berechnet werden»

Die Menge an nicht-markiertem Antigen O kann dann in relativen oder absoluten Werten bestimmt werden mit !Hilfe von Standard-Zubereitungen von Antigen C zur Herstellung einer Eichkurve·

Die Technik ist z.B. besehrieben in einem. Übersichtsartikel von R.S. Yalow und S.A. Berson in IAEA-SM-124/106,S,455-481;-

Es sind verschiedene Techniken bekannt zur Abtrennung des gebundenen von dem freien Antigen,, Ein solches Verfahren besteht in der Ausfällung des Antigen-Antikörper-Komplexes aus der Lösung durch Zugabe eines zweiten Antikörpers gegen das ^-Globulin de.r zur Bildung des ersten Antikörpers angewandten Tierart. Dieser zweitü^irper kann entweder in Lösung oder an einem unlöslichen Träger wie Dextran adsorbiert zugegeben Werden.

Beide Arten der Zugabe besitzen !Nachteile. Die Zugabe des zweitetPinrpers der an einem festen Träger adsorbiert ist führt zu Schwierigkeiten bei der Sicherstellung, daß der gesamte Komplex reagiert hat und auf dem Träger ausgefallen ist.

- 5 509831/0530

- 3 - 1A-45 940

Nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeit muß der Träger gründlich ausgewaschen werden, um das markierte Antigen zu entfernen, das physikalisch in dem Träger eingeschlossen und nicht an den Antikörper gebunden sein kann.

Bei Zugabe des zweiten Antikörpers als Lösung werden diese Misch- und Waschprobleme vermieden. Es bildet"sich jedoch eine sehr kleine Menge eines weißen oder durchscheinenden Niederschlags, die nach dem Zentrifugieren nahezu unsichtbar sein kann. Die Unmöglichkeit den festen Niederschlag in dem Proberöhrchen zu sehen, macht es für den Ausführenden schwierig, besonders wenn er keine Erfahrung besitzt, die überstehende Flüssigkeit vor der Messung der Aktivität des Niederschlags zu entfernen. Eine Lösung dieses Problems_/ die versucht wurde_f besteht darin, zusätzliches inertes Serum zuzusetzen, während ein Überschuß des zweiten Antikörpers verwendet wird, um die physikalische Menge des Niederschlags zu vergrößern. Bei dieser Lösung müssen jedoch verhältnismäßig große Mengen teueres Serum und zweite Antikörper zugesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Yerfahren betrifft eine andere (alternative oder zusätzliche) Lösung dieses Problems und umfaßt die Anfärbung des zweiten Antikörpers,, so daß der entstehende Niederschlag gefärbt und dadurch besser sichtbar ist.

Die Erfindung betrifft eine Analyseeinheit für immunologische Bestimmungenj umfassend

a) eine Menge der markierten Form des zu bestimmenden Antigens;

b) eine Menge eines ersten AntikÖrpers₍ der mit dem zu.bestimmenden Antigen reagiert;

c) eine Menge eines zweiten Antikörpers, der mit dem ersten Antikörper-Antigen-Komplex reagiert und ihn aus der Lösung entfernt, und ist dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper in Wasser löslich und künstlich angefärbt ist.

-4-

80 98 3 1/öS 30

- 4 - 1A-45 940

Die Analyseeinheit enthält üblicherweise auch eine Menge des nicht-markierten Antigens zur Standartisierung.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Durchführung einer immunologischen Bestimmung. , das die folgenden Schritte umfaßt:

1·) Inkubieren eines wässrigen G-emisches des zu bestimmenden Antigens, einer markierten Form des Antigens und eines ersten Antikörpers zu dem Antigen in einer solchen Menge_fdie nicht ausreicht mit dem gesamten Antigen zu reagieren und

2.) Ausfällung des ersten Antikörper-Antigen-

Komplexes durch Zugabe eines wässrigen Gemisches aus einer wässrigen Lösung eines zweiten Antikörpers, der mit dem ersten Antikörper-Antigen-Komplex unter Bildung eines Fiederschlags reagiert und ist dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper künstlich angefärbt ist, um einen gefärbten Niederschlag zu erhalten·

Der zweite Antikörper wird - wie es üblich ist - hergestellt, indem inan etwas des ersten körpers einer zweiten Cierart verabreicht. So kann, wenn der erste ßörper gebildet worden ist durch Verabreichung des Antigens an beispielsweise ein Kaninchen der zweite Antikörper gebildet werden durch Verabreichung des Kaninchen-Antikörpers an beispielsweise einen Esel. Das Eselserum wird vorzugsweise behandelt, um die ^" -Globulin-Fraktion abzutrennen, da es nur diese Fraktion ist, die mit dem Kaninchen-Antikörper-Antigen-Komplex einen niederschlag bildet.(Der Niederschlag wird sichtbar gemacht, indem er leuchtend gefärbt ist in einer farblosen Flüssigkeit. Es ist daher nachteilig, wenn Serum-Bestandteile, die in Lösung bleiben, angefärbt³? fⁿDie halbgereinigte /-G-lobulin-Fraktion wird angefärbt, indem sie mit einem geeigneten Farbstoff umgesetzt wird. Die Anfärbung von biologischen Proben zur Sichtbarmachung unter dem UV-Mikroskop ist für pathologische Bakterien und für Immuno-Fluorescenzhtstologische Anfärbuntersuchungen bekannt. Die Art der Farb-

S09831/0S3G - ⁵ ~

- 5 - 1A-45 940

stoffe und des Anfärbeverfahrens ist im allgemeinen für das erfindungsgemäße Verfahren, nicht kritisch und übliche Färbemittel und übliche Färbeverfahren können angewandt werden. Die Anwendung von Fluorescin -isothioeyanat oder Procion Brilliant Rot ist jedoch bevorzugt.

Die Anwendung von Fluoresc In-isothiocyanat zur Markierung von Proteinen ist beschrieben von Rinderknecht in Nature, London 193,(1962), 167-168.

Die Anwendung von Procion-Farbstoffen zur Anfärbung von Proteinen ist beschrieben von Fazekas de St. Groth,S.,Webster, R.G. und Datyner, A. in Biochimica et Biophysica Acta,71(1963),377-91· (Diese Literaturstelle erwähnt besonders die Anwendung von Procion Brilliant Blau RS, aber das Verfahren ist auch auf Procion Rot anwendbar)· ' .

In einigen Fällen wird durch das Anfärbverfahren oder die Bindung des Farbstoffs an die Antikörper, deren Wirksamkeit für immunologische Ausfällreaktionen gehemmt. In solchen Fällen ist es möglich eine Modifizierung des Färbeverfahrens anzuwenden, bei der das wirksame'Zentrum der Antikörper geschützt wird.

1.) Vor dem Färben wird der zweite Antikörper z.B. Antikaninchen-jj^-Globulin gereinigt durch Extraktion auf eine feste Phase, enthaltend den ersten Antikörper z.B. Kaninchen^-Globulin. Die feste Phase kann aus Sepharose oder G'lasteilchen bestehen.

'2.) Die feste Phase wird gewaschen um alle nicht-gebundenen Proteine zu entfernen und dann bei dem gewünschten pH-Wert mit^! · dem Farbstoff vermischt. Sowohl das an die feste Phase gebundene Kaninchen-Gldbulin als auch der zweite Antikörper werden angefärbt, aber da sie aneinander gebunden sind, werden die ·■ aktiven Stellen des Antikörpers vor der Färbung geschützt.

3.) Überschüssiger Farbstoff wird .zusammen mit "zerstörtem Antikörper", der seine Fähigkeit mit unbeweglich gemachtem

-6-5G9831/G53G

- β - 1Α-45 940

bzw. immobilisiertem Kaninchen-.Mxlobulin Bindungen einzugehen _;verloren hat,

4.) Der gefärbte zweite Antikörper wird dann von der festen Phase durch einen niedrigen pH-Wert und hohen Salzgehalt eluiert. Die feste Phase wird verworfen· Der so hergestellte zweite Antikörper ist angefärbt worden, während seine aktiven Bindungsstellen für Kaninchen-^-Globulin blockiert waren und daher vor der Anfärbung geschützt.

Die immunologische Reaktionsfähigkeit dieser Zubereitung sollte nicht verschlechtert sein und der Antikörper sollte ebenso gut wie der natürliche zweite Antikörper reagieren. Die Art des Antigens ist nicht kritisch. Die Erfindung ist anwendbar auf irgendein Antigen, das durch ein immunologisches Doppelantikörper-Verfahren bestimmt werden kann. Typische Gruppen von Antigenen umfassen Steroide, Proteinhormone und Peptide, Eine Liste von geeigneten Antigenen ist in dem oben erwähnten Artikel von Ya low and Berson erwähnt. Die Anwendung von gefärbten zweiten Antikörpern ist besonders günstig zur Bestimmung von menschlichen Wachstumshormonen, die Schilddrüse

stimulierenden Hormonen, luteinisierenden Hormonen und besonders Pollicel stimulierenden Hormonen.(FSH).

Die Art durch die das Antigen markiert ist ist nicht kritisch. Das wird am günstigsten erreicht durch ein radioaktives Isotop, aber eine Enzymmarkierung ist ebenfalls wahlweise möglich.

Da lösungen der verschiedenen Reageh 1ien. häufig nicht über längere Zeiten stabil sind^ ist es bevorzugt,- das Reagens in Form von trockenen, z.B. gefriergetrockneten Peststoffen zur Verfügung zu stellen, die mit Wasser unter Bildung gepufferter Lösungen rekonstituiert werden können. Es kann bevorzugt sein_; das markierte Antigen das nicht-markierte Antigen-soweit erforderlich- und den ersten Antikörper in einzelnen Prüfröhrchen vorher zu "verteilen.

-7-509831/0530

!?■!■:■■■■

- 7 - 1A-45 940

Die Anwendung eines gefärbten zweiten Antikörpers anstelle eines weißen oder farblosen ändert die Mengenverhältnisse der Reagentien und die anderen Bedingungen des immunologischen Bestimmungsverfahrens nicht.

Bei einem Versuch wurde die '"-Globulin-Fraktion von Esel-Serum, enthaltend Antikörper gegen den ersten Antikörper, der bei einem immunolgischen Bestimmungsverfahren von ISH angewandt wird auf einer Protein-Konzentration von 1 Gew.-fo bei einem pH-Wert von 9 gehalten mit Hilfe eines Hatriumbicarbonat-Natriumchlorid-Pufferj;. 1; bis 10 mg Procion Brilliant Rot Farbstoff wurden auf 100 mg Protein zugegeben. Die Färbung war nach 30 min vollständig. Eicht gekuppelter Farbstoff wurde entfernt, indem man die Lösung durch ein quaternäres Ammonium-Polystyrol-Ionenaustauscherharz in Chloridform leitete, Das entstehende angefärbte ß-Globulin wurde als zweiter Antikörper nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt bei einem sonst üblichen immunologischen Bestimmungsverfahren von FSH. Man erhielt einen gefärbten Niederschlag, der nach dem Zentrifugieren in dem Reagensglas deutlich sichtbar war.

Vergleich der Wirksamkeit van gefärbtem (rosa) zweiten Antikörper mit natürlichem (farblosen) zweiten Antikörper.

Es wurden zwei immunologische Bestimmungen von FSH folgendermaßen durchgeführt: ·

1.) Standard Reagensglaser: 2QO/ul FSH Standardlösung geeigneter Verdünnung -+· 200 «1 einer lösung von Anti-FSH-serum«, .

2.) Vergleichsserum-Reagensgläser: 200 «1 Vergleichsserum ·+> 200 «1 Lösung von Anti-FSH-Serum.

3.) Alle Reagensgläser wurden 16 bis 20 h bei Raumtemperatur inkubiert.

4.) 20OyUl mit ^J markierter FSH-Lösung wurden zu allen Reagensgläsern gegeben.

-8-509831/0530

- 8 - 1A-45 940

5·) Die Reagensgläser wurden 6 bis 8 Ii bei Raumtemperatur inkubiert.

6,) Bei einer Bestimmumr'wurden 100 ml einer lösung von gefärbtem zweiten Antikörper ( in geeigneter Verdünnung) zu jedem Reagensglas gegeben.

Bei der anderen Bestimmung (B) wurden 100 ml einer lösung von natürlichen:» farblosen Antikörper (ebenfalls in entsprechender Verdünnung) zu jedem Reagensglas gegeben.

7·) Es wurde über lacht bei 2 bis 4⁰C inkubiert,

8.) 1,0 ml Wasser wurde in alle Reagensgläser gegeben und 30 min mit 2000 g zentrifugiert.

9.) Die überstehende Flüssigkeit wurde aus dem Reagensgläsern abgesaugt. Das konnte bei Bestimmung A leicht durchgeführt werden ohne die Gefahr^ den gefärbten niederschlag mit zu entfernen, da dieser deutlich sichtbar war. Das Absaugen der überstehenden Flüssigkeit über den farblosen niederschlagen ■bei Bestimmung B konnte nicht so leicht und sicher durchgeführt werden, da die niederschlage nahezu unsichtbar waren. Als Alternative zu dem Absaugen kann die überstehende Flüssigkeit abdekantiert oder die umgedrehten Reagensgläser über einem Kissen von Adsorptionspapier (Filterpapier) entwässert werden,» Die Gläser deren niederschlag während der Entfernung der Lösung verrutscht war urnd aus den Reagensgläsern, verloren gegangen war, konnten leicht bei der Bestimmung A identifiziert werden, da die niederschlage gefärbt und leicht sichtbar waren und eine Korrektur ermöglichten,während im .Falle der Bestimmung B es nahezu nicht möglich war,festzustellen, wenn die farblosen niederschlage aus den Reagensglaserη verloren gingen.

10.) nach Entfernung der überstehenden Flüssigkeiten wurde die Radioaktivität in den Reagensgläsern gemessen und die Standardkurven für jede Bestimmung aufgestellt. Die FSH-Konzentration der Vergleicbssera wurde durch Interpolation erhalten. Die Bestimmungen A und B ergaben vergleichbar Ergebnisse für jedes Vergleichsserum. Patentansprüche

⁶²⁴³ 509831/0630

Claims

Pa tentansprüche

1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung mit Hilfe der folgenden Schritte:

a. Inkubation eines wässrigen Gemisches des zu bestimmenden Antigens, einer markierten Eorm des Antigens und eines ersten Antikörpers zu dem Antigen in einer solchen Menge, die nicht ausreicht, um mit dem gesamten Antigen zu reagieren,, und

b. Ausfällung eines ersten Antikörper-Antigents-Komplexes durch Zugabe einer wässrigen Lösung eines zweiten Antikörpers zu dem wässrigen Gemisch, der'mit dem erwähnten ersten Antikörper-Antigen-Komplex unter Bildung eines Niederschlags reagiert, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweiten Antikörper einen künstlich angefärbten verwendet. ■

g e k e η η -

2. Verfahren .nach Anspruch 1, dadurch zeichnet, daß man als Antigen menschliches Wachstumshormon, Schilddrüsen-stimulierendes Hormon,luteinisierendes Hormon oder Follikel -stimulierendes Hormon verwendet.

3. Analyseneinheit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch-1 oder 2 enthaltend

a) eine Menge einer markierten Eorm des zu bestimmenden ' " Antigens;

b) eine Menge eines ersten Antikörpers, der mit dem zu bestimmenden Antigen reagiert;

c) eine Menge eines .zweiten Antikörpers, der mit dem ersten Antikörper-Antigen-Komplex reagiert und ihn aus der Lösung ■ entfernt, dadurch gekennze.ichnet , daß der

509831/Ö53G

24618 Π

-Jt- 1A-45 940

zweite Antikörper in Wasser löslich und künstlich angefärbt ist.

4. Analyseneinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich nicht-markiertes Antigen enthält.

5. Analyseneinheit nach Anspruch 1 oder 2, ,dadurch gekennzeichnet , daß der zweite Antikörper durch Fluoresc in-isothiocyanat oder Prcion Brilliant Rot angefärbt ist.

6. Analyseneinheit nach Anspruch 3 bis 5» dadurch gekennzeichnet , daß die aktiven Stellen des zweiten Antikörpers während der Färbung geschützt worden sind, indem man den zweiten Antikörper an den ersten Antikörper gebunden, in gebundenem Zustand gefärbt und den gefärbten zweiten Antikörper von dem ersten .ferper abgetrennt hat.

7. Analyse»einheit nach Anspruch 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen Humanwachstumshormon, Schilddrüsen-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon oder lOlli'kel-stimulierendes Hormon ist.

509831/0530