DE2709399B2

DE2709399B2 - Einrichtung zum Messen von Zelleigenschaften

Info

Publication number: DE2709399B2
Application number: DE2709399A
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1977-03-04
Filing date: 1977-03-04
Publication date: 1979-11-08
Also published as: FR2382691A1; US4225229A; FR2382691B1; DE2709399A1; GB1574566A; DE2709399C3; CH626725A5

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung nach dem Oberbegriff des Anspruchs I.

Biologische Zellen, z. B. aus dem menschlichen Körper entnommene Zellen, können dadurch untersucht werden, daß sie mit verschiedenen chemischen Stoffen behandelt und Lichterscheinungen beobachtet und gemessen werden, die nach dieser Behandlung und Bestrahlung der Zellen mit Licht auftreten, z. B. die Fluoreszenz der Zellen. Z. B. werden Zellen mit zwei verschiedenen Fluores/enzfarbsioffen angefärbt, von denen der eine für die DNS und der andere für das Prolein der Zelle charakteristische Fluoreszenzerscheinungen verursacht.

Dabei werden Farbstoffe verwendet, die bei der Fluoreszenzanregung Maxima in verschiedenen Wellenlängen zeigen. Unter Verwendung der bisher üblichen Geräte kommt es bei simultanen Messungen dadurch zu Fehlern, daß die Fluoreszenzlichispektren der verwendeten Farbstoffe verhältnismäßig breit sind und einander überlappen. Licht des einen Farbstoffes s erreicht bei diesen Geräten immer auch zu einem gewissen Teil den für den anderen Farbstoff bestimmten Photomultiplier. Eine Vorrichtung für diesen Zweck beschreibt M. Stöhr, »Double Beam Application in Flow Technics and Resent Results«, Piilse-Cytophotomeiry.

in 1976, p. 39—45. Die Vorrichtung ist mit einem Argon-Ionen-Laser und einem Helium-Cadmium-Laser ausgestattet, die bei 488 ηm und 441 nm emittieren. Zusätzlich werden noch besondere Spiegel für J>5 nm verwendet. Stöhr erwähnt noch, daß Schwierigkeiten vermieden werden können, falls die Punkte des Zusammenwirkens zwischen einem Teilchen und den erleuchtenden Laserstrahlen räumlich getrennt werden. Irgendeine Lösung dieses Problems ist jedoch in dem zitierten Aufsalz nicht dargestellt.

>(i Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung mit zwei Meßstellen zu schaffen, bei denen die Durchfluß- und Beobachtungsbedingungen im wesentlichen gleich sind.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die

.', Meßstellen an einem Knie des Durchflußkanals ausgebildet sind, wobei der Zufluß- und der Abflußquerschnitt je eine der beiden Meßstellen bilden, die durch die vom Knie eingeschlossene Ecke getrennt sind. Vorzugsweise ist die der eingeschlossenen Ecke

«ι gegenüberliegende Außenwand des Knies als Beobachtungsfenster ausgebildet. Die Erfindung sieht ferner vor. daß das Beobachtungsfenster und die Durchtrittsflächcn der Meßstellen im wesentlichen rechtwinklig zur Winkelhalbierenden des Kniewinkels sich erstrecken.

Γι Bei der erfindungsgemäßen Einrichtung zeigen die beiden Mcßsiellen praktisch gleiche DurchfluUbedingiingcn. Sie sind zwar räumlich getrennt, trotzdem so eng benachbart, daß die für die Beleuchtung erforderlichen zwei getrennten Lichtquellen keine teuren Laser

4(i /μ sein brauchen. Vielmehr können nach der Erfindung die Lichtquellen zwei nebeneinander liegende, in der Durchlässigkeit verschiedene ^Pilter sein, die zwischen einer primären Lichtquelle und der Meßstelle angeordnet sind. Unter Verwendung einer üblichen, dichromati-

t'i sehen Teilerplatte wird das Licht von der primären Lichtquelle durch die beiden Filter entsprechend dem »Köhlerschen Beleuchtungsprinzip« nach den beiden Meßstellen gesandt, von denen die eine das Licht des einen Filters und die andere das Licht des zweiten

Vi Filters empfängt. Hinter der Teilerplatte sind unter Verwendung einer zweiten Teilerplatte zwei Photomultiplier angeordnet, die über halbseitige Blenden in entsprechender Aufteilung die Fluoreszenz von jeweils einer der Meßstellen aufnehmen.

ν· Die Gesamtanordnung ist demnach wesentlich einfacher und billiger als die bisher bekannten Einrichtungen. Trotzdem ist mit der neuen Einrichtung eine bezüglich der Anregungslichtwcllcnlängen einwandfrei getrennte Anregung der Zellen beim Durch-

*io tritt durch die beiden Meßslcllen möglich, ebenso eine bezüglich der Fluoreszcnzlichtwellcnlängen einwandfrei gelrennte Messung dieser Zellen. Besondere Justierungsarbeiten, die eine bisher mögliche Überlappung weitestgehend verhindern sollten, sind nicht

"> erforderlich. Die Zellen können den Meßstcllen mit einem Hiillstrom zugeführt werden. Damit ergibt sich eine Vereinfachung gegenüber mit Querstrom arbeitenden Durchflußkammern. Die beiden Meßstellen lieecn

symmetrisch zueinander und bilden je einen Abschnitt der einwandfrei festlogbaren Fokusebene des Objektivs. Weiter ist es möglich, ein Objektiv mit gmUer Apertur vorzusehen. Durch die Hüilsiromanordnung und entsprechende Einstellung der Sirömungsbedingungen IaOi sich erreichen, daß die Zellen praktisch einzeln durch die beiden Mcßstellen hindurchtreten.

Die Erfindung wird in der nachfolgenden Beschreibung und den Zeichnungen beispielsweise erläutert. Es zeigt

Fig. I vereinfacht eine erfindungsgemäUe Durchflußkammerund

Fig. 2 eine erfindungsgemäße Einrichtung, ebenfalls in vereinfachter Darstellung.

Die Einrichtung weist eine Durchflußkammer 10 auf, in der ein Durchflußkanal 12 ausgebildet ist, der knieförmig um eine innere Ecke 16 herumführt. Der Scheitel des Kniewinkels ist abgeschnitten und durch ein Deckglas 14 ersetzt, das sich im wesentlichen rechtwinklig /ur Mittelhalbierenden der Ecke 16 erstreckt.

Parallel zur Fläche des ebenen Deckglases 14 liegt der über ein Objektiv 24 zu beobachtende Durchflußquerschnitt, der durch die mil A-B gekennzeichnete gestrichelte Linie markiert ist. Dieser Querschnitt liegt einerseits im Zufluß- andererseits im Abflußschcnkcl des Kanals 12, wobei die beiden Teile durch die Kante 18 der Ecke 16 getrennt sind. Dadurch ergeben sich die beiden voneinander getrennten Meüsiellen 20 und 22, durch die die zu beobachtenden Teilchen oder Zellen unter im wesentlichen gleichen Bedingungen hindurchgehen.

Die Durchmesser im Bereich der Mefistellen 20, 22 richten sich nach den zu untersuchenden Partikeln. Je nach deren Größe liegen sie in einem Hei eich /wischen 0.1 und 0,5 mm. Für Säugclicrzcllen sind Durchmesser von 0,2 mm zweckmäßig.

|edc der beiden Meßstellen kann geringfügige Unterschiede in der Beleuchlungsintensilät aufweisen. Um darin begründete Meßfehler zu vermeiden, wird eine Hüllstromanordnung verwendet, die dazu führt, dal) all. Zellen eine ganz bestimmte Stelle der Fokusebene — Meßstelle — passieren, wodurch alle Zellen derselben Lichtenergie ausgesetzt werden. Eine Zellsuspension wird von einem hier durch den Pfeif 28 markierten Vorrat in einen Zuieilungskanal 26 eingespeist, der im Zuflußschenkel 12 mündet. In den Zuflußichcnkel !2 wird außerde.n von einer durch den PfHI 30 markierten Zuführungseinrichmng ein HiÜI-si rom in den Zuflu'Jschenkel 12 eingeführt. Der llüllstrom kann aus dem gleichen Medium wie die Flüssigkeit bestehen, in welchen die /ti beobachtenden Zellen suspendiert sind.

Der Abflußschcnkcl des Kanals 12 führt bei J2 m einen Abflnßbchälttr. An den Abflußschenkel kann über auch bei 12 ein Sort ersystem für die Zellen angeschlossen werden, wobei eine Sortierung durch die Ergebnisse der Messung an den Meßstellen 20,22 gesteuert werden kann.

Die einwandfreie Trennung der Meßsiellen 20, 22 durch die Kante 18 der Ecke 16 gestaltet ein besonders einfaches Beleuchtungssystem. Eine primäre Lichtquelle 40 ist mit einem Kollcktorsysiem 42 versehen, das den Strahlengang des von der Quelle 40 ausgesandten Lichtbündels parallclisicrt. Mit tier Linse 44 wird die Lichtquelle in die »innere Pupille« des Mikroskupobjeklivs abgebildet, was der »Köhlerischen Beleuchtung» der MeßslcMc entspricht. Im Strahlengang sind zwei Filter 46, 48 nebeneinander derart angeordnet, dal! das Lichibündel der primären Lichtquelle 40 in zwei verschiedene, parallel nebeneinander liegende Lichtbündel aufgeteilt wird. Entsprechend den Filtereigenschäften entstehen dadurch /wci verschiedene, in wesentlichen monochromatisch: Lichtbünuel I und II.

so daß die Filter 46, 48 als sekundäre

Ttquc!

angesehen werden können. Eine dichromatische Teilerplatte 50 ist unter 45° zuroptischen Achse des Objektiv, . 24 angeordnet. Die optische Achse des Objektivs 24 stimmt mit der Winkelhalbierenden der Ecke 16 überein und steht damit senkrecht zur Fläche der Meßsiellen 20, 22. Mit Hilfe der Teilerplatte wird durch das Bündel I, das durch das Filier 46 hindurchgegangen ist. die ι Mcßsielle 20 und durch das Büni'el II. das durch die Filterplatie 48 hindurchgegangen ist, die Meßstelle 22 beleuchtet.

Mit Hilfe einer zweiten Tcilcrplatte 54. die ebenfalls auf der optischen Achse des Objektivs 24 unter einem Winkel von 45" hinter der Teilcrplatte 50 angeordnet ist, werden die Fliiorcszenzerschcinungen an den Meßsiellen 20, 22 mittels der Photoclektronenvervielfucher 60 und 62 aufgenommen. Vor jedem Multiplier ist eine halbseitig geschlossene Blende 56 denn in der Zwischenbildcbenc des Auflichtmikroskops angeordnet. daß das Licht von der Meßstelle 20 durch die Blende 56 !en Phoioclektronenverviclfacher 60 erreicht, während dieser gegen Licht von der Meßstelle 22 abgeschirmt ist. Umgekehrt geht Licht von der M-.'ßstelle 22 durch die Teilerplattc 54 und die Blende 58 hindurch in den PhotoelektiOnenvervielfachcr 62. während dieser dun Ii die halbseitige Schließung der Blende 58 gegen Licht von der Meßstelle 20 abgeschirmt ist.

Die Anordnung gestattet, mit einer verhältnismäßig großen inneren Pupille 52 und entsprechend großer Apertur des Objektivs 24 zu arbeiten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Einrichtung zum Messen von Zellen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind und mit der Flüssigkeit durch Meßstellen hindurchfließen, die in einem Durchflußkanal einer Durchflußkamnier ausgebildet und durch Fenster in der Wandung des Kanals beobachtbar sind, mittels Fluoreszenzanregung durch zwei in der Wellenlänge verschiedene Lichtquellen, von denen je eine Lichtquelle einer Meßstelle zugeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßstellen (20, 22) an einem Knie des Durchflußkanals (12) ausgebildet sind, wobei der Zufluß- und der Abflußquerschniu je eine der beiden Meßstellen bilden, die durch die vom Knie eingeschlossene Ecke (16,18) getrennt sind.

2. Einrichtung nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß das Beobachtungsfenster (14) die der eingeschlossenen Ecke (16, 18) gegenüberliegende Außenwand des Knies bildet.

3. Einrichtung nach Anspruch I oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß das Beobnchüingsfenster (14) und die Fläche der Meßstellen (20, 22) im wesentlichen rechtwinklig zur Winkelhalbierenden des Kniewinkels liegen.

4. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine I lüllstromzufiihrung(26,28,30).

5. Einrichtung nach einem Jer vorhergehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquellen zwei nebeneinander liegende, in der Durchlässigkeit verschiedene Filter (46, 48) umfassen, die zwischen einer primären Lichtquelle (40) und den Meßstcllen (20,22) angeordnet sind.

6. Einrichtung nuch einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gek<· .nzeichnet. daß jeder Meßstelle (20, 22) je ein Photoelektronenvcrvielfacher (60,62) zugeordnet ist.

7. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung (40, 46, 48) und die Beobachtungseinrichtung (60, 62) unter Verwendung von Teilerplatten (50, 54) auf derselben Seite des Beobachtungsfensters (14) liegen.

8. Einrichtung nach Anspruch 6 oder 7. dadurch gekennzeichnet, daß vor jedem Photoeleklronenvervielfacher eine halbseitig geschlossene Blende (56,58) angeordnet ist.