DE2710455C2 - N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid-alpha-methylamide, process for its preparation and pharmaceuticals containing this compound - Google Patents
N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid-alpha-methylamide, process for its preparation and pharmaceuticals containing this compoundInfo
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- A61K2039/5555—Muramyl dipeptides
Description
OHOH
NH—COCH3
H3C-CH-CO—NH-CH- CO—NH- CH-CONHCH3 NH-COCH 3
H 3 C-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CONHCH 3
COOHCOOH
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise Benzyl^-acetamido-^o-O-benzyliden-S-O-iD-l-carboxyätnyO^-desoxyjJ-D-glucopyranosid mit dem entsprechenden Dipeptid, dessen gamma-Carboxylgruppe geschützt ist, umsetzt und die Schutzgruppen abspaltet.2. Process for the preparation of the compound according to claim 1, characterized in that in each case in a manner known per se benzyl ^ -acetamido- ^ o-O-benzylidene-S-O-iD-l-carboxyätnyO ^ -deoxyjJ-D-glucopyranoside with the corresponding dipeptide, the gamma-carboxyl group of which is protected and splitting off the protecting groups.
3. Arzneimittel, enthaltend den Wirkstoff nach Anspruch 1 zusammen mit üblichen pharmazeutischen Zusatz- und Verdünnungsmitteln oder Impfstoffzubereitungen.3. Medicaments containing the active ingredient according to claim 1 together with conventional pharmaceuticals Additives and diluents or vaccine preparations.
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Die Erfindung betrifft N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-alpha-methylamid, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung sowie diese Substanz als Wirkstoff enthaltende Arzneimittel.The invention relates to N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid-alpha-methylamide, a process for the preparation this compound as well as drugs containing this substance as an active ingredient.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist in Wasser löslich und kann als wirksames immunologisches Adjuvans dazu verwendet werden, in einem Organismus die Immunreaktion zu stimulieren.The compound of the invention is soluble in water and can be used as an effective immunological Adjuvant can be used to stimulate the immune response in an organism.
Bei dem erfindungsgemäßen Adjuvans handelt es sich um N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäurealpha-methylamid [2-(2-Acetamido-2-desoxy-3-O-D-glucopyranoxyI)-D-propionyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-(alpha-methylamid)] der Formel IThe adjuvant according to the invention is N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid alpha-methylamide [2- (2-Acetamido-2-deoxy-3-O-D-glucopyranoxyI) -D-propionyl-L-alanyl-D-glutamic acid- (alpha-methylamide)] of formula I.
CH2OHCH 2 OH
OHOH
NH-COCH3
H3C-CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH-CONHCH3 NH-COCH 3
H 3 C-CH-CO-NH-CH-Co-NH-CH-CONHCH 3
(CH2J2
COOH(CH 2 J 2
COOH
das im folgenden der Einfachheit halber abgekürzt als MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH1) bezeichnet wird.which in the following is abbreviated as MUr-NAc-L-AIa-D-GIu (NHCH 1 ) for the sake of simplicity.
Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die die genannte Verbindung enthalten und insbesondere dazu dienen, die Wirkung der schwachen Immunogene zu verstärken. Insbesondere betrifft die Erfindung Arzneimittel, die die genannte Verbindung enthalten und die dazu verwendet werden können. Menschen und Warmblüter gegen Bakterien-, Virus- und Parasiten-Infektionen und gegen verschiedene Gewebeantigene normalen oder pathologischen Ursprungs zu immunisieren.The invention also relates to medicaments which contain the said compound and in particular thereto serve to enhance the effect of the weak immunogens. In particular, the invention relates to pharmaceuticals, which contain the said compound and which can be used for this purpose. Humans and warm-blooded animals against bacterial, viral and parasite infections and against various normal tissue antigens or to immunize pathological origin.
Ein besonderes Interesse an der erfindungsgemäßen Verbindung beruht auf der Tatsache, daß es nicht erforderlich ist, auf besondere Verabreichungsmedien zurückzugreifen, von denen die Adjuvanswirkung abhängt, so daß die Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe, mit denen der Wirkstoff kombiniert wird, lediglich dazu· verwendet werden, die Anwendung des Produktes zu erleichtern. Insbesondere ist esA particular interest in the compound of the invention is based on the fact that it is not required is to use special administration media on which the adjuvant effect depends, so that the binders, carrier materials and / or auxiliaries with which the active ingredient is combined will only be used to make the product easier to use. In particular it is
nicht erforderlich, bei der Injektion des genannten Produktes eine Zubereitung zu verwenden, die eine Ölphase aufweistit is not necessary to use a preparation that has an oil phase when injecting the named product having
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Adjuvans auf oralem oder parenieralem Wege, insbesondere durch Injektion oder mit Hilfe der Impflanzette, oder über die Schleimhäute verabreicht werden.Furthermore, the adjuvant according to the invention can be administered orally or parenatally, in particular through Injection or with the aid of the implantable lancet, or through the mucous membranes.
Die Erfindung betrifft insbesondere Arzneimittel, die MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH3) zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel, Trägermaterial und/oder Hilfsstoff enthalten. Die besonders bevorzugten Zubereitungen dieser Art umfassen injizierbare Lösungen, die eine wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten. Zu diesem Zweck verwendet man vorteilhafterweise sterile Lösungen in einer wäßrigen, vorzugsweise isotonischen Phase, wie in einer isotonischen Salzlösung oder einer isotonischen Glucoselösung. Die Erfindung ist jedoch hierauf nicht beschränkt, so daß man auch ejnfache Lösungen in destilliertem Wasser verwenden kann. Es ist femer möglich, Injektionsmedien mit einer Ölphase zu verwenden, insbesondere Wasser-in-Öl-Emulsionen. Diese Emulsionen erhält man insbesondere mit pflanzlichen Ölen, die vom Stoffwechsel abgebaut werden können, wie sie beispielsweise in der FR-PS 23 13 078 beschrieben sind.The invention relates in particular to medicaments which contain MUr-NAc-L-Ala-D-GIu (NHCH 3 ) together with a pharmaceutically acceptable binder, carrier material and / or excipient. The particularly preferred preparations of this type comprise injectable solutions which contain an effective dose of the compounds according to the invention. For this purpose, it is advantageous to use sterile solutions in an aqueous, preferably isotonic phase, such as in an isotonic saline solution or an isotonic glucose solution. However, the invention is not restricted to this, so that single solutions in distilled water can also be used. It is also possible to use injection media with an oil phase, in particular water-in-oil emulsions. These emulsions are obtained in particular with vegetable oils which can be broken down by the metabolism, as described, for example, in FR-PS 23 13 078.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können in den verschiedenartigsten Formen vorliegen, wobei man zu ihrer Herstellung Bindemittel, Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet, die fur den angestrebten Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise verwendet man die Arzneimittel in Form von Cachets, Tabletten oder Gelkügelchen für die orale Verabreichung und in Form von Aerosolen oder Gelen bei der Verabreichung über die Schleimhäute.The medicaments according to the invention can be in the most varied of forms, with one to their production binders, carrier materials and / or auxiliaries used for the desired Route of administration are suitable. For example, the drugs are used in the form of cachets, Tablets or gel beads for oral administration and in the form of aerosols or gels for administration over the mucous membranes.
Das erfindutigägemäße Adjuvans kann auch in gefriergetrockneter Form vorliegen, so daß man unmittelbar vor der Verwendung Lösungen bereiten kann, die man durch Injektion oder mit Hilfe der Jmpfpflanze verabreichen kann.The adjuvant according to the invention can also be present in freeze-dried form, so that one can immediately solutions can be prepared before use to be administered by injection or with the aid of the vaccine can.
Eine pharmazeutische Zubereitung, die zur Herstellung von injizierbaren Lösungen unmittelbar vor ihrer Verwendung geeignet ist, umfaßt eine Dosis von etwa 2 mg des erfindungsgemäßen Adjuvans in gefriergetrocknetem Zustand und etwa 10 mg Lactose als Trägermaterial. Die Erfindung ist ferner auf Arzneimittel gerichtet, die MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH3) zusammen mit einem immunogenen Mittel enthalten, insbesondere zusammen mit einem schwachen impfenden Antigen.A pharmaceutical preparation which is suitable for the production of injectable solutions immediately before their use comprises a dose of about 2 mg of the adjuvant according to the invention in the freeze-dried state and about 10 mg of lactose as carrier material. The invention is further directed to medicaments which contain MUr-NAc-L-Ala-D-GIu (NHCH 3 ) together with an immunogenic agent, in particular together with a weak vaccinating antigen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH3), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man jeweils in an sich bekannter Weise BenzyW-acetamido^.ö-O-benzyliden-S-O-iD-l-carboxyäthyU^-desoxy-jS-D-glucopyranosid mit dem entsprechenden Dipeptid, dessen gamma-Carboxj ??ruppe geschützt ist, umsetzt und die Schutzgruppen abspaltet.The invention also relates to a process for the preparation of MUr-NAc-L-Ala-D-GIu (NHCH 3 ), which is characterized in that in each case BenzyW-acetamido ^ .ö-O-benzylidene- SO-iD-l-carboxyäthyU ^ -deoxy-jS-D-glucopyranoside with the corresponding dipeptide, the gamma-carboxy group of which is protected, and the protective groups are split off.
Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung, die insbesondere ein Beispiel zur Herstellung des erfindungsgemaßen Produktes sowie Versuche umfaßt, anhand derer die pharmakologischen Eigenschaften dieses Produktes ersichtlich sind.Details and advantages of the invention emerge from the further description, which in particular an example for the preparation of the product according to the invention as well as experiments on the basis of which the pharmacological properties of this product are evident.
Beispiel 1
N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsäure-alpha-methylamidexample 1
N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid-alpha-methylamide
In der ersten Stufe synthetisiert man die Peptidkette, worauf man in einer zweiten Stufe diese Kette an den Muramylrest bindet. Bei dieser Synthese sind die funktioneilen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, durch Schutzgruppen geschützt, die anschließend wieder abgespalten werden.In the first stage, the peptide chain is synthesized, and then in a second stage this chain is attached to the Muramyl residue binds. In this synthesis, the functional groups that do not take part in the reaction are protected by protective groups, which are then split off again.
Stufe A: BOC-D-GluiNHCHjJ-OBzlLevel A: BOC-D-GluiNHCHjJ-OBzl
Man löst 3,36 g (lOmMol) des y-Benzylesters von BOC-D-GIu (E.Schröder, E. Klieger, Justus Liebig's Ann. Chem. 673 (1964) 196) in 50 ml Tetrahydrofuran. Zu der auf -IS0C abgekühlten Lösung gibt man unter Rühren 1,1 ml (10 mMol) N-Methylmorpholin und 1,3 ml (10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester. Nach IO Minuten bei etwa O0C leitet man einen Strom von trockenem Methylamin in die Suspension ein. Nach 60 Minuten verdünnt man die Reaktionsmischung mit Äthylacetat auf 150 ml, worauf man die organische Phase mit Wasser bis zu einem neutralen pH-Wert wäscht und anschließend über Magnesiumsulfat trocknet. Nach dem Abfiltrieren engt man die Äthylacetatphase zur Trockne ein und fällt das Produkt mit Äther aus. Man erhält 2,8 g des Produktes (Ausbeute = 80%). Das Produkt besitzt folgende physikalische Kenndaten: 3.36 g (10 mmol) of the γ-benzyl ester of BOC-D-GIu (E. Schröder, E. Klieger, Justus Liebig's Ann. Chem. 673 (1964) 196) are dissolved in 50 ml of tetrahydrofuran. 1.1 ml (10 mmol) of N-methylmorpholine and 1.3 ml (10 mmol) of isobutyl chloroformate are added to the solution, which has cooled to -IS 0 C, while stirring. After 10 minutes at about 0 ° C., a stream of dry methylamine is passed into the suspension. After 60 minutes, the reaction mixture is diluted to 150 ml with ethyl acetate, whereupon the organic phase is washed with water to a neutral pH and then dried over magnesium sulfate. After filtering off, the ethyl acetate phase is concentrated to dryness and the product is precipitated with ether. 2.8 g of the product are obtained (yield = 80%). The product has the following physical characteristics:
^ F 124 bis 126°C ^ F 124 to 126 ° C
ί Mb + 1,4° (absol. Methanol)ί Mb + 1.4 ° (absolute methanol)
T Analyse: C18H26O5N2 (350,42)T analysis: C 18 H 26 O 5 N 2 (350.42)
5 berechnet: C 61,69% H 7,48% N 7,99%;
gefunden: C 62% H 7,6% N 8,2%.5 Calculated: C 61.69% H 7.48% N 7.99%;
found: C 62% H 7.6% N 8.2%.
Stufe B: Hydrochlorid von D-GIu(NHCH3)OBz] (B)Stage B: Hydrochloride of D-GIu (NHCH 3 ) OBz] (B)
Man behandelt 1,4 g (4 mMol) der in Stufe A erhaltenen Verbindung A während 30 Minuten mit 12 ml einer etwa 1 n-Chlorwas£erston*säurelösung in Essigsäure. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein und erhält das Produkt in Form eines Öls. Es erweist sich bei der Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel in einer n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/20/6/24, VoL/VoI.) als homogen.1.4 g (4 mmol) of the compound A obtained in step A are treated with 12 ml of a for 30 minutes about 1 n-chlorohydrate acid solution in acetic acid. The reaction mixture is concentrated to dryness and receives the product in the form of an oil. It turns out on thin layer chromatography on silica gel in a n-butanol / pyridine / acetic acid / water mixture (30/20/6/24, vol / vol.) as homogeneous.
BOC-L-AIa-D-GIu(NHCHO-OBzI (C)BOC-L-AIa-D-GIu (NHCHO-OBzI (C)
Man gibt 1 g (3,5 mMol) des Succinimidesters von BOC-AIa (G. W. Anderson, J. E. Zimmermann, F. M. CaI-lahan, J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 1839) zu einer auf 00C abgekühlten Lösung von 3,7 mMol der in Stufe B erhaltenen Verbindung B und 0,4 ml (3,7 πιΜοΐ) N-Methylrnorpholin in Dimethylformamid. Nach dem Stehenlassen über Nacht bei Raumtempuatur engt man die Reaktionsmischung zur Trockne ein und nimmt mit 100 ml Äthylacetat auf. Man wäscht die organische Phase nacheinander mit einer 10%igen Lösung von Zitronensäure in Wasser, mit einer 1 n-Natriumbicarbonatlösung und dann bis zur Neutralität mit Wasser. Man trocknet die Äthylacetatphase während 30 Minuten über Magnesiumsulfat, filtriert und engt zur Trockne ein. Man kristallisiert das Produkt aus einer Methanol/Petroläther-Mischung um. Man erhält 1,04 g (Ausbeute = 71%) des Produktes, das die folgenden physikalischen Kenndaten besitzt:To a solution, cooled to 0 0 C solution of (. GW Anderson, JE Zimmermann, FM CaI-Lahan, J. Am. Chem. Soc 86 (1964) 1839), adding 1 g (3.5 mmol) of the succinimide ester of BOC-Ala of 3.7 mmol of the compound B obtained in stage B and 0.4 ml (3.7 πιΜοΐ) of N-methylnorpholine in dimethylformamide. After standing overnight at room temperature, the reaction mixture is concentrated to dryness and taken up in 100 ml of ethyl acetate. The organic phase is washed successively with a 10% solution of citric acid in water, with a 1N sodium bicarbonate solution and then with water until neutral. The ethyl acetate phase is dried over magnesium sulfate for 30 minutes, filtered and evaporated to dryness. The product is recrystallized from a methanol / petroleum ether mixture. 1.04 g (yield = 71%) of the product are obtained which has the following physical characteristics:
F 145 bis 147°C
[a]jl + 6,4° (Eisessig)F 145 to 147 ° C
[a] jl + 6.4 ° (glacial acetic acid)
Analyse: C2IH31O6N3 (421,50)Analysis: C 2 IH 31 O 6 N 3 (421.50)
berechnet: C 59,84% H 7,41% 0 22,77% N 9,97%:
gefunden: C 60,2% H 7,4% 0 22,82% N 10,01%.
•55 Calculated: C 59.84% H 7.41% 0 22.77% N 9.97%:
Found: C 60.2% H 7.4% 0 22.82% N 10.01%.
• 55
Hydrochlorid von L-AIa-D-GIu(NHCH3M)BzI (D)Hydrochloride of L-Ala-D-GIu (NHCH 3 M) BzI (D)
Man behandelt 842 mg (2 mMol) der in Stufe C erhaltenen Verbindung C während 30 Minuten mit 5 ml einer etwa 1 n-Chlorwasserstofflösung in Essigsäure. Man engt die Reaktionsmischung zur Trockne ein und reinigt den Rückstand durch Chromatographie über einCi, mit Kieselgel (35 g) beschickten Säule (Chlorform/ Methanol-Mischung, 5/5, Vol./Voi.). Man vereinigt die erhaltenen reinen Fraktionen, engt sie ein und erhält 614 mg (Ausbeute = 86%) des Produktes in Form eines Öls.842 mg (2 mmol) of compound C obtained in step C are treated with 5 ml for 30 minutes an approximately 1N hydrogen chloride solution in acetic acid. The reaction mixture is concentrated to dryness and purifies the residue by chromatography on a CI column loaded with silica gel (35 g) (chlorine form / Methanol mixture, 5/5, v / v). The pure fractions obtained are combined, concentrated and receives 614 mg (yield = 86%) of the product in the form of an oil.
GS-bzKO-bzO-Mur-NAc-L-Ala-D-GluiNHCHjJ-OBzl (E)GS-bzKO-bzO-Mur-NAc-L-Ala-D-GluiNHCHjJ-OBzl (E)
Man gibt 377 mg (0,8 mMol) (/?-bzl-4,6-bzi>Mur-NAc zu einer Lösung von 0,86 Mol der in Stufe D erhaltenen Verbindung D und 0,1 ml (0,86 mMol) N-Methylmorpholin in 10 ml Dimethylformamid.377 mg (0.8 mmol) (/? - bzl-4,6-bzi> Mur-NAc) are added to a solution of 0.86 mol of that obtained in step D. Compound D and 0.1 ml (0.86 mmol) of N-methylmorpholine in 10 ml of dimethylformamide.
so Man gibt 108 mg (0,8 mMol) Hydroxybenzotriazol und 165 mg (0,8 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu.
Nach Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur fällt man das Produkt und den gebildeten Dicyclohexylharnstoifmit
Wasser aus, filtriert ab und trocknet. In dieser Weise erhält man 767 mg eines Niederschlages,
was einer Ausbeute von 96% entspricht.
Man reinigt 380 mg des Niederschlages über einer mit 30 g Kieselgel beschickten Säule. Man eluiert die
Säule zunächst mit Chloroform und dann mit einer Chloroform/Methaaoi-Mischung (5/5, Vol/vcl.). Man
vereinigt die reinen Fraktionen und engt sie ein. In dieser Weise erhält man 250 mg des Produktes (Ausbeute
= 80%) mit den folgenden physikalischen Kenndaten:so 108 mg (0.8 mmol) of hydroxybenzotriazole and 165 mg (0.8 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide are added. After standing overnight at room temperature, the product and the dicyclohexylureaif formed are precipitated with water, filtered off and dried. In this way, 767 mg of a precipitate is obtained, which corresponds to a yield of 96%.
380 mg of the precipitate are purified on a column charged with 30 g of silica gel. The column is eluted first with chloroform and then with a chloroform / methaaoi mixture (5/5, v / v). The pure fractions are combined and concentrated. In this way, 250 mg of the product are obtained (yield = 80%) with the following physical characteristics:
Drehwert [a]% - 17° (Dimethylformamid)Rotation value [a]% - 17 ° (dimethylformamide)
Analyse: C41H50OnN4 0,75 H2O (792,88)Analysis: C 41 H 50 O n N 4 0.75 H 2 O (792.88)
berechnet: C 62,46% H 6,65% N 7,10%;
gefunden: C 62,7% H 6,69% N 6,92%.Calculated: C 62.46% H 6.65% N 7.10%;
Found: C 62.7% H 6.69% N 6.92%.
& MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH.,) (F) & MUr-NAc-L-AIa-D-GIu (NHCH.,) (F)
Man hydriert 198,22 mg (0,25 mMol) der in Stufe E erhaltenen Verbindung E in 15 ml Eisessig während 10 Stunden in Gegenwart eines Palladiumkatalysators (Palladium auf Kohlenstoff). Nach dem Abfiltrieren198.22 mg (0.25 mmol) of the compound E obtained in step E are hydrogenated in 15 ml of glacial acetic acid during 10 hours in the presence of a palladium catalyst (palladium on carbon). After filtering off
des Katalysators und dem Einengen der Reaktionsmischung zur Trockne erhält man das Produkt durch Ausfällen aus einer Äthanol/Aceton/Äther-Mischung. Man erhält 180 mg des Produktes (Ausbeute = 85%) mit folgenden physikalischen Kenndaten:the catalyst and the concentration of the reaction mixture to dryness, the product is obtained by precipitation from an ethanol / acetone / ether mixture. 180 mg of the product are obtained (yield = 85%) with the following physical characteristics:
F 157 bis 161°C SF 157 to 161 ° C S
Das Produkt erweist sich als homogen bei der Chromatographie über mit Kieselgel beschichteten Platten unter Verwendung einer n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser-Mischung (30/20/6/24, Vol/Vol.) und einer n-Butanol/Essigsäure/Wasser-Mischung (4/1/5, Vol./Vol. - obere Phase). lüThe product turns out to be homogeneous when chromatographed over plates coated with silica gel using a n-butanol / pyridine / acetic acid / water mixture (30/20/6/24, vol / vol.) and a n-butanol / acetic acid / water mixture (4/1/5, v / v - upper phase). lü
berechnet: C 47,42% H 6,76% N 11,06%; gefunden: C 47,5% H 6,8% N 11,0%.Calculated: C 47.42% H 6.76% N 11.06%; Found: C 47.5% H 6.8% N 11.0%.
Beispiel 2
Fharmakoiogische Eigenschaften vuii N-Auciyimuraruyi-L-aiariyl-D-giiitarriirisaurcri-alpha-rncthyiarnidExample 2
Pharmacological properties vuii N-Auciyimuraruyi-L-aiariyl-D-giiitarriirisaurcri-alpha-rncthyiarnid
Die Toxizität des erfindungsgemäßen Produktes untersucht man durch intravenöse Injektion an Mäusen mit einem Alter von 2 Monaten. Durch progressive Steigerung der verabreichten Dosierungen bestimmt man jene, bei der die Mortalität der Mäuse einer gleichen Gruppe 50% erreicht (DL50).The toxicity of the product according to the invention is examined by intravenous injection in mice 2 months of age. By progressively increasing the doses administered, one determines that at which the mortality of the mice in the same group reaches 50% (DL 50 ).
Es konnte gezeigt werden, daß die DL50 des untersuchten Produktes oberhalb 1 g/kg Körpergewicht der Tiere liegt, was einer Dosis entspricht, die wesentlich größer ist als die Dosis, bei der das Produkt seine Adjuvanseigenschaften entfaltet.It could be shown that the DL 50 of the investigated product is above 1 g / kg body weight of the animals, which corresponds to a dose which is significantly greater than the dose at which the product develops its adjuvant properties.
Bei den Untersuchungen, deren Ergebnisse im folgenden angegeben sind, wird der Einfluß des erfindungsgemäßen Wirkstoffes auf den Gehalt der Antialbumin-Antikörper unter den folgenden Dsdingungen ermittelt.In the investigations, the results of which are given below, the influence of the active ingredient according to the invention on the content of the anti-albumin antibodies is determined under the following conditions.
Man verabreicht Gruppen von jeweils acht Mäusen des Stammes Swiss mit einem Alter von 2 Monaten durch subcutane Injektion 0,5 mg des Antigens, das in Form von Rinderserumalbumin (BSA) verabreicht wird, und 0,1 mg der untersuchten Substanz in einer isotonischen Salzlösung. Diese hohe Antigendosis führt, da sie an der Grenze der paralysierenden Dosis bezüglich der Immunreaktion liegt, aufgrund dieser Tatsache bei den KontroUtieren nur zu einer geringen oder keiner Reaktion auf das Antigen und stellt daher ein strenges Kriterium zum Nachweis der Wirkung eines Adjuvans dar. 30 Tage später behandelt man die Mäuse erneut mit 0,1 mg des gleichen Antigens.Groups of eight mice of the Swiss strain, each 2 months old, are administered by subcutaneous injection 0.5 mg of the antigen administered in the form of bovine serum albumin (BSA) and 0.1 mg of the tested substance in an isotonic saline solution. That high dose of antigen because it is at the limit of the paralyzing dose with respect to the immune response, due to this Fact in the control animals showed little or no reaction to the antigen and therefore represents a strict criterion for demonstrating the effectiveness of an adjuvant. 30 days later, the Mice again with 0.1 mg of the same antigen.
Der Antikörpergehalt wird durch passive Hämagglutination bestimmt, wozu man rote Blutkörperchen von Schafen verwendet, welche Blutkörperchen mit Formaldehyd behandelt, mit Antigen bedeckt worden sind, das nach der von A. A. Hirata und M.W. Brandiss (J. Immunol. 100 (1968) 641 bis 648) beschriebenen Methode untersucht worden ist. Die Probennahme erfolgt 14, 28, 34 und 36 Tage nach der ersten Injektion.Antibody levels are determined by passive hemagglutination using red blood cells used by sheep which have treated blood cells with formaldehyde, coated with antigen are based on that of A. A. Hirata and M.W. Brandiss (J. Immunol. 100 (1968) 641-648) Method has been investigated. Samples are taken 14, 28, 34 and 36 days after the first injection.
Zu Vergleichszwecken behandelt man die Mäuse statt mit MUr-NAc-L-AIa-D-GIu(NHCH3) entweder mit Lipopolysacchariden (LPS) (die man mit der Wasser/Phenol-Methode aus S. enteritidis extrahiert hat) oder mit dem Adjuvans, das unter der Bezeichnung »WSA« bekannt ist und von Adam und KoH. (Infect. Immun. 7 (1973) 855 bis 861) beschrieben wurde. Die Kontrollmäuse werden nur mit dem Antigen behandelt.For comparison purposes, the mice are treated either with lipopolysaccharides (LPS) (which have been extracted from S. enteritidis using the water / phenol method) or with the adjuvant instead of MUr-NAc-L-Ala-D-GIu (NHCH 3) , which is known under the name »WSA« and by Adam and KoH. (Infect. Immun. 7 (1973) 855-861). The control mice are treated with the antigen only.
Die Ergebnisse verdeutlichen, daß das in Form einer isotonischen Salzlösung verabreichte Produkt Mur-NAc-L-AIa-D-GIu-(NHCH3) einen starken Anstieg des Gehalts der gebildeten Antikörper verursacht, während unter den gleichen Bedingungen das Produkt »WSA« praktisch inaktiv ist. Di« mit Mur-NAc-L-Ala-D-GIu(NHCH3) erzielten Reaktionen können ganz allgemein als vergleichbar mit jenen angesprochen werden, die man mit »LPS« erzielt, wobei jedoch festzustellen ist, daß das erfindungsgemäße Produkt im Gegensatz zu diesem vorbekannten Material frei ist von toxischen Wirkungen.The results make it clear that the product Mur-NAc-L-Ala-D-GIu- (NHCH 3 ) administered in the form of an isotonic saline solution causes a sharp increase in the content of the antibodies formed, while under the same conditions the product "WSA" is practically is inactive. The reactions achieved with Mur-NAc-L-Ala-D-GIu (NHCH 3 ) can generally be addressed as being comparable to those achieved with "LPS", although it should be noted that the product according to the invention is in contrast to this previously known material is free from toxic effects.
Wie bei den oben genannten Untersuchungen verfolgt man das Ansteigen des Antikörpergehalts, das durch die Injektion des Antigens und der erfindungsgemäßen Verbindung verursacht wird, wobei in diesem Fall das injizierte Material eine Ölphase enthält, die das unvollständige Freund'sche Adjuvans umfaßt (Wasser-in-Öt-Emulsion).As with the studies mentioned above, the increase in the antibody content is followed the injection of the antigen and the compound of the invention is caused, in which case the injected material contains an oil phase which comprises the incomplete Freund's adjuvant (water-in-oil emulsion).
Für diese Untersuchungen verwendet man Meerschweinchen (Hartley) mit einem Gewicht von 350 g. Den K cn trol !tieren verabreicht man in jede Hinterpfote 0,1 ml einer Emulsion entweder des unvollständigen f'reynd'schen Adjuvans (FlA) oder des vollständigen Freund'schen Adjuvans (FCA), die 500 μg Ovalbumin (Antigen) enthält. Das untersuchte Produkt wird in einer Dosis von 100 pg in einer Emulsion des unvollständigen Freund'schen Adjuvans verabreicht.Guinea pigs (Hartley) weighing 350 g are used for these studies. The 0.1 ml of either the incomplete emulsion is administered to each hind paw f'reynd's adjuvant (FlA) or the complete Freund's adjuvant (FCA), the 500 μg ovalbumin (Antigen) contains. The investigated product is administered in a dose of 100 pg in an emulsion of the incomplete Freund's adjuvant.
24 Tage nach der Injektion bestimmt man den Antikörpergehalt durch passive Hämagglutination (PHA), wie es oben angegeben ist, und durch Ausfallen nach der Methode von Folin.24 days after the injection, the antibody content is determined by passive hemagglutination (PHA), as indicated above, and by precipitation by the Folin method.
48 Stunden nach dieser Injektion bestimmt man den Durchmesser und die Verhärtung der Injektionsstellc.48 hours after this injection, the diameter and hardening of the injection site are determined.
Ovalbumin + HA <500 900 0,0,0,0,0,0Ovalbumin + HA <500 900 0,0,0,0,0,0
femäße Produkt MUr-NAc-L-AIa-D-GI(NHCH3) in sehr starkem Maße das Ansteigen des AntikörpergehaltsThe same product MUr-NAc-L-AIa-D-GI (NHCH 3 ) shows a very strong increase in the antibody content begünstigt und zu einer Verzögerung der Hypersensibilitätsreaktion gegenüber dem gleichen Antigen fuhrt.favored and leads to a delay in the hypersensitivity reaction to the same antigen.
und die dazu verwendet werden können, die Wirksamkeit von Impfstoffen bakteriellen oder viralen Ursprungsand which can be used to assess the effectiveness of vaccines of bacterial or viral origin zu verbessern, insbesondere jener Impfstoffe, die schwach immunogen sind.improve, especially those vaccines that are weakly immunogenic.
Sie können insbesondere dazu verwendet werden, die Immunisierung des Organismus (menschliche oder tierische Patienten) gegenüber Infektionen, die durch Bakterien oder Viren oder Tumorantigene etc. verursacht werden, zu begünstigen. Sie sind ebenfalls geeignet zur Herstellung von Seren, die Antikörper enthalten, die bezüglich dieser Antigene aktiv sind.In particular, they can be used to immunize the organism (human or animal patients) against infections caused by bacteria or viruses or tumor antigens etc. They are also suitable for the preparation of sera which contain antibodies which are active with regard to these antigens.
Claims (1)
CH2OHI. N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamic acid-alpha-methylamide of the formula I.
CH 2 OH
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