DE2360262A1 - Verfahren zur herstellung von cephalosporinen - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHUNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 3. Dezember 1972

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomaohi 2-chome, Higashj-ku, Osaka (Japan) Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues und industriell verwertbares Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Cephalosporins der allgemeinen Formel "

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NH₀

R-CHCOM

Il -ι

(D

worin R für einen gegebenenfalls substituierten, sechsgliedrigen cyclischen Kohlenwasserstoffreste welcher gesättigt oder ungesättigt sein kann oder einen· ungesättigten fünfgliedrigen heterocyclischen Rest, der ein Heteroatom im

1 -22

Ring aufweist, R für Wasserstoff oder -OR , worin R eine organische Gruppe bedeutet, stehen η 1 oder 2 und X —OR , -SO R₁ -NH₂ oder -CN bedeuten, worin R^ für eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe steht und m O, 1 oder 2 ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

1· eine α-substituierte -α-Aminosäure der allgemeinen Formel

■ - ² , (II)

R-CHCOOH

worin R die oben angeführte Bedeutung hat, oder deren reaktionsfähiges Derivat mit

2« einer 7-Aminocephemverbindung der allgemeinen Formel

COO(CH₂)_n-X

worin R , η und X die oben angeführte Bedeutung haben, unter Verwendung eines Mikroorganismus mit cephalosporinerzeugender Wirkung der Familie der Psendoaionadaceae, insbe -

— 2 —

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sondere eines solchen der Gattung Mycoplana, Protatninobacter, Acetobacfer, Gluconobacter, Xanthomonas oder Pseudomonas kondensiert.

In den meisten Fällen wurden 7-AminocephemverbindungGn, welche als Zwischenprodukte für die Herstellung verschiedener Arten von Cephalosporinen wichtig sind, in Form eines 4-Carbonsäureesters erhalten.

Der Esterrest vurde unter jenen Gruppen ausgewählt, welche leicht zu entestern sind, ohne daß dadurch die übrige Struktur beeinflußt wird. Die häufigsten verwendeten Ester sind Benzylester, Bis-(p-methoxyphenyl)-methylester und 2,2,2-Trichloräthylester, welche in der belgischen Patentschrift Nr.717 7^1 geoffenbart sind, ferner die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.25 7^6/1971 geoffenbarten Benzhydrylester, die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.28 557/1971 geoffenbarten 3,5-Dimethoxybenzylester; die 3,5-Di-tert.butyl-4-hydroxybenzylester, welche in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.28 55^/

1971 beschrieben sind, die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.28 559/1971 genannten tert.-Butylester und die in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.22 83I/

1972 geoffenbarten Triphenylmethylester.

Die 7-Aminocephem-Jl—carbonsäureester können in das als Endprodukt vorliegende Cephalosporin durch chemische oder enzymatische Entfernung der Estergruppe umgewandelt werden, wobei die freie 7-Aminocephem-4-carbonsäure hergestellt und dann der N-Acylierung unterworfen wird. Es kann auch die Stellung 7 des Esters chemisch acyliert und das acylierte Produkt darauf entestert werden, um die gewünschte Cephalosporinverbindung zu.erhalten.

Anderseits war es bisher bei der Herstellung von Cephalosporinen und ihren Estern durch sine chemische Kondensationsrealction zwischen a-substituierten-oc-Aminosäuren

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und 7-Atninocephem-4~carbonsäuren oder ihren Estern nötig, entweder vorher die Aminogruppen der Aminosäuren zu schützen, um unerwünschte Nebenreaktionen zu verhindern, oder die Aminogruppen vorher beispielsweise in die Azidogruppe (N„) umzuwandeln, welche leicht wieder in eine Aminogruppe übergeführt werden kann. Daher ist es nötig, nach der Kondensationsreaktion entweder die Schutzgruppe von der Aminogruppe zu entfernen oder den genannten Rest in die Aminogruppe umzuwandeln. Diese Nebenreaktionen müssen unter gemäßigten Reaktionabedingungen durchgeführt werden, damit kein Einfluß auf die nicht an der Reaktion beteiligten Reste ausgeübt wird, vor allem muß darauf geachtet werden, weder den Cephemkern noch die Saureamidbindung in der Stellung 7 der Seitenkette zu spalten. Diese Nebenreaktionen führen unweigerlich zu einer Ausbeuteverminderung an Cephalosporinen.

Es wurde ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporinverbindungen der Formel (i¹)

R-CK-COM

I I 1

vorin R und R die' oben angeführte Bedeutung haben, entwikkelt, welches darin besteht, daß eine α-substituierte-a-Aminosäure der Formel (il) oder ein reaktionsfähiges Derivat derselben und eine T-Aminocephem-^-carbonsäureverbindung in einem enzymatisehen Verfahren umgesetzt werden, welches nicht den vorherigen Schutz der Aminogruppe erfordert (japanische Patent-Offenlegung Nr.25 388/72). Es ist jedoch schwierig, aus dem nach diesem Verfahren hergestellten Reaktionsgemisch die gewünschte Cephalosporinverbindung der Formel (l¹) in großer Ausbeute zu isolieren, da dieses Ge-

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misch eine große Menge a-substituierter-a-Aminosäure der Formel (il) enthält, die- entweder umgesetztes Ausgangsprodukt darstellt oder im Verlauf der Reaktion aus ihrem reaktionsfähigen Derivat gebildet wurde, da sowohl die oc-substituierte-a-Aminosäure der Formel (il) und die gewünschte Cephalosporxnverbindung der Formel (l¹) amphotere Substanzen sind und ihre physikalischen Eigenschaften einander sehr stark ähneln«

Es wurde der Versuch unternommen, die Kondensationsreaktion zwischen einer a-substituierten-oc-Aminosäure der Formel (il) oder eines ihrer reaktionsfähigen Derivate mit einem Ester einer 7-Aminocephem-^-carbonsäure, insbesondere mit einem der oben angeführten Ester anstelle der 7-Aminocephem-4-carbonsäure selbst durchzuführen und es wurde dabei festgestellt, wie auch aus dem unten angeführten Bezugsbeispiel hervorgeht, daß die Ausbeuten an den, entsprechenden Cephalosporinsäureestern wesentlich niedriger sind,als dies bei der Herstellung von Cephalosporinverbindungen unter Einsatz von 7-Aminoceph.em-4-carbonsa.ure der Fall ist.

. In dei* Folge wurden Untersuchungen über die Auswirkungen einer großen Anzahl von Esterresten auf die Kondensationsreaktion zwischen einem 7-ArainQcephera-4-oarbonsäureester und einer a-substituierten-a-Aminosäure der Formel (il) oder eines ihrer reaktionsfähigen Derivate angestellt und es wurde überraschenderweise gefunden, daß jene 7-Aminoeephem-4-carbonsäureester, welche z.B. einen Esterrest der allgemeinen Formel -CH₂CH₂X (worin X SOgR³, NH₃ oder CN bedeutet und R eine niedere Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine gegebenenfalls substituierte Phenylgruppe ist), oder einen Ester der allgemeinen Formel -CH₂X (worin X für -OR², SR² oder SOR² steht, worin R²die oben angeführte Bedeutung besitzt) aufweisen, bei der e.nzymatisGhen Kondensationsreaktion mit den α-substituierten-OC-Amino Säureverbindungen Cephalosporinester der Formel (l)

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mit hohen Ausbeuten ergehen,

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines mikrobiellen Verfahrens zur Herstellung von Cephalosporxnes tern der Formel (i) aus einer oc-substituierten-OU-Aminosäure der Formel (il) oder ihrer reaktionsfähigen Derivate und einem 7-Aminocephem-4-carbonsäureester der Formel (ill), welches neu ist und gegenüber den bekannten Verfahren wesentliche Vorteile aufweist.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Cephalosporinestern der Formel (l)_f nach welchem die Isolierung des gewünschten Cephalosporinesters d,er Formel (l) aus dem die OC-substituierte—α-Aminosäure der Formel (Xl) enthaltenden Reaktionsgemisch sehr leicht ist.

In der oben angeführten Formel (il) bedeutet R einen gegebenenfalls substituierten sechsgliedrigen, cyclischen Kohlenwasserstoffrest, welcher sowohl gesättigt als auch ungesättigt sein kann oder einen ungesättigten, fünfgliedrigen, heterocyclischen Rest, welcher ein Heteroatom aufweist.Als Beispiele für den sechsgliedrigen, cyclischen Kohlenvasserstoffrest sind Phenyl, Cyclohexenyl (d.h. 1-Cyclohexenyl, 2-Cyclohexenyl und 3-Cyclohexenyl), Cyclohexadienyle (d.h. 1,3-Cyclohexadienyl, 1,4-Cyclohexadienyl, 1,5-Cyclohexadienyl und 2,3-Cyclohexadienyi) und Cyclohexyl zu nennen. Jeder dieser Kohlenwasserstoffreste kann einfach oder mehrfach am Ring substituiert sein. Beispiele für geeignete Substituenten sind Hydroxyl, Halogene (z.B. Brom, Chlor, Jod), Alkyle wie niederes Alkyl (z.B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl), Alkenyle wie niederes Alkenyl (z.B. Vinyl, Allyl), Alkoxy wie niederes Alkoxy (z.B. Methoxy, Äthoxy, Propoxy, •Isopropoxy)} Carboxyl; Mercapto; Cyano; Nitro; SuIfο; Amino; SuIfamino; Carboxyalkyl wie Carboxyniederalkyl (z.B.Carboxymethyl, Carboxyäthyl, Carboxypropyl, Carboxyisopropy1) u.dgl.

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Als Beispiele für die fünfgliedrlgen, heterocyclischen Kohlenwasserstoff reste sind jene mit einem Heteroatom vie O, S oder N vie z.B. Thienyl (d.h. 2-Thienyl oder 3-Thienyl), Furyl (d.h. 2-Furyl oder 3-Furyl) od.dgl. zu nennen.

Beispiele für die oc-substituierten-ct-Aminosäuren sind Phenylglycin, Cyclohexadienylglycin, Cyclohexenylglycin, Cyclohexylglycin, 2-Thienylglycin, 2-Furylglycin, p-Hydroxyphenylglycin, p-Mercaptophenylglycin, p-Carboxyphenylglycin, p-Sulfoxyphenylglycin, p-Aminophenylglycin, p-Nitrophenylglycin, p-Chlorphenylglycin, p-Bromphenylglycinjp-Methylphenylglycin, p-Äthylphenylglycin, p-Methoxyphenylglycin, p-Cyanophenylglycin, p-Sulfaminophenylglycin u.dgl. Obgleich die oben als Beispiele angeführten Verbindungen nur para-substituierte Verbindungen sind, können auch solche, νeiche die gleichen Substituenten in der Ortho- oder Metastellung des Phenylglycins aufweisen, eingesetzt verden.Es sind auch Verbindungen mit zwei oder mehr gleichen oder verschiedenen Substituenten an den entsprechenden Ringen geeignet. Diese Verbindungen können z.B. durch die Strecker-Synthese aus Aldehyden mit der entsprechenden R-Gruppe hergestellt werden.

Die cc-substituierte-OC-Aminosäure der Formel (ll) kann in freier Form oder als Salz, wie z.B. als Hydrochlorid, Natrium- oder Kaliumsalz, eingesetzt verden.

Als reaktionsfähige Derivate der a-substituierten-oc-Arainosäuren der Formel (ll) können beliebige, im Carboxylrest substituierte Derivate eingesetzt werden, welche bei Hydrolyse in einem wässerigen Medium unter Verwendung eines gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzenden Mikroorganismus die oc-substituierten-oc-Aminosäuren der Formel (ll) ergeben. Als Beispiele für reaktionsfähige Derivate sind Alkylester wie Niederalkylester (z.B. Methylester, Äthylester,n-Propylester und Isopropylester der oc-substituierten-oc-Amino-

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säuren der Formel (il), Aralkylester wie Phenylniederalkylester (z.B. Benzylester, Phenätliylester und Phenylpropylester) derselben, Arylester (z.B. Phenylester), Alkylthioester (z.B.Methylthioester und Thioglycolester) derselben und Amide, Dipeptide dieser Aminosäuren mit einer anderen Aminosäure (z.B. N-(Phenylglycylglyein) u.dgl. zu nennen.

1

In der Formel (ill) bedeutet R Wasserstoff oder -OR ,

2
worin R für eine organische Gruppe steht. Beispiele für derartige organische Gruppen sind z.B. Alkyle wie Niederalkyl (z.B. Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl), Alkenyle wie Niederalkenyl (z.B. Vinyl, Allyl), Alkanoyle wie Niederalkanoyl (z.B. Acetyl, N-Propionyl, Isopropionyl), und Alkylthiocarbonyl wie Niederalkylthiocarbonyl (z.B. Methylthiocarbonyl, Äthylthiocarbonyl, Propionylthiocarbonyl). X steht für eine Gruppe der Formeln -OR , -SO R , NH oder CN, worin R ein Alkyl mit bis zu drei Kohlenstoffatomen wie Methyl, Äthyl, n-Propyl oder Isopropyl oder eine Phenylgruppe und m O, 1 oder 2 bedeuten.

Beispiele für 7-Aminocephem-^-carbonsäureester der Formel (ill) sind 7-Aminocephalosporansa.ure-methoxymethylester, 7- Amino -3-de sac et oxy c ephalo sp*r ansäur eme thy I sulfonyl äthylester, 7-Amino-3-ceρhem-3-πIethoxymethyl-4-carbonsäuremethylthiomethylester, 7-Amino-3-cephem-3-/_ 2-(1-oxopyridyl)-thiotnethyl_/-4-carbdnsäurecyanäthylester, 7-Amino-3-desacetoxy· cephalosporansäureäthylsulfonyläthylester, 7-Amino-3-desacetoxycephalοsporansäurephenylsulfonyläthy!ester, 7-Amino-3-desacetoxycephalosporansäureniethylsulf inylmethylester, 7-Amino-3-(1-pyridylmethyl)-3-cephem-4-carbonsäurecyanäthylester, 7-Amino-3-/ 1-(4-carboxamidopyridyl)-methyl_/-3-cephem-^-carbonsäuremethoxymethylester, 7-Amino-3-ⁿiethylthiocarboxymethyl-3-cephem-4-carbonsäureaminoäthylester, 7-Amino-3-1rimethylaminomethyl-3-cephem-'+-carbonsäuremethylthiomethy1-ester, 7-Amino-3-dimethyldithiocarbanlyllnethyl-3-cepllem-4-carbonsäureniethoxymethylester, 7-Amino-3-"azidomethyl-3-

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cephem-^-carbonsäuremethoxymethylester, 7-Amino-3-benzyloxyc arbonylaminome thy 1-3-cephem- k -carbonsäur erne thy lthioraethylester u.dgl.

Manche dieser 7"Arainocephera-4-carbonsäureester sind neu« Sie können nach einem der nachstehend angeführten, an sich bekannten Verfahren, hergestellt werden:

t) Der Alkohol der Formel (HO(CH„) X), welcher dem betreffenden Esterrest entspricht, oder einem reaktionsfähigen Derivat eines solchen Alkohols wie ein Chlorameisensäureester dieses Alkohols (z.B. Methylsulfonyläthylchlorameisensäureester), wird mit Penicillin G oder V umgesetzt, um einen Penicillin G-Ester oder Penicillin V-Ester zu erhalten, welcher seinerseits einer Ringerweiterungsreaktion unterworfen wird, um den entsprechenden 7-Acyl-3-desacetoxycephalosporansäureester zu erhalten, worauf man durch Desacylierung der Stellung 7 der letztgenannten Verbindung den gewünschten 7-Amino-3-desacetoxycephalosp^tiransäureester erhält.

2) Nach Schützen der Aminogrüppe des Cephalosporin C wird die Verbindung mit dem Alkohol, welcher dem gewünschten Esterrest entspricht oder einem reaktionsfähigen Derivat dieses Alkohols umgesetzt, um den entsprechenden Cephalosporin-C-Ester herzustellen, dann wird die 7-Acylgruppe durch ein chemisches oder enzymatisches Verfahren abgetrennt, um den gewünschten 7-Aminocephalosporansäureester zu erhalten.

3) Die Stellung 3 des Cephalosporin C wird nach Bedarf modifiziert und dann folgt das unter 2) angegebene Verfahren, um den gewünschten 7-Aminocephem-4-carbonsäureester zu erhalten.

Der gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzende Mikroorganismus kann unter den in Mikroorganismendepots hinterlegten Stämmen ausgewählt oder aus der Natur entnommen werden, so z.B. aus Erdreich, Abwässern, Meerwasser, Blumen,

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Früchten oder der Atmosphäre. Sollten sich unter diesen Mikroorganismen Stämme befinden, die unerwünschte Enzyme wie

ß-Lactamase II (Cephalosporinase) und Esterase bilden, wel_ ehe einen Einfluß auf die gewünschten Cephalosporinester der Formel (il) ausüben und diese modifizieren, so besteht die Möglichkeit, Mutanten zu bilden, welche diese unerwünschten Enzyme nicht hervorbringen. Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung sind alle von den oben angeführten Mikroorganismen nach herkömmlichen Verfahren abgeleiteten Mutanten, welche zur Herstellung der gewünschten Cephalosporinester geeignet sind, verwendbar.

Nachstehend folgt eine teilweise Angabe der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sehr gut geeigneten, bekannten, im Institute for Fermentation^ Osaka, Japan (IFO) und National Institute of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture and Forestry, Japan (NARl) deponierten Kulturen: Die in der gesamten Beschreibung angeführten IFO und NARI-Nummern bedeuten die Akzessionsnmnraern der Mikroorganismen in den betreffenden Hinterlegungsstellen:

. . .Acetobacter acetosus .

IFO-3290", Glueohobacter albidus IFO-3251, Acetobacter aurantiua IF0-3245, Acetobacter aurantium IFO-3249,. Gluconobacter cerinus IFO-3262, G-luconobacter industrius IFO-326Q, Gluconobacter dloxyacetonicus IFO-3272, Gluconobacter gluconicus IFO-8171, Gluconobacter liquefaciens IFO-12388, Gluconobacter melagenogenes IFO-3293, Gluconobacter oxydans IFO-3189, Acetobacter -pasteuriamis IFO-3223, Gluconobacter suboxydans IFO-3130, Acetobacter turbidans IFO-3225, Acetobacter xylinua IF0-3144, Acetobacter xylinum IFO-3288, Xanthomonas citri IFO-3855,

Xanthonionas pruni IFO-3780, Xanthoaonas oryzae IFO-3995, Xanthoaonas campestris NARI (p 1-1-1, Xanthomonas cucurbitg NAHI φ 1-3-1, Xanthomonas hyacinth! NARI®1-4-1, Xantho-

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- ΊΟ -

Konas phaseοIi f.sp.alfaltä NARIζΧ)1-6-1, XanthOEonas phaseoli f. so. so.j ens e ΝΛΒΙ (X) 1-7-1, Xanthoaonas physalidicola NARI(X)1-8-1, Pseudomonas aeruginosa IFO-3454, Pseudomonas convexa IFO-12662, Pseudomonas inaltophila IPO-12690, Pseudomonas melanogenuin IFO-12020, Pseudoaonas . vendrelli IFO-3899 u.dgl. Beispiele für aus der Natur isolierte Mikroorganismen sind Mycoplana dimorpha IFO-13213, Mycoplana bullata IFO-I3267, Protaminobacter alboflavus IFO-1.3221 u.dgl.

Um den gewünschten Cephalosporinester der Formel (l) durch enzymatische Wirkung eines solchen Mikroorganismus, * welcher fähig ist Cephalosporinester der Formel (l) zu produzieren, herzustellen kultiviert man zuerst den Mikroorganismus und bringt die erhaltene Kulturbrühe oder daraus aufgearbeitetes, das cephalosporinproduzierende Enzym enthaltende Material mit einer cc-substituierten-oc-Aminosäure der Formel (ll) oder einem ihrer reaktionsfähigen Derivate unter geeigneten Bedingungen und einem 7-Aminocephem-4-carbonsäureester der Formel (ill) in Berührung.

Die Kultivierungsmethode zur Bereitstellung der oben angeführten Kulturbrühe kann jede beliebige aerobe Rührkultur, Schüttel- oder statische Kultur sein. Es ist jedoch empfehlenswert, den Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen zu kultivieren. Das Kulturmedium kann jede beliebige herkömmliche Zusammensetzung aufweisen. Es kann eine oder mehrere natürliche Substanzen wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Casaminosäure, Maisquellwasser und nach Bedarf zusätzliche kohlenstoffhaltige Verbindungen wie Zucker, organische. Säuren, n-Paraffine u.dgl., verschiedene anorganische und organische stickstoffhaltige Verbindungen einschließlich Ammonium- und Nitratstickstoff, Phosphate, Magnesiumsalze, Natrium-

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k 0 9 & 2-4;/,1-0 8 8

Chlorid und andere metallische Ionen_s verschiedene Vitamine u.dgl. enthalten. Der pIT-Wert des Mediums wird auf etwa ('· bis etwa B eingestellt. Die InkubatLpnstemperatur liegt im Bereich von 20 bis >iO°C, vorzugsweise 24 bis 37°C. Obgleich die Inkubationsdauer von dem eingesetzten Mikroorganismpnstamm und den Kulturbedingungen, vor allem der Beschaffenheit der Kultur, der Zusammensetzung des Mediums und dor Inkubationstemperatur abhängt, so ist es ratsam, die Kultivierung zu jenem Zeitpunkt zu beenden zu welchem die Cephalosporinesterproduktion des Organismus ihren Höhepunkt erreicht hat, d.h. zu jenem Zeitpunkt welcher zwischen dein spaten Stadium der logarithmischen Wachstumsphase und dem frühen Stadium der stationären Vachstumsphase liegt. Im allgemeinen liegt die KuItivierungsdauer im Bereich von etwa 8 bis etwa 60 Stunden.

Die so hergestellte Kulturbrühe oder das daraus aufgearbeitete enzymhaltige Material wird in der Reaktion zur Herstellung des gewünschten Cephalosporinesters der Formel (i) eingesetzt. Das aus der Kulturbrühe aufgearbeitete, enzymhaltige Material umfaßt alle durch Verarbeitung der Kulturbrühe erhaltenen Materialien mit cephalcsporinesterproduzierender Wirkung. Tritt z.B. die zur Bildung der Cephalosporine führende Wirkung intrazellular auf, so kann das enzymhaltige, aufgearbeitete Material aus

1) den aus der Kulturbrühe entnommenen, gewaschenen Zellen,

2) dem zellfreien Extrakt, welcher nach einem bekannten Verarbeitungsverfahren hergestellt werden kann,

3) dem teilweise oder ganz gereinigten, cephalosporinbildenden Enzym, das nach einem bekannten Verfahren aus dem oben genannten zellfreien Extrakt hergestellt wurde,

k) dem cephalosporinbildenden Enzym, welches dadurch hergestellt wird, daß der ganz oder teilweise gereinigte Wirkstoff cbi-iiii sei: oder physikalisch ί*.η <·ΐπα was.^e ο run 1 or-

u υ a * > ui ι υ 88

BAU ORIGINAL

liehe Substanz von hohe*!» Motokulargcniicht go bund on wird, bestehen.

Tritt die cenhalospoi'inbildende Wirkung extrazell.iil.ar . auf, so kann das enzymhalt ige"» aufgearbeitete' Material z.B. aus

1) der überstehenden Flüssigkeit, welche durch Entfernen der Zellen aus der Kulturbinlhe erhalten wird,

2) dem teilweise oder gründlich gereinigten cephalosporinbildenden Enzym, welches durch bekannte Enzymreinigungsverfahren, denen man die überstehende Schicht unterwirft, hergestellt werden und

3) dem cephalosporinbildenden Enzym bestehen, welches entweder physikalisch, oder chemisch an eine wasserunlösliche Substanz mit hohem Molekulargewicht gebunden ist.

Bei der Herstellung eines Cephalospijrinesters der Formel (i) durch Umsetzen einer a-substituierten-ce-Aminosäure der Formel (il) oder eines ihrer reaktionsfähigen Derivate mit einem 7-Aminoc'ephem-^— carbonsäureester (ill) in Gegenwart der Kulturbrühe oder des daraus aufgearbeiteten, enzymhaltigen Materials wird die Kondensationsreaktion im allgemeinen vorzugsweise in einer wässerigen Lösung durchgeführt. Der pH-Wert des Reaktionssystems wird dabei auf h bis 8, insbesondere auf 5 bis 7» eingestellt. Wenn die Kulturbrühe oder das daraus aufgearbeitete enzymhaltige Material wasserlös- ■ lieh ist, wird die oben angeführte Kondensationsreaktion in Lösung durchgeführt. Ist di,e Kulturbrühe oder das daraus aufgearbeitete enzymhaltige Material wasserunlöslich, so wird die Reaktion in Suspension oder auf solche Weise durchgeführt, daß eine wässerige Lösung, welche eine OC-substituierte-a-Aminosäure der Formel (il) oder ein reaktionsfähiges Derivat derselben und einen 7-Aminocephem-4-carbonsäureester der Formel (ill) enthält, über eine den enzymbildenden Wirkstoff enthaltende Kolonne geleitet wird, wodurch die Kondensationsreaktion während des AbwärtsfHeßens der wässerigen

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lösung in der Kolonne vor sich ^eht. In diesen Fallen kann dem Reaktionssystem ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel vxη' Alkohol oder Aceton zugegeben werden, um die Ausbeute der Kondensationsreaktion zu erhöhen. Die Reaktionsdauer beträgt gewöhnlich 10 bis 3OO Minuten, je nach der Konzentration der Substrate, Stärke der cephalosporinesfcerbildenden Wirkung und der Reaktionsteinperatur, Die Reaktionstemperatur liegt etwa im Bereich von 5 bis 50 C. Die Konzentration des Substrates hängt hauptsächlich von der Stärke der cephalosporinesterbildenden Wirkung ab. Im allgemeinen wird y-Aminocephem-^-carbonsäureester (ill) in einer Konzentration von 0,1 bis 10 ^€Jo eingesetzt. Um die Ausbeute an Cephalosporinester (l), bezogen auf 7-Aminocephem-^-carbonsäureester (ill) zu erhöhen, ist es empfehlenswert, die Ct-substituierte-a-Aminosäure (il) oder ihr reaktionsfähiges Derivat in einer Konzentration einzusetzen, welche einem oder mehreren Moläquivalenten, vorzugsweise 2 oder mehr Moläquivalenten, bezogen auf den Ester, entspricht.

Der Cephalosporinester der Formel (l), welcher aus einer a-substituierten-oc-Aminosäure der Formel (il) oder einem ihrer reaktionsfähigen Derivate und einem 7-Aminocephem-4-carbonsäureester (ill) in Gegenwart der oben angeführten Kultur oder des daraus aufgearbeiteten Materials hergestellt wurde, kann leicht aus dem a-substituierte-a-Aminosäure (^i) enthaltenden Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. mit einem Ionenaustauscherharz oder durch Ausnutzung der verschiedenen Löslichkeiten der Verbindungen (l) und (il) beim isoelektrischen Punkt der Verbindung, (il) Die Verbindung der Formel (ill) kann auch aus dem Reaktionsgemisch nach einem bekannten Reinigungsverfahren wie z.B. durch Chromatographie oder durch Verwendung einer organischen Säure oder Base, welche mit dem Cephalosporinester der Formel (i) ein wasserunlösliches Salz bilden kann, unter milden Bedingungen entfernt werden.

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Unter den Cephalosporincstom der Formel (i) sind jene Verbindungen neu, in welchen X -SO R" (vorin m O, 1 oder und R eine Alky!gruppe mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen ist) bedeutet.

Die Cephalosporinester der Formel (i) können leicht durch Behandlung der oben angeführten Cephalosporine der Formel (i¹) mit einer Alkalilösung hergestellt verderi.

In der Beschreibung bedeuten, wenn nicht anders angeführt, die Abkürzungen "m,u", "ml", "I"-, "⁰C",■ "mM" und "N" Millimikron, Milliliter, Liter, Grad Celsius, millimolare Konzentration und Normalität. Ebenso bedeutet fo Gewicht pro Volumen, d.h. Gramm pro Deziliter.

Nachstehend sind die drei verschiedenen, in den Beispielen und Bezugsbeispielen angeführten Medxenzusainmensetzungen angeführt:
Medium A:*

Medium B:

Natriumglutamat	pH	Kartoffelinfusion	PH	0,2	ϊ'ο
Hefeextrakt	Hefeextrakt	0,2	io
Pepton	Thioglykolsäurernedium (hergestellt von Daigo Nutritive Chemicals Co. Ltd)	0,5
Kaliummonohydrogenpho sphat	Glycerin	0,2	$
Magnesiumchlorid	Glykose	0,1	I *
Eisen-II-sulfat	0,0	Yo
Sucrose	2,0
7,2
10 %	$
1,0	i>
1,0	°/o
1,5
0,3
7

AOUO 'J U I I 0 8 8 .

	2360262	1,	0	io
Medium C:		1,	0
	Fleische xfcrakt	ο,	5
	Pepton
	Natriumchlorid

pH 7

Bezu^sboispiel 1;

100 ml Medium A in einem 1 Liter-Kolben wurden mit einer 1 Tag alten Schrägkultur von Xanthomonas oryzae IFO-3955 beimpft und die Kulturbrühe wurde unter Schütteln bei 28 C 20 Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit 100 ml/0,05 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 6 gewaschen und in 20 ml der Pufferlösung suspendiert. Die Suspension wurde auf Teströhrchen in Mengen von je 2 ml pro Röhrchen verteilt. D-2-Phenylglycintnethylester und jeder der unten angeführten 7-Amino-3-desacetoxycephalosporansäure-(7-ADCA)-ester wurden in 3 ml einer 0,1 N wässerigen Lösung von K_pHPOj (pll-¥ert auf 6,0 eingestellt) in Konzentrationen von 60 bzw. 30 m>l suspendiert oder gelöst J die entstandene Lösung oder Suspension wurde jeder der oben angeführten Zellsuspensionen zugegeben. Die Reaktion wurde unter Rühren bei 37 C durchgeführt. Nach 0,1, 2 und Stunden wurden Proben von je 0,5 ml entnommen. Dann wurden 2,0 ml Tetrahydrofuran zugegeben und jede Probe wurde zentrifugiert, um die Zellen und denaturierte Proteine von der überstehenden Schicht zu trennen. In der überstehenden Schicht wurde die restliche Menge an 7-ADCA-Ester,an entstandenem Cephalosporxnester, an prozentuellem Anteil an Cephemkern od.dgl. gemessen. Diese Werte wurden mit den zur Stunde 0 ermittelten Werten verglichen, um die im Verlauf der Reaktion eingetretenen Veränderungen festzustellen.

Die restliche Menge an 7 ADCA-Ester wurde ermittelt, indem aus einem Anteil von 0,5 ml aus der überstehenden Schicht das Lösungsmittel abdestilliert, der Destillations-

16 -

B2/. / 1 088

rückstand mit einer 5 ^igen wässerigen Ameisensäure! ösung auf 5fO nil aufgefüllt und dann der Es Lorgehal t nach 'dem Ve riahren von L.P.Sarrelli (J.Pharin.Sci.j57. 2 1 72, ( 1 9o8 ) ) bestimmt wurde. Das Cephalosporinesterprodukt wurde mittels Dünnschichtchromatographie an Silikagel. (Entwicklerlüstm^smittel: (1) Obei-e Schicht von n-Butanol/Essigsäure/l/asser (Ί:1:5); (2) Chloroform/Aceton (8:2); (3)Methylenchlorid/ Äther (i:i))als ein UV-absorbierender, Ninhydrin-positiver Fleck gefunden. Die Gesamtausbeute an /Cephemkernen 100 ^r,o. Aus der nachstehend angeführten Tabelle sind die eingesetzten 7-ADCA-Ester und die Reaktionsergebnisse ersichtlich. Zur Kontrolle wurde unter den gleichen Bedingungen auch 7-ADCA umgesetzt.

*)Cephemkernen wurde aus der Stärke der Absorption der überstehenden Schicht bei 260 m/u ermittelt. Bei allen Proben war die Ausbeute an

Unter Einsatz einer 1 Tag alten Schrägkultur von Xanthomonas citri IFO-3835 wurde der oben beschriebene Vorgang wiederholt, die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 ersichtlich.

In den Bezugsbeispielen und Beispielen wurde die Ausbeute, an Cephalosporinester mit einem Densitometer grob geschätzt und durch die folgenden Zeichen angegeben:

.- ί keine Produktion + : weniger als 0,01 (Molverhältnis bezogen auf "* Ausgangs-7-ADCA-Ester)

+ : 0,01 - 0,05
++ : 0,05 - 0,3

mehr als 0,3

- 17 - ' 409824/1088 B&DQRK5INÄL

T a b e lie

7-ADCA-Ester	Xanthomonas orvzae	Abnahme an 7-ADCA- Ester	Xanthoraonas	> citri
(nur Esterrest ist	IPO-3955	'< 5 J0	IFO-3Ö5:
angeführt) *	Produktion von Cephalosporin- ester	<5*	Produktion von Cephalosporin- ester	Alinahino an 7-ADCA- Ester
Benzyl		15 %	±
Bis- (p-methoxyphenyl) - methyl		< 5 1° -
2,2,2-Trichlor^äthyl	+	< 5 i°	+
Benzhydryl	±	<5 *■	±	< 5 %
3,5-Dimethoxybenzyl	±		±	<5 fo
5,5-Di-tert-butyl-4- abgcösashyd roxyb enzy 1	±	< 5 r^	±	12 % °° co
tert-Butyl	+	75 %		<5 ja 5^ ^
Tripheny!methyl	, ±	±	CO /CC/
H(7-ADCA)*	+ 1·+	1-tt	<5 JS
10 fo
80 %

* Daten des Reaktionsgemisches nach -1 Stunde. Alle anderen Daten gelten für die Reaktionsgemische nach ¹^ Stunden.

3 Tage alte Schrä(jkultüren der ent sprechenden unten
angeführten Mikroorganismen wurden in einem mit 1OO ml gefüllten 1 Liter-Kolben beimpft". Jedes der beimpften Medien wurde unter Schütteln bei 28 C 20 Stunden lang kultiviert, die entstandenen Kulturbrühen wurden zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Die Zellen wurden mit 100 ml 0,05 M
Phosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 6 einmal gewaschen und in 20 ml der Pufferlösung suspendiert. Jeder der entstandenen Zellsuspensionen wurde in Mengen von je 2 ml
auf je ein Testrohrchen verteilt. Jede der so hergestellten Zellsuspensionen wurde dem Reaktionssystem aus D-2-Phenylglycin-methylester und den unten angeführten 7-ADCA-Estern zugegeben (wie in Bezugsbeispiel 1 angeführt). Die Ergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich.

- 19 -098 2U 1088

BAD ORiGtNAL

Tabelle

O CO CO

	Acetobacter	B	Acetobacter	B	Acetobacter	B	Gluconobacter	B	C
7-ADCA-Ester	pas t Guri amis	.< 5 %	turbidan3	< 5 io	xylinum "ΐΗΡδ'144·.	< 5 %	su bp_xyrl a η ρ	<5 %
(es ist nur der Esterrest angegeben)	A	<5 io	Λ	< 5 io	A	<5 %	A	<5 %	JOO)
	• ±	. 8 %	±	io io	±	1 Ci I JO	■±	<5 ϊ	CD KJ
I ; Benzyl	I ±	<5 io		< 5· io	±	<5 c/o	±	<5 io
Bis-(p-methoxyphenyl) methyl	+	<5 io	+	< 5 io	+	<5 io :	±	<5 io
2,2,2-Trichlor^äthyl	±	<5 fr	±	< 5 c/o	+J	<5 %	±
Benzhydryl	± ,	6 io	±	5 io	±	5 %	±	<5 i;"
3,5-Diinethoxybenzyl		•<5 *		< 5 %		<5 %	±	<5 5*
3,5-Di~tert-butyl-4- ; hydroxybenzyl	+ '	70 io	+	65 io	+	55 io	±	35 io
■ tert-Butyl	±		±		±		±
Triphenylinethyl
Γ Η(7-ADCA)*

* Die Daten für 7-ADCA, gelten für die Reaktionsgemische nach 1 Stunde; die Daten für 7-ADCA-Ester für Reaktionsgemische nach 4 Stunden Anmerkung A: Produktion, an Cephalosporinester B: Abnahme an 7-ADCA-Ester

.i spiel "}i ~ β/1 »

Mit den entsprechenden 2 Tage eilten Schrägkultüren der unten angeführten Mikroorganismen wurden in einem 1 Liter-Kolben befindliche 100 ml Medium G beimpft. Dann wurde unter Schütteln 20 Stunden bei 28 C kultiviert. Die entstandenen Zellen wurden aus den Kulturbrühen abzentrifugiert, mit 100 ml 0,05 M Phosphatpiifferlösung von pH 6 einmal gewaschen und in 20 ml dieser Lösung suspendiert. Jede der Suspensionen wurde in einer Menge von je 0,2 ml in Teströhrchen eingebracht und jede der entstandenen Zellsuspensionen wurde einem aus-D-2-Phenylglycinmethylester und den unten angeführten 7-ADCA-Estern bestehenden Reaktionssystem, wie in Bezugsbeispiel 1 beschrieben, zugegeben. Die Ergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich.

- 21 -

0982 4/108 8

Tabelle

	*■»
	ο
03 &	CO OO
	NJ
3}	■>^
	CD
	00
	OO

7-ADCA-Ester	Mycoplana	B	Protaminobacter	B	Pseudomonas	B	PseudoEcna ο	B
(es ist nur Esterrest	dimorpha	<5 $	aIboflavus	<5 c/i	melaRenura	<5 1°	malton.hi^a	<5 cJo
angegeben)	IK)-I? 213	<5 fo	1FO-13221	<5>	Ι1Ό-12020	<5 %	IFO-126SO	<5 c/^
	A	12 70	A	8 fo	A	10 #	A	6 70
Benzyl	1+	<5 6Jo	+1	<5 c/o	14-	<5 fo	14-	<5 ^
Bis- (p-methoxyphenyl)- methyl	±	<5 5&	4-1	<5 Io	±	<5 %	+1	<5 ^
2,2,2-Trichlor^äthyl		<5·*		<5 Jl	+	<5 9δ		<5 #
Benzhydryl	, ±	8 5fe	±	5 °/« . ■	+1	6 L/o	±	< 5 ^
3,5-Dimethoxybenzyl		<5 S^	±	<5 ?S	±	<5 %	44	< 5 ^
3,5-Di~t-butyl-4- I hydroxybenzyl		65 ^ v	14-	68 Jt	±	70 ^ '	4-1	45 ^ ;
t-Butyl	+	+	■· +	14-
Triphenylmethyl ;		4-1	+1	4-1
H(7-ADCA) ' · .	• +++		+++	++

Die Daten für 7-ADCA geltqn für die Reaktionsgemische nach 1 Stunde; die Daten für 7-ADGA-Ester für die Reaktionsgemische nach k Stunden.

Anmerkung; As Produktion von Cephalösporinester
B: Abnahme an 7-ADCA-Ester

K&

SS

In 200 ml Kolben wurden 20 ml Medium Λ eingebracht,dann wurde das Medium in jedem Kolben mit einer- Öse einer 1 Tag · alten Schrägkiiltur der unten angef uhr ton Milcro organ! sjnen beimpft. Es wurde unter Schütteln bei 28 C 20 Stunden lang kultiviert. Jede der entstandenen Kulturbrühen wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, diese wurden mit 20 ml 0,05 M Phosphatlösung mit einem pH-Wert von 6 gewaschen und in 10 ml der genannten Pufferlösung suspendiert. Jede der so hergestellten Lösungen wurde auf Teströhrchen in Mengen zu 2,5 ml pro Röhrchen verteilt. D-2-Phenylglycinmethylester und jeder der unten angeführten 7-Amino-3-desacetoxycephalosporansäure(7-ADCA)-ester wurden in 2,5 ml der gleichen Phosphatpufferlösung in Konz ent rat ionen von 6o mM bzw. JO niM gelöst, diese Lösung wurde in jede der Teströhrchen eingebracht. Die Reaktion wurde unter Schütteln bei 37 C durchgeführt, nach 0, 30, 6θ und 120 Minuten wurden jedem Reaktionsgemisch Proben von je 0,5 nil entnommen. Dann wurden jeder der Proben 2,0 ml Tetrahydrofuran zugegeben und die Zellen und denaturierten Proteine abzentrifugiert. Die erhaltene überstehende Schicht wurde hinsichtlich der Menge an restlichen 7-ADCA-Ester, der hergestellten Menge Cephalospörinester, der prozentuellen Ausbeute an Cephemkern und,anderen Variablen untersucht. Die Ergebnisse wurden mit den zum Zeitpunkt 0 erhaltenen Ergebnissen verglichen, um die im Verlauf der Reaktion aufgetretenen Veränderungen feststellen zu können. Die Menge an 7-ADCA-Ester wurde durch Entnehmen einer Probe von 0,5 ml aus der überstehenden Schicht, Abdestillieren des Lösungsmittels, Auffüllen des Rückstandes auf 5|0 nil mit einer 5 /oigen wässerigen Ameisensäurelösung und Anwendung des in Bezugsbeispiel 1 erwähnten Marrelliverfahrens bestimmt,

Die erhaltenen Cephalosporinester wurden bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel (Entwicklerlösungsmittel (i) Obere Schicht von n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:5);

A q S 8 2 4 / IO 8 8

2360282

(2) Chloroform/Ac«.» Lon ( ο :.'?)) j owe i J;; als UV-absorbierondor, Ninhydrin-posi1ivor IM pck ftoi'undon. JVi.o jToznutiiollc .Auiibou in an CophiMnlcom vunle aus dor St<irko dor Absorption dor iiborst olionden Schicht hoi .?6θ in ,u boi'echnoi-. Aus TaIu-I Io h sind die oiiißpsctzlon J-Al)CA-V,: tor mid die Ei'f7ebjii.si-it? nach όθ IIiiiutcui Reaktiojiszod t orsiclitJ icli. Zur Kontrolle vurde unter den glpidip.n Bodiii;.7uii,^(in 7-ADCA umgesetzt.

Es vurde (jeftmdon, dai'> die aus MethylsulTonyläthylostor, Äthyl suJ i'onylä tliylostor und bzv. PhenylsulfonyJäthylestor der 7~ADCA lior/7f?stell ton Oeplial Dsjiorincüter mit auf cheiniechom Veße lier^ostel 1 ton Proben von Ceplialexinmethylsul i'ony 1-äthy 1 ο fi sr, Ooplinlexinäthy .1 sul fonyl ä" t -hy] ester und Cephal oxinpheiiylsul fonyl äthj'-l ostor iduiit sind.

- Zh -

409824/ 1088 BAD ORiGiNAL

Tabelle h

O CO CO

7-ADCA-Ester (es ist nur der Esterrest angegeben

Me thylsulfonyläthyl Äthylsulf onyl ätiiyl PhenyIsulfonylä thyl H(7-ADCA)

Xanthomona3 oryzae IFO-3995

Produktion an _Λυιι»ιιΐιι« Cephalosporin· an 7-ADCA··

ester

Abnahme

Ester

80 f»

85 V" 70 Vo 72 ⁽/o

Ausbeute

phenikern

Xanthomonas citri

IFO-3835

Produktion an Cephalosporinester

Abnahme ani Ausbeute 7-ADCA- an Ce-Ester phenikern

85	Vo	>	95
81	Io '	>	95
75		>	95
82	>	95

Beispiel 2;

Tn Kolben mit 200 ml Fassurigsrauin wurden je hO ml Medium B eingebracht, mit jeweils einer Öse einer 3 Tage alten Schrügkultur der in Tabelle 5 angeführten Mikroorganismen beimpft , Es wurde unter Schütteln bei 28 C hS Stunden lang IcuL-tiviert. Dann wurden aus jeder der entstandenen Kulturbrühen die Zellen abzentrifugiert, mit kO ml 0,05 M Phosphatpufferlösung einmal gewaschen (pH-Wert 6,0) und in 10 ml der Pufferlösung suspendiert. Jede der so erhaltenen Suspensionen wurde in Mengen von je 2,5 ml pro Röhrchen auf Teströhrchen verteilt, dann wurde jeder der so hergestellten Zellaasuspensionen D-2-Phenylglycinmethyle.ster und jeder der nachstehend angeführten 7-ADCA-Ester zugegeben. Das System wurde 60 Minuten lang unter den in Beispiel 1 angeführten Bedingungen reagieren gelassen. Der Ergebnisse sind aus Tabelle 5 ersichtlich.

- 26 -

409824/1088 BAD ORIGINAL

Tabelle 5

•P-

to OO

OO OO

"7—ADGA—Ester (es ι

Aceto"bacter

A

B

α

Acetobaci:

. A

ß ■

er

C

io

Acetobacter

A

B

C

j

GI11 c 0110b act G τ

A

3 .

C .

• pasteurianua .

70 $

>95 io

.'tiirb idans

+++

70 io

■

>95

io

xylinum

+++

60 c/'o

>35

C/o

suboxydans

42 io

>95 ?·:

rest angegeben)

IFO-3223

+++

65 %

>95 fj

IFO-3225

-H-+

65 io

>95

Yo

, IFO-8144

+++

55 io

>95

c/o

IFO-313Q

23 ^

>95 fr

+++

73 io

>95 %

+++

65 a/o

>95

io

+++

48 io

>95

++

31 io

>95 5i

Methylsulfonyl äthyl

+++

72 °h

>95 */*

+++

68 Jo

>95

+++

>95

-H-

30 fo

>95 '/«

ÄthylsulfonylathyI

Phenylsulfonylöthyl

H(7-ADCA)

Anmerkung A: Produktion von Cephalosporinester
B: Abnahme an 7-ADCA-Ester
C: Gesamtausbeute an produziertem Cephemkern

O CJ3

Beispiel 3'· Q%

In Kolben mit 200 ml Fasf.iin;;?rauin wurden je hO ml Medium C eingebracht und mit einer Öse der entsprechenden, 2 Ta{jc alten Schrägkxil türen der unten angeführten Mikroorganismen beimpft. Es wurde unter Schütteln bei 28 C ^S Stunden 1ang kultiviert. Jede der so entstandenen Kulturbrühen wurde zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, diese wurden in 10 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-tfert von 6,0 suspendiert. Jede so erhaltene Suspension wurde in Mengen von je 2,5 ml pro Röhrchen auf Teströhrchen verteilt. Jeder der hergestellten Suspensionen wurde D-2-Phenylglycinmethylester (Konzentration: 60 mM) und jeder der nachstehend angeführten 7-ADCA-Ester in einer Konzentration von 30 mM zugegeben, das System wurde bei 37 C 60 Minuten lang reagieren gelassen.Die Ergebnisse sind aus Tabelle 6 ersichtlich. Die aus Methylsulfonyläthylester, Xthylsulfonyläthylester bzw. Phen3^rlsulfonyläthylester der 7-ADCA hergestellten Cephalosporinester erwiesen sich als ident mit auf chemischem ¥ege hergestellten Proben der Cephalexinraethylsulfonyläthylester, Cephalexinäthylsuifonyläthylester bzw. Cephalexinphenylsulfonyläthylester.

- 28 -

/, (ι a η ; u 11 u β 8

BAD ORIGINAL

T a b e lie 6

7-ADCA-Ester (es ist nur der· Ester rest angegeben)

Mycoplana diraorpha

B

σ

ProtaminolDacter

B

C

Pseudomonas

B

C

PsGudoraonas

B

C

Me thylsulf onyläthyl Äthylsulfonyläthyl PhenyIsulfonyla thyI H(7-ADCA)

A

65 c/o 60 % 55 c/o 62 io

>95 % >95 io >95 c/o >95 io

alboflavus

60 fo 53 fo 62 io 60 io

>95 o/o >95 io >95 io >95 p/o

melanogeniim TFO-12020 ■

70 fo 62 $> 65 % 65 #

>95 % >95 5^ >95. fo >95 %

malt-ophila

40 fo 35 fo 25 6Z- - 42 fi

>95 f- >95 % >95 > >95 c/i

Z

A

Λ

Λ

-H-

Anmerkung Aj Produktion von Cephalosporxnester B: Abnahme an 7-ADCA-Ester C: Gesamtausbeute an Cephemkern

£f

CD

CJj)

Beispiel 't i

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Xanthomonas oryzae IFO-3995 und Xanthomonas citri IFO-3S35 20 Stunden lang kultiviert, um je 20 ml Kulturbrühe zu erhalten. Jeder Brühe wurden die Zellen entnommen, in 10 ml 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 6,o) suspendiert und in Mengen von je 2,5 ml pro Röhrchen auf 4 Testrührchen verteilt Der D-2-Phenylglycinmethylester und jeder der nachstehend angeführten 7-ADCA-Ester wurden in 2,5 ml der oben genannten Phosphatpufferlösung mit Konzentrationen von 60 mM bzw. 30 niM gelöst. Die entstandene Lösung wurde jedem der Teströhrchen zugegeben. Die Reaktion wurde unter Rühren bei 37 C 60 Minuten lang fortgesetzt. Als 7-ADCA-Ester wurden die entsprechenden Methoxymethy!ester, Methylthxoniethylester und Methylsulf inylmethylester eingesetzt. Die erhaltenen Cephalosporinester varen ident mit auf chemischem Wege hergestellten Proben von Cephalexinmethoxymethylester, Cephalexinmethylthiomethylester und Cephalexinmethylsulfinylmethylester. Die Ergebnisse dieser Reaktionen sind aus Tabelle 7 ersichtlich.

- 30 -

409824/108 8

T a b e lie

	Xanthomonas	B	C	Xanthomonas ci-tri	B	I	•	C
7-ADCA-Ester (es ist nur der Esterrest an gegeben)	oryzae . IFO-3995 '	ÄQ Γ ΟΟ /o	>95c/o	. IPO-3835	70 7"	>95 %
	A	72 io. ■	>95 $	A	65 %	■>95 fo
Methoxymethyl	+++	75 %	>95 l/o	+++	73 io	> 95 fo
MethoxythiomethyI	+++	70 56	>95 f°	+++	78 io ,
Methylsulfynylmethyl	+++			+++
H(7-ADCA)				•f++

Anmerkung A: Produktion an Cephalosporinester B: Abnahme an 7-ADCA-Ester C: Gesamtausbeute an Cephemkern

Beispiel 5 ι

Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden Acotob.iCtor j)?istonrianus TFO-3223, Acetpbactor turbidans IFO-3225 und Acetobiictnr xylinnm IFO-81'f^ jeweils 20 Stunden lang kultiviert, um je '4O ml Kulturbrühe zu erhalten. Aus jeder Brühe wurden die Zellen entnommen und in 10 rnl 0,05 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Fert von 6,0 suspendiert. Diese Suspension wurde in Mengen von je 2,5 ml pro Röhrchen auf h Teströhrchen verteilt. D-2-Phen.ylglycinniethylester und jeder der nachstehend angeführten 7-ADCA-Ester wurden in 2,5 ml der Phosphatpufferlösung in Konzentrationen von όθ m!I bzw. 30 i"M gelöst, die entstandene Lösung wurde in jedes der Teströhrchen eingebracht. Die Reaktion wurde unter Rühren bei 37 C 60 Minuten lang· fortgesetzt. Als 7-ADCA-Ester wurden die entsprechenden Methylsulfinylmethylester, Cyanoäthylester und Aniinoäthylester verwendet. Die angesammelten Cephalosporinester waren ident mit auf chemischem Vege hergestellten Proben von Cephalexinmethylsulfinylmethylester, Cephalexincyanoäthylester bzw. Cephalexinaminoiithylester_c Die Ergebnisse dieser Reaktionen sind aus Tabelle 8 ersichtlich.

409Ü24/1088

T a belle

7-ADCA-Ester
(es ist nur der
Esterrest angegeben)

Methylsulfynylmethyl

ο Cyan^ätliyX

⁰⁰ Amino^thyl

ζ H(7-ADCA)

Acetobacter ^: pagteurianus IF0-3223

73

34 58 70

>95

>95 >95 >

Acetobacter turbidans

+-H

85 fo	>95
38 "/o	>95
35 fo	>95
70 °/o	>95

Acetobacter xyliniim
IFÖ-8T44

Anmerkung A: Produktion von Cephalosporinester B: Abnahme an 7-ADCA-Ester C: Gesamtausbeute an Cephemkern

%

$

fc Yc

> 95 #

> 95 5«» >95 ?& >95 7«

CJ) O NJ CD K>

Beispiel· 6;

200 nil Medium B wurden in einen 1 Liter-Kolben eingebracht und mit Zellen einer 3 Tage alten Schrägkultur von Acetobacter turhidans IFO-3225 beimpft. Es wurde bei 28°C hS Stunden lang kultiviert. Aus der entstandenen Kulturbriihe wurden die Zellen abzentrifugiert und in 50 ^ml destilliertem Wasser suspendiert. 50 ^m^- einer wässerigen Lösung mit einem pH-Wert von 6,0, welche 160 mM D-2-Phenylglycinmethylester und 80 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester enthielt, wurden mit 50 ml der wie oben beschrieben hergestellten Zellsuspension vermischt. Das System wurde unter Rühren bei 37 C 30 Minuten lang reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde der pH-Wert des Systems mit 2X NaOH-Lösung auf 6 gehalten. Nach beendeter Reaktion wurde die erhaltene Menge an Cephalosporinester polarimetrisch bestimmt. Sie betrug 28,5 mM.Das System wurde abgekühlt und die Zellen abzentrifugiert. Der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit wurde auf 4,5 eingestellt, die Flüssigkeit wurde über Nacht bei h C stehen gelassen* Dann wurden die D-Phenylglycinkristalle daraus entfernt und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei e,iner Temperatur von nicht mehr als 30 C auf 1/3 seines ursprünglichen Volumens eingeengt. Das Konzentrat wurde wieder bei h C über Nacht stehen gelassen. Der entstandene Niederschlag wurde entfernt und die überstehende Schicht an einer Kolonne von Amberlite XAD-2 chromatographiert'. Die Kolonne wurde mit Wasser durchspült, um die Cephalexinesterfraktionen zu,sammeln. Die mit dem gewünschten Ester angereicherten Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Man erhielt auf diese Weise 1,2 g pulverförmigen Cephalexinmethylsulfonyläthylester mit einem Reinheitsgrad von etwa 93 5», einem

Schmelzpunkt von 15^-152°C, fa/^= +1O2°(c=O,5 #, H_o0)} •\cL " *·

^E1cm ²⁶° ⁽²⁶° ^m/^u)·

409824/1088

Beispiel >:

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde Xanthomonas citri IFO-3935 20 Stunden lan/?: kultiviert, um 20 ml einer Kulturbrühe ?.u erhalten, aus welcher dann die Zeilen abzentrifugiert und in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert wurden. Dann wurden 10 ml dieser ZolTsuspension mit einer inzwischen hergestellten wässerigen Losung (pH=6), welche 80 mM D-2-Phenylglycininethylester-Hydrochlorid und 40 mM 7-Aminocephalosporansäure(7-ACA)methoxymethylester enthielt, vermischt. Das System wurde unter Rühren bei 37 C 30 Minuten reagieren gelassen, der pH-Vert wurde während der Reaktion auf 6,0 gehalten. Nach beendeter Reaktion wurde nach dem in J.Am.Chem.Soc .,9Jl_-, ^035» (1972-) beschriebenen enzymatischen Verfahren eine Menge von 12,5 mM Cephalo'glycinmethoxymethylester festgestellt.

Beispiel 8;

In einen Kolben mit 100 ml Fassungsraum wurden 20 ml Medium B eingebracht und mit einer Öse voll von Zellen einer 3 Tage alten Schrägkultur von Acetobacter turbidans IFO-3225 beimpft, dann wurde unter Schütteln bei 28 C 2k Stunden lang kultiviert. Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe abzentrifugiert und in 5 ml destilliertem Wasser suspendiert. Diese Zellsuspension wurde dann mit 5 ml einer Lösung von 160 mM DL-a-amino(2'-ThienylJ-essigsäuremethylester-Hydrochlorid und 80 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester in destilliertem Wasser vermischt. Das System wurde 1 Stunde lang bei 37 C reagieren gelassen, wahrend dieser Zeit wurde der pH-Wert mit 5N NaOH auf 6,0 gehalten. Man erhielt im Reaktionsgernf. sch 27,5 mM DL-7- ^x-Amino-(2 '-thienyl)acetamido]f-3-desacetoxy-3-cephem-h-carbonsäuremethylsulfonyläthylester.

Beispiel 9s

In einen Kolben mit 100 ml Fassungsraum wurden 20 ml

- 35 -

4098 24/ 1088; BAD ORIGINAL

Medi tun A eingebracht, mit einer Öse einer 2 Tage alten Sciir.i_t'ikultur von Xanthomonas citri IFO-3^35 beimpft, dann wurde 20 Stunden lang· bei 28 C kultiviert. Die Zellen wurden aus der Kulturbrühe abzentrifugiert und in 5 ml destilliertem Wasser suspendiert. Diese Zellsuspension wurde mit einer inzwischen hergestellten Lösung (pH-Wert 6,0) von 1 60 m>i D-CC-amino(p-hydroxyphenyl)essigsäuremethylester-Hydrochlorid und 80 mM 7-ADCA-Methylsulfonyläthylester in destilliertem Wasser vermischt. Das System wurde 1 Stunde lang bei 37 C reagieren gelassen, während dieser Zeit wurde der pH-Wert durch Zugabe von 5N NaOH auf 6,0 gehalten. Man erhielt 29,3ⁿ'M D-7- £ oc- amino ( p-hydroxyphenyl) ac et amido'j-3-de sac et oxy-3-c epheni-4-carbonsäureniethylsulfonyläthylester im Reaktionsgemisch.

0 Figuren
11 Patentansprüche

40982W1U88 BAD OFIIGIhWL

Claims (1)

1. worin R für einen sechsgliedrigen, cyclischen, gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoffrest, welcher gesättigt oder ungesättigt sein kann, oder einen ungesättigten, fünfgliedrigen heterocyclischen Rest, der ein Heteroatom im Ring auf-

   1 2 2

   weist, steht, R für Wasserstoff oder -OR steht, worin R

   e ine organische Gruppe bedeutet, η 1 oder 2 und X -OR , -SO R , -NH₂ oder -CN bedeuten, worin R für eine Alky!gruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder, eine Phenylgruppe und m für 0, 1 oder 2 stehen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung aus

   1) einer a-substituierten-a-Aminosäure der allgemeinen Formel ,

   R-CHCOOH

   oder einem reaktionsfähigen Derivat derselben, worin R die oben angeführte Bedeutung hat und

   2) einer 7-Aminoceph.emverbindung der allgemeinen Formel

   (III)

   C00(CH₂)_n-X

   - 37 -

   409824/1088'

   worin R ι η und X die oben angeführten Bedeutungen haben, in einem wässerigen Medium der enzymatisehen Reaktion mit einem Mikroorganismus aus der Familie Pseudomonadaceae, welcher fähig ist, einen Cephalosporinester dor Formel (i) aus einer CC-substituierten-cc-Aminosäure der Formel (ll) oder deren reaktionsfähigem Derivat und einer 7-Aminocepheraverbindung der Formel (ill) herzustellen, unterworfen wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die α-substituierte Säure oder ihr reaktionsfähiges Derivat und die 7-Aminocephemverbindung mit einer Kulturbrühe des Mikroorganismus oder mit einem cephalosporinproduzierendes Enzym enthaltenden, aus einer Kulturbrühe erhaltenen, aufgearbeiteten Material in Berührung gebracht werden.

   3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion im Temperaturbereich von etwa 5 bis etwa 50 C und bei einem pH-Wert von etwa h bis etwa 8 vorgenommen wird_e

   k. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der 7-Aminocephemverbindung im wässerigen Median im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10,0 ^c/o Gew./Vol und jene der ct-sübstituierten-a-Aminosäure oder ihres reaktionsfähigen Derivates im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 # Gew/Vol liegt.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

   gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen For-

   f iir T "\

   mel (ill) einsetzt, in der ^/-OR^steht, worin Tr für ein

   Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe steht.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis h, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (Hl) einsetzt, in der X für -SO R^ steht, worin R^ für Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe und m für 0, 1 oder 2 stehen.

   409824/1088

   7· Verfahren riacli einem dei- Ansprache 1 bis η, dadurch gekeimzeiclinet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (ill) einsetzt, in der X für eine Aminogruppe steht.

   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (ill) einsetzt, in der X fur/Cyangruppe steht.

   9· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als reaktionsfähiges Derivat der a-sub-

   tituierten-oc-Aminosäure ein Alkylester, ein Aralkylester, ein Arylester oder ein Alkylthioester derselben eingesetzt wird .-"..-

   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus einsetzt der zu einer der Gattungen Mycoplana, Protaminobacter, Acetobacter, Gluconobacter, Xanthononas oder Pseudomonas gehört.

   11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Acetobacter acetosus, Glixconobactei? albidus,

   Acetobacter aurantiua, Gluconobacter cerinus, Crluconobacter Industrins, Gluconobacter (ΐ

   GlucoRObacter gluconicus, Gluconobacter liquefaciens, Gluconobactsr melanogenus, Gluconobacter oxydans, Acetobacter pas^&rlanus, Gluconobacter sub oxydans, Acetobacter turbidana, Acetobacter xylinua, Xanthomonaa c-jOiapestris, Xanthomonas cucurbitae, Xanthomonaa hyacinthi, Xanthomonaa phaseoli, Xanthomonas physalidiacola, Xanthomonas citrl, ' Xanthomonaa-pruni, Xanthomonas oryzae, Pseudomonas convexa, Pseudoiaonas maltophilla, Pseudomonas melanogenua _t: Pseudoaonas Tendrelli, Mycoplana dimorpha, Hycoplana bullata c*" Protaminobacter.alboflavuseingesetzt wird.

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   BAD ORiGiNAL

   12. Cephalosporinverbindungen der allgemeinen Formel

   worin R für einen sechsgliedrigen, cyclischen, gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoffrest, welcher gesättigt oder ungesättigt sein kann, oder einen ungesättigten, fünfgliedrigen heterocyclischen Rest, der ein Heteroatom im Ring aufweist,

   1 2 2

   steht, R für Wasserstoff oder -OR steht, worin R eine organische Gruppe bedeutet, η 1 oder 2 und X -SO R^ bedeuten₉ worin m für 0, 1 oder 2 und Fr für eine Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder eine Phenylgruppe steht.

   13· Cephalosporinverbindung nach Anspruch 12₅ wobei X in der allgemeinen Formel den Methylsulfonylathylrest bedeutet.

   14. Cephalosporinverbindung nach Anspruch 12, wobei X in der allgemeinen Formel den Ä'thylsulfonyläthylrest bedeutet.

   15. Cephalosporinverbindung nach Anspruch 12, wobei X in der allgemeinen Formel den Phenylsulfonyläthyl.rest bedeutet.

   16. Cepahlosporinverbindung nach Anspruch 12, wobei X in der allgemeinen Formel den Methylthioäthylrest bedeutet. ·

   17. Cephalosporinverbindung nach Anspruch 12, wobei X in der allgemeinen Formel den Methylsulfinylmethylrest bedeutet.

   18. Cephalosporinverbindung nach Anspruch 12, wobei X in der allgemeinen Formel den Methylsulfonylathylrest bedeutet.

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