DE2736950A1 - Verfahren und vorrichtung zum messen der konzentration von molekuelen mit einem selektiven spektrum in einer probensubstanz - Google Patents
Verfahren und vorrichtung zum messen der konzentration von molekuelen mit einem selektiven spektrum in einer probensubstanzInfo
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Description
Cf
I PHN 8572
° 8.8.1977
H.V. Philips' biueüa:i.ptvi;u.j..C;Xii, tina.'x-van vers/cb
Verfahren und Vorrichtung zum Messen der Konzentration vonMolekülen-mit einem selektiven Spektrum in einer
Probensubs tanz.
Die Erfindung, bezieht sich auf ein
Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen der Konzentration von Molekülen mit einem selektiven Spektrum
in einer Probensubstanz.
Viele organische Moleküle (z.B. Phenolmoleküle) weisen namentlich sowohl sehr
selektive Absorptionsaspekten als auch sehr selektive Fluoreszenz- oder Ph'jsphorezenz-Emissionsaspektren,
d.h. Spektren mit stark, akzentuierten Vorder- und Hinterflanken, auf.
Ein übliches Verfahren zum Messen der Konzentration von Mokeülen dieser Art in einer
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Probensubstanz (gewöhnlich einer wässerigen Lösung dieser Moleküle) besteht insbesondere darin,
dass die Probe monochromatischem Anregungslicht mit einer Wellenlänge ausgesetzt wird, die im Absorptionsspektrum
des Moleküls liegt, und dass dann das entsprechende von der Probenflüssigkeit emittierte
Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht mit einer höheren Wellenlänge ausgefiltert und aufgefangen
und schliesslich die Intensität des aufgefangenen Lichtes gemessen wird. Die gemessene Intensität
gibt insbesondere eine Anzeige über die Konzentration der zu prüfenden Moleküle in der Probensubstanz.
Obgleich das genannte Verfahren verschiedene Vorteile aufweist, wodurch es anderen
möglichen Verfahren vorzuziehen ist, hat dieses Messverfahren den Nachteil, dass bei der Messung
Ungenauigkeiten infolge der unvermeidlich dem Nutzsignal
überlagerten Störsignale, die von Streulicht und/oder von unerwünschtem Fluoreszenz- oder
Phosphoreszenzlicht herrühren, das von Spuren anderer ±i der Probensubstanz vorhandener Moleküle
emittiert wird, nicht berücksichtigt werden.
Die Vorliegende Erfindung bezweckt, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen,
durch die es möglich wird, die Konzentration von
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Phenolmolekülen zu messen, ohne dass Ungenauigkeiten
infolge dem Nutzsignal überlagerter Störsignale, die bei Anregung von den zu prüfenden
Molekülen emittiert werden, auftreten.
Die Erfindung schafft ein Messverfahren, das darin besteht, dass die Probensubstanz
monochromatischem Anregungslicht einer ersten Art ausgesetzt wird, dessen Wellenlänge innerhalb
des Absorptionsspektrums der zu messenden Moleküle liegt; dass eine erste Lichtemission der Probensubstanz
ausgefiltert und aufgefangen wird, deren Wellenlänge innerhalb des Emissionsspektrums der
Moleküle liegt, und dass die Intensität des aufgefangenen monochromatischen Lichtes bestimmt wird,
während bei diesem Verfahren anschliessend die Probensubstanz monochromatischem Anregungslicht
einer zweiten Art ausgesetzt wird, dessen Wellenlänge in der Nähe der des monochromatischen Lichtes
der genannten ersten Art, aber ausserhalb der Absorptions- und Emissionsspektren der Moleküle liegt,
dann eine entsprechende zweite Lichtemission der Probensubstanz ausgefiltert und aufgefangen wird,
deren Wellenlänge gleich der der ersten Lichtemission ist, und schliesslich die neue Intensität
des aufgefangenen Lichtes bestimmt und diese von der
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zuerst genannten Intensität subtrahiert wird, um ein nützliches monochromatisches Lichtsignal zu
erhalten, das irei von Störsignalen infolge von Streulicht oder von unerwünschtem Fluoreszenz- oder
Phosphoreszenzlicht ist, das von Spurenanderer in der Probensubstanz vorhandener Moleküle emittiert
wird.
Die Messvorrichtung nach der
Erfindung enthält einen Anregungsmonochromator, der dazu eingerichtet ist, die Probensubstanz einer
ersten und dann einer zweiten Art monochromatischen Anregungslichtes auszusetzen, deren Wellenlängen
nahe beieinander, aber innerhalb des Absorptionsspektrums der zu prüfenden Moleküle bzw. ausserhalb
der Absorptions- und Emissionsspektren derselben Moleküle liegen; einen Auffangmonochromator, der
dazu eingerichtet ist, die entsprechenden von der Probensubstanz ausgesandten Emissionen auszufiltern
und aufzufangen, deren Wellenlänge innerhalb des Emissionsspektrums der Moleküle liegt, sowie
elektronische Verarbeitungsmittel, die dazu eingerichtet sind, die Intensitäten, die diesen Emissionen
entsprechen, zu bestimmen und voneinander zu subtrahieren.
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daher im wesentlichen ein Verfahren und eine Vorrichtung, die auf der Anwendung zweier monochromatischer
Anregungslichtarten statt einer einzigen monochromatischen Lichtart basieren, wobei die Wellenlängen
dieser Lichtarten nahe beieinander liegen, und wobei eine dieser Wellenlängen, die innerhalb des Absorptionsspektrums der zu prüfenden Moleküle liegt, die
Emission monochromatischen Fluoreszenz- oder Phospho
resenzlichtes herbeiführt, das das Nutzsignal bildet
und dem unvermeidlich Störsignale infolge von Streulicht und von gegebenenfalls von Spuren anderer
Moleküle emittiertem Fluoreszenz oder Phosphoreszenzlicht überlagert sind, während die andere Wellenlänge,
die ausserhalb der Absorptions- und Emissionsspektren
der zu prüfenden Moleküle liegt, nur die Emission eines
StörB-chtsignals infolge von Streulicht und gegebenenfalls von Spuren anderer Moleküle emittiertem Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht herbeiführt. Da die
Störsignale für beide Anregungswellenlängen gleich (oder im wesentlichen gleich) sind, wird es klar
sein, dass, wenn die zwei aufgefangenen Lichtsignale voneinander subtrahiert werden, die Störsignale sich gegenseitig ausgleichen und auf diese
Weise das Nutzsignal abgetrennt wird, das die wirksame Konzentration der zu prüfenden Moleküle in der
Probensubstanz darstellt. Die doppelte monochroma-
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tische Anregung nach der vorliegenden Erfindung ermöglicht es also, die Ungenauigkeitsfaktoren, die
bei dem bekannten einfachen monochromatischen Anregungsverfahren auftreten, zu beseitigen.
Wie bereits erwähnt wurde, weist die zweite Art monochromatischen Anregungslichtes
eine Wellenlänge auf, die der der ersten Art monochromatischen Anregungslichtes nahe, aber ausserhalb
der Absorptions- und Emissionsspektren der zu prüfenden Moleküle liegt. In der Praxis muss die
Wellenlänge der zweiten Art monochromatischen Lichtes vorzugsweise innerhalb des Raumes zwischen den
beiden Spektren liegen, wenn sowohl Störsignale infolge von Streulicht als auch Störsignale infolge
störenden Lichtes, das von Spuren anderer in der Probensubstanz vorhandener Moleküle emittiert wird,
beseitigt werden solen, während diese Wellenlänge gerade grosser als die maximale Wellenlänge der
Emissionsspektren der zu prüfenden Moleküle sein muss, wenn es nur erforderlich ist, Störsignale infolge
von Streulicht zu beseitigen, oder wenn es vom technischen Standpunkt nicht möglich ist, Anregung mit der
zweiten Art monochromatischen Lichtes bei einer Wellenlänge zwischen den beiden Spektren durchzuführen.
Da diese Spektren gewöhnlich etwa 30 n»
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voneinander entfernt sind, wird der Abstand zwischen den zwei Anregungswellenlängen daher
zwischen etwa 15 und etwa 6O nm variieren. Meistens wird es sich nicht um gesonderte Wellenlängen,
sondern um sehr schmale Wellenlängenbänder handeln, die zwischen O,1 und 10 nm variieren können.
Abhängigkeit von der Art zu.· prüfender Moleküle und von verschiedenen anderen Bedingungen in
bezug auf Aufbau und Betrieb. Ebenso .wird die abgetrennte und aufgefangene Wellenlänge für das von
der Probensubstanz emittierte Fluoreszenz» oder Phosphoreszenzlicht nicht einen einzigen Wert aufweisen,
sondern wird in der Praxis aus einem schmallen Wellenlängenband bestehen, das zwischen 1 und 100 nm
variieren kann, in Abhängigkeit von den besonderen Bedingungen.
Vorzugsweise werden die zwei Arten monochromatischen Anregungslichtes sehr schnell
nacheinander emittiert, um es gegebenenfalls zu ermöglichen, Messungen an fliessenden Proben, d.H. an
Proben, die in bezug auf die Messvorrichtung in Bewegung sind, vorzunehmen. Namentlich variiert die
Zeitverzögerung vorzugsweise zwischen 0,1 und 10/Usec.
Es ist einleuchtend, dass sich dabei einige Probleme in bezug auf die Wahl des geeignetsten
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Monochroraators ergeben, weil die meisten käuflich erhältlichen Monochromatoren, die
verschiedene bewegbare Teile besitzen, nicht dazu benutzt werden können, von einer Wellenlänge
auf die andere umzuschalten. Nach der Erfindung wird dieses Problem vorzugsweise durch die
Anwendung eines völlig statischen Monochromators (bei dem von sehr schnell wechselnder Beleuchtung mit
zwei Lampen ausgegangen wird) gelöst, wie in der italienischen am 17· Oktober 1973 eingereichten
Patentanmeldung Nr. 30228/A 73 (PHN 7228) beschrieben ist, auf die für nähere Einzelheiten verwiesen
wird.
Die Erfindung wird nachstehend beispielsweise an Hand der Zeichnung näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Ubersiht einer Messvorrichtung nach der Erfindung,
Fig. 2 dieselbe Vorrichtung in detaillierterer Form,
Figuren 3 und k die Lage der
Anregungswellenlänge und der Fluoreszenz- oder
Phosphoreszenz-Emissionswellenlänge in bezug auf die Absorptions- und Emissionsspektren der zu
prüfenden Moleküle, wenn alle Störsignale unter-
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drückt werden bzw. wenn nur Störsignale infolge von Streulicht unterdrück: werden, und
Signalformen zur Illustrierung der Wirkung der Vorrichtung.
Zeichnung und insbesondere in den Figuren 1 und 2 dargestellt ist, enthält einen Anregungsmonochroma tor 1, eine Probenzelle 2, die die Probensubstanz 3 enthält, in der die Konzentration bestimmter
Moleküle mit einem selektiven Spektrum gemessen werden muss (z.B. ein Phenol in einer wässerigen
Losung), einen Messmonochromator h und schliesslich
eine analoge, digitale oder kombiniert analoge/ digitale elektronische Verarbeitungsvorrichtung 5·
Der Anregungsmonochromator ist vom statischen Typ, wie in der italienischen am 17·
Oktober 1973 eingereichten Patentanmeldung Nr. 30228 A/73 (PHN 7228) beschrieben ist, und
enthält zwei Lampen 6 nnd 7» die wechselweise schnell nacheinander (wiederholte Male) aufleuchten, um das entsprechende monochromatische
Anregungslicht 8 und 9 (Fig* 2) in sehr schneller zeitlicher Reihenfolge (0,1 bis 10 yusec.) und
mit Wellenlängen "ΚΛ und A„, die ebenfalls sehr
ν ι α
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nahe beieinander (15 bis 60 mn voneinander) liegen, zu erhalten.
Es wird angenommen, dass die zu prüfenden Moleküle ein /Absorptionsspektrum S
SL und ein Emissionsspektrum S aufweisen, wie in den
Figuren 3 und k dargestellt ist, was mit einem
konstanten Streulicht L, und mit etwaigen sekundären
Spektren s und s (Fig. 3) infolge von Spuren anderer Cl ©
Moleküle in derselben Substanz einhergeht. Wenn die Wellenlänge Λ -· einer
ersten Art monochromatischen Anregungslichtes im wesentlichen mit der Mitte des Absorptionsspektrums
S zusammenfällt, was tatsächlich der Fall ist,
Si
werden die Moleküle dann angeregt und emittieren entsprechendes Fluoreszenz- (oder Phosphoreszenz)
licht mit einer entsprechenden Wellenlänge /\ot
die im wesentlichen mit der Mitte des Emissionsspektrums S zusammenfällt. Der genannten Licht-
emission mit einer Wellenlänge A_ ist eine bestimmte
Art Streulicht L, überlagert und in gewissen Fällen wird sekundäres Licht infolge des Anregungseffekts
emittiert, der durch das Licht mit einer Wellenlänge
X1 bestimmt wird, das auf etwaige ebenfalls in
der Probensubstanz vorhandene Spuren von MAekülen
mit den Spektren s und s fällt.
Sl ©
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Das so emittierte Lichtsignal
mit einer Wellenlänge \ „, das in Fig. 2 mit der
Bezugsziffer 10 bezeichnet ist und in der Praxis aus einem Nutzsignal infolge monochromatischen
von den zu prüfenden Molekülen emittierten Lichtes und einem diesem Licht überlagerten Störsignal
infolge des Auftretens von Streulicht und gegebenenfalls von von Spuren anderer Moleküle emittiertem
monochromatischem Licht besteht, wird von dem Messmonochromator k ausgefiltert und aufgefangen, der
für diesen Zweck ein Eingangsfilter 11 mit einem sehr schmalen Band, das um Ä„ zentriert ist; einen
verstellbaren Spiegel 12 und einen Photovervielfacher 13 enthält, der dazu dient, das schwache Lichtsignal
10 in ein verstärktes elektrisches Signal 14 umzuwandeln
(Fig. 2).
Während die Wellenlänge A« der
ersten Art monochromatischen Anregungslichtes im wesentlichen in der Mitte des Absorptionsspektrums
S des zu prüfenden Moleküls liegt, ist die Wellenlänge /\p der zweiten Art monochromatischen
Anregungslichtes ausserhalb des genannten Absorptinnsspsrktrums, und zwar zwischen den zwei Spektren
S. und S (Fig. 3) oder auf einem Wert gelegen, der
grosser als S0 ist (Fig. k). Diese zweite Art kann
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daher die zu prüfenden Moleküle nicht derart anregen, dass, wie im Falle von Αλ* diese
Moleküle Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht mit einer Wellenlänge X„ emittieren, aber sie
kann wohl ein Störlichtsignal 15 mit einer Wellenlänge \ „ (Fig. 2) an den Messmonochromator h
liefern, wobei dieses Signal exakt mit der Störkomponente des Signals 10 zusammenfällt, die durch
die vorhergehende Anregung mit einer Wellenlänge /L bestimmt wird und im Fall der Fig. 3 sowohl das
Streulicht als auch das monochromatische von Spuren von Molekülen mit den Spektren s und s emittierte
a e
Licht und im Falle von Fig. h nur Streulicht darstellt.
Das genannte Störlichtsignal 15 wird mittels des Filters 11 ausgefiltert und in ein
entsprechendes elektrisches Signal 16 mittels des Photovervielfachers 13 umgewandelt, der zwei
Signale liefert, die mehrere Male zeitlich schnell aufeinander folgen, und zwar ein Signal 14 infolge
von Anregung mit der Wellenlänge ^11 das aua dem
Nutzsignal und einem diesem Signal überlagerten Störsignal besteht, und ein Signal 16 infolge
von Anregung mit der Wellenlänge A2» das nur aus
einem Störsignal mit einem Wert gleich dem des im Signal 14 vorhandenen Störsignals besteht.
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η
8
Die genannten Signale i4 und
16, die naturgemäss verschiedene Amplituden aufweisen,
sind in Fig. 5 durch die Signalform C graphisch dargestellt, wobei die Signalform A
das Muster der monochromatischen Anregungssignale 8 und 9» die naturgemäss gleiche Amplituden
aufweisen, und die Signalform B das Muster der elektrischen Signale 17 und 18 darstellt, die von
einer Photodiode 19 erzeugt werden(Figuren 1 und
2) und die vorher bestimmten Bruchteile 20 und 21 der monochromatischen Anregungssignale 8 und 9 darstellen.
Sowohl die Reihenfolge elektrischer Emissionssignale i4und 16 als auch die Reihenfolge
elektrischer Bezugssignale 17 und 18 werden von dem Photovervielfacher 13 bzw. von der Photodiode 19
der elektronischen Verarbeitungsvorrichtung 5 zugeführt, in der zwei Speicherverstärker 22 und 23»
die auch unter der Bezeichnung "Pufferspeicher" bekannt sind, diese Signale verstärken und speichern.
Die genannten Reihenfolgen von Signalen werden dann in einer Signalnormalisiervorrichtung 2k verglichen,
die die emittierten Lichtsignale 14 und 16 mit den das Anregungslicht 17 und 18 darstellenden Signalen
vergleicht und die Ausgangssignale 25 und 26 liefert,
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die völlig den Signalen 1U und \6 entsprechen,
aber in bezug auf die etwaigen kleinen Änderungen in der Stärke des vom Monochromator 1 emittierten
Anregungslichtes kompensiert sind.
Die normalisierten Signale 25 und 16 werden dann in einem Integratorteiler 27
integriert, der den Mittelwert aller Signale 25 und aller Signale 26 bestimmt, wodurch die mittleren
Signale 28 bzw. 29 erhalten werden, die frei sind von kleinen Änderungen infolge geringer Änderungen
in der Wirkung der Teile der Vorrichtung, von denen sie erzeugt sind, insbesondere des Photovervielfachers
13, der gewöhnlich auf dem Zählen von Photonen basiert.
Schliesslich werden die mittleren Signale 28 und 29, die ebenfalls gesondert auf den
Ausgangswiedergabevorrichtungen 30 bzw. 31 sichtbar gemacht werden können, verglichen und das zweite
Signal wird von dem ersten in einem Differentiator 32 subtrahiert, der ein einziges Ausgangssignal 33
liefert, das von einer (analogen oder digitalen) Ausgangswiedergabevorrichtung "}h sichtbar gemacht
wird.
Da das Signal 28 das nützliche
monochromatische Emissionssignal der zu prüfenden Moleküle mit einem überlagerten Störsignal darstellt,
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das durch das Streulicht und durch etwaiges monochromatisches Störlicht bestimmt wird,
das von Spuren anderer Moleküle, die sich in der Probensubstanz befinden, emittiert wird, und
da das Signal 29 nur das genannte Störsignal darstellt (mit demselben Wert) wird es klar sein,
dass das Ergebnis der im Differentiator 32 durchgeführt
sn Subtrahierbearbeitung das gewünschte Nutzsignal ist, das völlig frei von überlagerten
Störsignalen ist·. Das genannte Nutzsignal ist in Fig. 5 durch die Signalform D dargestellt.
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Claims (7)
- I PHN 8572 8.8.1977PATENTANSPRUECHE :
.— \vi·^ Verfahren zum Messen der Konzentration von Molekülen mit einem selektiven Spektrum in einer Probensubstanz, dadurch gekennzeichnet, dass die Probensubstanz monochromatischem Anregungslicht einer ersten Art ausgesetzt wird, dessen Wellenlänge innerhalb des Absorptionsspektrums der zu prüfenden Moleküle liegt; dass eine erste Lichtemission der Probensubstanz ausgefilert und aufgefangen wird, deren Wellenlänge im Emissionsspektrum der Moleküle JLegt, und dass die Intensität des aufgefangenen monochromatischen Lichtes bestimmt wird, während bei diesem Verfahren anschliessend die Probensubstanz monochromatischem Anregungslicht einer zweiten Art ausgesetzt wird, dessen Wellenlänge in der Nähe der Wellenlänge dsr ersten Art monochromatischen Lichtes, aber ausserhalb der Absorptions- und Emissionsspektren der Moleküle liegt, dann eine entsprechende zweite Lichtemission der Probensubstanz ausgefiltert und aufgefangen wird, deren Wellenlänge gleich der der ersten Lichtemission ist, und anschliessend die neue Intensität des aufgefangenen Lichtes bestimmt und von der zuerst genannten Intensität subtrahiert wird, um ein nützliches monochromatisches Lichtsignal zu erhalten, das809810/0678ORIGINAL INSPECTEDIPHN 8572 8.8.1977frei von Störsignalen infolge von Streulicht oder von unerwünschtem Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzlicht is.-t, das von Spuren anderer in der Probensubstanz vorhandener Moleküle emittiert wird. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte zweite Art monochromatischen Anregungslichtes eine Wellenlänge aufweist, die zwischen den Absorptions- und Emissionsspektren der Moleküle liegt.
- 3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte zweite Art monochromatischen Anregungslichtes eine Wellenlänge aufweist, die grosser als die innerhalb des Emissionsspektrums der Moleküle liegenden Wellenlängen ist.
h» Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder - 3, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der ersten und der zweiten Art monochromatischen Anregungslichtes ein Zeitintervall von 0,1 bis 10/Usec. liegt.
- 5· Vorrichtung zum Messen derKonzentration von Molekülen mit einem selektiven Spektrum in einer Probensubstanz, dadurch gekennzeichnet, dass sie enthält : einen ersten Monochromator, der dazu eingerichtet ist, die Probensubstanz809810/0678I PHN 8572 8.8.1977einer ersten und dann einer zweiten Art monochromatischen Anregungslichtes auszusetzen, deren Wellenlängen nahe beieinander, aber innerhalb des Absorptionsspektrums der zu messenden Moleküle bzw. ausserhalb der Absorptions- und Emissionsspektren der Moleküle liegen; einen zweiten Monochromator, der dazu eingerichtet ist, die entsprechenden von der Probensubstanz emittierten Lichtemissionen auszufiltern und aufzufangen, deren Wellenlänge innerhalb des Emissionsspektrums dee Moleküls liegt, sowie elektronische Verarbeitungsmittel, die dazu eingerichtet sind, die Intensitäten, die diesen Emissionen entsprechen, zu bestimmen und voneinander zu subtrahieren.
- 6. Vorrichtung nach Anspruch 5tdadurch gekennzeichnet, dass der genannte zweite Monochromator ein Eingangsfilter mit einem schmalen Band und einen Photovervielfacher zur Verstärkung und Umwandlung der von der Probensubstanz emittierten Lichtintensitäten enthält, die von dem genannten Eingangsfilter ausgefiltert werden, um entsprechende elektrische Emissionssignale zu erhalten.
- 7. Vorrichtung nach Anspruch 5t oder6, dadurch gekennzeichnet, dass die elektronischen Verarbeitungsmittel809810/0678I PHN 8572 8.8.1977enthalten: Speichermittel für die genannten elektrischen Emissionssignale und für weitere elektrische, die Anregungslichtintensitäten darstellende Signale; Signalnormalisierungsmittel zum Vergleichen der genannten elektrischen Emissionssignale und der genannten weiteren elektrischen Signale zum Erhalten normalisierter Signale, dje für Änderungenin der Intensität des Anregungslichtes unempfindlich sind; Integrationsteilermittel zur Bestimmung des Mittelwertes der normalisierten von der ersten Art. monochromatischen Anregungslichtes abgeleiteten Signale und der normalisierten von der zweiten Art monochromatischen Anregungslichtes abgeleiteten Signale, sowie Differentiermittel, mit deren Hilfe das mittlere von der zweiten Art monochromatischen Anregungslichtes abgeleiteten Signale, von dem mittleren von der ersten Art monochromatischen Anregungslichtes abgeleiteten Signal subtrahiert wird, um ein einziges Signal zu erhalten, das das nütäiche monochromatische Lichtsignal darstellt, das von den zu prüfenden Molekülen emittiert wird.809810/0678
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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8128 | New person/name/address of the agent |
Representative=s name: HARTMANN, H., DIPL.-ING., PAT.-ASS., 2000 HAMBURG |
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8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |