DE68912156T2

DE68912156T2 - Fluoreszenz-Spektralphotometer und dafür verwendetes Verfahren zur Festlegung der Wellenlänge.

Info

Publication number: DE68912156T2
Application number: DE89103100T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Koshi; Hisako Minegishi; Takayuki Ono; Minoru Owada
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1988-02-24
Filing date: 1989-02-22
Publication date: 1994-04-28
Anticipated expiration: 2009-02-23
Also published as: JPH073366B2; DE68912156D1; US4957366A; EP0330183A2; EP0330183B1; JPH01214723A; EP0330183A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenz-Spektralphotometer gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1 sowie ein Wellenlängeneinstellverfahren hierfür, das dazu geeignet ist, die Anregungswellenlänge und die Fluoreszenzwellenlänge auf ihre optimalen Werte einzustellen.
Bei einem Fluoreszenz-Spektralphotometer betreffen die grundlegendsten Meßzustände die Anregungswellenlänge und die Fluoreszenzwellenlänge. Um diese einzustellen, ist eine aus dem Stand der Technik bekannte Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff von Anspruch 1, der in US-A-4,330,207 offenbart ist, so aufgebaut, daß entweder die Anregungswellenlänge oder die Fluoreszenzwellenlänge festgelegt wird, während die andere durchgetastet wird und so eingestellt wird, daß der Maximalwert für das von einer Probe erhaltene Spektrum erzielt wird.
Jedoch beruht die oben beschriebene Technik aus dem Stand der Technik auf der Überlegung, daß die optimale Wellenlänge für eine Probe die Wellenlänge für die größte Signalspitze im Spektrum der Probe ist. Dieser Überlegung haftet für den Fall kein Mangel an, daß die Konzentration der Probe hoch ist und die Probe starke Fluoreszenz abstrahlt. Wenn jedoch die Konzentration niedrig ist oder die von der Probe abgestrahlte Fluoreszenz schwach ist, sind Spitzenwerte aufgrund von Raman-Streuung von Licht durch das Lösungsmittel, Streulicht höherer Ordnung des Anregungslichts usw. größer als diejenigen aufgrund der Fluoreszenz, und die optimale Wellenlänge ist nicht immer die Wellenlänge der maximalen Signalspitze. Ursprünglich wird ein Fluoreszenz-Spektralphotometer häufig zum Zweck hochempfindlicher Analyse verwendet und in vielen Fällen ist die Fluoreszenz der Probe schwach. Aus diesem Grund bestand ein Problem dahingehend, daß, so lange nicht die Bedienperson deutlich erkennt, daß die optimale Wellenlänge nicht immer die Wellenlänge der maximalen Signalspitze ist, die Funktion des automatischen Einstellens der optimalen Wellenlänge eher zu fehlerhaftem Betrieb beim Einstellen der Meßbedingungen führt.
SPACE LIFE SCIENCES, Vol. 3, 1972, Seiten 360-373 offenbart ein Fluoreszenzspektrometer, das es ermöglicht, entweder die Anregungswellenlänge oder die Fluoreszenzwellenlänge festzulegen und die andere Wellenlänge durchzutasten. Um die obigen Nachteile zu vermeiden, wird die Verwendung eines Polarisators vorgeschlagen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Hauptaufgabe der Erfindung ist es, ein Fluoreszenz- Spektralphotometer anzugeben, das dazu in der Lage ist, fehlerhaften Betrieb zu verhindern, und das die Anregungswellenlänge und die Fluoreszenzwellenlänge auf die optimale Wellenlänge einstellen kann, und ferner ein Wellenlängeneinstellverfahren für das Fluoreszenz-Spektralphotometer anzugeben, durch das die optimale Wellenlänge leicht eingestellt werden kann.
Die Signalspitzenwellenlänge aufgrund von Fluoreszenz hängt nicht von Änderungen der Anregungswellenlänge ab, die nur zu Änderungen des Ausmaßes der Fluoreszenz führt. Wenn sich dagegen die Anregungswellenlänge ändert, ändern sich die Signalspitzenwellenlängen aufgrund von Raman-Streulicht durch das Lösungsmittel, das Streulicht höherer Ordnung usw. entsprechend. Ein Hauptmerkmal dieser Erfindung besteht darin, daß einem solchen Unterschied der Wellenlängenänderungen Beachtung geschenkt wird, wobei die Wellenlänge entweder eines anregungsseitigen Spektroskops oder eines fluoreszenzseitigen Spektroskops auf eine beliebige erste Wellenlänge festgelegt wird und das erste Spektrum gemessen wird, wenn das andere nach der Wellenlänge durchgestimmt wird, woraufhin die Wellenlänge des einen auf eine zweite Wellenlänge eingestellt wird, die sich von der ersten unterscheidet, und das zweite Spektrum erneut gemessen wird, wenn das erste nach der Wellenlänge abgestimmt wird, die Signalspitzenwellenlänge des ersten Spektrums mit der des zweiten Spektrums verglichen wird, und die Anregungs- oder Fluoreszenzwellenlänge eingestellt wird, wobei diejenige Signalspitzenwellenlänge, für die in etwa Übereinstimmung herrscht, als Signalspitzenwellenlänge aufgrund von Fluoreszenz angesehen wird.
Neben den oben beschriebenen Aufgaben und Merkmalen werden bei den Ausführungsbeispielen andere Maßnahmen ergriffen, die untenstehend im einzelnen beschrieben werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 veranschaulicht den Aufbau eines Fluoreszenz-Spektralphotometers, das ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist;
Fig. 2 ist ein Schema zum Erläutern des Grundprinzips der Erfindung;
Fig. 3 ist ein Flußdiagramm zum Einstellen der Wellenlänge des Fluoreszenz-Spektralphotometers, das ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist;
Fig. 4A bis 4F zeigen Signalverläufe bei Verarbeitungen, die verschiedenen Schritten im Flußdiagramm von Fig. 3 entsprechen; und
Fig. 5 zeigt ein Spektrum für den Fall, daß der Fluoreszenz Streulicht zweiter Ordnung überlagert ist.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELE

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. In Fig. 1 wird ein von einer Xenon (Xe)-Lampe 1 abgestrahlter Lichtfluß durch ein anregungsseitiges Spektroskop 2 monochromatisiert und auf ein Probengefäß 3 projiziert. Fluoreszenz, die von der Probe erzeugt wird, wird der Wellenlänge nach durch ein fluoreszenzseitiges Spektroskop 4 ausgewählt, und dann wird die Intensität derselben durch einen Detektor 5 gemessen. Vom Detektor 5 ausgegebene Signale werden an einen Computer 9 gegeben, um eine Datenverarbeitung auszuführen, nachdem sie durch einen Signalverstärker 8 verstärkt wurden. Ferner wird die Wellenlänge des anregungsseitigen Spektroskops 2 über ein anregungsseitiges Wellenlängenverstellsystem 6 durch den Computer 9 gesteuert. Auf dieselbe Weise wird die Wellenlänge des fluoreszenzseitigen Spektroskops 4 durch ein fluoreszenzseitiges Wellenlängenverstellsystem 7 gesteuert. Hierbei ist das Spektrum, das durch Fixieren der Wellenlänge des anregungsseitigen Spektroskops 2 und durch Verändern der Wellenlänge des fluoreszenzseitigen Spektroskops 4 erhalten wird, das Fluoreszenzspektrum. Im entgegengesetzten Fall wird das Anregungsspektrum erhalten. Diese Spektren werden über den Detektor 5 und den Signalverstärker 8 in den Computer 9 eingegeben. Der Computer 9 weist eine Funktion zum Abspeichern dieser Spektren auf, und er ermittelt Signalspitzen in den Spektren.
Fig. 2 zeigt in der Praxis erhaltene Spektren im Detail, wobei das Fluoreszenzspektrum als Beispiel verwendet ist. Das durch das Fluoreszenz-Spektralphotometer erhaltene Spektrum beinhaltet Streulicht aus dem Anregungslicht sowie Raman- Streulicht getrennt von den Signalspitzen aufgrund der Fluoreszenz. Ferner enthält es dann, wenn ein Spektroskop unter Verwendung eines Beugungsgitters verwendet wird, Streulicht höherer Ordnung, wie Streulicht zweiter Ordnung des Anregungslichts oder Raman-Streulicht zweiter Ordnung usw. Um durch die Fluoreszenz verursachte Signalspitzen herauszufinden, bei denen es sich um zu messende Objekte handelt, sind für ein Spektrum mit einer Anzahl von Spitzenwerten lange Analyseerfahrung und Kenntnisse des Fluoreszenzspektralphotometers erforderlich. Daher war es für Anfänger schwierig, sie aufzufinden. Um diese Schwierigkeit zu beseitigen, ist das erfindungsgemäße Fluoreszenz-Spektralphotometer so aufgebaut, daß es eine Funktion zum automatischen Auffinden von durch Fluoreszenz verursachten Signalspitzen, bei denen es sich um die zu messenden Objekte handelt, auf die folgende Weise aufweist. Um die durch die Fluoreszenz verursachten Signalspitzen von den anderen zu unterscheiden, wird die Eigenschaft genutzt, daß die Wellenlänge der durch Fluoreszenz verursachten Signalspitzen sich nicht ändert, wenn die Anregungswellenlänge verändert wird, daß sich jedoch die Wellenlängen der anderen abhängig von Änderungen der Anregungswellenlänge ändert.
Fig. 3 zeigt ein Flußdiagramm für den Computer 9 zum Erkennen der durch Fluoreszenz verursachten Signalspitzen und zum Einstellen der Anregungswellenlänge und der Fluoreszenzwellenlänge auf die optimale Wellenlänge für die Probe und die Fig. 4A bis 4F zeigen Signalverläufe im Verlauf der Verarbeitung. Zunächst wird zum Auffinden einer Signalspitze der Anregungswellenlänge die Fluoreszenzwellenlänge auf die 0-te Ordnung gesetzt, und das Anregungsspektrum wird gemessen (Schritt 30 in Fig. 3). Die Wellenlänge für die maximale Signalspitze im erhaltenen Spektrum wird als EX&sub1; abgespeichert (Schritt 31 in Fig. 3; Fig. 4A). EX&sub1; repräsentiert eine provisorisch ermittelte Wellenlänge und sie stimmt nicht immer mit der optimalen Anregungswellenlänge überein.
Danach wird die Anregungswellenlänge auf EX&sub1; festgelegt (Schritt 32 in Fig. 3). Das Fluoreszenzspektrum wird im Wellenlängenbereich über EX&sub1; + 10 nm gemessen. Die Messung erfolgt ausgehend von EX&sub1; + 10 nm, um die Signalspitze aufgrund von Streulicht des Anregungslichts auszuschließen. Jedoch kann dieser Unterschied gegenüber EX&sub1; beliebig gewählt werden, abhängig von verschiedenen Bedingungen, wie der Schlitzbreite des Fluoreszenz-Spektralphotometers. Nachfolgend wird die Erläuterung für die Annahme vorgeführt, daß der Schlitz 10 nm breit ist, wie beim Beispiel. Die Signalspitzen im erhaltenen Fluoreszenzspektrum werden aufgesucht und mit W(1), W(2), ... in abnehmender Reihenfolge durchnumeriert. Diese Wellenlängen für die Signalspitzen werden abgespeichert (Schritt 33 in Fig. 3; Fig. 4B). Dann wird die Anregungswellenlänge auf EX&sub1; + 10 nm festgelegt (Schritt 34 in Fig. 3) und das Fluoreszenzspektrum wird erneut im Wellenlängenbereich länger als EX&sub1; + 10 nm gemessen. Die Signalspitzen im erhaltenen Spektrum werden mit Wp(1), Wp(2), durchnumeriert und abgespeichert (Schritt 35 in Fig. 3; Fig. 4C). Ausgehend von W(1) werden W(1), W(2), ... jeweils mit Wp(1), Wp(2) verglichen. Wenn ein Wert Wp vorliegt, dessen Differenz kleiner als 11 nm ist, wird W&sub1; als optimale Wellenlänge EMWL für die Fluoreszenzseite abgespeichert. Wenn kein solcher Wert vorhanden ist, werden W(2), W(3), ... in dieser Reiehnfolge mit den Werten Wp verglichen. Auf dieselbe Weise gilt, daß dann, wenn ein Wert Wp vorhanden ist, dessen Differenz kleiner als 11 nm ist, W(2), W(3), ... als EMWL angenommen werden (Schritt 36 in Fig. 3). Es dient zum Zweck des Auffindens der Fluoreszenzsignalspitzen ohne Auslassung so weit wie möglich, selbst wenn Fluoreszenzsignalspitzen einander überlagert sind und ihre Signalspitzenwellenlängen verschoben sind, daß die Signalspitzen mit einer Toleranz angenommen werden, d.h. nicht nur die Signalspitzen in den in den Fig. 4B und 4C angezeigten Spektren, die völlig miteinander übereinstimmen, sondern es werden auch Signalspitzen verwendet, die miteinander innerhalb einer Toleranz von 11 nm übereinstimmen. Bei diesem Beispiel beträgt dann, wenn die Anregungswellenlänge um 10 nm verändert wird, das Änderungsausmaß im Streulicht zweiter Ordnung des Anregungslichts 20 nm; dasjenige beim Raman-Streulicht beträgt 12 nm bei 200 nm, was die kleinste Wellenlänge für gewöhnliche Fluoreszenz-Spektralphotometer ist; und dasjenige des Streulichts zweiter Ordnung entspricht 24 nm. In einem längeren Wellenlängenbereich des Anregungslichts ist das Ausmaß der Verschiebung für das Raman-Streulicht noch größer. Aus dem oben angegebenen Grund wird die Grenze für die Toleranz auf 11 nm bestimmt. Bisher wurde die optimale Wellenlänge für die Fluoreszenzseite aufgefunden. Demgemäß ist es durch Festlegen dieser optimalen Wellenlänge für die durch Fluoreszenz verursachte Signalspitzenwellenlänge möglich, diese als geeignete Wellenlänge einzustellen, selbst für den Fall, daß die Konzentration der Probe niedrig ist.
Ferner wird bei diesem Ausführungsbeispiel zum Einstellen der optimalen Wellenlänge auf der Anregungsseite die untenstehende Verarbeitung ausgeführt. D.h., daß zum Auffinden der optimalen Wellenlänge auf der Anregungsseite die Fluoreszenzwellenlänge auf den oben angegebenen Wert EMWL fixiert wird (Schritt 37 in Fig. 3) und daß das Anregungsspektrum bis zu EMWL - 10 nm gemessen wird. Die Signalspitzen im erhaltenen Spektrum werden aufgesucht und mit W(1), W(2), ... in absteigender Reihenfolge durchnumeriert. Die Signalspitzenwellenlängen werden abgespeichert (Schritt 38 in Fig. 3; Fig 4D). Danach wird die Fluoreszenzwellenlänge für EMWL + 20 nm fixiert (Schritt 39 in Fig. 3) und das Anregungsspektrum wird erneut bis zu EMWL - 10 nm gemessen. Die Spitzenwerte im erhaltenen Spektrum werden als Wp(1), Wp(2), ... durchnumeriert, und die zugehörigen Wellenlängen werden abgespeichert (Schritt 40 in Fig. 3; Fig. 4E). Auf ähnliche Weise wie auf der Fluoreszenzseite werden die Werte W mit den Werten Wp verglichen. Wenn ein Wert Wp vorliegt, für den die Differenz kleiner als 8 nm ist, ist der zugehörige Wert W die optimale Wellenlänge EXWL für die Anregungsseite (Schritt 41 in Fig. 3; Fig. 4F). Hierbei ist das Ausmaß der Verschiebung auf der Fluoreszenzseite mit 20 nm festgelegt, da die Wellenlänge des Streulichts nur um 1/2, d.h. um 10 nm im Anregungsspektrum für ein Verschiebungsausmaß auf der Fluoreszenzseite variiert. Aus diesem Grund wird der Bezugswert, auf dessen Grundlage die optimale Wellenlänge ermittelt wird, innerhalb einer Grenze von 8 nm festgelegt.
Wie oben beschrieben, ist es möglich, die optimalen Wellenlängen für die Anregungs- und Fluoreszenzseite zu erkennen und die Anregungs- und Fluoreszenzwellenlänge hierfür einzustellen. Zu diesem Zeitpunkt reicht es aus, die optimalen Werte für die Bezugnahme zu untersuchen, auf Grundlage welcher das Verschiebungsausmaß, die Verschiebungsrichtung und die optimale Wellenlänge für die Anregungs- und Fluoreszenzseite bestimmt werden, abhängig von verschiedenen Bedingungen des Fluoreszenz-Spektralphotometers.
Obwohl obenstehend der Ablauf für den Fall beschrieben wurde, daß sowohl die Anregungswellenlänge als auch die Fluoreszenzwellenlänge unbekannt sind, reicht es aus, nur nach der Wellenlänge auf der unbekannten Seite zu suchen, wenn eine der beiden Wellenlängen bekannt ist. Der Ablauf in diesem Fall ist der folgende. Wenn die Wellenlänge auf der Anregungsseite bekannt ist, wird unter der Annahme, daß in Fig. 4B EX&sub1; = EXWL gilt, der Inhalt der Fig. 4B und 4C ausgeführt. Ferner reicht es aus, wenn sie auf der Fluoreszenzseite bekannt ist, den Inhalt der Fig. 4D und 4E auszuführen.
Ferner kann, wenn die Fluoreszenzwellenlänge der Wellenlänge von Streulicht zweiter Ordnung überlagert ist, wie z.B. in Fig. 5 angezeigt, und es nicht möglich ist, die Fluoreszenzwellenlänge durch den Inhalt des oben beschriebenen Ausführungsbeispiels zu identifizieren, die vorläufige Anregungswellenlänge in EX&sub1;, die der Ausgangspunkt für das oben beschriebene Ausführungsbeispiel ist, auf eine andere Wellenlänge eingestellt werden und der Inhalt von Fig. 3 kann erneut ausgeführt werden. Dies, da die Wellenlänge des Streulichts zweiter Ordnung und die Fluoreszenzwellenlänge dank der Tatsache voneinander unterschieden werden können, daß sich die erstere ändert, während sich die letztere nicht ändert, wenn die Anregungswellenlänge verändert wird. EX&sub1; kann zu diesem Zeitpunkt entweder die zweite Signalspitzenwellenlänge oder aber eine andere im Anregungsspektrum (Fig. 4A) folgende sein, wie es erhalten wurde, wenn die Fluoreszenz auf die 0-te Ordnung gesetzt ist, oder es kann ein Wert sein, der von EX&sub1; beim obigen Ausführungsbeispiel einfach um eine beliebige Wellenlänge verschoben ist.
Wie oben ausgeführt, ist es erfindungsgemäß unabhängig vom Ausmaß der von einer Probe emittierten Fluoreszenz immer möglich, die Anregungs- und die Fluoreszenzwellenlänge auf die optimalen Wellenlängen einzustellen und so fehlerhaften Betrieb aufgrund der Einstellung der Meßwellenlänge zu verhindern. Auf diese Weise kann die Wirkung erzielt werden, daß es möglich ist, den Vorgang zum Einstellen der Anregungs- und Fluoreszenzwellenlänge beträchtlich zu vereinfachen, bei denen es sich um die grundlegendsten Meßbedingungen für ein Fluoreszenz-Spektralphotometer handelt, und die Zuverlässigkeit des Meßergebnisses zu verbessern.

Claims

1. Fluoreszenz-Spektralphotometer mit

einer Lichtquelle (1);

einem anregungsseitigen Spektroskop (2) zur Separierung des von der Lichtquelle (1) ausgestrahlten Lichts nach der Wellenlänge und Projektion von Anregungslicht einer bestimmten Wellenlänge auf eine Probe (3);

einem fluoreszenzseitigen Spektroskop (4) zur Separierung des von der Probe (3) abgestrahlten Fluoreszenzlichts nach der Wellenlänge;

einem Detektor (5) zur Erfassung des vom fluoreszenzseitigen Spektroskop (4) abgestrahlten Fluoreszenzlichts;

einer Einrichtung (9) zur Speicherung eines ersten Spektrums, wenn eines der beiden Spektroskope (2, 4) auf eine beliebige Wellenlänge eingestellt ist und die Wellenlänge des anderen abgetastet wird;

gekennzeichnet durch

eine Einrichtung (9) zur Speicherung eines zweiten Spektrums, wenn das erste der Spektroskope (2, 4) auf eine andere Wellenlänge eingestellt ist, die eine andere ist als die genannte beliebige Wellenlänge, und die Wellenlänge des anderen Spektroskops abgetastet wird; und

eine Einrichtung (9) zum Vergleichen des ersten Spektrums mit dem zweiten Spektrum und zum Festlegen der anregungsseitigen oder fluoreszenzseitigen Wellenlänge auf diejenige Wellenlänge, bei der entsprechende Maxima in den beiden Spektren in etwa übereinstimmen.

2. Fluoreszenz-Spektralphotometer nach Anspruch 1, der weiterhin aufweist:

eine Einrichtung (9) zur Erfassung der Wellenlänge des Maximums, das erhalten wird, wenn die Wellenlänge des ersten der Spektroskope (2, 4) fest eingestellt ist und die Wellenlänge des zweiten Spektroskops abgetastet wird;

eine Einrichtung (9) zur Speicherung eines ersten Spektrums, wenn das zweite Spektroskop (2 oder 4) auf die erfaßte Wellenlänge des Maximums eingestellt ist und die Wellenlänge des ersten Spektroskops abgetastet wird;

eine Einrichtung (9) zur Speicherung eines zweiten Spektrums, wenn das zweite Spektroskop (2 oder 4) auf eine Wellenlänge eingestellt ist, die eine andere ist als die Wellenlänge des Maximums und die Wellenlänge des ersten Spektroskops abgetastet wird;

3. Fluoreszenz-Spektralphotometer nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Wellenlänge, bei der entsprechende Maxima in den beiden Spektren in etwa übereinstimmen, eine Wellenlänge innerhalb der Grenze ist, die durch das Ausmaß der Verschiebung durch die Raman-Streuung aufgrund der Probe (3) bestimmt ist.

4. Verfahren zur Festlegung einer Wellenlänge bei einem Fluoreszenz-Spektralphotometer, bei dem Anregungslicht einer bestimmten Wellenlänge auf eine Probe (3) projiziert wird; das von der Probe (3) abgestrahlte Fluoreszenzlicht erfaßt wird; und eine Messung der Probe (3) bewirkt wird; mit folgenden Schritten:

Festlegen der Wellenlänge des auf die Probe (3) projezierten Anregungslichts auf eine erste Wellenlänge (Schritte 31, 32);

Messen eines ersten Spektrums des von der Probe (3) abgestrahlten Fluoreszenzlichts (Schritt 33);

gekennzeichnet durch

Festsetzen der Wellenlänge des Anregungslichts auf eine zweite Wellenlänge (Schritt 34);

Messen eines zweiten Spektrums des von der Probe (3) abgestrahlten Fluoreszenzlichts (Schritt 35); und

Festsetzen der Wellenlänge, bei der entsprechende Maxima in den beiden Spektren in etwa übereinstimmen, auf die von der Probe (3) abgestrahlte Wellenlänge (Schritt 36).

5. Verfahren nach Anspruch 4, das ferner folgende Schritte umfaßt

Erfassen von Fluoreszenzlicht bei einer ersten Wellenlänge des von der Probe (3) abgestrahlten Lichts (Schritt 37);

Messung eines ersten Spektrums, das durch kontinuierliches Abtasten der auf die Probe (3) projizierten Wellenlänge erhalten wird (Schritt 38);

Erfassung des Fluoreszenzlichts bei einer zweiten Wellenlänge des von der Probe (3) abgestrahlten Lichts (Schritt 39);

Messung eines zweiten Spektrums, das durch kontinuierliches Abtasten der auf die Probe (3) projizierten Wellenlänge erhalten wird (Schritt 40); und

Festsetzen der Wellenlänge, bei der entsprechende Maxima in den beiden Spektren in etwa übereinstimmen, auf die von der Probe (3) abgestrahlte Wellenlänge (Schritt 41).

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die erste Wellenlänge die erwähnte Fluoreszenzlicht-Wellenlänge und die zweite Wellenlänge des von der Probe (3) abgestrahlten Lichts eine andere ist als die Fluoreszenzlicht-Wellenlänge.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Wellenlänge, bei der entsprechende Maxima in den beiden Spektren in etwa übereinstimmen, eine Wellenlänge innerhalb der Grenze ist, die durch das Ausmaß der Verschiebung durch die Raman-Streuung aufgrund der Probe (3) bestimmt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Unterschied zwischen der ersten und der zweiten Wellenlänge geringer ist als das Ausmaß der Verschiebung durch die Raman-Streuung aufgrund der Probe (3).